一、大肠埃希菌O157∶H7特异基因检测与毒力基因分析（论文文献综述）
张立伟[1]（2021）在《河北地区鸡源致病性大肠杆菌分离鉴定及耐药性研究》文中提出致病性大肠杆菌耐药程度越来越严重,已对畜禽安全生产和人类健康及公共卫生构成了极大威胁,全球对致病性大肠杆菌耐药性及传递相关问题极为关注。本研究从河北地区病鸡肝脏分离大肠杆菌,通过生化试验、16S r RNA基因测序对分离菌株进行鉴定,K-B法测定其药物敏感性,PCR方法检测其血清型和毒力基因,同时检测质粒介导喹诺酮类耐药基因（Plasmid mediated quinolone resistance,PMQR）、超广谱内酰胺酶基因（Extended-spectrum beta-lactamases,ESBLs）和整合子整合酶基因。参考系统发育群分类及多位点序列分型（Multilocus-sequence typing,MLST）方法,对大肠杆菌进行分群,本研究旨在阐明河北地区鸡源大肠杆菌致病性和耐药性分子流行特征,为制定相应的防控策略提供依据。结果如下:1.56株大肠杆菌生化表型分为8种,以B4为主。血清型分为11种,O78、O2、O157和O1为优势血清型,分别占26.79%、23.21%、17.86%和14.29%。2.肠道致病性大肠杆菌26株,其中EHEC、EAEC和ETEC,分别占76.92%、15.38%和7.69%。56株大肠杆菌携带15种肠道外大肠杆菌毒力基因,fim C和Omp A携带率均为100%;aat A、yij P、irp2、mat和iss的检出率分别为98.21%、98.21%、98.21%、96.43%和92.86%。铁转运相关基因（iro N、fyu A、iuc D和irp2）检出率均高于80%。3.45株大肠杆菌对氟喹诺酮类药物耐药率为58.93%～80.36%,携带qnr S、qnr B和aac（6′）-Ib-cr,比率分别为82.22%、4.44%和4.44%。41株大肠杆菌对第三代头孢菌素类药物呈现为多重耐药,主要携带blaCTX-M-9、blaCTX-M-1、blaCTX-M-8、blaCTX-M-25、bla OXA、blaSHV和blaTEM,其中blaCTX-M-65基因亚型和blaCTX-M-55型检出率最高。4.56株大肠杆菌分为22种ST型,其中ST1199、ST1200、ST1201、ST1202、ST1203、STN1、STN2和STN3为新型ST型,ST88（12.5%）、ST85（10.71%）和ST243（10.71%）型为优势型。系统发育群检测到D、B2、B1、A群,其分别占42.86%、25%、21.43%和10.71%。41株PMQR大肠杆菌有19种ST型。质粒携带blaCTX-M大肠杆菌有16种ST型,优势型为ST85（16.67%）和ST243（16.67%）。综上所述,河北地区鸡源大肠杆菌O血清型多样,毒力因子种类繁多,普遍携带qnr S和blaCTX-M耐药基因,后者主要以blaCTX-M-55、blaCTX-M-65和blaCTX-M-14为优势耐药基因亚型,MLST分型中检测到6种新型ST型,为河北地区鸡源耐药性致病大肠杆菌病的有效防控及其耐药性及传递研究提供了理论支持。
伍麦尔·麦海提[2]（2021）在《新生犊牛肺源致病性大肠杆菌的分离鉴定及耐药性分析》文中指出牛源肠外致病性大肠杆菌（ExPEC）是一类引起肠外组织感染的致病性病原菌,可引起牛的败血症,脑膜炎,尿道感染和肺炎等疾病,并易引起继发感染或混合感染。本研究对阿拉尔某牛场疑似由大肠杆菌引起死亡的犊牛病变组织进行采样和病理观察,并通过细菌分离、形态学和生理生化鉴定及16S rRNA鉴定,确定病原为牛肺源ExPEC。通过动物试验,初步研究了该病原体的危害和病理表现。对所分离到的牛肺源ExPEC菌株进行毒力基因检测和药敏试验,以期为牛源ExPEC感染的预防和治疗提供参考依据。2020年7月至11月,在阿拉尔市某规模化牛场采集因呼吸系统疾病致死的新生犊牛组织（脾脏、心脏、淋巴结、肝脏、肾脏、肺脏）,病死犊牛肺脏和心冠脂肪有明显出血点和淤血点;经过细菌分离、生化鉴定,初步鉴定为大肠杆菌,经细菌16S r RNA基因鉴定,显示分离株的基因序列与E.coli参考菌株的相似性为99%以上,确定为肠外致病性大肠杆菌。采用PCR扩增法对所分离到的牛源ExPEC菌株进行毒力基因检测,结果发现:12种毒力基因中agg R毒力基因扩增出15株,其余ipa H、hly F、fim C、fyu A、irp2分别扩增出13株、12株、10株,9株、7株;毒力基因的检出率分别为agg R（65.21%）、ipa H（56.52%）、hly F（52.17%）、fim C（43.47%）、fyu A（39.13%）、irp2（30.43%）,其中agg R、ipa H的扩增率为最高。用分离得到的牛源ExPEC菌株进行小鼠攻毒试验,结果发现6个试验组小鼠在12～36h内相继死亡,死亡小鼠肺脏组织分离到的细菌经鉴定为ExPEC。对本试验中筛选到的30株牛源ExPEC菌株进行了抗生素药敏试验,结果显示:β-内酰胺类、喹诺酮类、氨基糖苷类和四环素类药物耐药率较高,其中青霉素（95.65%）氨苄西林（91.3%）、庆大霉素（82.6%）、卡那霉素（78.26%）、苯唑西林（78.26%）、万古霉素（73.91%）、丁胺卡那（69.56%）的耐药率较高。β-内酰胺类bla TEM和喹诺酮类gyr A耐药基因检出率最高,分别为65.21%,52.17%;氨基糖苷类耐药基因aac C2检出率为（39.13%）;磺胺类耐药基因sul2和四环素类tet（A）的耐药率相等。本研究通过对阿拉尔某规模化牛场犊牛牛源ExPEC的分离与鉴定、耐药性分析、耐药基因和毒力基因的检测及动物试验,确定了病原及其耐药情况,为本地区牛源ExPEC的诊断与防治提供了理论依据。
张凌[3]（2021）在《新疆牛源非O157产志贺毒素大肠埃希菌的O-血清群、毒力因子与耐药性研究》文中提出目的:系统研究新疆牛源非O157产志贺毒素大肠埃希菌（Shiga toxin-producing E.coli,STEC）的O-血清群、毒力基因和耐药性,并初步探究非O157 STEC的毒力基因与耐药基因是否发生共转移。方法:以本实验室2015～2019年从新疆昌吉、伊犁、乌鲁木齐市、博乐和石河子收集的127株牛源非O157 STEC作为研究对象。（1）采用多重PCR（E.coli O-genotyping PCR）筛选非O157 STEC O-血清群。（2）通过多重PCR对非O157 STEC进行大肠埃希菌系统发育分群,并检测志贺毒素基因亚型(stx1a、stx1c、stx1d和stx2a2g)和溶血素基因ehx A,在5%绵羊血平板上测试ehx A阳性菌株的溶血性。（3）使用K-B法对非O157 STEC进行18种抗菌药物的药敏试验,并对耐药菌株进行接合试验验证耐药基因能否发生水平转移。（4）对多重耐药性菌株进行全基因组框架图测序注释耐药基因和毒力基因。结果:（1）127株新疆牛源非O157 STEC检测出19个O-血清群,包括O145、O22、O179、O8、O29、O81、O88、O113、O130、O28ac、O116、O119、O21、O48、O140、O147、O183、O110和O159。（2）系统发育分群结果显示,牛源非O157 STEC以A群为主（116/127,91.39%）,B1群次之（9/127,7.09%）。127株非O157 STEC中stx1a、stx2a、stx2c和ehx A毒力基因的检出率分别为96.85%（123/127）、78.74%（100/127）、1.57%（2/127）和93.70%（119/127）。41株ehx A阳性菌株对绵羊血红细胞表现溶血活性。（3）127株非O157 STEC中共有8株耐药菌,均呈多重耐药表型,对4～13种抗菌药物耐药,包括β-内酰胺类、四环素类、磺胺类、酰胺醇类和氨基糖苷类,且耐药谱中均有TET-SXT-CHL-STR耐药组合。8株非O157 STEC均携带tet A基因和Inc A/C质粒。接合转移试验表明,8株耐药菌可将全部或部分耐药表型转移至E.coli J53;8株耐药菌携带的tet A基因和Inc A/C质粒均可转移至E.coli J53,转移率为100%,其中6株菌将stx1a、stx2a和ehx A转移至E.coli J53,转移率为75.00%。（4）全基因组框架图测序注释到70种耐药基因和141种毒力基因。结论:新疆牛源非O157 STEC O-血清群分布呈多样化,主要以O145、O22和O179为主;具有8种毒力基因谱,优势谱型为stx1a/stx2a/ehx A;并首次发现非O157 STEC的耐药基因和毒力基因发生共转移。本研究系统评价新疆牛源非O157 STEC的血清群、毒力因子和耐药性。牛源非O157 STEC作为耐药基因和毒力基因的储存库对新疆公共卫生安全存在潜在威胁。
纪凯丽[4]（2020）在《7种血清型STEC多重荧光定量PCR检测方法的建立及其应用》文中研究表明产志贺氏毒素大肠杆菌（Shigella toxin-producing Escherichia coli,STEC）是一类肠道病原体的总称,可引起全球范围内的零散感染或广泛爆发。牛是STEC最主要的宿主,STEC在其肠道内生存、繁殖,随粪便排出体外,污染食物、水源、土壤,经粪口途径传播,对人类有高致病性,可引起人类的胃肠道疾病如出血性肠炎、溶血性尿毒症,严重者还会导致死亡。O157血清型是STEC的主要致病血清型,但近年来,一些非O157血清型（如O26、O45、O103、O111、O121、O145）的流行也日益严重,在有的国家和地区甚至超过了 O157血清型。为快速、准确地检测奶牛粪便中O26、O45、O103、O111、O121、O145、O157等7种血清型的STEC,本文建立了一种富集增菌后进行多重荧光定量PCR的检测方法,可有效检出奶牛粪便中的这7种STEC,并在验证了该方法的可行性后,将此方法应用于江苏省部分地区奶牛场的粪便样品检测。1.7种血清型STEC多重荧光定量PCR检测方法的建立传统的分离培养、生化鉴定检测方法过程复杂,检测周期比较长,且容易造成漏检。本文采用Taqman探针法,建立一种多重荧光定量PCR检测方法,配合富集培养,可快速、准确地对样品进行检测。本研究将7种血清型的产志贺氏毒素大肠杆菌分为三组:①针对O157血清型,检测其高特异性O抗原基因rfbE与stx1、stx2、eae四个基因;②针对O103、O111、O121血清型,检测其wzxO103、wzxO111、wzxO121三个基因;③针对O26、O45、O145血清型,检测其wzxO26、wbqE+FO45、wzxO145三个基因。针对这三组目标血清型菌株的靶标基因,同时进行三个多重荧光定量PCR反应,即可完成对7种血清型菌株的检测。特异性试验结果显示,三组多重荧光定量PCR除阳性对照组出现目的基因扩增外,其余对照组均无扩增曲线;灵敏性试验结果显示,每个菌株的检测限浓度均达到101 CFU/mL;重复性试验结果显示,各靶基因在模板浓度相同情况下,Ct值差值小于1。以上结果证明该多重荧光定量PCR检测法的特异性好、灵敏度高和重复性好,该检测方法具有可行性。检测方法在实验室层面初步建立后,为进一步验证方法在生产上的可行性,从奶牛场采集100份奶牛粪便样品,于富集前、后分别用国际上广泛使用的多重经典PCR（cPCR）检测方法与本研究建立的多重荧光定量PCR（mqPCR）进行检测,结果显示:O26、O45、O103、O111、O121、O145、O157 等 7 种血清型,富集前 cPCR 检测法阳性率为2%、2%、3%、0%、1%、5%、1%;富集前mqPCR检测法阳性率为4%、5%、7%、1%、4%、17%、5%;富集后 cPCR 检测法阳性率为 5%、3%、6%、1%、4%、11%、2%;富集后 mqPCR 检测法阳性率为 8%、11%、10%、3%、7%、25%、7%。数据表明,多重荧光定量PCR检测前将样品进行富集培养,可有效提高样品检出率,较国际上广泛使用的多重经典PCR方法更加敏感准确。2.江苏省部分地区奶牛场粪便样品临床检测从江苏省部分地区的4个奶牛场分别采集100份奶牛粪便样品,共400份。将样品振荡培养增菌,取增菌后培养物制取DNA模板,采用本研究构建的富集增菌后多重荧光定量PCR进行检测。结果显示:O26、O45、O103、O111、O121、O145、O157等7种血清型,在A奶牛场样品中的阳性率为6%、11%、7%、0%、4%、14%、5%;在B奶牛场样品中的阳性率为9%、4%、11%、2%、8%、18%、6%;在C奶牛场样品中的阳性率为3%、5%、4%、0%、3%、27%、0%;在D奶牛场样品中的阳性率为2%、3%、2%、0%、1%、16%、0%。数据表明,4个奶牛场的优势血清型均为STEC O145,阳性率分别 14%、18%、27%、16%。综上所述,本文所建立的多重荧光定量PCR检测法灵敏度高、特异性好;江苏省不同牛场之间STEC流行情况不同。
黄昭鸿[5]（2020）在《产志贺毒素大肠埃希氏菌标志性毒力基因stx快速检测与分型法的建立》文中进行了进一步梳理产志贺毒素大肠埃希氏菌（Shiga toxin-producing Escherichia coli,STEC）作为食源性致病菌中的一种,其致病能力极强,被感染者容易形成出血性结肠炎或血性腹泻,严重者可进一步发展为溶血性尿毒综合征,危及生命。STEC广泛分布于生活环境中,在食品制作、加工、包装以及运输过程中极易感染此菌。建立一种快速、简便的产志贺毒素大肠埃希氏菌检测与分型方法有助于更好地开展食品安全的检测,进一步降低STEC的感染风险。本研究利用不对称聚合酶链式反应（Asymmetric Polymerase Chain Reaction,aPCR）结合免疫层析技术（Immu-nochromatographic Assay,ICA）,快速检测并准确分型产志贺毒素大肠埃希氏菌STEC标志性毒力基因stx,主要内容和结果如下:首先,建立快速检测STEC标志性毒力基因stx的方法。利用不对称PCR技术分别制备生物素标记的stx1和stx2目标基因单链DNA,该扩增产物与红色聚苯乙烯微球标记的stx1和stx2目的基因上游引物特异性结合,结合物上的生物素基团与免疫层析试纸条上的链霉亲和素特异性结合而显色,实现对STEC标志性毒力基因stx的检测。对检测条件进行优化,结果显示:stx1不对称PCR体系中stx1F:Biotin-stx1R最佳引物浓度比为1:7,stx2不对称PCR体系中stx2F:Biotin-stx2R则为1:4,不对称PCR最佳循环次数为55,最佳退火温度为55℃,stx1与stx2的最佳引物加入量均为3μL（Biotin-stx1R与Biotin-stx2R浓度均为2μM）,标记物聚苯乙烯微球最佳封闭剂为1%的BSA,最优加入量为20μL。利用所建立的方法能准确地检测出含有stx基因的STEC,且对不含stx基因的菌株显示阴性检测结果,具有良好的检测特异性。其次,建立快速分型stx1和stx2的方法。利用双重不对称PCR（Duplex aPCR）制备地高辛标记的stx1目标基因单链DNA与生物素标记的stx2目标基因单链DNA,该扩增产物与被红色聚苯乙烯微球标记的stx1和stx2目标基因上游引物特异性结合,结合物上的地高辛和生物素分别与试纸条上的抗地高辛抗体和链霉亲和素特异性结合并显色,根据不同检测线的显色情况,判断菌株所携带的不同类型的stx基因。对检测条件进行优化,结果显示:双重不对称PCR体系中stx1F:Digoxin-stx1R与stx2F:Biotin-stx2R引物浓度最佳比例皆为1:6,最佳循环次数为45,最佳退火温度为59℃,stx1与stx2的最佳引物加入量均为3μL（Digoxin-stx1R与Biotin-stx2R浓度均为2μM）,标记物聚苯乙烯微球的最佳封闭剂为Seablock,最适加入量为50μL。利用该方法对不同stx基因型的STEC菌株进行检测,结果显示该方法能够准确地分型检测stx1与stx2基因。最后,利用本实验建立的stx基因分型检测法对20株菌株进行stx基因的检测与分型,结果显示该方法可准确地检测出含有STEC标志性毒力基因stx的菌株并实现准确分型。该方法对于非产志贺毒素菌株呈现阴性检测结果。具有选择性高且快速、准确和安全的优点,结果判定便利、直观,可实现现场快速检测的目的,适合基层实验室使用。
杨卓[6]（2019）在《同时检测7种致病菌的多重串联式PCR技术的建立及应用》文中进行了进一步梳理奶制品因其含丰富的营养物质在全球范围内被人们所喜爱,然而它也是微生物繁殖的天堂,容易被细菌污染,从而引发诸多食品安全问题。检测奶制品中常见的食源性病菌,对于控制食源性疾病的爆发具有重要意义。传统的微生物检测方法主要是依靠培养基培养、生化血清鉴定、形态特征观察等,这些方法步骤繁琐,周期长,无法定量以及无法同时检测多种致病菌。为此,急需建立一种快速有效、通量高、且能准确定量的检测方法,以满足目前的发展趋势。本研究旨在建立一套能同时检测7种食源性致病菌,且能运用于不同实际样品的MT-PCR检测方法,同时通过人工染毒的方法模拟样品,评估该方法的实用性并运用于实际工厂采样的分析检测中。主要研究内容及结果如下:1.MT-PCR检测方法的建立选取阪崎肠杆菌的OmpA基因、单核细胞增生性李斯特菌ORF2819基因、大肠埃希菌的uidA基因、金黄色葡萄球菌的Nuc基因、鼠伤寒沙门氏菌STM4497基因、蜡样芽孢杆菌nheA基因、福氏志贺氏菌的RFC基因构建多重串联实时荧光定量PCR体系同时检测7种食源性致病菌;特异性实验及标准曲线表明,该方法具有良好的特异性及扩增效率。同时对该体系的关键点—第一轮循环数进行优化,并与普通荧光定量PCR结果比较发现,当第一轮循环数大于15时,扩增效果要优于普通荧光定量PCR,但考虑到循环数越多,非特异性扩增产物也随之增多,因此将最佳循环数定为15。在最佳循环数下,该方法能同时检测出10-3 ng/μL的金黄色葡萄球菌的DNA,10-4 ng/μL的单核细胞增生性李斯特菌,其余5种菌种的检测下限均达到10-5 ng/μL。2.MT-PCR检测能力的评估为了评估MT-PCR的样品检测能力,采取人工染毒的方法,将7种目标菌种的十倍系列稀释液同时人为加入到无菌水、无菌婴儿配方奶粉、瞬时高压灭菌牛奶中作为待测样品进行检测。结果表明,在无菌水中该方法能够检测出101 CFU/mL的7种目标菌种;在瞬时高压灭菌牛奶中可以检测出102 CFU/mL的7种目标菌种;在无菌婴儿配方奶粉中,单核细胞增生性李斯特菌和金黄色葡萄球菌能检测到102 CFU/g,其余菌种均能检测到103CFU/g。3.MT-PCR在运用在实际工厂检测中为了将该方法运用到实际检测中,本研究对广州某婴儿米粉工厂进行实地采样,用该方法对工厂样品进行检测分析,并与第二代测序结果及传统微生物检测分析进行比较。结果表明,该工厂存在易被忽略的污染点,例如鼓烘中的WPS风管中的残粉,该采样点微生物丰度高,难以拆卸清洗并且长时间累积残粉,是易爆发微生物污染的区域。通过比较三种检测方法得出,传统微生物检测方法仅能初步的判断出该采样点是高风险区域,无法明确定量检测出污染的细菌数量及种类,同时耗时长;第二代高通量检测技术通量高,检测出残粉、水样中的微生物种类及丰度,但无法具体定量微生物;而多重串联实时荧光定量PCR能够准确的判断出关键污染的微生物,同时能够对这些微生物进行定量,最终发现金黄色葡萄球菌仅存在于粉尘样品37号和P号中,菌落数分别为278 CFU/g、266 CFU/g;4号生产线地漏涂抹样4-2及水样4号、1号生产线地漏涂抹样6-2及水样6号、粉尘样品P号和37号均存在大肠埃希菌,菌落数分别为1.8×105 CFU/g、2.9×105 CFU/mL、3.7×104 CFU/g、4.6×105 CFU/mL、5.2×105CFU/g、4.4×104 CFU/g;除4号、37号样品外,4-2、6-2、6、P样品均存在福氏志贺氏菌,菌落数分别为432 CFU/g、912 CFU/g、623 CFU/mL、884 CFU/g。
王佩佩[7]（2018）在《家禽屠宰场微生物分布特征及大肠杆菌耐药性评估与ERIC-PCR分型研究》文中研究说明随着抗生素的滥用,作为危害严重食源性致病菌之一的大肠杆菌,其耐药性不断增强,多重耐药谱逐步变宽。肉鸡作为大肠杆菌传播的主要载体,在屠宰加工过程中容易通过食物链传到人体,探究家禽屠宰场加工生产链中大肠杆菌的污染状况,追踪大肠杆菌污染的主要环节显得尤为重要。本研究以浙江省某大型家禽屠宰场为采样点,检测空气沉降微生物的污染指标,评估屠宰场不同区域的微生物污染水平,以分离获得的大肠杆菌为主要研究对象,检测毒力基因并评估其耐药性,通过ERIC-PCR分型探究分离株的亲缘关系。（1）本实验取屠宰场厂房外部和内部空气沉降微生物,检测其污染指标,并通过16S rRNA V3-V4的Illumina高通量测序方法分析其菌群结构多样性。结果显示屠宰后八个车间的菌落总数、肠杆菌科、霉菌和酵母数量均有所增加,宰杀沥血间菌落总数达到最高达到1100 cfu/皿,浸烫脱羽间肠杆菌科数达到最高1500cfu/皿,宰杀沥血间霉菌、酵母数量分别最高达到175 cfu/皿、50cfu/皿。比较屠宰场厂房内外部的空气沉降细菌菌群结构,从门的水平上来看,屠宰场厂内和厂外优势门相同,均为厚壁菌门（Firmicute）、放线菌门（Actinobacteria）和变形菌门（Proteobacteria）。但从属的水平上屠宰场厂房外和屠宰场厂内优势属几乎都不相同,两者存在不同属类别的细菌污染。屠宰场厂房内空气中主要优势属葡萄球菌属（Staphylococcus）,埃希氏菌属（Escherichia）,假单胞菌属（Pseudomonas）,而屠宰场厂房外空气中主要优势属是芽孢杆菌属（Bacillus）,（Phycicoccus）,考克氏菌属（Kocuria）。（2）本实验取屠宰场的存在水体,以及用无菌纱布擦拭各区域的地面和器械表面采集微生物进行培养后,通过16S rRNA V3-V4的Illumina高通量测序方法分析其菌群结构多样性,并用PCR对细菌的9大类24种耐药基因进行检测。结果表明,屠宰场不同区域水体、地面和屠宰器械表面微生物均以变形菌门（Proteobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）和放线菌门（Actinobacteria）为主,其相对丰度分别为45.18%87.74%、0.09%33.46%、3.34%28.09%;优势菌属为不动杆菌属（Acinetobacter）、链球菌属（Streptococcus）、嗜冷杆菌属（Psychrobacter）、水栖菌属（Enhydrobacter）、皮生球菌属（Dermacoccus）、假单胞菌属（Pseudomonas）、黄杆菌属（Flavobacterium）、乳球菌属（Tetragenococcus）,金黄杆菌属（Chryseobacterium）和弓形杆菌属（Arcobacter）,约占总类群40%。各样品中共检测到21种耐药基因,其中sulⅠ、sulⅡ、qnrS、blaTEM和aadA1的检出率为100%,floR、tetA和ereA的检出率为88.9%以上。（3）本实验从收集的屠宰场空气沉降微生物、存在水体、地面、器械表面和冷鲜鸡共240个样品中分离大肠杆菌,检测大肠杆菌的毒力基因并评估其耐药性。结果显示在预冷间的预冷水、外界的干净屠宰用水、包装间和冷藏间的空气中未检出大肠杆菌,但在其他区域均有检测出大肠杆菌。大肠杆菌耐药基因检测结果表明,来源于冷鲜鸡表面ESBL型大肠杆菌检出率最高,对单环β内酰胺类的氨苄西林（62.0%）、磺胺类的复方新诺明（55.4%）耐药最明显,多重耐药菌株多达33株（35.9%）,最多耐7种类型的抗生素;除了青霉素类基因（mecC）和多粘菌素类基因（mcr-1）未检出,耐药基因pmrA（92.4%）、blaTEM（78.3%）和qnrS（53.3%）检出率较高。此外,毒力基因检测结果显示肠毒素性大肠杆菌（ETEC）毒力基因est检出率最高,高达31.5%。空气来源的大肠杆菌毒力基因检出率种类最多,检测出stx、est、elt和aggR这四种毒力基因。（4）本实验对分离获得的92株大肠杆菌进行ERIC-PCR分型分析,结果显示在以相似系数0.80的水平上,不同来源的家禽屠宰场大肠杆菌分离株可以分型为11种菌型（AH）,其中E型有32株,为优势菌型,来源包括鸡肛门拭子、挂禽间冷鲜鸡、净膛间挂钩纱布和预冷间空气等不同环节的样品,由此可见同一屠宰场的空气、水体、器械、地面和冷鲜鸡相互之间存在着大肠杆菌的交叉污染。
张瑾瑜[8]（2018）在《新疆牛源STEC的分离鉴定、血清型与毒力基因检测及药物敏感性分析》文中研究说明目的:研究新疆部分地区牛源STEC在牛粪便、胴体、饲料和饮水中的存在情况,揭示其在牛场各个环节中的分布规律,以及其流行病学特点;方法:1、2015年9月至2017年1月期间,分别从新疆伊犁、博乐、五家渠、昌吉和乌鲁木齐等地的9个牛场、1个活畜交易市场和1个牛屠宰加工厂采集牛肛拭子、粪便、胴体拭子、饲料和饮水样本,经EC肉汤增菌后,用常规方法结合PCR（16S r RNA）技术进行大肠杆菌的分离鉴定,再用PCR检测大肠杆菌分离株的Stx1、Stx2基因。2、对分离得到的牛源STEC菌株,用多重PCR法检测“the Big Six”血清型的菌株的所占比例。3、对分离得到的牛源STEC菌株,用PCR检测eae A和Hly毒力基因,采用K-B纸片法对17种兽医临床常用的抗革兰氏阴性杆菌药物进行敏感性检测;结果:1、从9个牛场、1个活畜交易市场和1个屠宰加工厂中共采集到1453份样本,其中STEC阳性样本为217份（14.9%,217/1453）;新疆伊犁、博乐、石河子、昌吉、五家渠及乌鲁木齐的STEC样本阳性率分别为9.9%、19.9%、4.0%、26.2%、43.0%、7.5%;春季（3月-5月）、夏季（6月-8月）、秋季（9月-11月）和冬季（12月～次年2月）的STEC样本阳性率分别为27.3%（147/538）、0.8%（2/247）、13.0%（49/376）和6.5%（19/292）;肛拭子、胴体拭子、粪便、饲料和饮水样本STEC阳性率分别为19.4%（190/978）、8.3%（4/48）、6.7%（16/239）、1.1%（1/94）和6.4%（6/94）;共分离到468株STEC菌株,其中132株携带Stx1,122株携带Stx2,214株同时携带Stx1和Stx2。2、400株牛源STEC中O26、O45、O103、O111、O121、O145和O157血清型的菌株的检出率分别为2.5%、0%、0%、1.0%、0%、1.0%和0.75%。3、7株分离自腹泻犊牛的STEC菌株中eae A基因的携带率为14.3%（1/7）,Hly基因携带率为100%;7株分离自腹泻犊牛的STEC菌株对麦迪霉素耐药性最高,耐药率达到了100%,而对头孢噻肟、头孢噻吩、头孢哌酮、头孢唑啉、头孢曲松、头孢他啶、头孢呋辛、头孢吡肟、头孢西叮、氨曲南、妥布霉素、氨苄西林、氧氟沙星、链霉素敏感性最高,均达到100%,其次是卡那霉素达到85.7%;结论:牛源STEC普遍存在于所检测的牛场、活畜交易市场和屠宰加工厂,肛拭子样本阳性率最高,而牛胴体被污染的情况较严重,春季是STEC的排菌高峰期;分离到的牛源STEC菌株同时携带Stx1和Stx2的菌株最多;在制定防控牛源STEC的措施时,要尽量避免牛粪便对胴体的污染,春季更要注意牛粪便的无害化处理。目前新疆部分地区存在国际较为流行的non-O157血清型的菌株,但检出率不高,O157血清型菌株亦是如此。分离自腹泻犊牛的7株目标菌均携带Hly毒力基因,推测其对人类有较强的潜在致病性,7株菌对兽医临床常用抗生素有耐药情况存在,但总体耐药水平不高。
丁浩[9]（2017）在《新疆部分地区牛源E.coli O157:H7的分离鉴定、毒力基因检测及药物敏感性试验》文中认为研究新疆部分地区健康牛群中E.coli O157:H7的分布情况,及分离菌株携带毒力基因的特点和对临床常用抗菌药的敏感性情况,并验证生产实践中免疫磁珠富集法对于牛源E.coli O157:H7分离结果的影响。1、从新疆伊犁、博乐、五家渠、昌吉和乌鲁木齐等地的10个牛场随机采集健康牛的肛拭子样本883份和胴体表面拭子48份,经EC肉汤增菌后,用免疫磁珠法富集,再用SMAC平板和MUG液体培养基进行筛选,最后用PCR和生化试验进行鉴定。2、对分离得到的牛源E.coli O157:H7菌株,用PCR法检测Stx1、Stx2、eaeA、Hly和Tccp等毒力基因,分析分离株毒力基因携带特点。3、对分离得到的牛源E.coli O157:H7菌株,采用K-B纸片法对17种兽医临床常用的抗革兰氏阴性杆菌药物进行敏感性检测。4、对从新疆伊犁、昌吉和五家渠采集的243份牛场源肛拭子、粪便、饲草料、饮水和胴体拭子样本,采用免疫磁珠法富集后和直接涂布SMAC平板的方法进行初步筛选,再进行后续E.coli O157:H7的分离鉴定,采用Fisher exact test statistic和McNemar’s Test进行统计学分析,评价生产实践中免疫磁珠富集法在牛源E.coli O157:H7分离过程中的作用。结果显示:1、从931份样本中共分离得到16株E.coli O157:H7,检出率1.72%,其中伊犁地区11株、乌鲁木齐5株,检出率分别为3.93%、1.48%,博乐、昌吉和五家渠的样本中均未检出;从883份肛拭子和48份胴体拭子样本中分别检出14株、2株E.coli O157:H7,检出率分别为1.59%、4.17%。2、16株牛源E.coli O157:H7分离株志贺毒素基因的携带率为81.3%,其中stx1、stx2及stx1和stx2携带率分别为12.5%、25.0%和43.7%。eaeA、Hly、Tccp基因携带率分别为100%、87.5%、75.0%。3、16株E.coli O157:H7分离株对妥布霉素敏感性最高,达到100%,其次是头孢西丁、头孢吡肟、氧氟沙星、氨曲南、头孢他啶达到93.8%;而对麦迪霉素耐药性最高,耐药率达到了100%;4、免疫磁珠法从243份样品中分离到8株E.coli O157:H7,而普通方法只检出了其中的4株,虽然统计学差异不显着（P≧0.05）,但在本试验中免疫磁珠法确实提高了E.coli O157:H7检出数。由以上结果可以得出结论:E.coli O157:H7存在于新疆部分地区健康牛群中,但分离率不高;牛胴体拭子中检出了E.coli O157:H7,且多数分离株同时携带多种毒力基因,推测其对人类有较强的潜在致病性;分离的16株菌对兽医临床常用抗生素有耐药情况存在,但总体耐药水平不高;虽然本实验中,免疫磁珠法和常规法相比差异不显着,但却明显增加了分离菌的数量,故依然推荐在开展E.coli O157:H7的病原检测时使用免疫磁珠富集法。
梁文娟[10]（2017）在《基于CRISPRs的大肠埃希菌分型方法及其与耐药和毒力关系》文中进行了进一步梳理致病大肠埃希菌引起人类或动物腹泻、出血性肠炎、溶血性尿毒综合症、血小板减少性紫癜、脑膜炎和败血症等疾病,甚至导致死亡,给公众健康带来严重危害。可移动元件的水平转移在高毒力、强耐药和新型大肠埃希菌形成过程中发挥重要作用。CRISPR/Cas系统,广泛存在于古细菌和细菌中,基于CRISPRs间隔序列的高度多态性,可作为细菌分子分型和进化的靶标;CRISPR/Cas系统参与古生菌和细菌的适应性免疫,可特异性抵抗噬菌体感染及质粒接合转移,从而限制外源遗传物质的水平基因转移。目的1分析不同致病类型大肠埃希菌CRISPR/Cas及其侧翼序列的结构特征,探讨CRISPRs间隔序列能否作为大肠埃希菌分子分型的靶标,评价分型效果。2建立大肠埃希菌CRISPRs的方法,根据CRISPRs型别预测血清型,评价其实际运用和预测血清型效果。3分析产志贺毒素大肠埃希菌（Shiga toxin-producing E.coli,STEC）的CRISPRs型别与分离时间、地点的关系,探讨CRISPRs型别在STEC菌株感染暴发时的流行病学意义。4探讨CRISPR/Cas与噬菌体、质粒及其介导的可获得毒力和耐药基因的关系,为大肠埃希菌CRISPR/Cas调控耐药和毒力的作用机制提供依据。方法1通过BLAST重复序列识别并获得203株全基因组测序大肠埃希菌CRISPRs,选取前后2000bp作为CRISPRs候选范围;通过CRISPRs finder和BLAST分析CRISPRs的重复序列和间隔序列,使用ClustalX对间隔序列、cas和侧翼序列进行比对,使用SeroTypeFinder和MLST获取菌株的血清型和ST型。2 PCR扩增并测349株大肠埃希菌CRISPRs,CRISPRs finder和BLAST分析大肠埃希菌CRISPRs型别,用血清抗体鉴定菌株血清型。3分析记录GenBank中705株鸟枪法测序STEC菌株的分离时间和地点,使用SeroTypeFinder和CRISPRs finder获取血清型和CRISPRs型别。4利用PHAST获取203株全基因组测序大肠埃希菌噬菌体,通过GenBank获取其质粒信息,通过VirulenceFinder和ResFinder获取染色体和质粒上的可获得的毒力和耐药基因信息。卡方检验分析CRISPR/Cas与质粒和可获得耐药基因的分布;Pearson相关分析CRISPR/Cas与噬菌体和可获得毒力基因的关系。结果1 CRISPR/Cas在大肠埃希菌中的分布全基因测序203株大肠埃希菌中,73.4%含有I-E CRISPR/Cas,其中,1株O177:H21菌株仅有cas2和cas1,菌株1303仅有cas2和cas3,12株完全没有cas;8.4%含有I-F CRISPR/Cas,均含有完整cas;B7A和Co6114菌株同时存在I-E和I-F CRISPR/Cas;17.2%仅有CRISPR3-4（无CRISPR/Cas）。在cas或者CRISPR2中间发现插入序列IS4,IS66和IS30。I-F CRISPR/Cas和无CRISPR/Cas的大肠埃希菌均属于B2种系。2基于CRISPR1上游序列鉴定大肠埃希菌和志贺菌在大肠埃希菌和志贺菌CRISPR1上游侧翼序列有99%一致性,且有种属特异性,PCR扩增此区域鉴定大肠埃希菌和志贺菌的灵敏度和特异度均大于91%。3建立基于CRISPRs大肠埃希菌分型方法CRISPR1,CRISPR2,CRISPR3,CRISPR4和CRISPR3-4的间隔序列数目的范围分别是1-25,1-27,4-7,2-22和1-2;独特间隔序列数目分别是339,346,57,66和6,且出现1-72次不等。将I-E CRISPR/Cas,I-F CRISPR/Cas和仅有CRISPR3-4分别命名CT I型,CT II型和CT III型。根据CRISPRs中间隔序列数目、构成和排列顺序进行分型。203株大肠埃希菌被分为79个CT型别（CT I型64个,CT II型9个和CT III型6个）;76个血清型和66个ST型。CRISPRs型别能将相同血清（ST）型STEC菌株分成2类,将O157:H7（ST11）,O104:H4（ST678）和O26:H11（ST21）分别分成CT I 4和CT I 5,CT I 11和CT I 12,CT I 15和CT I 16。扩增实验室菌株的CRISPR1,CRISPR2,CRISPR3,CRISPR4和CRISPR3-4,检出率分别是81.1%,94.5%,1.4%,1.4%和4.6%;根据CRISPRs间隔序列分布预测O157:H7准确率是95.0%。4建立CRISPRs STEC菌株的分型方法705株（含13种血清型）STEC菌株中,O157:H7,O26:H11,O111:H8菌株构成比占前三位,分别是44.0%,16.3%,9.8%;时间分布显示STEC菌株于2010年和2011年呈现一个高峰;地区分布显示分离株最多是美国,其次是荷兰,分别占50.9%和7.2%。根据CRISPRs间隔序列可将相同血清型STEC菌株分为不同亚型。O157:H7的A型、O104:H4的B型和O111:H8的A型分别占其菌株的89.0%,87.9%和91.3%;O145:H28的A型和B型分布欧洲,北美主要是C型,D型,E型和G型;O26:H11的H型在欧洲,Z型在美国,而B型和C型在北美和欧洲均有;O69:H11的A型和B型均分离于美国,C型分离于荷兰;O118:H16的C型均来源于美国;O45:H2的A型在北美,B型在中国。5 CRISPR/Cas与噬菌体、质粒和可获得的毒力、耐药基因的关系全基因测序203株大肠埃希菌中,99.5%（202/203）的大肠埃希菌的染色体中含有噬菌体,数目为1-22个;相关分析显示I-E CRISPR/Cas的间隔序列数目与噬菌体数目呈负相关线性关系（r=-0.450,P<0.001）。56.2%（114/203）大肠埃希菌含质粒,含I-E CRISPR/Cas和无CRISPR/Cas的两组细菌的质粒分布有统计学差异（χ2=6.583,P=0.010）。53株大肠埃希菌含耐药质粒,无CRISPR/Cas和I-E CRISPR/Cas的两组细菌的耐药质粒分布有统计学差异（χ2=19.756,P<0.001）,无CRISPR/Cas和I-F CRISPR/Cas的两组细菌的耐药质粒分布有统计学差异（P=0.017,Fisher’s精确检验）。99.5%的大肠埃希菌的染色体中含有可获得毒力基因,数目为2-28个;相关分析显示I-E CRISPR/Cas间隔序列数目与染色体上可获得毒力基因数目呈负相关线性关系（r=-0.623,P<0.001）。30.01%（61/203）大肠埃希菌的染色体中含有可获得的耐药基因,数目1-21个;含I-E CRISPR/Cas和I-F CRISPR/Cas两组细菌的耐药基因分布有统计学差异（χ2=9.206,P=0.002）。结论1大肠埃希菌CRISPR/Cas广泛分布,部分菌株存在cas缺失和IS序列。2 CRISPR1上游序列可用来鉴定大肠埃希菌和志贺菌。3建立CRISPRs大肠埃希菌分型方法,具有很好的效果。4 CRISPRs对相同血清型STEC菌株分型,在一定的程度上可识别高毒株型别和追溯菌株的分离地区。5 I-E CRISPR/Cas与噬菌体和毒力基因有关;I-F CRISPR/Cas可能能阻止其染色体获得耐药基因;无CRISPR/Cas大肠埃希菌更易存在质粒,且多为耐药质粒。
二、大肠埃希菌O157∶H7特异基因检测与毒力基因分析（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、大肠埃希菌O157∶H7特异基因检测与毒力基因分析（论文提纲范文）
（1）河北地区鸡源致病性大肠杆菌分离鉴定及耐药性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 致病性大肠杆菌研究进展 |
| 1.2 大肠杆菌耐药性研究进展 |
| 1.3 目的与意义 |
| 1.4 技术路线图 |
| 第2章 鸡源大肠杆菌分离鉴定 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 鸡源大肠杆菌致病性及毒力基因分析 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 方法 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第4章 鸡源致病性大肠杆菌耐药性及耐药基因检测 |
| 4.1 材料 |
| 4.2 方法 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第5章 鸡源致病性大肠杆菌分子分型及系统发育群分布 |
| 5.1 材料 |
| 5.2 方法 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 结论与创新点 |
| 主要结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表论文和参加科研情况 |
| 攻读学位期间发表论文 |
| 攻读硕士期间参加的科研项目 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（2）新生犊牛肺源致病性大肠杆菌的分离鉴定及耐药性分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 引言 |
| 1.1 大肠杆菌的生物学特性 |
| 1.1.1 大肠杆菌的培养特性 |
| 1.1.2 大肠杆菌的生化特性 |
| 1.2 肠外致病性大肠杆菌的研究现状 |
| 1.2.1 肠外致病性大肠杆菌流行情况 |
| 1.3 流行病学特点 |
| 1.4 肠外致病性大肠杆菌与犊牛肺炎 |
| 1.5 诊断方法 |
| 1.5.1 实验室诊断 |
| 1.5.2 微生物检查法 |
| 1.5.3 分子生物学检测 |
| 1.6 预防措施 |
| 1.7 ExPEC毒力基因 |
| 1.7.1 黏附素 |
| 1.7.2 毒素(α溶血素) |
| 1.7.3 细胞黏附特异性基因 |
| 1.7.4 铁摄取系统 |
| 1.7.5 侵袭力基因 |
| 1.7.6 毒力岛 |
| 1.8 大肠杆菌耐药性 |
| 1.8.1 耐药大肠杆菌的危害 |
| 1.8.2 大肠杆菌耐药基因 |
| 1.9 研究目的及意义 |
| 第2章 新生犊牛肠外致病性大肠杆菌的分离鉴定 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 样品来源 |
| 2.1.2 仪器设备 |
| 2.1.3 试剂 |
| 2.1.4 主要试剂的配置 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 病理学观察 |
| 2.2.2 菌体形态学鉴定 |
| 2.2.3 菌体生化鉴定 |
| 2.2.4 分子生物学鉴定 |
| 2.3 试验结果 |
| 2.3.1 器官病理学观察 |
| 2.3.2 菌体培养及形态学鉴定 |
| 2.3.3 菌株生化鉴定 |
| 2.3.4 16SrRNA的鉴定结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 新生犊牛肠外致病性大肠杆菌的毒力基因检测 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 菌株样品 |
| 3.1.2 试验动物 |
| 3.1.3 仪器设备 |
| 3.1.4 主要试剂 |
| 3.1.5 毒力基因PCR扩增引物的设计与合成 |
| 3.1.6 PCR产物琼脂糖凝胶的配制 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 毒力基因PCR扩增 |
| 3.2.2 小鼠攻毒试验 |
| 3.3 试验结果 |
| 3.3.1 毒力基因检测结果 |
| 3.3.2 小鼠致病性试验结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第4章 肠外致病性大肠杆菌药物敏感试验及耐药基因检测 |
| 4.1 试验材料 |
| 4.1.1 菌种 |
| 4.1.2 实验试剂 |
| 4.1.3 实验仪器 |
| 4.1.4 药敏片 |
| 4.1.5 PCR扩增引物 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 药物敏感性试验 |
| 4.2.2 耐药基因PCR检测 |
| 4.3 试验结果 |
| 4.3.1 药敏试验结果 |
| 4.3.2 耐药基因PCR检测结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第5章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 附录 1 |
（3）新疆牛源非O157产志贺毒素大肠埃希菌的O-血清群、毒力因子与耐药性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 产志贺毒素大肠埃希菌的O-血清群 |
| 1.2 产志贺毒素大肠埃希菌的毒力因子 |
| 1.3 移动遗传元件 |
| 1.4 产志贺毒素大肠埃希菌基因组学的研究进展 |
| 1.5 研究目的和意义 |
| 第2章 新疆地区牛源非O157 STEC O-血清群分型 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 新疆地区牛源非O157 STEC毒力因子分析 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 牛源非O157 STEC耐药基因和毒力基因发生共转移 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第5章 非O157 STEC高通量测序 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 第6章 结论 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 谢辞 |
| 作者简介 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
| 攻读硕士学位期间获得的奖励证书 |
（4）7种血清型STEC多重荧光定量PCR检测方法的建立及其应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第一章 产志贺氏毒素大肠杆菌研究进展 |
| 引言 |
| 1. STEC的流行特性 |
| 1.1 STEC病原学 |
| 1.2 STEC流行病学 |
| 2. STEC毒力基因 |
| 2.1 LEE毒力岛和eae基因 |
| 2.2 志贺氏毒素(Stx) |
| 2.3 hly |
| 3. STEC检测方法研究进展 |
| 3.1 传统检测法 |
| 3.2 免疫磁珠富集法 |
| 3.3 免疫学检测法 |
| 3.4 分子生物学检测法 |
| 4. 本研究的目的与意义 |
| 第二章 7种血清型STEC多重荧光定量PCR检测方法的建立 |
| 1. 材料 |
| 1.1 菌株 |
| 1.2 主要培养基与试剂 |
| 1.3 主要仪器、探针和引物 |
| 2. 方法 |
| 2.1 模板制备 |
| 2.2 PCR扩增体系 |
| 2.3 7种STEC菌株血清型验证 |
| 2.4 灵敏度检测 |
| 2.5 特异性检测 |
| 2.6 重复性检测 |
| 2.7 方法验证 |
| 3. 结果 |
| 3.1 菌株血清型验证结果 |
| 3.2 多重cPCR结果 |
| 3.3 单重qPCR结果 |
| 3.4 多重mqPCR结果 |
| 3.5 多重mqPCR特异性分析结果 |
| 3.6 多重mqPCR灵敏性分析结果 |
| 3.7 多重mqPCR重复性分析结果 |
| 3.8 方法验证结果 |
| 4. 讨论 |
| 第三章 江苏省部分地区奶牛场粪便样品中7种血清型STEC菌株的检测 |
| 1. 材料 |
| 1.1 样品采集 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2. 方法 |
| 2.1 DNA模板制备 |
| 2.2 多重荧光定量PCR检测 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 全文总结 |
| 后续研究计划 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间参与发表的学术论文 |
| 致谢 |
（5）产志贺毒素大肠埃希氏菌标志性毒力基因stx快速检测与分型法的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语 |
| 1 绪论 |
| 1.1 产志贺毒素大肠埃希氏菌简介 |
| 1.1.1 产志贺毒素大肠埃希氏菌不同的血清型及其危害 |
| 1.1.2 产志贺毒素大肠埃希氏菌宿主 |
| 1.1.3 产志贺毒素大肠埃希氏菌传播途径 |
| 1.2 产志贺毒素大肠埃希氏菌致病机制 |
| 1.2.1 志贺毒素 |
| 1.2.2 LEE毒力岛 |
| 1.2.3 pO157大质粒 |
| 1.3 产志贺毒素大肠埃希氏菌检测方法 |
| 1.3.1 平板培养法 |
| 1.3.2 免疫学检测法 |
| 1.3.3 分子生物学法 |
| 1.3.4 产志贺毒素大肠埃希氏菌检测方法比较 |
| 1.4 不对称PCR技术简介与应用 |
| 1.5 研究目的和意义 |
| 2 不对称PCR结合免疫层析法快速检测产志贺毒素大肠埃希氏菌stx基因 |
| 2.1 实验材料与试剂 |
| 2.1.1 菌株 |
| 2.1.2 培养基 |
| 2.1.3 主要药品和试剂 |
| 2.1.4 实验仪器 |
| 2.1.5 试剂及其配制 |
| 2.1.6 实验设计的引物 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 产志贺毒素大肠埃希氏菌的培养 |
| 2.2.2 产志贺毒素大肠埃希氏菌基因组提取 |
| 2.2.3 免疫层析试纸条的制备 |
| 2.2.4 聚苯乙烯微球的活化与标记 |
| 2.2.5 不对称PCR体系的建立 |
| 2.2.6 免疫层析实验 |
| 2.2.7 免疫层析试纸条检测stx基因 |
| 2.2.8 特异性实验 |
| 2.2.9 数据处理 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 不对称PCR上、下游引物添加比例的优化 |
| 2.3.2 不对称PCR循环次数的优化 |
| 2.3.3 不对称PCR退火温度的优化 |
| 2.3.4 不对称PCR引物加入量的优化 |
| 2.3.5 不同封闭剂对检测结果的影响 |
| 2.3.6 BSA的添加量对检测结果的影响 |
| 2.3.7 免疫层析试纸条检测stx基因 |
| 2.3.8 特异性实验 |
| 2.4 本章小结 |
| 3 双重不对称PCR结合免疫层析法快速分型产志贺毒素大肠埃希氏菌stx基因 |
| 3.1 实验材料与试剂 |
| 3.1.1 菌株 |
| 3.1.2 培养基 |
| 3.1.3 主要药品和试剂 |
| 3.1.4 实验仪器 |
| 3.1.5 试剂及其配制 |
| 3.1.6 实验设计的引物 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 产志贺毒素大肠埃希氏菌的培养 |
| 3.2.2 产志贺毒素大肠埃希氏菌基因组提取 |
| 3.2.3 免疫层析试纸条的制备 |
| 3.2.4 聚苯乙烯微球的标记 |
| 3.2.5 双重不对称PCR体系的建立 |
| 3.2.6 免疫层析实验 |
| 3.2.7 免疫层析试纸条分型stx基因 |
| 3.2.8 特异性实验 |
| 3.2.9 数据处理 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 双重不对称PCR上、下游引物添加比例的优化 |
| 3.3.2 双重不对称PCR循环次数的优化 |
| 3.3.3 双重不对称PCR退火温度的优化 |
| 3.3.4 双重不对称PCR引物加入量的优化 |
| 3.3.5 不同封闭剂对分型结果的影响 |
| 3.3.6 Seablock的添加量对分型结果的影响 |
| 3.3.7 聚苯乙烯微球标记方式对分型结果的影响 |
| 3.3.8 聚苯乙烯微球上样量对分型结果的影响 |
| 3.3.9 免疫层析试纸条分型stx基因 |
| 3.3.10 特异性实验 |
| 3.4 本章小结 |
| 4 结论与展望 |
| 4.1 结论 |
| 4.2 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 在读期间公开发表论文(着)及科研情况 |
| 已发表的论文 |
| 参与的科研项目 |
（6）同时检测7种致病菌的多重串联式PCR技术的建立及应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 常见的食源性病原微生物及其危害 |
| 1.1.1 阪崎肠杆菌 |
| 1.1.2 沙门氏菌 |
| 1.1.3 大肠埃希菌 |
| 1.1.4 志贺氏菌 |
| 1.1.5 蜡样芽孢杆菌 |
| 1.1.6 单核细胞增生性李斯特菌 |
| 1.1.7 金黄色葡萄球菌 |
| 1.2 食源性病原微生物检测技术的研究现状及进展 |
| 1.2.1 传统检测方法 |
| 1.2.2 免疫学方法 |
| 1.2.3 分子生物学方法 |
| 1.3 多重串联式实时荧光定量PCR |
| 1.4 研究背景和意义 |
| 1.5 研究内容与目的 |
| 1.5.1 研究目的 |
| 1.5.2 研究内容 |
| 第二章 多重串联式实时荧光定量PCR检测方法的建立 |
| 2.1 实验材料与设备 |
| 2.1.1 材料与试剂 |
| 2.1.2 主要仪器与设备 |
| 2.1.3 主要试剂的配制 |
| 2.1.4 实验菌株 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细菌基因组DNA的提取 |
| 2.2.2 外引物的设计与合成 |
| 2.2.3 内引物的设计与合成 |
| 2.2.4 第一轮多重PCR的构建 |
| 2.2.5 第二轮qPCR的构建 |
| 2.2.6 第一轮循环数的优化 |
| 2.2.7 MT-PCR特异性检验 |
| 2.2.8 MT-PCR标准曲线的制作及灵敏度检验 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 内外引物目的片段的扩增检验 |
| 2.3.2 MT-PCR的构建 |
| 2.3.3 MT-PCR的优化 |
| 2.3.4 MT-PCR标准曲线的制作 |
| 2.3.5 MT-PCR的特异性检验 |
| 2.3.6 MT-PCR的灵敏度检验 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 MT-PCR方法检测能力的评估 |
| 3.1 材料与设备 |
| 3.1.1 试验材料与试剂 |
| 3.1.2 主要仪器与设备 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 人工染毒 |
| 3.2.2 样品基因组DNA的提取 |
| 3.2.3 MT-PCR检验 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 MT-PCR在人工染毒的婴儿配方奶粉中的检测能力 |
| 3.3.2 MT-PCR在人工染毒的UHT牛奶中的检测能力 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 MT-PCR运用在工厂检测中 |
| 4.1 材料与设备 |
| 4.1.1 试验材料与试剂 |
| 4.1.2 主要仪器与设备 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 样品的采集 |
| 4.2.2 样品地点 |
| 4.2.3 样品处理 |
| 4.2.4 MT-PCR检测分析 |
| 4.2.5 16 S高通量测序 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 样品处理 |
| 4.3.2 MT-PCR检验 |
| 4.3.3 16 S高通量测序结果 |
| 4.3.4 16 S高通量测序与MT-PCR的对比分析 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 创新点 |
| 5.3 展望 |
| 参考文献 |
| 在校期间发表论文 |
| 致谢 |
（7）家禽屠宰场微生物分布特征及大肠杆菌耐药性评估与ERIC-PCR分型研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 冷鲜鸡概述 |
| 1.1.1 冷鲜鸡定义 |
| 1.1.2 冷鲜鸡屠宰加工中微生物的污染 |
| 1.2 大肠杆菌概述 |
| 1.2.1 大肠杆菌的生长培养特性及生化特点 |
| 1.2.2 致病性大肠杆菌 |
| 1.3 大肠杆菌耐药性的相关研究 |
| 1.4 禽大肠杆菌毒力因子 |
| 1.5 大肠杆菌鉴定方法 |
| 1.5.1 传统鉴定方法 |
| 1.5.2 新型鉴定方法 |
| 1.6 细菌分型技术的研究进展 |
| 1.6.1 表型分型法 |
| 1.6.2 分子分型法 |
| 1.7 高通量测序技术 |
| 1.7.1 第二代测序技术 |
| 1.7.2 单分子测序技术 |
| 1.7.3 高通量测序技术的优点 |
| 1.7.4 高通量测序技术的应用 |
| 1.8 研究目的与意义 |
| 1.9 研究内容与技术路线 |
| 1.9.1 研究内容 |
| 1.9.2 技术路线 |
| 2 家禽定点屠宰场空气微生物分布结构特征 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验仪器和试剂 |
| 2.1.2 样本的采集 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 屠宰场空气菌落总数污染情况 |
| 2.2.2 屠宰场空气肠杆菌科污染情况 |
| 2.2.3 屠宰场空气沉降真菌污染情况检测 |
| 2.2.4 屠宰场空气沉降细菌菌群结构 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 屠宰前后屠宰场空气中菌落总数变化对比 |
| 2.3.2 屠宰前后屠宰场空气中肠杆菌科数量变化对比 |
| 2.3.3 屠宰前后屠宰场空气中霉菌和酵母数量变化对比 |
| 2.3.4 屠宰前后屠宰场空气沉降菌群结构变化对比 |
| 3 家禽屠宰场环境和屠宰器械表面微生物菌群结构和耐药基因分析 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验仪器和试剂 |
| 3.1.2 样品来源 |
| 3.1.3 样品处理和细菌基因组DNA提取 |
| 3.1.4 耐药基因的PCR扩增 |
| 3.1.5 高通量测序及数据分析 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 样品微生物物种丰富度及多样性 |
| 3.2.2 屠宰区域水体、地面和屠宰器械表面细菌菌群结构 |
| 3.2.3 样品的聚类与主坐标分析 |
| 3.2.4 屠宰区域水体、地面和屠宰器械表面微生物样品的耐药基因检测结果 |
| 3.3 讨论 |
| 4 大肠杆菌的分离和耐药性检测 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验仪器和试剂 |
| 4.1.2 样品来源 |
| 4.1.3 大肠杆菌的分离 |
| 4.1.4 大肠杆菌的鉴定 |
| 4.1.5 分离大肠杆菌的耐药表型测定 |
| 4.1.6 分离大肠杆菌的耐药基因测定 |
| 4.1.7 分离大肠杆菌的毒力基因PCR检测 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 不同来源的大肠杆菌分离情况 |
| 4.2.2 分离大肠杆菌的耐药表型检测情况 |
| 4.2.3 分离大肠杆菌的多重耐药性检测情况 |
| 4.2.4 分离大肠杆菌的毒力基因检测情况 |
| 4.2.5 分离大肠杆菌的耐药基因检测情况 |
| 4.3 讨论 |
| 5 大肠杆菌ERIC-PCR分型 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 材料与试剂 |
| 5.1.2 仪器与设备 |
| 5.2 ERIC-PCR基因型鉴定 |
| 5.2.1 引物的选择 |
| 5.2.2 ERIC-PCR反应 |
| 5.2.3 ERIC-PCR分型及指纹图谱分析 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 ERIC-PCR指纹图谱 |
| 5.3.2 不同来源大肠杆菌分离株的ERIC-PCR分型 |
| 5.3.3 屠宰场空气来源大肠杆菌分离株的ERIC-PCR分型 |
| 5.3.4 屠宰场水体、地面和器械来源大肠杆菌分离株的ERIC-PCR分型.. |
| 5.3.5 屠宰场冷鲜鸡来源大肠杆菌分离株的ERIC-PCR分型 |
| 5.4 讨论 |
| 6 结论、创新点和展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 创新点 |
| 6.3 展望 |
| 参考文献 |
| 作者简历 |
（8）新疆牛源STEC的分离鉴定、血清型与毒力基因检测及药物敏感性分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 STEC的病原学 |
| 1.2 STEC的流行病学 |
| 1.3 STEC的宿主与传播途径 |
| 1.4 STEC的分布规律研究现状 |
| 1.5 STEC的毒力基因及致病机制 |
| 1.6 STEC的耐药现状 |
| 1.7 研究的目的和意义 |
| 第2章 新疆部分地区牛源STEC分离鉴定 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 新疆部分地区牛源STEC分离株血清型的多重PCR鉴定 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 腹泻犊牛STEC分离株毒力基因检测及药物敏感性试验 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第5章 结论 |
| 参考文献 |
| 谢辞 |
| 作者简介 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
（9）新疆部分地区牛源E.coli O157:H7的分离鉴定、毒力基因检测及药物敏感性试验（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩写词表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 E.coli O157:H7的概况 |
| 1.2 E.coli O157:H7毒力基因及致病机制 |
| 1.3 E.coli O157:H7耐药现状 |
| 1.4 E.coli O157:H7的检测技术 |
| 1.5 研究目的和意义 |
| 第2章 新疆部分地区牛源E.coli O157:H7分离鉴定 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 牛源E.coli O157:H7分离株毒力基因携带特点分析 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 牛源E.coli O157:H7分离株药物敏感性试验 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第5章 免疫磁珠富集法对牛源E.coli O157:H7分离鉴定的影响 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 第6章 结论 |
| 参考文献 |
| 谢辞 |
| 作者简介 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
（10）基于CRISPRs的大肠埃希菌分型方法及其与耐药和毒力关系（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 引言 |
| 第一部分 建立CRISPRs的大肠埃希菌分型方法 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 建立大肠埃希菌CRISPR/Cas位置的新描述方法 |
| 3.2 大肠埃希菌CRISPR/Cas的结构特征 |
| 3.3 大肠埃希菌CRISPR/Cas的分布及与种系关系 |
| 3.4 大肠埃希菌CRISPRs的侧翼序列比对 |
| 3.5 基于CRISPR1上游侧翼序列对大肠埃希菌和志贺菌鉴定 |
| 3.6 大肠埃希菌CRISPRs的分析 |
| 3.7 建立CRISPRs的大肠埃希菌分型方法 |
| 3.8 评价CRISPRs对大肠埃希菌的分型效果 |
| 3.9 实验验证CRISPRs的大肠埃希菌分型效果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 大肠埃希菌CRISPR/Cas分布情况 |
| 4.2 基于CRISPRs侧翼序列的分析 |
| 4.3 基于CRISPRs的大肠埃希菌分型 |
| 5 小结 |
| 第二部分 CRISPRs分型方法在产志贺毒素大肠埃希菌中应用 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 STEC菌株的分布 |
| 3.2 基于CRISPRs的STEC分型 |
| 4 讨论 |
| 4.1 STEC菌株的流行分布 |
| 4.2 基于CRISPRs的STEC型别与流行分布的关系 |
| 5 小结 |
| 第三部分 大肠埃希菌CRISPR/Cas与可移动元件介导毒力和耐药的关系 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 统计学方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 CRISPR/Cas的分布与噬菌体的关系 |
| 3.2 CRISPR/Cas的分布与质粒的关系 |
| 3.3 CRISPR /Cas与染色体上可获得的毒力和耐药基因的关系 |
| 4 讨论 |
| 4.1 CRISPR/Cas系统与噬菌体的关系 |
| 4.2 CRISPR/Cas系统与质粒的关系 |
| 4.3 CRISPR/Cas系统与染色体上可获得毒力和耐药基因的关系 |
| 5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 大肠埃希菌CRISPR/Cas系统的结构特征及功能研究进展 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
| 附录 |
四、大肠埃希菌O157∶H7特异基因检测与毒力基因分析（论文参考文献）
- [1]河北地区鸡源致病性大肠杆菌分离鉴定及耐药性研究[D]. 张立伟. 河北工程大学, 2021(08)
- [2]新生犊牛肺源致病性大肠杆菌的分离鉴定及耐药性分析[D]. 伍麦尔·麦海提. 塔里木大学, 2021(08)
- [3]新疆牛源非O157产志贺毒素大肠埃希菌的O-血清群、毒力因子与耐药性研究[D]. 张凌. 新疆农业大学, 2021
- [4]7种血清型STEC多重荧光定量PCR检测方法的建立及其应用[D]. 纪凯丽. 扬州大学, 2020(01)
- [5]产志贺毒素大肠埃希氏菌标志性毒力基因stx快速检测与分型法的建立[D]. 黄昭鸿. 江西师范大学, 2020(12)
- [6]同时检测7种致病菌的多重串联式PCR技术的建立及应用[D]. 杨卓. 暨南大学, 2019(02)
- [7]家禽屠宰场微生物分布特征及大肠杆菌耐药性评估与ERIC-PCR分型研究[D]. 王佩佩. 中国计量大学, 2018(02)
- [8]新疆牛源STEC的分离鉴定、血清型与毒力基因检测及药物敏感性分析[D]. 张瑾瑜. 新疆农业大学, 2018(05)
- [9]新疆部分地区牛源E.coli O157:H7的分离鉴定、毒力基因检测及药物敏感性试验[D]. 丁浩. 新疆农业大学, 2017(02)
- [10]基于CRISPRs的大肠埃希菌分型方法及其与耐药和毒力关系[D]. 梁文娟. 郑州大学, 2017(05)