一、ATP敏感性钾通道与心肌低氧损伤（论文文献综述）
段晨阳[1]（2020）在《Drp1在急性缺血缺氧损伤致线粒体质量失衡中的作用及机制研究》文中研究指明线粒体作为细胞有氧呼吸的主要场所,是缺血缺氧后较早发生损害的细胞器之一。以往针对线粒体的治疗措施主要以抗氧化应激、抗凋亡等线粒体功能障碍发生后的效应为靶点,缺乏针对线粒体质量调控过程中关键环节的防治措施,治疗效果有限。近年研究表明,线粒体质量失衡如线粒体过度分裂、融合受损、自噬和代谢紊乱等关键环节异常与缺血缺氧损伤后多器官功能障碍和机体物质能量代谢紊乱的发生密切相关。Drp1作为经典线粒体动力蛋白,主要影响了线粒体质量调节中的线粒体分裂过程。以往研究认为Drp1只有在内质网和线粒体接触（ER-Mito接触）引起线粒体预收缩后才会被招募到线粒体上参与线粒体分裂过程,但招募机制还有待深入研究。并且正常情况下转位到线粒体上参与线粒体分裂的Drp1仅占总Drp1含量的6%,还有大量Drp1存在于胞浆中。那么大量存在的细胞质Drp1具有哪些功能?在被招募到线粒体之前是否已经开始参与线粒体分裂过程?对于ER-Mito接触形成及线粒体预收缩是否有调控作用?对除了线粒体分裂的其他线粒体质量调控环节比如线粒体自噬、线粒体代谢等是否也有影响呢?此外,目前研究认为Drp1被招募到线粒体上后主要是通过其GTPase活性切割线粒体膜介导分裂的,但是Drp1介导线粒体分裂结束后下一步如何发展一直是困扰大家的问题。近年来在多种疾病模型中发现Drp1参与了线粒体和细胞功能调节,但具体调控机制尚不清楚。有研究表明,线粒体mPTP通道过度开放是线粒体膜电位改变、细胞坏死等发生的先决条件,而ROS大量堆积可能是引起上述线粒体和细胞功能障碍的重要诱因。那么缺血缺氧后线粒体Drp1除了介导线粒体分裂外,是否对线粒体外膜mPTP通道开放和ROS的产生及清除也有影响?为此,本研究利用整体失血性休克和细胞糖氧剥夺方法复制急性缺血缺氧损伤模型。首先我们了解了缺血缺氧损伤后多组织器官线粒体质量失衡的特征规律。其次我们探究了Drp1在急性缺血缺氧损伤致线粒体质量失衡中的作用及调控机制,重点研究了细胞质Drp1介导ER-Mito接触对线粒体预收缩的启动机制以及线粒体Drp 1对mPTP和ROS等线粒体功能的调控机制。最后,我们观察了使用Drp 1抑制剂Mdivi-1或者Drp 1敲除干预等措施对缺血缺氧损伤后多器官功能的保护作用,为从维持线粒体质量平衡角度调整急性缺血缺氧损伤临床救治方案提供了新思路和新靶点。[研究内容]第一部分:急性缺血缺氧损伤后多组织器官线粒体质量失衡的特征规律研究利用失血性休克SD大鼠模型和糖氧剥夺细胞模型,观察缺血缺氧不同时相点（0.5h、1h、2h、3h、4h）血管组织、肠组织、心肌组织及其对应细胞线粒体形态和数量变化以及ATP产生、ROS含量、线粒体膜电位等线粒体功能变化,以了解急性缺血缺氧损伤多组织器官线粒体质量失衡的特征规律。第二部分:Drp1在急性缺血缺氧损伤致线粒体质量失衡中作用及调控机制研究1.急性缺血缺氧损伤后线粒体动力蛋白Drp1表达、分布及修饰变化利用失血性休克SD大鼠模型和糖氧剥夺血管平滑肌细胞（VSMC）模型,观察缺血缺氧不同时相点线粒体动力蛋白表达、分布情况;观察缺血损伤后血管和肠组织Drp1修饰变化。2.Drp1在缺血缺氧损伤后线粒体形态和数量变化中作用及对ER-Mito接触的调控机制（1）Drp1介导线粒体分裂对线粒体形态和数量变化的调控作用利用Drp1干扰/过表达腺病毒转染的VSMC细胞,观察干预线粒体Drp1对正常情况下和缺氧后线粒体形态和数量变化的影响,以明确Drp1介导线粒体分裂对线粒体形态和数量变化的调控作用。（2）细胞质Drp1介导ER-Mito接触对线粒体预收缩的启动机制利用失血性休克SD大鼠和Drp1敲除小鼠（Drp1+/-）模型、糖氧剥夺VSMC细胞模型,观察缺血缺氧不同时相点ER-Mito接触情况;观察干预细胞质Drp1对ER-Mito接触和线粒体预收缩的影响;观察干预Drp1-Shroom4复合体对肌动蛋白束化、ER-Mito接触以及线粒体预收缩的影响,以阐明细胞质Drp1通过Shroom4束化肌动蛋白启动ER-Mito接触形成的机制。（3）细胞质Drp1加速线粒体转位的发生机制利用失血性休克SD大鼠模型和糖氧剥夺VSMC细胞模型,观察缺血不同时相点Calnexin、Fundc1表达及分布情况;观察干预内质网蛋白Calnexin对缺氧早期Drp1和Fundc1的线粒体转位、线粒体预收缩和线粒体分裂的影响,以了解细胞质Drp1在ER-Mito接触位点Calnexin-Fundc1环的招募作用下加速线粒体转位的发生机制。（4）Drp1介导线粒体自噬对破损线粒体的清除机制利用失血性休克Drp1敲除小鼠（Drp1+/-）模型和糖氧剥夺Drp1干扰腺病毒转染的VSMC细胞模型,基因组学分析生理和缺血损伤情况下Drp1可能参与的调控通路;观察干预Drp1对缺血缺氧后线粒体自噬小体和自噬溶酶体形成的影响;观察干预Drp1对自噬相关蛋白表达及分布的影响,以阐明Drp1通过Clec16a-Parkin途径介导线粒体自噬的机制。3.Drp1在缺血缺氧损伤mPTP开放和ROS堆积等线粒体功能变化中作用及调控机制（1）Drp1在缺血缺氧损伤后线粒体mPTP通道开放中的作用及调控机制利用失血性休克SD大鼠、Drp1敲除小鼠（Drp1+/-）模型和糖氧剥夺VSMC细胞模型,观察缺氧不同时相点mPTP开放情况;观察缺血缺氧不同时相点mPTP结构蛋白表达和分布情况;观察干预mPTP结构蛋白HK2表达活性对缺氧后mPTP开放的影响;观察干预线粒体Drp1-LRRK2结合对HK2活性、分布和mPTP开放的影响,以阐明线粒体Drp1对缺血缺氧损伤mPTP过度开放的调控机制。（2）Drp1在缺血缺氧损伤后线粒体ROS堆积中的作用及调控机制利用失血性休克Drp1敲除小鼠（Drp1+/-）模型和糖氧剥夺VSMC细胞模型,观察机体能量代谢变化;代谢组学检测干预Drp1对缺血损伤后线粒体代谢的影响;观察干预Drp1介导谷胱甘肽代谢对线粒体功能的影响,以阐明Drp1通过影响线粒体代谢参与ROS生成和清除的潜在调控通路。第三部分:干预Drp1对急性缺血缺氧损伤重要器官功能保护作用及临床意义研究使用Drp1抑制剂Mdivi-1以及Drp1敲除干预观察缺血缺氧损伤后（1）血管反应性、血管管径变化、血管平滑肌细胞收缩张力以及动态血压维持情况;（2）肝肾血流灌注、肝功、肾功、心输出量、心损和心肌细胞收缩力;（3）肠上皮紧密连接情况、肠道菌群组成及肠屏障功能;（4）血流动力学指标（LVSP、±dp/dt max）、血气指标（Lac、HCO3-、BE、pH等）以及72h存活情况,以阐明干预Drp1对急性缺血缺氧损伤后重要器官功能的保护作用及其临床意义。[研究结果]第一部分:急性缺血缺氧损伤后多组织器官线粒体质量失衡的特征规律研究1.缺血缺氧损伤后血管、肠和心脏组织线粒体形态和数量均发生明显变化,但变化时间、变化程度和变化形式存在差异。血管组织变化起始于缺血缺氧后1h并逐渐加剧。肠组织在缺血缺氧后0.5h即发生明显变化,但后续并没有进一步加重。心脏组织变化不如血管和肠组织明显,缺血缺氧后2h才有稍许增加,并且不同于血管和肠组织线粒体缺血缺氧后表现为线粒体过度分裂和碎片化线粒体数量增多,缺血缺氧损伤对心肌线粒体的影响主要体现在心肌线粒体排布紊乱和内部嵴结构的破坏。2.缺血缺氧损伤后血管、肠和心脏组织线粒体功能均发生明显变化,且缺血缺氧损伤后相同组织线粒体功能变化均晚于线粒体形态和数量的变化。第二部分:Drp1在急性缺血缺氧损伤致线粒体质量失衡中作用及调控机制研究1.急性缺血缺氧损伤后线粒体动力蛋白Drp1表达、分布及修饰变化（1）缺血缺氧损伤1h后Drp1发生从细胞质到线粒体转位,且其时相变化规律与线粒体碎片化程度呈正相关,提示Drp1线粒体转位在缺血缺氧早期线粒体过度分裂中发挥了重要作用。进一步发现转位到线粒体上的Drp1主要富集在线粒体预收缩位点,对于线粒体分裂的发生具有重要意义。（2）缺血损伤后Drp1的磷酸化、苏木化、亚硝基化修饰明显增高,泛素化修饰轻度减低。缺血缺氧损伤后活跃的Drp1修饰变化对于线粒体质量调控具有重要意义。2.Drp1在缺血缺氧损伤后线粒体形态和数量变化中作用及对ER-Mito接触的调控机制（1）缺血缺氧后线粒体碎片化的发生是由于Drp1线粒体转位后介导线粒体过度分裂导致的。干扰Drp1后线粒体Drp1减少的同时伴随线粒体碎片数量减少。正常情况下过表达Drp1会导致线粒体过度分裂和线粒体数量的增加。上述结果明确了 Drp1线粒体转位介导线粒体分裂对线粒体形态和数量变化的决定作用。（2）缺血缺氧损伤初期Drp1发生大量线粒体转位之前,过度磷酸化和亚硝基化的细胞质Drp1通过激活细胞骨架调节蛋白Shroom4并与之结合形成Drp1-Shroom4复合体。Drp1-Shroom4复合体如“卡扣”一样将内质网周围散乱分布的F-肌动蛋白束化,增强了内质网与线粒体之间的牵引力和有效接触面积。随后内质网在束化F-肌动蛋白锚定端INF2的牵引下,缠绕在线粒体周围,形成ER-Mito接触并进一步引起线粒体预收缩。（3）缺血缺氧损伤ER-Mito接触引起大量线粒体预收缩后,内质网Calnexin会迁移到ER-Mito接触位点并与细胞质中Fundcl结合形成功能环,加速细胞质Drp1沿内质网轨迹向ER-Mito接触位点的线粒体转位过程。（4）缺血缺氧损伤后活化Drp1可上调线粒体Clec16a表达,一方面抑制了 Parkin的线粒体募集,导致线粒体碎片形成自噬小体受阻;另一方面也加速了自噬小体向自噬溶酶体的转变,促进了缺血缺氧损伤后的自噬流过程。3.Drp1在缺血缺氧损伤mPTP开放和ROS堆积等线粒体功能变化中作用及调控机制（1）缺血缺氧晚期,线粒体收缩位点大量富集的Drp1除了介导线粒体分裂外,还会通过结合mPTP结构蛋白BAX,识别线粒体收缩位点附近的mPTP通道。然后通过招募线粒体LRRK2到线粒体收缩或分裂位点形成Drp1-LRRK2复合体引起mPTP通道结构蛋白HK2失活及其线粒体分离,破坏mPTP通道结构,导致mPTP通道过度开放,线粒体CytC释放增多,影响线粒体功能和细胞功能。（2）缺血缺氧后活化Drp1会造成ROS的过度堆积,进而破坏线粒体功能,引起细胞能量代谢异常。其潜在发生机制包括:（a）活化Drp1通过抑制辅酶Q的生物合成破坏线粒体呼吸链,导致线粒体ROS生成增加;（b）活化Drp1抑制线粒体谷氨酸-谷胱甘肽代谢,导致ROS清除减少;（c）活化Drp1通过阻断神经递质途径（包括酪氨酸-多巴胺代谢和维生素E相关通路）进一步降低ROS清除率。第三部分:干预Drp1对急性缺血缺氧损伤重要器官功能保护作用及临床意义研究1.急性缺血缺氧损伤后合并使用Drp1抑制剂Mdivi-1液体复苏可以明显提高血管反应性及其收缩张力。干预Drp1可以很好地维持缺血缺氧损伤后的动态血压。2.干预Drp1可以改善缺血损伤后肝肾血流灌注和肝肾功能,对于缺血损伤后心肌细胞收缩力也有一定的影响。3.Drp1敲除干预可以通过影响肠道菌群中拟杆菌门的组成、恢复短链脂肪酸（SCFA）的产生,从而保护缺血损伤后的肠屏障功能。4.干预Drp1介导的线粒体质量失衡可以很好地改善缺血缺氧损伤后血流动力学、血气和存活情况。[结论]1.Drp1在急性缺血缺氧损伤致线粒体质量失衡中发挥了重要作用。其中“Drp1的过度激活（磷酸化、苏木化、亚硝基化）”和“大量细胞质Drp1的线粒体转位”是急性缺血缺氧后线粒体形态数量和功能发生变化的重要原因。2.缺血缺氧后大量存在的细胞质Drp1在被招募到线粒体之前已经开始参与线粒体分裂过程。具体表现为过度磷酸化和亚硝基化的细胞质Drp1通过Shroom4束化肌动蛋白,增强内质网和线粒体之间牵引力,启动大量ER-Mito接触并引起大量线粒体预收缩,为后续细胞质Drp1转位到线粒体收缩位点介导线粒体过度分裂奠定了结构基础。3.缺血缺氧后细胞质Drp1加速线粒体转位是由于ER-Mito接触位点Calnexin-Fundcl功能环大量形成,促进了细胞质Drp1沿内质网向ER-Mito接触位点的大量迁移。4.缺血缺氧晚期Drp1介导线粒体分裂结束后下一步会进一步影响线粒体功能。线粒体Drp1一方面在线粒体收缩或分裂位点通过识别并破坏线粒体mPTP通道结构引起mPTP过度开放,CytC释放增加;另一方面还可通过多种线粒体代谢途径影响ROS的清除和生成,导致ROS过度堆积,最终加重了缺血缺氧后线粒体和细胞功能损伤。5.急性缺血缺氧损伤后使用Drp1抑制剂Mdivi-1液体复苏或者Drp1敲除干预可以保护血管收缩张力、改善肝肾血流灌注以及肠屏障功能,弥补了常规林格液体复苏“虽然可以快速扩容但难以长时间维持血压”的缺陷,对于延长急性缺血缺氧损伤患者的临床救治时间、提高患者救治率和存活率具有重要临床意义。
杜康[2]（2020）在《琥珀酸脱氢酶与mitoKATPC在大鼠心肌缺血后处理中的机制研究》文中指出目的:观察大鼠体外循环（Cardiopulmonary bypass,CPB）下心肌缺血再灌注损伤（Myocardial ischemia-reperfusion injury,MIRI）中琥珀酸脱氢酶（Succinate dehydrogenase,SDH）的变化,明确缺血后处理（Ischemic postconditioning,IPO）减轻大鼠MIRI,与SDH、线粒体ATP敏感性钾通道(Mitochondrial adenosine triphosphate-sensitive potassium channel,mitoKATPC)的关系和作用,明确大鼠IPO心肌保护机制中SDH与mitoKATPC的关系。方法:160只成年雄性SD大鼠,体重300-350g。建立成年大鼠CPB缺血再灌注及IPO模型。随机分为8组,每组20只:正常组（Nor）、SDH竞争性抑制剂丙二酸二甲酯（Dimethyl malonate,dm）对照组（dm+Nor）、缺血再灌注组（I/R）、dm+缺血再灌注组（dm+I/R）、缺血后处理组（IPO）、dm+缺血后处理组（dm+IPO）、mitoKATPC特异性抑制剂5-羟基癸酸（5-Hydroxydecanoate,5-HD）+缺血后处理组（5-HD+IPO）、dm+5-HD+缺血后处理组（dm+5-HD+IPO）。Nor组大鼠CPB转机160分钟后结束实验;I/R组行CPB转机10分钟后,关闭主动脉并造成大鼠全心停跳30分钟,开放主动脉转机复灌120分钟,结束实验;IPO组在I/R组的基础上,于转机复灌前,对主动脉予以30s开放和30s关闭,重复3次,最后开放主动脉转机复灌117分钟后结束实验;dm+I/R组、dm+IPO组和dm+5-HD+IPO组均于全心停跳前10分钟开始泵注dm 4mg/kg·min-1,持续40min,直至复灌开始,dm+Nor组在对应时间段泵注dm,其余各组在对应时间段泵注等体积生理盐水;5-HD+IPO组和dm+5-HD+IPO组于IPO前5min注射5-HD5mg/kg,其余各组在对应时间注射等体积生理盐水。术中持续监护生命体征。于复灌末,采血并摘取大鼠心脏进行如下检测:1.制备心肌2,3,5-三苯基四氮唑氯化物（2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride,TTC）染色标本,测量心肌梗死面积（Infarct size,IS）并计算百分比（IS%）;2.制备心肌电子染色标本,于透射电镜下观察心肌超微结构,并计算心肌细胞线粒体Flameng评分;3.通过ELISA法测定血浆肌酸激酶同工酶（Creatine kinase-MB,CK-MB）和肌钙蛋白I（Cardiac troponin I,cTnI）浓度;4.制备心肌免疫荧光染色标本,于激光共聚焦显微镜下评估活性氧簇（Reactive oxygen species,ROS）生成;5.吸光度法测定心肌组织中SDH活性,以及琥珀酸（Succinic acid,SA）和延胡索酸（Fumaric acid,FA）的含量;6.通过RT-qPCR和Western-blotting技术测定心肌组织琥珀酸脱氢酶黄素蛋白（Succinate dehydrogenase flavoprotein,SDHA）的mRNA和蛋白表达。结果:1.心肌IS%的变化:I/R组IS%较Nor组明显增大（P<0.05）;而dm+I/R组和IPO组IS%较I/R组获得了较好改善（P<0.05）;同IPO组相比,dm+IPO组IS%有所降低（P<0.05）,5-HD+IPO组IS%增大（P<0.05）。5-HD+IPO组与dm+5-HD+IPO组无差异（P>0.05）。2.心肌超微结构改变和线粒体Flameng评分的变化。2.1心肌超微结构改变:Nor组和dm+Nor组心肌超微结构基本正常;I/R、5-HD+IPO组和dm+5-HD+IPO组心肌超微结构出现明显破坏,以I/R组最为明显;IPO组和dm+I/R组优于I/R组,但较dm+IPO组损伤较重。2.2线粒体Flameng评分的变化:同Nor组相比,I/R组Flameng评分明显升高（P<0.05）,dm+Nor组无差异（P>0.05）;同I/R组相比,dm+I/R组和IPO组Flameng评分降低（P<0.05）;同IPO组相比,dm+IPO组Flameng评分降低（P<0.05）,5-HD+IPO组Flameng评分升高（P<0.05）。5-HD+IPO组与dm+5-HD+IPO组无差异（P>0.05）。3.血浆CK-MB&cTnI浓度的变化:同Nor组相比,I/R组CK-MB&cTnI明显升高（P<0.05）,dm+Nor组无差异（P>0.05）;同I/R组相比,dm+I/R组和IPO组CK-MB&cTnI降低（P<0.05）;同IPO组相比,dm+IPO组CK-MB&cTnI降低（P<0.05）,5-HD+IPO组CK-MB&cTnI升高（P<0.05）。5-HD+IPO组与dm+5-HD+IPO组无差异（P>0.05）。4.心肌ROS含量的变化:同Nor组相比,I/R组ROS含量增加（P<0.05）,dm+Nor组无差异（P>0.05）;同I/R组相比,dm+I/R组和IPO组ROS含量减少（P<0.05）;同IPO组相比,dm+IPO组ROS含量减少（P<0.05）,5-HD+IPO组ROS含量增加（P<0.05）。5-HD+IPO组与dm+5-HD+IPO组无差异（P>0.05）。5心肌SDH活性,SA和FA含量的变化。5.1心肌SDH活性的变化:同Nor组相比,I/R组SDH活性升高（P<0.05）,dm+Nor组SDH活性下降（P<0.05）;同I/R组相比,dm+I/R组和IPO组SDH活性降低（P<0.05）;同IPO组相比,dm+IPO组SDH活性降低（P<0.05）,5-HD+IPO组SDH活性升高（P<0.05）。5-HD+IPO组与dm+5-HD+IPO组无差异（P>0.05）。5.2心肌SA含量的变化:Nor组SA含量高于dm+Nor组（P<0.05）,但明显低于I/R组（P<0.05）;dm+I/R组和IPO组较I/R组SA含量降低（P<0.05）;同IPO组相比,dm+IPO组SA含量降低（P<0.05）,5-HD+IPO组SA含量升高（P<0.05）。5-HD+IPO组与dm+5-HD+IPO组无差异（P>0.05）。5.3心肌FA含量的变化:同Nor组相比,I/R组FA含量降低（P<0.05）,dm+Nor组FA含量升高（P<0.05）;同I/R组相比,dm+I/R组和IPO组FA含量升高（P<0.05）;同IPO组相比,dm+IPO组FA含量升高（P<0.05）,5-HD+IPO组FA含量降低（P<0.05）。5-HD+IPO组与dm+5-HD+IPO组无差异（P>0.05）。6.心肌SDHA mRNA和蛋白质表达量的变化:Nor组SDHA表达量高于dm+Nor组（P<0.05）,但明显低于I/R组（P<0.05）;同I/R组相比,dm+I/R组和IPO组表达量降低（P<0.05）;同IPO组相比,dm+IPO组表达量降低（P<0.05）,5-HD+IPO组表达量升高（P<0.05）。5-HD+IPO组与dm+5-HD+IPO组无差异（P>0.05）。结论:1.心肌缺血再灌注促进琥珀酸脱氢酶黄素蛋白的表达,使琥珀酸脱氢酶活性增加,导致心肌缺血再灌注损伤。2.应用琥珀酸脱氢酶抑制剂丙二酸二甲酯抑制琥珀酸脱氢酶活性,可有效减轻心肌缺血再灌注损伤。3.缺血后处理可以减轻大鼠体外循环下心肌缺血再灌注损伤,其机制与开放线粒体ATP敏感性钾通道及抑制琥珀酸脱氢酶的活性有关,且缺血后处理对琥珀酸脱氢酶的抑制作用是通过开放线粒体ATP敏感性钾通道实现的。
王佳琪[3]（2020）在《HIF-1/HRE通路在吡那地尔后处理对大鼠缺氧复氧心肌细胞保护机制中作用的研究》文中进行了进一步梳理目的:1.观察吡那地尔后处理对大鼠缺氧复氧心肌细胞损伤的保护作用;2.探讨HIF-1/HRE通路在吡那地尔后处理心肌保护中的作用及激活机制。方法:应用体外心脏灌注装置（MPA）获取实验所需成年大鼠的心肌细胞,在设置为37℃的培养箱培养24h后,随机分为正常组（N组）、缺氧复氧组（HR组）、吡那地尔后处理组（P组）、五羟葵酸和吡那地尔后处理组（5HD+P组）、N-2-巯基丙酰-甘氨酸和吡那地尔后处理组（MPG+P组）、N-2-巯基丙酰-甘氨酸与二甲基乙二酰甘氨酸和吡那地尔后处理组（MPG+DMOG+P组）。按以下方式进行处理:N组:继续在培养箱中培养160min;HR组:先缺氧40min,再复氧120min;P组:缺氧40min后,吡那地尔处理5min,接着复氧115min;5HD+P组:缺氧40min后,5HD处理10min,吡那地尔处理5min,接着复氧105min;MPG+P组:缺氧40min后,MPG处理10min,吡那地尔处理5min,接着复氧105min;MPG+DMOG+P组:缺氧40min后,MPG处理10min,DMOG处理10min,吡那地尔处理5min,接着复氧95min。实验检测指标:（1）透射电子显微镜下观察复氧末各组心肌细胞超微结构,并对线粒体行Flameng评分;（2）激光共聚焦显微镜检测各组复氧末线粒体膜电位（Mitochondrial membrane potential,MMP）;（3）ELISA试剂盒分别检测复氧25min及复氧末ROS的含量;（4）qRT-PCR法及Western-Blot法测复氧末目的基因HIF-1α、HO-1、iNOS、VEGF基因mRNA和蛋白的表达量。结果:1.透射电子显微镜下各组细胞超微结构和线粒体Flameng评分:超微结构显示:N组细胞超微结构基本正常,HR组损伤最为严重;与P组比,5HD+P组和MPG+P组损伤加重,二者间损伤差异不明显,MPG+DMOG+P组损伤与之相似;与5HD+P组相比,MPG+DMOG+P组损伤程度明显减轻（P<0.05）,MPG+P组变化不明显;与MPG+P组比,MPG+DMOG+P组损伤程度明显减轻。Flameng评分显示:N组评分最低,HR组评分最高（P<0.05）;与P组比较,HR组、5HD+P组和MPG+P组均显着升高（P<0.05）,三者间差异无统计学意义（P>0.05）,MPG+DMOG+P组稍增高,差异无统计学意义（P>0.05）;与MPG+P组比,MPG+DMOG+P组评分显着降低（P<0.05）。2.心肌细胞MMP（红/绿荧光比值）的变化:N组红绿荧光比值最高,HR组最低（P<0.05）;与P组相比,HR组、5HD+P组和MPG+P组比值明显下降（P<0.05）,且三者间差异无统计学意义（P>0.05）,MPG+DMOG+P组稍降低,差异无统计学意义（P>0.05）;与5HD+P组相比,MPG+P组降低无统计学意义（P>0.05）,MPG+DMOG+P组显着升高（P<0.05）;与MPG+P组比,MPG+DMOG+P组比值显着升高（P<0.05）。3.心肌细胞ROS含量的变化:复氧25min时刻:N组ROS含量最低,HR组、5HD+P组最高（P<0.05）,二者间差异无统计学意义（P>0.05）;与P组相比,MPG+P组、MPG+DMOG+P组降低（P<0.05）,二者间差异无统计学意义（P>0.05）;复氧120min时刻:N组ROS含量最低,HR组最高（P<0.05）;与P组相比,MPG+DMOG+P组变化无统计学意义（P>0.05）,5HD+P组、MPG+P组含量均升高（P<0.05）,且二者间差异无统计学意义（P>0.05）;5HD+P组、MPG+P组高于MPG+DMOG+P组（P<0.05）。与复氧25min时刻相比,复氧120min时刻N组、HR组、5HD+P组和MPG+DMOG+P组ROS含量的差异无统计学意义（P>0.05）;P组降低（P<0.05）;MPG+P组升高（P<0.05）。4.HIF-1α、HO-1、iNOS和VEGF mRNA的表达量:HIF-1α的mRNA在各组之间表达无差异（P>0.05）。与N组相比,HO-1、iNOS和VEGF三种基因的mRNA的表达在其余组明显上升（P<0.05）,其中P组和MPG+DMOG+P组表达最高（P<0.05）,二者间差异无统计学意义（P>0.05）;与P组相比,HO-1、iNOS和VE GF三种基因mRNA的表达在HR组、5HD+P组和MPG+P组显着降低（P<0.05）,且三者间差异无统计意义（P>0.05）;与5HD+P组、MPG+P组相比,MPG+DMO G+P组表达显着升高（P<0.05）。5.HIF-1α、HO-1、iNOS和VEGF蛋白水平表达量:与N组相比,其余组目的基因蛋白表达均明显升高,且P组和MPG+DMOG+P组最高（P<0.05）,二者间差异无统计学意义（P>0.05）;与P组相比,HR组表达降低（P<0.05）,5HD+P组和MPG+P组将P组蛋白高表达抑制（P<0.05）;与5HD+P组、MPG+P组相比,MPG+DMOG+P组表达显着升高（P<0.05）。结论:基于本实验的研究条件及研究结果,得出:1.HIF-1/HRE通路参与了吡那地尔后处理对大鼠缺氧复氧心肌细胞的保护作用。2.吡那地尔后处理通过开放mitoKATP,产生适量ROS作为信号分子,激活HIF-1/HRE通路,进一步促进下游HO-1、iNOS、VEGF基因表达,起到对缺氧复氧心肌细胞的保护作用。
杨龙[4]（2020）在《HIF-1调控线粒体自噬恢复七氟醚后处理减轻糖尿病心肌缺血再灌注损伤的机制研究》文中研究表明目的:心血管疾病是目前全球突出性的社会医疗问题,患病率持续上升,已成为全球范围内造成死亡的最主要原因。糖尿病作为心血管疾病的重要危险因素,合并有糖尿病的缺血性心脏病患者诱发心肌缺血再灌注损伤的几率是非糖尿病缺血性心脏病患者的23倍。七氟醚后处理（Sevoflurane Postconditionning,SPostC）能有效减轻健康心肌缺血再灌注损伤,但糖尿病状态下,SpostC的心肌保护作用弱化。前期研究证实糖尿病状态下七氟醚后处理保护作用弱化的原因可能在于受损的HIF-1信号通路,应用去铁胺（DFO）能够激活糖尿病状态下受损的HIF-1α重现七氟醚后处理保护作用,但具体机制不清。新近研究发现线粒体自噬在七氟醚后处理心肌保护作用中起关键作用,但在糖尿病状态下,线粒体自噬被抑制。如何重现糖尿病状态下SpostC心肌保护作用是目前急需解决的重要临床问题,而阐明HIF-1α/BNIP3介导的线粒体自噬是否参与恢复糖尿病状态下七氟醚后处理保护作用尤为重要。本研究在前期研究基础上探讨HIF-1调控的线粒体自噬在SpostC对抗缺血性心肌损伤中的作用,期望通过调控HIF-1介导的线粒体自噬恢复糖尿病状态下七氟醚后处理保护作用。方法:在离体层面,建立H9C2心肌细胞缺氧/复氧模型,在复氧初接受2.4%七氟醚后处理。通过测定细胞活力、LDH活性及流式细胞仪测定细胞凋亡反映细胞损伤情况;透射电镜观察自噬小体反映自噬情况;western blot检测HIF-1α、BNIP3、Beclin-1蛋白表达;利用干扰RNA技术沉默BNIP3观察其在促进自噬方面作用。在体水平,通过结扎大鼠冠脉前降支40分钟后复灌120分钟建立I/R模型。在缺血前24h腹腔内注射DFO（200mg/kg）,复灌初15分钟给与1MAC七氟醚后处理。复灌2h后测定心肌梗死面积、线粒体超微结构、自噬小体、ATP含量、膜电位、ROS产生率以及HIF-1α、BNIP3、LC3-II、Beclin-1、P62、LAMP2蛋白表达和心脏功能。结果:细胞实验缺氧复氧损伤后,与H/R组相比,SpostC能够上调HIF-1α、BNIP3蛋白表达（P<0.05,SPostC组vs H/R组）,促进自噬小体清除,细胞活力明显增加,LDH降低,但是这种保护作用在给与2ME2或沉默BNIP3后完全消除。糖尿病状态下,与I/R组相比,SpostC组保护作用弱化,给与DFO处理后,SPostC能够上调HIF-1α及其下游靶基因BNIP3蛋白表达（P<0.05）,同时降低自噬关键蛋白LC3-II、Beclin-1、P62的表达,增加LAMP2蛋白表达;自噬小体堆积明显减少,ROS产生率下降,ATP含量明显增加,膜电位提高,心肌梗死面积明显减小,心功能改善明显（P<0.05,SPostC组vs DFO+SpostC组）。结论:SPostC通过调控HIF-1α/BNIP3信号通路促进线粒体自噬减轻心肌细胞缺氧复氧损伤。主要机制在于SPostC能够上调HIF-1α的表达,进一步激化下游靶基因BNIP3,促进了BNIP3介导的线粒体自噬,通过清除自噬小体并增加细胞活力,降低LDH水平,抑制细胞凋亡,最终对抗细胞缺氧复氧损伤。糖尿病状态下,通过DFO预处理联合SPostC能够激活受损的HIF-1α并上调HIF-1α的蛋白表达,进一步促进HIF-1α/BNIP3介导的线粒体自噬,及时清除受损的线粒体,避免了线粒体来源的ROS对线粒体膜电位的攻击,使得线粒体功能得到稳定,心肌梗死面积明显减少,改善了心功能。
冉玉华[5]（2012）在《埃他卡林对脑神经血管单元的保护作用及其分子机制》文中提出脑血管疾病是威胁人类健康的重大疾病之一,具有高死亡率，高发病率和高并发症发生率的特点。调查显示全世界每年大约有795，000名的人群受到其危害，其相关治疗费用更是高达68.9亿美元。其中约70%为缺血性脑血管疾病。我国是脑血管疾病的高发国之一,并且近20年来其发病率一直呈上升趋势，脑血管疾病已成为我国人口的第二大死亡原因。目前针对其临床治疗的药物疗效有限，亟需研发具有新作用靶点和作用途径的缺血性脑血管疾病治疗药物。缺氧脑损伤的主要病理改变是脑缺氧导致神经元死亡,从而影响脑功能，在此过程中神经元、胶质细胞以及脑微血管内皮细胞自身的损伤、坏死和凋亡以及相互的影响是脑组织损伤过程的细胞变化基础。随着近年来医学界对中枢神经系统多种细胞形态和功能的再认识，神经血管单元（neurovascular unit，NVU）概念逐步得到医学界的认同。所谓NVU，是指由神经元、星形胶质细胞、脑微血管内皮细胞、小胶质细胞及维持脑组织完整性的细胞外基质和他们之间的相互作用和相互联系构成的一个整体概念。NVU扩充了血脑屏障（Blood brain barrier，BBB）的内涵与外延，具有多种细胞组成的动态微环境结构特征。NVU与缺血性脑血管疾病的发生发展具有密切的关系,其作为一个功能模块，已日益成为治疗脑缺氧损伤研究的重要靶点之一。ATP敏感性钾离子通道(KATP通道)是细胞膜上可以偶联细胞兴奋性和能量代谢的受细胞内ATP浓度调控的、具有弱内向整流作用的一类重要分子。文献报道，KATP通道在大脑各区几乎均有表达，在神经血管单元的三种主要细胞神经元、胶质细胞和内皮细胞上也有分布表达。研究显示，该通道在生理条件下往往处于关闭状态，而在缺血/缺氧状态下开放，通过减少兴奋性递质的释放以及启动下游多条细胞信号通路，可在多种组织中发挥抗缺血/缺氧损伤的内源性保护作用。埃他卡林是我国具有自主知识产权的一类新药，具有脂肪胺结构的新结构类型的KATP通道开放剂，在国际上被列为第九类钾通道开放剂。他是小分子化合物能够透过血脑屏障。前期研究发现在沙土鼠双侧颈动脉结扎全脑缺血模型上发现埃他卡林对缺血所致动物行为异常具有明显的对抗作用，能够减少兴奋性递质的释放；能够剂量依赖性地减少全脑缺血所致海马CA1区锥体神经元的丢失。在脑卒中易感型自发性高血压大鼠盐负荷模型上发现，埃他卡林剂量依赖性地减少脑卒中的发生率和致死率，延缓卒中发生并延长存活时间；在减压缺氧大鼠脑损伤模型上发现，埃他卡林对高原脑水肿具有防治作用，能够维持血脑屏障的通透性，维持脑内离子平衡。但是埃他卡林作为ATP敏感性钾通道开放剂在缺氧脑损伤的模型上是否可以靶向神经血管单元发挥保护作用以及埃他卡林是如何针对缺氧脑损伤靶向于缺氧脑损伤进程中神经血管单元的功能的动态变化及其相互调节来发挥作用的，即埃他卡林实现神经血管保护作用的分子作用机制尚未阐明。进一步明确埃他卡林对缺氧性脑损伤的保护作用及其机制将为埃他卡林靶向神经血管单元发展成为针对神经损伤多元复杂病理机制诸多关键环节和高度激活的复杂信号转导级联反应的多潜能神经保护剂提供进一步的实验研究基础，也将为缺氧脑损伤的预防和治疗带来新的治疗策略。本研究从不同的层次来研究埃他卡林对缺氧损伤神经血管单元的多环节多途径保护作用。在整体动物水平上，采用10%氧浓度常压缺氧舱，并结扎大鼠单侧颈总动脉造成缺氧脑损伤模型，证明埃他卡林对大鼠缺氧脑损伤的神经保护作用。在细胞水平上，建立连二亚硫酸钠无糖环境诱导细胞糖氧剥夺缺氧损伤模型，通过神经血管单元（NVU）成员细胞神经元、星形胶质细胞和微血管内皮细胞实验，证实埃他卡林具有抗缺氧损伤NVU细胞的保护作用。此外，本研究进一步探究埃他卡林激活KATP通道靶向神经血管单元抗缺氧脑损伤涉及的分子机制。研究得到了如下的结果：第一部分、埃他卡林对脑神经血管单元缺氧损伤的保护作用一、埃他卡林对神经血管单元主要细胞类型的保护作用1、神经血管单元细胞表达KATP亚型的差异RT-PCR结果显示，在NVU三种细胞中Kir6.1的m RNA表达不同，微血管内皮细胞﹤神经元﹤星形胶质细胞；SUR2B的m RNA表达也有差异，神经元﹤星形胶质细胞﹤微血管内皮细胞；在微血管内皮细胞中Kir6.1和Sur2B的表达比较也存在显着差异，Kir6.1﹤SUR2B。2、埃他卡林对神经血管单元缺氧损伤细胞存活率的影响在体外细胞缺氧损伤模型下，给予0.01,0.1,到1mol/l的埃他卡林可以明显地提高NVU细胞包括神经元、星形胶质细胞、脑微血管内皮细胞缺氧损伤后的存活率。3、埃他卡林对神经血管单元缺氧损伤细胞LDH的释放的影响0.01,0.1,和1mol/l的埃他卡林后可以显着的降低NVU成员细胞在低氧损伤下LDH的释放量。埃他卡林的这种作用可以被KATP的阻断剂格列苯脲所阻断。二、埃他卡林对大鼠缺血缺氧脑损伤的保护作用1、埃他卡林对大鼠缺血缺氧脑损伤病理改变的影响利用大鼠单侧颈总动脉结扎并处于10%常压缺氧环境造成，大鼠缺氧脑损伤模型，用HE染色的方法观察大鼠脑组织的病理变化，结果发现损伤组大鼠脑皮层神经细胞间隙明显增大，血管周围间隙增大，神经元数量减少，神经胶质细胞肿胀增大，毛细血管扩张充血。不同剂量的埃他卡林给药组（2,4,8mg/kg，每天灌胃给予）仍可见少量的胶质细胞和血管周围空晕，随着剂量增大，脑组织损伤程度逐渐减轻。2、埃他卡林对大鼠缺血缺氧脑损伤血脑屏障通透性变化的影响通过透射电镜观察大鼠缺血缺氧脑损伤后血脑屏障的结构变化发现，正常情况下，可见血管外周间隙致密；缺血缺氧组大鼠血管和组织外周间隙增大，可见明显的间隙和空泡；不同剂量埃他卡林（2,4,8kg/mg，每天灌胃给予）组作用之后可见血管外周间歇有不同程度的减小。第二部分、埃他卡林对脑神经血管单元缺氧损伤保护作用分子机制的研究一、埃他卡林对神经血管单元缺氧损伤凋亡相关蛋白表达的影响1、埃他卡林对神经血管单元缺氧损伤细胞凋亡形态学的影响Hoechest33258染色发现，神经血管单元细胞在缺氧损伤的环境中，体现细胞核染色质密度增加，浓缩集聚等典型的凋亡特征，而给予埃他卡林后，凋亡细胞数量下降，染色质浓缩程度减轻。2、埃他卡林对神经血管单元缺氧损伤细胞凋亡率的影响流式细胞仪检测神经元、星形胶质细胞和内皮细胞的凋亡率，在缺氧条件下，较之正常组，凋亡率显着增高（P﹤0.05），三种细胞皆有类似的结果。给予0.01,0.1和1mol/l埃他卡林后，凋亡率显着降低。3、埃他卡林对缺氧损伤神经血管单元细胞抗凋亡作用强弱比较埃他卡林对神经元的抗凋亡作用与它对内皮细胞的抗凋亡作用存在显着差异，（P﹤0.025）。埃他卡林对抗缺氧损伤引起星形胶质细胞的凋亡作用与它对内皮的抗凋亡作用也明显差异，（P﹤0.017）。4、埃他卡林对神经血管单元缺氧损伤细胞凋亡相关通路的影响缺氧损伤之后，神经元、星形胶质细胞以及内皮细胞中caspase-3mRNA和蛋白在模型组较之正常组均明显增高，0.01到1mol/l埃他卡林给药组中caspase-3mRNA和蛋白表达较之模型组都发生显着下调。0.01到1mol/l的埃他卡林处理细胞之后，NVU三种成员细胞中bax的mRNA表达较之模型组显着下降，而bcl-2的mRNA表达则明显升高。模型组细胞中caspase-9的蛋白表达明显升高，与正常组有显着差异，P﹤0.05。而埃他卡林作用组中caspase-9的蛋白表达显着下降。NVU细胞缺氧损伤后，Western blot的方法检查细胞胞浆中的cytC的蛋白表达较之正常对照明显增加，而1mol/l的埃他卡林可以逆转cytC的表达上调。此外，Western blot的方法还证实星形胶质细胞和微血管内皮细胞中pAkt/tAkt的蛋白表达在缺氧损伤后显着下调，而埃他卡林可以明显的上调pAkt/tAkt的蛋白表达。5、埃他卡林调节大鼠缺氧脑损伤脑组织凋亡相关蛋白表达情况大鼠缺氧脑损伤后，利用IHC的方法发现脑组织中Bcl-2的表达减少，同时Bax的表达增加，致Bcl-2/Bax的比值减小。当灌胃给予8mg/kg埃他卡林后，可以抑制脑缺血再灌注损伤所致的脑细胞凋亡，表明它具有神经保护作用。这一作用与其逆转Bcl-2表达下调，逆转Bax的表达上调以及对抗Caspase-3的表达上调有关。免疫组化的实验结果证实，在正常大鼠脑皮层中作为维持血脑屏障的成员之一的MMP-9呈现致密分布。大鼠发生缺氧脑损伤后，脑皮层组织中MMP-9的表达下降，血脑屏障通透性增加；8mg/kg的埃他卡林组大鼠脑皮层MMP-9的表达显着上升。正常大鼠脑组织中有一定量的pCREB表达，大鼠缺氧缺血脑损伤后pCREB的表达明显少于正常组，而给予埃他卡林的大鼠，脑组织中可见pCREB的表达较之模型组显着上升。pCREB可促进下游促神经营养因子的释放和细胞存活。二、埃他卡林对大鼠缺氧脑损伤线粒体功能的影响1、埃他卡林对大鼠缺氧脑损伤脑线粒体形态的影响缺氧缺氧损伤组大鼠脑线粒体，单位面积内数量下降，HE染色结果可见大部分线粒体膜出现破损的状态，线粒体嵴间隙变大，出现空泡。缺氧损伤后给予埃他卡林2mg/kg，线粒体数量有所增加，线粒体膜破损减轻，嵴间隙变小。2、埃他卡林对大鼠缺氧脑损伤脑线粒体功能的影响大鼠缺氧脑损伤后，利用氧电极检查脑线粒体的各项指标发现发现，缺氧损伤组的ATP合成速率下降至（117.32±1.72），较之正常对照组（128.82±9.68），下降明显，P﹤0.05。而埃他卡林能增加大鼠缺氧脑损伤脑线粒体ATP合成速率达到（128.43±1.12）；埃他卡林能增加大鼠缺氧脑损伤脑线粒体磷/氧比即P/O比值（2.11±0.05）较之缺氧损伤组（2.08±0.04），有显着差异；埃他卡林能增强大鼠缺氧脑损伤脑线粒体的呼吸率（respiratory control rate，RCR）为（3.11±0.24），较之缺氧损伤组（2.91±0.23）有统计学差异。可见埃他卡林可以维持缺氧损伤线粒体后的形态和功能。3、埃他卡林对缺氧损伤神经血管单元细胞线粒体膜电位的影响经过缺氧损伤后NVU细胞经罗丹明123染色，发现罗丹明123的荧光强度都明显下降，说明线粒体膜电位明显下降。而埃他卡林预处理过的细胞经缺氧损伤之后，线粒体膜电位的下降得到一定程度的逆转。4、埃他卡林对维持神经血管单元细胞膜电位作用差异比较埃他卡林对神经元线粒体膜电位的维持作用和对内皮细胞的作用存在显着区别。5、埃他卡林对缺氧损伤神经血管单元ROS生成的影响采用DCFH-DA探针测定细胞内活性氧水平，发现在神经血管单元三种细胞正常状态下，几乎没有ROS的产生，低氧诱导损伤细胞之后，三种细胞内ROS的水平显着增加，较之正常组有明显差别，埃他卡林作用低氧损伤的细胞之后，细胞内的ROS水平较之损伤组显着下降，P﹤0.05。三、埃他卡林对缺氧损伤神经血管单元释放神经营养因子的影响1、埃他卡林对缺氧损伤神经血管单元细胞BDNF,GDNF,CNTF,NGF释放的影响缺氧处理后的神经元分泌BDNF量与正常组比较，下降了78%（P <0.05），而微血管内皮细胞在埃他卡林处理之后，可以增加显着增加神经元的存活率，星形胶质细胞在缺氧损伤时，BDNF的分泌也出现显着下降的情况，与正常组比较BDNF的分泌下降到37%（P <0.05）。微血管内皮细胞经缺氧损伤后，内皮细胞分泌BDNF下降。经1mol/l的埃他卡林作用后，可以显着性增加细胞分泌BDNF。缺氧损伤可降低星形胶质细胞分泌GDNF，与正常组相比，GDNF的分泌下降到23%,（P <0.05）。经0.01-1mol/l的埃他卡林预处理缺氧损伤的细胞，其GDNF的分泌均有所增加。NVU细胞分泌CNTF和NGF的分泌也受到缺氧损伤而明显下降，而埃他卡林能不同程度的增加其分泌的减少，但是钾通道的拮抗剂格列苯脲并不能阻断埃他卡林的这种作用，提示埃他卡林虽然可能增加缺氧损伤后CNTF,NGF的分泌，ATP敏感性钾通道的激活并非直接作用，而只是参与了其中的某些调节环节，具体机制有待进一步研究。2、埃他卡林对大鼠缺氧脑损伤后大鼠皮层BDNF, TrkB蛋白表达的影响免疫组化的结果证实，在正常的大鼠脑皮层组织，BDNF主要分布于皮层的边缘区域。缺氧脑损伤之后，皮层部分BDNF的表达明显减少，但经埃他卡林2，4，8mg/kg处理后，大鼠皮层组织中BDNF的表达呈现浓度依赖性的增加。TrkB的变化与BDNF的表达呈现出一致的趋势。TrkB的蛋白表达在缺氧缺血之后，较之正常组显着下降，P <0.05。分别给予埃他卡林2，4，8mg/kg治疗，随着药物剂量的增加，可以逆转TrkB蛋白表达的下降，呈浓度依赖性的上调TrkB蛋白表达。3、埃他卡林处理后ECM,ACM对化学缺氧损伤神经血管单元细胞相互作用的影响经过缺氧损伤处理的神经元作为对照组不加任何药物干预，内皮细胞经过缺氧处理收集培养液（ECM），按相同的处理过程，从星形胶质细胞培养液中得到（ACM），实验证实，ECM和ACM分别与对照组的神经元共培养，均能增加神经元存活率，（E-CM:54.1%vs38.9%, P=0.04;A-CM:51.4%vs33.2%，P=0.03）。0.01μmol/L的埃他卡林处理ECM和ACM后，再与对照组神经元共培养，神经元的存活率进一步提高，分别为（E-CM vs Ipt+E-CM=54.1%vs78.2%, P=0.025;A-CM vs Ipt+A-CM=51.4%vs55.2%, P=0.045）。综上所述，本研究结论如下：1、ATP敏感性钾通道的开放剂埃他卡林能对神经血管单元低氧损伤发挥保护作用，在缺氧损伤的情况下，埃他卡林激活ATP敏感性钾通道可以保护神经元，星形胶质细胞和微血管内皮细胞，表现在缺氧损伤后它能增加细胞存活率，降低细胞释放LDH。2、ATP敏感性钾通道的开放剂埃他卡林能够对抗缺氧脑损伤，他可以维持血脑屏障的结构，降低MMP-9表达的病理性上调，从而降低脑水肿，维持血脑屏障的通透性而发挥神经保护作用。2、埃他卡林对神经血管单元缺氧损伤的保护作用与其抑制缺氧损伤诱导的NVU细胞凋亡，维持脑线粒体的功能，阻止线粒体膜电位的丢失有关，降低ROS生成的增加。其抗凋亡作用涉及细胞凋亡线粒体途径的多个信号分子以及pAkt/tAkt的表达水平变化。可能与激活线粒体ATP敏感性钾通道有关。此外，它可以上调后抗凋亡的bcl-2m RNA表达，下调促凋亡bax，caspase-3mRNA的表达；从蛋白水平，埃他卡林同时能下调Caspase-3蛋白表达。埃他卡林还能抑制CytC的蛋白释放，上调pAkt/tAkt的表达水平，下调Caspase-9的蛋白表达，从而多方面的抑制缺氧损伤引起的神经血管单元细胞凋亡的发生。4、埃他卡林保护神经血管单元的作用与其促进NVU细胞分泌释放神经营养因子BDNF，GDNF,NGF及CNTF相关，神经营养因子分泌的增加强化了神经血管单元细胞-细胞间的相互作用，维持NVU的动态平衡。5、在缺氧损伤的情况下，埃他卡林激活ATP敏感性钾通道可以靶向保护神经血管单元，这一效应与上游分子pCREB的表达增强有关，他的活化可以同时调节神经营养因子的释放并抑制细胞凋亡过程的发生，从而发挥细胞内源性神经保护作用。6、埃他卡林对NVU成员细胞的作用具有细胞选择性，对微血管内皮细胞的作用最强，这与内皮细胞上KATP的靶点Kir6.1，SUR2B表达丰度有关。
王凯[6]（2012）在《心肌ATP敏感钾通道在运动预适应诱导减轻运动性心肌损伤保护效应中变化的研究》文中进行了进一步梳理研究目的：运动预适应（exercise preconditioning，EP）诱导机体产生强大的心肌保护效应日益成为运动医学界关注热点，其诱导心肌保护效应的机制可能涉及到触发物质-中介物质-效应物质细胞信号转导途径。本研究在EP减轻力竭运动致运动性心肌损伤保护效应基础上，探讨心肌ATP敏感钾通道(ATP-sensitive potassium channels, KATPchannels)亚基kir6.2和SUR2A在运动预适应心肌保护效应中的变化，同时使用PKC抑制剂白屈菜赤碱（chelerythrine chloride，CHE），探讨在EP心肌保护效应中，PKC对心肌KATP通道表达调控的影响，为EP心肌保护效应及其机制的研究提供实验依据和思路。研究方法：SD大鼠随机分对照组（C组）、力竭运动组（EE组）、早期运动预适应组（EEP组）、 PKC抑制剂+早期运动预适应组（CHE+EEP）、早期运动预适应+力竭运动组（EEP+EE组）、PKC抑制剂+早期运动预适应+力竭运动组（CHE+EEP+EE组）、晚期运动预适应组（LEP组）、PKC抑制剂+晚期运动预适应组（CHE+LEP）、晚期运动预适应+力竭运动组（LEP+EE组）、PKC抑制剂+晚期运动预适应+力竭运动组（CHE+LEP+EE组）。大强度跑台运动建立EP模型，力竭跑台运动致大鼠运动性心肌损伤。用苏木素-伊红（hematoxylin erosin, HE）染色观察心肌形态结构变化，用苏木素-碱性品红-苦味酸（haematoxylinbasie fuchsin picric acid, HBFP）染色方法观察心肌缺血缺氧改变，用免疫化学发光法检测心肌肌钙蛋白I（cardic troponin I, cTnI）含量，用酶联免疫吸附法检测血清氨基末端前体脑钠肽（N-terminalpro-brainnatriuretic peptide, NT-proBNP）含量，评价运动性心肌损伤后心肌形态结构和功能变化，并观察EP诱导减轻运动性心肌损伤保护效应。用原位杂交方法观察心肌KATP通道kir6.2mRNA和SUR2A mRNA的分布，用实时荧光定量PCR方法检测心肌KATP通道kir6.2mRNA和SUR2AmRNA的变化，用免疫荧光组织化学方法观察心肌KATP通道kir6.2和SUR2A蛋白表达分布，用免疫印迹方法检测心肌KATP通道kir6.2和SUR2A蛋白的变化。同时使用PKC抑制剂CHE，揭示在EP心肌保护效应中PKC对心肌KATP通道亚基kir6.2和SUR2A表达调控的影响。研究结果：（1）与C组相比，EE组血清cTnI和NT-proBNP含量明显升高，心肌纤维弯曲变形，心肌缺血缺氧严重。与EE组相比，EEP+EE组血清cTnI和NT-proBNP含量明显降低，心肌缺血缺氧减轻。LEP+EE组血清cTnI含量明显降低，NT-proBNP含量无明显变化，心肌缺血缺氧加重。（2）和C组相比，EEP和LEP组kir6.2mRNA表达水平无明显变化，EEP组kir6.2蛋白表达水平明显降低，LEP组kir6.2蛋白表达水平无明显变化；EEP和LEP组SUR2A mRNA表达水平有升高趋势，EEP组SUR2A蛋白表达水平无明显变化，LEP组SUR2A蛋白表达水平明显降低。EE组kir6.2mRNA表达水平呈下降趋势，kir6.2蛋白表达水平明显升高；SUR2A mRNA表达水平明显升高，SUR2A蛋白表达水平明显升高。和EE组相比，EEP+EE和LEP+EE组kir6.2mRNA表达水平呈下降趋势，kir6.2蛋白表达水平明显降低；EEP+EE组SUR2A mRNA表达水平明显下降，LEP+EE组SUR2A mRNA表达水平呈下降趋势，EEP+EE和LEP+EE组SUR2A蛋白表达水平明显降低。（3）和EEP组相比，CHE+EEP组kir6.2mRNA表达水平明显下降，kir6.2蛋白表达水平明显升高，SUR2A mRNA表达水平呈下降趋势，SUR2A蛋白表达水平明显下降。和EEP+EE组相比，CHE+EEP+EE组kir6.2mRNA表达水平下降趋势，kir6.2蛋白表达水平呈降低趋势，SUR2A mRNA表达水平明显升高，SUR2A蛋白表达水平明显升高。和LEP组相比，CHE+LEP组kir6.2mRNA表达水平呈下降趋势， kir6.2蛋白表达水平呈下降趋势， SUR2AmRNA表达水平呈升高趋势，SUR2A表达水平明显升高。和LEP+EE组相比，CHE+LEP+EE组kir6.2mRNA表达水平明显升高，kir6.2蛋白表达水平呈下降趋势，SUR2A mRNA表达水平呈降低趋势，SUR2A表达水平明显升高。研究结论：（1）力竭运动导致了大鼠运动性心肌损伤，EP诱导了减轻力竭运动致运动性心肌损伤保护效应（。2）心肌KATP通道kir6.2mRNA表达水平在EP减轻力竭运动致运动性心肌损伤保护效应中未发生明显变化，而SUR2A mRNA表达水平在该心肌损伤保护效应中发生明显变化。同时该通道kir6.2和SUR2A蛋白表达水平在此心肌保护效应中明显降低。提示心肌KATP通道通过kir6.2和SUR2A水平的变化参与了减轻力竭运动致大鼠运动性心肌损伤保护效应。（3）在EP减轻力竭运动致运动性心肌损伤保护效应中，PKC调控了心肌KATP通道kir6.2和SUR2A的表达，表明在心肌KATP通道介导EP心肌保护效应信号转导途径中，PKC是该通道上游中介物质。 CHE的使用对心肌KATP通道kir6.2和SUR2A表达具有不同影响，提示PKC对kir6.2和SUR2A表达调控的机制不一样，具体机制尚需深入探讨。
赵刚[7]（2011）在《调节ATP-敏感性钾通道功能的药物与内源性物质对脑线粒体呼吸功能的影响及其分子机制》文中进行了进一步梳理脑血管病,特别是其中最为常见的缺血性脑血管疾病严重危害人类健康。而溶栓后的再灌注过程可进一步加重缺血组织损伤。缺血及再灌注损伤的机制可能涉及能量代谢障碍、自由基损伤、细胞内及线粒体内钙离子超载、兴奋性氨基酸毒性、炎症反应、线粒体损伤及细胞凋亡等。其中,对线粒体功能变化的研究成为心脑缺血性疾病研究领域的热点。线粒体（mitochondrion）是一种结构和功能复杂而敏感的细胞器,其主要功能之一是氧化磷酸化（oxidative phosphorylation）。氧化磷酸化是需氧细胞生命活动的主要能量来源,是生物体产生ATP的主要途径。因此缺血及再灌注损伤涉及的能量代谢障碍主要与线粒体的结构受损,氧化磷酸化能力下降或丧失有关,保护线粒体功能和结构的完整是药物发挥抗脑缺血活性的关键机制之一[1,2,3,4]。线粒体ATP-敏感性钾通道（mitochondrial ATP-sensitive potassium channel,mitoKATP）自发现以来,其在缺血（再灌注）损伤及预适应中的作用备受关注。已经证实,mitoKATP通道开放后可通过多种机制保护缺血组织,减轻缺血缺氧及再灌注损伤[5,6,7]。因此,寻找新型mitoKATP通道开放剂,可能意味着寻找到新型神经及心脏保护药。脑缺血（再灌注）可引起脑内离子稳态失衡,导致神经细胞内和线粒体内Ca2+超载。线粒体内升高的Ca2+可通过诱导和加重活性氧（reactive oxygen species,ROS）的形成,开放线粒体通透性转运孔（mitochondrial permeability transition pore,mPTP）,促进线粒体内凋亡相关因子释放等复杂的机制[8],最终诱导细胞凋亡,引起组织损伤。失衡的离子稳态引起组织损伤的病理及生化机制备受关注。埃他卡林是新型脂肪胺类ATP-敏感性钾通道开放剂,我室前期研究表明,其具有抗脑缺血损伤的作用[9,10]。纳他卡林是从埃他卡林衍生物中筛选出的选择性更高的ATP-敏感性钾通道开放剂[11]。基于线粒体能量代谢障碍在脑缺血损伤中的重要地位,而线粒体膜上也存在ATP-敏感性钾通道（mitoKATP）,本文以线粒体呼吸功能为主要观测指标,探讨埃他卡林和纳他卡林等药物对脑线粒体呼吸功能的影响及其与mitoKATP的关系,试图寻找新型mitoKATP通道开放剂。并对脑缺血（再灌注）损伤时脑内离子稳态失衡可能涉及的重要的内源性物质——二价金属阳离子对脑线粒体呼吸功能的影响作初步探究,思考其在脑缺血时引起病理损伤可能的生化机制。一、调节ATP-敏感性钾通道功能的药物对脑线粒体呼吸功能的影响1.大鼠脑线粒体呼吸功能特征（1）采用差速离心法,提取大鼠脑皮层线粒体。采用Clark氧电极法测定脑线粒体呼吸功能。所得线粒体结构完整,氧化磷酸化功能活性良好,可用于评价药物对其呼吸功能的影响。（2）NADH呼吸链的耗氧速率,即电子传递速率低于FAD链（P<0.001）,但呼吸控制率高于FAD链（P<0.05）。NADH呼吸链的P/O高于FAD呼吸链（P<0.01）。两条呼吸链的OPR相近,即ATP合成的效率接近。（3）线粒体反应体系中,ADP消耗完以后曲线的斜率R4′大于ADP加入前的曲线斜率R4（P<0.05）,体现了呼吸链对线粒体内膜两侧H+梯度降低的补偿能力。本文首次提出补偿指数（compensatory index,CI）的概念。NADH呼吸链的CI高于FAD呼吸链（P<0.01）。2.埃他卡林和纳他卡林等药物对脑线粒体呼吸功能的影响（1）二氮嗪可显着抑制琥珀酸的氧化（P<0.01）,而显着加快苹果酸和谷氨酸的氧化（P<0.05）。二氮嗪对FAD呼吸链的R3和R4呼吸过程均有抑制作用（P<0.01,P<0.05）,但不影响RCR。二氮嗪可增大FAD呼吸链的P/O（P<0.01）,但由于对R3的抑制更明显,使OPR降低（P<0.05）。不加外源性底物,在ATP存在时,在R4呼吸状态加入二氮嗪可显着增大脑线粒体耗氧速率（14.20±4.21）%（P<0.01）。二氮嗪可减小脑线粒体悬液在540nm处的吸光值（P<0.05）,其作用可被5-HD拮抗,显示了其开放mitoKATP通道的作用。（2）埃他卡林可抑制琥珀酸的氧化（P<0.05）,加快苹果酸和谷氨酸的氧化（P<0.05）。其对NADH呼吸链的R3呼吸没有影响,可加快R4呼吸（P<0.05）,减小RCR（P<0.01）,增大P/O和OPR（P<0.01,P<0.05）。埃他卡林对FAD链显示不同的作用特点,即不影响R4,而加快R3（P<0.01）,使RCR增大（P<0.05）,不影响P/O和OPR。埃他卡林对两条呼吸链的CI均有增强作用（P<0.05）。不加外源性底物,在ATP存在时,在R4或R4′呼吸状态加入埃他卡林均可显着增大脑线粒体耗氧速率（P<0.05）。（4）纳他卡林可加快苹果酸和谷氨酸的氧化（P<0.05）,抑制琥珀酸的氧化（P<0.05）,且其抑制琥珀酸氧化的作用可被5-HD拮抗,说明纳他卡林抑制琥珀酸氧化的作用与其开放mitoKATP通道有关。纳他卡林对NADH呼吸链的R3呼吸没有影响,可加快R4呼吸（P<0.05）,减小RCR（P<0.05）,增大P/O和OPR（P<0.05,P<0.01）。纳他卡林可增大FAD呼吸链的RCR（P<0.05）。纳他卡林对NADH呼吸链和FAD呼吸链的CI均有增强作用（P<0.05,P<0.01）。不加外源性底物,在ATP存在时,在R4′呼吸状态加入纳他卡林可显着增大脑线粒体耗氧速率（7.58±2.76）%（P<0.05）,其作用可被5-HD拮抗（P<0.05）。纳他卡林可减小脑线粒体悬液在540nm处的吸光值（P<0.001）,其作用可被5-HD拮抗（P<0.001）。证明纳他卡林对mitoKATP通道有开放作用。（5）5-HD本身对脑线粒体呼吸功能有影响。表现在加快基础耗氧（P<0.01）,增大P/O、OPR和CI（P<0.05,P<0.05,P<0.01）。硝苯地平对脑线粒体R4呼吸没有显着影响,对R3、RCR、P/O和OPR均有抑制作用（P<0.05,P<0.01,P<0.01,P<0.01）。二、重要的内源性物质——二价金属阳离子对线粒体呼吸功能的影响1.镁离子对线粒体呼吸功能的影响（1）Mg2+可加快脑线粒体基础耗氧（15.90±13.74）%（P<0.05）,埃他卡林可增强其作用（P<0.05）,此时,Mg2+可使脑线粒体基础耗氧速率增大（44.50±9.50）%（P<0.05）。在ATP存在时,Mg2+可急剧加快脑线粒体耗氧速率（P<0.001）,迅速造成体系氧耗竭。（2）5-HD可浓度依赖性地部分拮抗Mg2+能量依赖性加速耗氧的效应。硝苯地平对Mg2+能量依赖性加速耗氧的效应没有影响。呼吸链抑制剂鱼藤酮可完全阻断Mg2+能量依赖性加速耗氧的效应。（3）Mg2+对心肌、肝脏和肾的线粒体也有能量依赖性加速耗氧的作用。说明,Mg2+能量依赖性加速线粒体耗氧的现象有一定的普遍性。2.钙离子对脑线粒体呼吸功能的影响Ca2+可在ATP存在时显着加快脑线粒体耗氧速率（P<0.05）,其增大幅度小于Mg2+。5-HD和硝苯地平都不影响Ca2+能量依赖性加快耗氧的效应。3.钡离子和锌离子对脑线粒体呼吸功能的影响ATP存在时,Ba2+可明显加快脑线粒体耗氧速率。与Mg2+和Ca2+相比,其效能较低。ATP存在时,Zn2+没有加快脑线粒体耗氧速率的效应,反而使耗氧完全停止。4.钙离子和钡离子对镁离子能量依赖性加速耗氧效应的影响Ca2+和Ba2+均可明显抑制Mg2+能量依赖性加速耗氧的效应。5.镁、钙、钡离子对CCCP引起的无效呼吸作用——解偶联效应的影响Ca2+和Ba2+均可抑制CCCP引起的无效耗氧——解偶联效应。Mg2+对CCCP的解偶联效应没有影响。基于以上实验结果,本文提出以下主要观点:1.本文首次提出补偿指数的概念。即线粒体反应体系中,ADP消耗完以后曲线的斜率R4′大于ADP加入前的曲线斜率R4,我们建议将R4′和R4比值定义为“补偿指数”,其意义在于呼吸链通过三个质子泵（复合体Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ）向膜间隙泵出H+,补偿H+电化学梯度降低的能力。NADH呼吸链的补偿指数高于FAD呼吸链。2.埃他卡林、纳他卡林和二氮嗪均可抑制琥珀酸的氧化,而加快苹果酸和谷氨酸的氧化。其中纳他卡林抑制琥珀酸氧化的作用与其开放mitoKATP通道有关。三者均可对脑线粒体呼吸功能各项参数产生影响,但彼此之间存在差异。3.纳他卡林可开放脑线粒体ATP-敏感性钾通道,为新结构类型的mitoKATP通道开放剂。4.镁离子可加快脑线粒体耗氧,埃他卡林可增强其作用。镁离子、钙离子和钡离子均可能量依赖性加快脑线粒体耗氧,锌离子没有此效应,反而可使线粒体耗氧完全停止。镁离子对脑、心肌、肝脏和肾线粒体均有能量依赖性加速耗氧的效应。钙离子和钡离子可拮抗镁离子的作用。钙离子和钡离子可拮抗解偶联剂CCCP引起的无效呼吸作用,镁离子没有此效应。
范明[8]（2011）在《生理学发展研究》文中提出一、引言"十一五"期间,中国生理学有了历史上从未经历的飞速发展,形成了多专业领域百花齐放的局面。主要原因有以下几个方面。（一）国家科技投入的增加和科技政策的保障"十一五"期间,国家科技投入的增加有目共睹,这对传统学科的发展起到了至关重要的作用。生理学科已经走出求生存的阶段,步入求发展的境界。特别要提到的是在科技政策的保障方面,国家自然科学基金在保证学科的均衡发展方面做出了卓越的贡献,在生理学科方面给予了政策性支持。项目获准率高于大部分生命科学的其他学科。
严喜胜[9]（2008）在《低氧及氧化还原反应对大鼠心肌细胞IKATP的调节机制》文中认为目的:研究氧化还原剂及低氧对大鼠心室肌细胞ATP敏感性钾电流可能的调节机制。方法:分别应用全细胞和单通道膜片钳记录技术记录低氧,及氧化剂/还原剂对:氧化型谷胱甘肽/还原型谷胱甘肽（GSSG/GSH）,过氧化氢/二硫苏糖醇（H2O2 /DTT）对心肌细胞ATP敏感性钾电流的变化。结果:缺氧15分钟ATP敏感性钾电流增大,应用1mM的还原型谷胱甘肽可以使增大的ATP敏感性钾电流减小。在正常情况下,1mM的氧化型谷胱甘肽可以增大ATP敏感性钾电流,而在此基础上应用GSH 1mmol/l则能够使其发生逆转。为了进一步佐证氧化还原剂对ATP敏感性钾电流的作用,本实验还应用了H2O2和DTT,效果跟在常氧条件下GSSG 1mmol/l,GSH 1mmol/l对ATP敏感性钾电流的作用相似。为了研究氧化还原剂对ATP敏感性钾通道的调节机制,我们应用了PKA、PKC、PKG和CaMK II的阻断剂（H-89、BisindolylmaleimideⅥ、KT-5823和KN-62,KN-93）进行干预,结果表明;低氧或氧化型谷胱甘肽对ATP敏感性钾通道的增强作用与PKC,PKG, CaMK II的激活有关,但没有涉及到PKA信号转导通路。氧化还原反应与低氧对ATP敏感性钾电流的调节可能涉及到相同的信号转导通路。结论:氧化还原反应与低氧对ATP敏感性钾电流的调节可能涉及到相同的信号转导通路。
胡炀琳,万笑笑,罗丹,何欢,金肆[10]（2006）在《线粒体ATP敏感钾通道在低氧预处理抗低氧性肺损伤中的作用》文中提出目的探索线粒体ATP敏感钾通道在低氧预处理抗低氧性肺损伤中的作用。方法利用线粒体ATP敏感钾通道阻断剂5-HD和开放剂DE采用离体肺灌流方法造成大鼠肺预缺氧/缺氧损伤模型。30只大鼠随机分成5组:对照组、缺氧组、低氧预处理（HPC）+缺氧组、Diazoxide（DE）+缺氧组、5-HD+HPC+缺氧组。通过形态学观察,灌流液总蛋白含量测定,以及肺干湿重比测定,反映各组肺受损程度。结果与单纯缺氧组相比,DE+缺氧组及HPC+缺氧组肺泡及肺组织充血水肿和红细胞渗出明显减轻,肺干/湿重比较大,灌流液蛋白含量较低（P<0.05）,而5-HD+HPC+缺氧组与缺氧组无显着差异（P>0.05）。结论肺线粒体ATP敏感钾通道在低氧预处理抗低氧性肺损伤中具有保护作用。
二、ATP敏感性钾通道与心肌低氧损伤（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、ATP敏感性钾通道与心肌低氧损伤（论文提纲范文）
（1）Drp1在急性缺血缺氧损伤致线粒体质量失衡中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| Abstract |
| 摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 急性缺血缺氧损伤后多组织器官线粒体质量失衡的特征规律研究 |
| 引言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 Drp1在急性缺血缺氧损伤致线粒体质量失衡中的作用及调控机制研究 |
| 引言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 第三部分 干预Drp1对急性缺血缺氧损伤重要器官功能保护作用及临床意义研究 |
| 引言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述一 Drp1在缺血缺氧损伤中的作用及机制研究进展 |
| 参考文献 |
| 文献综述二 创伤休克血管低反应性研究进展 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表论文情况 |
| 致谢 |
（2）琥珀酸脱氢酶与mitoKATPC在大鼠心肌缺血后处理中的机制研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（3）HIF-1/HRE通路在吡那地尔后处理对大鼠缺氧复氧心肌细胞保护机制中作用的研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验方法 |
| 统计学方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（4）HIF-1调控线粒体自噬恢复七氟醚后处理减轻糖尿病心肌缺血再灌注损伤的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 七氟醚后处理促进HIF-1/BNIP3 介导的线粒体自噬减轻H9C2 心肌细胞缺氧复氧损伤的机制研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 研究材料 |
| 1.2 研究方法 |
| 1.3 研究方案 |
| 1.4 观察指标 |
| 1.5 统计分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二部分 HIF-1/BNIP3 介导的线粒体自噬在七氟醚后处理减轻SD大鼠心肌缺血再灌注损伤中的作用机制研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 研究材料 |
| 1.2 研究方法 |
| 1.3 研究方案 |
| 1.4 观察指标 |
| 1.5 统计分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三部分 去铁胺预处理联合七氟醚后处理调控HIF-1/BNIP3 介导的线粒体自噬减轻糖尿病大鼠心肌缺血再灌注损伤的机制研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 研究材料 |
| 1.2 研究方法 |
| 1.3 研究方案 |
| 1.4 观察指标 |
| 1.5 统计分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间获得的学术成果 |
| 个人简历 |
| 导师评阅表 |
（5）埃他卡林对脑神经血管单元的保护作用及其分子机制（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 一 材料 |
| 1 动物 |
| 2 主要药品及试剂 |
| 3 仪器设备 |
| 二 实验方法 |
| 1 细胞的原代培养 |
| 2 免疫细胞化学实验 |
| 3 原代细胞的鉴定 |
| 4 MTT 测定细胞存活率 |
| 5 LDH 测定实验 |
| 6 HE 染色实验 |
| 7 免疫组织化学 |
| 8 荧光染色实验 |
| 9 流式细胞仪测定细胞凋亡率实验 |
| 10 细胞线粒体膜电位的测定 |
| 11 RT-PCR/Realtime-PCR |
| 12 RIPA 裂解液提取蛋白 |
| 13 Western Blot 实验 |
| 14 透射电镜实验 |
| 15 动物组织线粒体的提取 |
| 16 氧电极测定线粒体功能 |
| 17 ELISA 实验 |
| 18 细胞缺氧模型的建立 |
| 19 大鼠缺血缺氧模型的建立 |
| 20 数据分析与统计处理 |
| 实验结果 |
| 第一部分 埃他卡林对神经血管单元缺氧损伤的保护作用 |
| 一 埃他卡林对神经血管单元主要细胞缺氧损伤的保护作用 |
| 引言 |
| 实验结果 |
| 1 埃他卡林对神经血管单元细胞缺氧损伤细胞存活率的影响 |
| 2 埃他卡林对神经血管单元细胞缺氧损伤 LDH 释放的影响 |
| 3 神经血管单元细胞表达 KATP的情况 |
| 二 埃他卡林对大鼠缺血缺氧脑损伤的保护作用 |
| 引言 |
| 实验结果 |
| 1 埃他卡林对大鼠缺血缺氧脑损伤脑组织病理改变的影响 |
| 2、埃他卡林对缺血缺氧脑损伤大鼠血脑屏障通透性变化的影响 |
| 3、埃他卡林对大鼠缺血缺氧脑损伤大鼠皮层组织 MMP-9 的表达影响 |
| 小结 |
| 第二部分 埃他卡林对神经血管单元缺氧损伤保护作用的分子机制研究 |
| 引言 |
| 实验结果 |
| 一 埃他卡林对神经血管单元缺氧损伤凋亡相关通路的影响 |
| 1 埃他卡林对神经血管单元缺氧损伤细胞凋亡形态学的影响 |
| 2 埃他卡林对神经血管单元缺氧损伤细胞凋亡率的影响 |
| 3 埃他卡林对神经血管单元缺氧损伤细胞抗凋亡作用差异比较 |
| 4 埃他卡林对神经血管单元缺氧损伤细胞凋亡相关蛋白表达的影响 |
| 5 埃他卡林对大鼠缺血缺氧脑损伤脑组织凋亡相关蛋白表达的影响 |
| 二 埃他卡林对大鼠缺血缺氧脑损伤脑线粒体功能的影响 |
| 1 埃他卡林对大鼠缺血缺氧脑损伤脑线粒体形态的影响 |
| 2 埃他卡林对大鼠缺血缺氧脑损伤脑线粒体功能的影响 |
| 3 埃他卡林对神经血管单元细胞缺氧损伤线粒脑线粒体膜电位的影响 |
| 4 埃他卡林对神经血管单元细胞缺氧损伤线粒脑线粒体膜电位维持作用的差异 |
| 5 埃他卡林对神经血管单元细胞低氧损伤 ROS 生成的影响 |
| 三 埃他卡林对缺氧损伤神经血管单元释放神经营养因子的影响 |
| 1 埃他卡林对神经血管单元缺氧损伤分泌神经营养因子的影响 |
| 2 埃他卡林对大鼠缺血缺氧脑损伤脑组织 BDNF，trkB 表达的影响 |
| 3 埃他卡林对缺氧损伤神经血管单元细胞相互作用的影响 |
| 小结 |
| 讨论 |
| 创新点 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（6）心肌ATP敏感钾通道在运动预适应诱导减轻运动性心肌损伤保护效应中变化的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 概述 |
| 第一部分 ATP 敏感钾通道与心肌保护效应研究的进展 |
| 1 ATP 敏感钾通道生物学特征 |
| 1.1 钾离子通道 |
| 1.2 ATP 敏感钾通道的结构特征 |
| 1.3 ATP 敏感钾通道基本特征 |
| 1.4 ATP 敏感钾通道生理功能 |
| 1.5 ATP 敏感钾通道开放剂及阻断剂 |
| 2 ATP 敏感钾通道与缺血预适应研究 |
| 2.1 ATP 敏感钾通道与缺血预适应 |
| 2.2 ATP 敏感钾通道与缺血预适应信号转导途径 |
| 3 心肌 ATP 敏感钾通道与 PKC |
| 3.1 PKC 结构和活化 |
| 3.2 PKC 介导的心肌保护效应 |
| 3.3 心肌 ATP 敏感钾通道与 PKC 相互关系 |
| 4 ATP 敏感钾通道与运动预适应 |
| 4.1 运动诱导的心肌保护效应 |
| 4.2 运动预适应诱导的心肌保护效应 |
| 4.3 ATP 敏感钾通道与运动预适应的研究现状 |
| 4.4 ATP 敏感钾通道介导心肌保护效应的潜在机制 |
| 5 结语和展望 |
| 6 参考文献 |
| 第二部分 运动预适应减轻力竭运动所致运动性心肌损伤保护效应 |
| 1 前言 |
| 2 实验对象与方法 |
| 2.1 实验对象 |
| 2.2 适应性跑台训练和实验分组 |
| 2.3 运动预适应动物模型的建立 |
| 2.4 运动性心肌损伤模型的建立 |
| 2.5 样本采集 |
| 2.6 实验仪器和试剂 |
| 2.7 技术路线 |
| 2.8 石蜡切片的制备 |
| 2.9 心肌组织 HE 染色 |
| 2.10 心肌组织 HBFP 染色 |
| 2.11 心肌组织缺血缺氧图像分析 |
| 2.12 心肌肌钙蛋白 I 的测定 |
| 2.13 大鼠血清 NT-proBNP 的检测 |
| 2.14 统计学处理 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 大鼠心肌 HE 染色变化 |
| 3.2 大鼠心肌 HBFP 染色及计算机图像分析 |
| 3.3 大鼠血清心肌肌钙蛋白 I 的含量变化 |
| 3.4 大鼠血清心肌 NT-proBNP 含量变化 |
| 4 分析与讨论 |
| 4.1 力竭运动与运动性心肌损伤 |
| 4.2 力竭运动致运动性心肌损伤机制 |
| 4.3 运动预适应诱导减轻力竭致运动性心肌损伤保护效应 |
| 5 结论 |
| 6 参考文献 |
| 第三部分 心肌 K_(ATP)通道 KIR6.2 和 SUR2A 在运动预适应心肌保护效应中变化的研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验对象 |
| 2.2 适应性跑台训练和实验分组 |
| 2.3 运动预适应动物模型的建立 |
| 2.4 运动性心肌损伤模型的建立 |
| 2.5 样本采集 |
| 2.6 实验仪器及试剂 |
| 2.7 技术路线 |
| 2.8 原位杂交法 |
| 2.9 实时荧光定量 PCR 法 |
| 2.10 免疫荧光组织化学方法 |
| 2.11 免疫印迹法 |
| 2.12 统计学处理 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 大鼠心肌 K_(ATP)通道亚基原位杂交实验观察 |
| 3.2 大鼠心肌 K_(ATP)通道亚基实时荧光定量 PCR 检测 |
| 3.3 大鼠心肌 K_(ATP)通道亚基免疫荧光组织化学实验观察 |
| 3.4 大鼠心肌 K_(ATP)通道亚基免疫印迹检测 |
| 4 分析与讨论 |
| 4.1 运动预适应对大鼠心肌 K_(ATP)通道 kir6.2 表达的影响 |
| 4.2 运动预适应对大鼠心肌 K_(ATP)通道 SUR2A 表达的影响 |
| 4.3 心肌 K_(ATP)通道介导 EP 心肌保护效应的机制探讨 |
| 5 结论 |
| 6 参考文献 |
| 第四部分 蛋白激酶 C 对运动预适应中心肌 K_(ATP)通道 KIR6.2 和 SUR2A表达变化的影响 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验对象 |
| 2.2 实验分组和适应性训练 |
| 2.3 运动预适应动物模型的建立 |
| 2.4 力竭运动致心肌损伤方案 |
| 2.5 样本采集 |
| 2.6 实验仪器及试剂 |
| 2.7 技术路线 |
| 2.8 原位杂交法 |
| 2.9 实时荧光定量 PCR 法 |
| 2.10 免疫荧光组织化学方法 |
| 2.11 免疫印迹法 |
| 2.12 统计学处理 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 大鼠心肌 K_(ATP)通道亚基原位杂交实验观察 |
| 3.2 大鼠心肌 K_(ATP)通道亚基实时荧光定量 PCR 检测 |
| 3.3 大鼠心肌 K_(ATP)通道亚基免疫荧光组织化学实验观察 |
| 3.4 大鼠心肌 K_(ATP)通道亚基免疫印迹检测 |
| 4 分析与讨论 |
| 4.1 PKC 和心肌 K_(ATP)通道表达调控的相互关系 |
| 4.2 PKC 调控心肌 K_(ATP)通道介导 EP 心肌保护效应的可能机制 |
| 5 结论 |
| 6 参考文献 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
| 在读期间发表论文及科研情况 |
| 主要英文缩略词汇表 |
（7）调节ATP-敏感性钾通道功能的药物与内源性物质对脑线粒体呼吸功能的影响及其分子机制（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 1.实验动物 |
| 2.主要药品及试剂 |
| 3.主要仪器设备 |
| 实验方法 |
| 1. 大鼠脑线粒体的提取 |
| 2. 大鼠心肌、肝脏和肾脏线粒体的提取 |
| 3. 大鼠脑线粒体超微结构观察 |
| 4. 线粒体呼吸功能的测定 |
| 5. 大鼠脑线粒体基质容积的测定 |
| 6. 数据分析与统计学处理 |
| 实验结果 |
| 第一部分 调节ATP-敏感性钾通道功能的药物对脑线粒体呼吸功能的影响 |
| 一、大鼠脑线粒体的呼吸功能特征 |
| 1. 大鼠脑线粒体超微结构观察 |
| 2. 大鼠脑线粒体呼吸功能特征 |
| 3. NADH呼吸链和FAD呼吸链呼吸功能的比较 |
| 4. 线粒体补偿指数（compensatory index，CI） |
| 结语 |
| 二、埃他卡林和纳他卡林等药物对脑线粒体呼吸功能的影响 |
| 1. 二氮嗪（diazoxide）对脑线粒体呼吸功能的影响 |
| 2. 埃他卡林（iptakalim）对脑线粒体呼吸功能的影响 |
| 3. 纳他卡林（natakalim）对脑线粒体呼吸功能的影响及其机制探讨 |
| 4. 5-羟基癸酸（5-HD）对脑线粒体呼吸功能的影响 |
| 5. 硝苯地平（nifedipine）对脑线粒体呼吸功能的影响 |
| 结语 |
| 第二部分 内源性物质——二价金属阳离子对线粒体呼吸功能的影响 |
| 一、镁离子对线粒体呼吸功能的影响 |
| 1. 镁离子对脑线粒体呼吸功能的影响 |
| 2. ATP存在时镁离子对脑线粒体耗氧速率的影响 |
| 3. 镁离子能量依赖性加速脑线粒体耗氧的机制探讨 |
| 4. 镁离子对心肌、肝脏及肾脏线粒体呼吸功能的影响 |
| 结语 |
| 二、钙离子对脑线粒体呼吸功能的影响 |
| 1.ATP存在时钙离子对脑线粒体耗氧速率的影响 |
| 2. 钙离子与镁离子能量依赖性加速脑线粒体耗氧效应的比较 |
| 3. 钙离子能量依赖性加速脑线粒体耗氧的机制探讨 |
| 结语 |
| 三、钡离子和锌离子对脑线粒体呼吸功能的影响 |
| 1.ATP存在时钡离子对脑线粒体耗氧速率的影响 |
| 2. 锌离子对脑线粒体呼吸功能的影响 |
| 结语 |
| 四、钙离子和钡离子对镁离子能量依赖性加速耗氧效应的影响 |
| 1. 钙离子对镁离子能量依赖性加速耗氧效应的影响 |
| 2. 钡离子对镁离子能量依赖性加速耗氧效应的影响 |
| 结语 |
| 五、钙、镁离子对CCCP引起的无效呼吸作用——解耦联效应的影响 |
| 1. 镁离子对CCCP解耦联效应的影响 |
| 2. 钙离子和钡离子对CCCP解耦联效应的影响 |
| 结语 |
| 讨论 |
| 一、大鼠脑线粒体的呼吸功能特征 |
| 二、调节ATP-敏感性钾通道功能的药物对脑线粒体呼吸功能的影响 |
| 三、内源性物质——二价金属阳离子对线粒体呼吸功能的影响 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
| 硕士期间发表文章 |
| 致谢 |
（9）低氧及氧化还原反应对大鼠心肌细胞IKATP的调节机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 正文 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 英文论文 |
| Introduction |
| Meterials and methods |
| Results |
| Discussion |
| References |
| 致谢 |
（10）线粒体ATP敏感钾通道在低氧预处理抗低氧性肺损伤中的作用（论文提纲范文）
| 材料与方法 |
| 一、离体肺灌流模型的建立 |
| 二、实验分组 |
| 三、检测 |
| 结 果 |
| 一、形态学 |
| 二、干湿重 |
| 三、灌流液总蛋白含量 |
| 讨 论 |
四、ATP敏感性钾通道与心肌低氧损伤（论文参考文献）
- [1]Drp1在急性缺血缺氧损伤致线粒体质量失衡中的作用及机制研究[D]. 段晨阳. 中国人民解放军陆军军医大学, 2020(07)
- [2]琥珀酸脱氢酶与mitoKATPC在大鼠心肌缺血后处理中的机制研究[D]. 杜康. 遵义医科大学, 2020
- [3]HIF-1/HRE通路在吡那地尔后处理对大鼠缺氧复氧心肌细胞保护机制中作用的研究[D]. 王佳琪. 遵义医科大学, 2020
- [4]HIF-1调控线粒体自噬恢复七氟醚后处理减轻糖尿病心肌缺血再灌注损伤的机制研究[D]. 杨龙. 新疆医科大学, 2020(07)
- [5]埃他卡林对脑神经血管单元的保护作用及其分子机制[D]. 冉玉华. 中国人民解放军军事医学科学院, 2012(10)
- [6]心肌ATP敏感钾通道在运动预适应诱导减轻运动性心肌损伤保护效应中变化的研究[D]. 王凯. 上海体育学院, 2012(04)
- [7]调节ATP-敏感性钾通道功能的药物与内源性物质对脑线粒体呼吸功能的影响及其分子机制[D]. 赵刚. 中国人民解放军军事医学科学院, 2011(07)
- [8]生理学发展研究[A]. 范明. 2010-2011生理学学科发展报告, 2011
- [9]低氧及氧化还原反应对大鼠心肌细胞IKATP的调节机制[D]. 严喜胜. 武汉科技大学, 2008(12)
- [10]线粒体ATP敏感钾通道在低氧预处理抗低氧性肺损伤中的作用[J]. 胡炀琳,万笑笑,罗丹,何欢,金肆. 华中医学杂志, 2006(05)