一、利用生物工程生产多烯酸油脂的探讨（论文文献综述）
吴彪[1]（2020）在《谷氨酸代谢途径对产油真菌脂肪酸积累机制研究》文中研究表明高山被孢霉是一种高产多不饱和脂肪酸（PUFAs）的产油丝状真菌,并已应用于工业化生产花生四烯酸（ARA）。经过近二十年的研究积累,高山被孢霉的PUFAs合成代谢网络已经被逐渐解析,但对高山被孢霉脂肪酸积累的机制还需进一步研究。前人初步确定了高山被孢霉谷氨酸代谢途径中编码1-吡咯啉-5-羧酸脱氢酶的基因（p5cdh）与脂肪酸合成具有很大的相关性,为探究p5cdh基因对高山被孢霉脂肪酸积累机制的影响,本研究通过同源过量表达高山被孢霉中p5cdh基因的方法构建重组菌株,对p5cdh基因与脂肪酸合成的相关性进行了验证;然后基于响应面分析法对重组菌株的发酵培养基进行优化,以期获得重组菌株的最大花生四烯酸产量。本课题主要研究结果如下:1.通过同源过量表达高山被孢霉中编码1-吡咯啉-5-羧酸脱氢酶的基因（p5cdh）从而构建了MA-p5cdh-1、MA-p5cdh-2、MA-p5cdh-3三株重组菌株。与野生型菌株相比较,重组菌株的NADPH水平和脂肪酸含量均显着提高,表明了谷氨酸代谢通路中的p5cdh基因通过提供NADPH的方式以促进高山被孢霉中脂肪酸的合成。2.基于响应面分析法对重组菌株MA-p5cdh-1的发酵培养基进行优化。通过响应面优化试验确定了重组菌株MA-p5cdh-1生产ARA的发酵培养基最佳浓度组合:92.69 g/L葡萄糖,15.41 g/L酵母提取物,2.95 g/L KH2PO4和2.97 g/L Na NO3,并通过验证可知在此条件下ARA的平均产量为9.02 g/L。结果表明ARA的产量比优化前平均提高了27.04%,成功实现了对MA-p5cdh-1发酵培养基的优化。
张明亮[2]（2019）在《海洋微生物聚酮合酶途径合成不饱和脂肪酸的分子调控机制研究》文中进行了进一步梳理二十二碳六烯酸（DHA）为ω-3不饱和脂肪酸,由于在人体中不能从头合成,它是人体必不可少的一种重要营养成分,具有重要的医药应用和营养价值。裂殖壶菌是DHA理想的来源之一,具有工业化生产前景,其合成DHA的途径为聚酮合酶途径,目前其分子调控机制研究较少,本文拟对海洋微生物聚酮合酶途径合成不饱和脂肪酸的分子调控机制进行研究,主要研究结果如下:开发稳定的DHA来源以满足日益增加消费需求意义重大。酿酒酵母菌Saccharomyces cerevisiae被FDA认证为安全菌株,其遗传操作成熟,已被用作克隆或纯化蛋白质的宿主,以及作为确定PKS簇中酶和各个模块的功能的工具,并且至今还没有关于在酿酒酵母中表达脂肪酸PKS途径合成DHA的报道,在此,我们首次在酿酒酵母菌Saccharomyces cerevisiae BJ5464-Npg A中设计并构建了Schizochytrium sp.FJU-512合成DHA的基因簇（pks）,通过酵母工程菌的异源表达获得了目标产物DHA;此外,通过分离纯化蛋白,获得了纯度较高的目的蛋白,体外实验证实了其活性。最后,利用代谢工程调控手段,大幅度提高了油脂及DHA的产量,最高油脂产量达到387.78 mg/L,DHA占总油脂含量为10.21%,DHA产量为39.57 mg/L,处于异源表达领先水平。裂殖壶菌与酿酒酵母同为单细胞真菌,很多代谢途径具有相似性。本研究进一步将代谢调控酿酒酵母工程菌增强DHA生物合成的研究结果,应用至 Schizochytrium sp.FJU-512中,并且发现苹果酸的添加可以明显的促进DHA的积累。为研究其分子调控机制,通过比较分析Schizochytrium sp.FJU-512脂质积累和脂质转换阶段全基因组转录变化。表明,当使用苹果酸时,氧化磷酸化的基因在脂质积累阶段上调,并在脂质转换阶段下调。然而,β-氧化和磷酸戊糖途径在脂质积累阶段下调,但在脂质转换阶段上调。此外,发现糖酵解和柠檬酸循环（TCA循环）受到抑制,丙酮酸分解代谢,支链氨基酸代谢,脂肪酸和维生素VB6合成代谢在两个阶段都得到了提高。前人研究表明,乙酰-Co A羧化酶（ACC）和ATP柠檬酸裂解酶（ACL）上调以增强乙酰-Co A的供应,以及苹果酸酶（ME）是促进NADPH的关键酶。然而,本研究结果显示,丙酮酸脱氢酶E2（PDHE2）和乙酰乳酸合成酶I/II/III大亚基（ILVB,ILVG和ILVI）是乙酰-Co A的主要提供者,而葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）是NADPH的主要贡献者,这为利用代谢工程手段改造裂殖壶菌进一步提高DHA产量提供理论依据。为了进一步研究脂肪酸PKS合成的机制,本研究运用蛋白晶体学的方法揭示了关键酶ER的催化机理。通过生物信息学比较分析发现,在Schizochytrium sp.FJU-512的PKS途径中,ER分别处于Orf B与Orf C亚基中,而在Shewanella piezotolerans WP3中,ER即为Pfa D,是一个单独的酶。因此,本研究对希瓦氏菌来源的PKS合成酶系中的Pfa D进行了结构解析工作。本研究在E.coli BAP1中的重组表达Pfa A、Pfa B、Pfa C和Pfa D,并纯化了这些蛋白;对PKS合成酶系Pfa D进行了结晶工作,在收集X-ray衍射数据后,获得了2.0?的蛋白晶体结构,通过分子置换法解析了Pfa D的蛋白质晶体结构。Pfa D是烯酰还原酶,总体结构由的不对称单元中的由一个同型源二聚体组成,每个亚基含有三个结构域:N-末端结构域;中心结构域形成一个经典的TIM桶形结构,桶形结构上结合一个FMN辅因子分子;C端结构域在TIM桶形结构域上形成一个盖子。我们将NAD和抑制剂（TUI）分子对接到活性部位,推测其抑制作用和催化机制,为通过蛋白质工程和代谢工程策略提高LC-PUFA积累提供理论依据和技术支持。
肖娜[3]（2019）在《高含量内源性亚油酸对耶氏解脂酵母细胞的毒性研究》文中研究说明亚油酸（linoleic acid,LA）属于多不饱和脂肪酸,是人体必需脂肪酸,参与生物体内许多重要的生理过程。但是亚油酸浓度过高时,也可能对细胞有毒性作用,因为其代谢可能涉及过氧化反应。产油微生物耶氏解脂酵母可以利用多种碳源合成胞内脂质。为了研究内源性亚油酸对耶氏解脂酵母细胞的毒性作用,本论文作了如下研究:通过将Δ12-脂肪酸脱氢酶基因转入耶氏解脂酵母细胞中,使其成功表达,提高细胞内亚油酸的比例。首先,通过基因工程手段将Δ12-脂肪酸脱氢酶基因连接到单拷贝表达载体p INA1312和多拷贝表达载体p INA1292上,得到重组表达质粒p INA1312-Δ12和p INA1292-Δ12。然后,将重组表达载体通过乙酸锂化学转化法转入到耶氏解脂酵母感受态细胞中基因组上,得到亚油酸含量较高的菌株,分别为1312-12和1292-12。将筛选出的重组菌株和对照菌株进行摇瓶培养,探究Δ12-脂肪酸脱氢酶基因过表达对耶氏解脂酵母生长、脂质积累、细胞形态等的影响。实验结果表明,Δ12-脂肪酸脱氢酶基因在耶氏解脂酵母中表达使生物量从8.50 g/L提高到12.75 g/L、脂肪酸中亚油酸的含量从7.01%提高到30.85%,酵母细胞的生长受到损害,并且重组菌株1292-12的细胞形态并非细胞与菌丝体共存,而是呈现体积较大的单细胞。为了证明亚油酸对酵母细胞的毒性作用,在发酵起始点在培养基中分别添加终浓度为10.00 g/L的鱼油或菜籽油来缓解毒性,在相同条件下进行发酵,测定重组菌株和对照菌株的生物量和油脂含量等,通过斑点试验测定其生长活力,观察其细胞形态。研究结果表明,添加鱼油或菜籽油作为碳源进行发酵时,重组菌株和对照菌株细胞内的C18:2比例相对降低,生物量比普通培养基发酵的重组菌株略高,但细胞形态并没有太大影响。即使在培养基中添加鱼油或菜籽油对细胞活力和脂质积累具有正面影响,但仍不足以显着逆转亚油酸对酵母细胞的毒性作用。为了进一步探究耶氏解脂酵母细胞内亚油酸的毒性作用机制,在培养基中添加终浓度为250μg/m L维生素C,测定重组菌株和对照菌株的丙二醛（Malondiadehyde,简称MDA）、活性氧（reactive oxygen species,简称ROS）、过氧化氢酶CAT和超氧化物歧化酶SOD等与脂质氧化水平相关的指标。当用维生素C处理时,相比未用维生素C处理的重组菌株,1292-12菌株细胞内的MDA含量从1.05 nmol/mg蛋白质降低到0.61 nmol/mg蛋白质;ROS含量比未用维生素C处理的低,过氧化氢酶（CAT）和超氧化物歧化酶（SOD）的活性分别增加40%和87%。实验结果表明,高含量内源亚油酸对耶氏解脂酵母具有一定的毒性作用,并且与脂质过氧化过程关系密切,添加维生素C能够缓解亚油酸对酵母细胞的毒性作用,为研究多不饱和脂肪酸对细胞的毒性作用机制提供了理论基础。
李志朋[4]（2019）在《裂殖壶菌利用聚酮合成酶途径合成ω-3多不饱和脂肪酸代谢机制》文中研究指明近年来,多不饱和脂肪酸（Polyunsaturated fatty acids,PUFAs）尤其是ω-3族的二十二碳六烯酸（Docosahexaenoic acid,DHA）和二十碳五烯酸（Eicosapentaenoic acid,EPA）,在食品、医疗、保健等领域得到广泛的应用,其需求也逐渐增加。裂殖壶菌（Schizochytrium sp.）因其生物量大、易于异养发酵和油脂含量丰富等优点,目前已逐渐被人们用做DHA生产的主要来源。然而,除DHA外裂殖壶菌的其他PUFAs含量仍然处于较低水平,这与该菌株中被认为PUFAs主要合成途径——聚酮合成酶（Polyketide synthases,PKS）途径的代谢与调控机制尚不明确密切相关。因此,限制了裂殖壶菌PUFAs生产的进一步发展。本研究以Schizochytrium ATCC1381为出发菌株,利用代谢工程手段对其PKS途径相关基因进行改造,结合代谢组学技术分析裂殖壶菌利用PKS途径合成PUFAs的作用机理。同时,根据自适应进化的原理对裂殖壶菌进行高糖驯化,并结合转录组和代谢组技术分析高糖驯化对PKS途径合成PUFAs的影响。在此基础上,通过对改造菌株进行分批补料发酵,有效提高PUFAs的产量。主要研究内容和结果如下:（1）利用同源重组方式对PKS途径的重要底物合成基因——丙二酰辅酶A:ACP转酰酶（Malonyl-coA:ACP transferase,MAT）基因,进行过表达研究。结果表明,MAT过表达菌株总油脂和PUFAs产量分别增加了10.1%和24.5%。代谢组学分析显示,MAT过表达菌株的细胞内葡萄糖吸收加速,而三羧酸循环（TCA）减弱,这可能会提供更多乙酰辅酶-A,用于合成PUFAs。同时,过表达菌株胞内胡萝卜素含量降低,会进一步促使碳通量转向PUFAs合成。MAT过表达菌株的发酵罐补料分批发酵的结果表明:其总油脂的产量进一步增加至110.5 g/L,比原始菌株提高39.6%;DHA和EPA产量提高至47.39 g/L和1.65 g/L,分别增加了 81.5%和172.5%。（2）对裂殖壶菌PKS基因簇中的链长因子（CLF）、脱氢酶（DH）基因、酮酰基还原酶（KR）和酮基合成酶（KS）基因进行基因敲除,探究PKS途径中关键基因与PUFAs合成之间的内在关联。结果表明,一方面,DH和CLF基因敲除,敲除菌株PUFAs产量分别降低了65.85%和84.24%,而脂质中饱和脂肪酸（SFAs）的比例略有增加。同时,CLF基因的敲除使22碳PUFAs 比例降低了57.51%。DH基因敲除突变体的每种PUFA的产量均下降。结合蛋白质结构预测分析表明,CLF基因对PUFAs合成中的碳链延伸具有重要作用,特别是对20碳至22碳PUFAs的最终延伸。代谢组学分析也表明,两种基因的破坏导致PUFAs的合成减少,继而削弱了糖酵解和三羧酸循环途径。另一方面,采用CRISPR Cas9技术对KR和KS进行敲除,敲除菌株的总油脂产量未受影响,DHA和DPA的比例显着降低（12～16%）,而饱和脂肪酸比例增加。本研究推测MAT、烯酰还原酶（ER）和DH为PKS和FAS两条途径的纽带基因;而另一类基因在PKS途径合成过程有作用,如KR、KS和CLF基因仅存在于PKS途径合成过程。（3）基于PKS基因簇中关键基因对PUFAs积累的影响,进一步开展了裂殖壶菌的高糖驯化研究。经过30代驯化,得到高糖驯化菌株Schizochytrium sp.HG-20,总油脂含量提升47.75%,达到26.3 g/L;油脂中EPA 比例提高204.14%,DHA提高18.12%。通过转录组学分析结果表明,驯化菌株与原始菌株相比,在糖酵解、FAS途径和PKS途径等有显着提升,其中关键基因3-磷酸甘油激酶（GAPD）、3-酮脂酰-ACP还原酶（FabG1）和酮酰基还原酶（KR）基因表达量上调最高,PKS基因簇中KR和酰基异构酶（IS）等基因上调表达在优化PUFAs的组成比例中起着重要作用。而氨基酸合成、磷酸戊糖等竞争途径降低,增加了 PUFAs合成的碳源供给。发酵罐补料分批实验进一步表明,驯化菌株的生物量和油脂总量可达241.3 g/L和94.6 g/L,相较于原始菌株提升75.2%和15.5%。其中DHA占总油脂比例为38.68%,相较于原始菌株提高23.77%,产量达 34.89 g/L;EPA 的比例为 1.91%,提高 124.70%,产量达 1.74 g/L。（4）在PKS途径合成油脂的过程中,苯甲酸类衍生物具有重要的调节作用。四种苯甲酸衍生物（苯甲酸、对氨基苯甲酸、对甲基苯甲酸和叶酸）的添加对裂殖壶菌发酵产油脂均具有促进作用,其中效果最佳的是对氨基苯甲酸,其油脂产量相较于空白增加了 56.84%。代谢组学分析结果表明,200 mg/L对氨基苯甲酸对油脂合成及相关代谢途径,如糖酵解和甲羟戊酸合成途径的促进作用最佳。同时,添加对氨基苯甲酸能够促进四氢叶酸合成,增加磷酸戊糖途径的下游代谢过程,产生更多NADPH,促进PKS和FAS途径合成油脂。
焦凯琳[5]（2019）在《微藻合成花生四烯酸和生产生物丁醇的研究》文中认为微藻具有生长快、生产力高及不占用可耕地的特点,加上其相对较高的脂质、碳水化合物和蛋白质含量,在能源日趋紧张、环境问题日益突出的21世纪越来越受到关注。花生四烯酸（ARA,C20:4ω6）是一种长链多不饱和脂肪酸（LC-PUFA）,它是脑膜磷脂的主要成分之一,也是众多类花生酸的前体,具有重要的营养价值。紫球藻（红藻）富含ARA,然而,其ARA的大量积累通常发生在不利于细胞生长的条件下,限制了微藻合成ARA的商业化生产。生物丁醇是一种非常有效的生物燃料,具有与汽油相似的特性,易于利用现有的石油和天然气基础设施实现普遍应用。然而,尽管利用微藻资源生产生物丁醇的想法早己被提出,但相关研究还远远不够。为打破当前微藻合成ARA的研究瓶颈以及推动微藻生物丁醇工艺的进一步发展,本研究开展了一系列针对性工作。首先,使用适当浓度的生长激素5-氨基乙酰丙酸（5-ALA）刺激紫球藻的生长,以实现同时促进细胞生长和提高ARA产量的双重目的。结果显示,在培养基中添加20 mg L-1的5-ALA可同时提高紫球藻的生物量和ARA含量。在此条件下,ARA产量高达170.32 mg L-1,较对照组提高了 70.82%。根据培养期间脂肪酸组成、总脂质、总蛋白、总碳水化合物和光合色素含量的变化,推测5-ALA刺激下的ARA积累是以其他不饱和脂肪酸（UFA）和总蛋白为代价的,这可能与玉米黄素的减少有关。脂质组学分析显示,三酰甘油（TAG）占所有检测到的脂质的47.5±3.6%,其次是磷脂酰甘油（PG）和二甘脂酰甘油（DGDG）。由于5-ALA促进了 TAG的增加,且TAG支链中78.1±3.4%（按重量计）含有ARA,因此,ARA的增加主要来自于TAG的积累。本研究证明了引入少量5-ALA是同时提高紫球藻生物量和ARA产量的简单有效的策略,有助于了解植物激素对微藻代谢途径的影响,指导微藻生物制品的研发。其次,以葡萄糖、乙酸钠、甘油三种有机碳源为底物,探索了紫球藻的混合营养生长。此外,提出了一种新的基于性状的方法,并结合广义加性模型确定了每种有机碳源对提高细胞生物量或脂肪酸产量的最适添加剂量。结果显示,添加0.50%（w/v）的葡萄糖对紫球藻细胞生长的促进效果最好;乙酸钠可同时促进紫球藻的细胞生长以及ARA和EPA的产量;甘油对细胞生长的促进效果最好,且ARA:EPA 比值也最大。乙酸钠和甘油的最佳用量分别为0.25%（w/v）和0.38%（v/v）。以甘油的最佳剂量获得了 211.47 mg L-1的ARA产量,这是迄今为止报道的微藻合成ARA的最高产量。本研究结果表明,综合考虑多种性状,为选择经济、安全的微藻培养最佳剂量提供了一种非常有效的策略。本研究首次尝试了紫球藻的混合营养生长,证明了有机碳源可以提高紫球藻的生物量和ARA的产量,为微藻合成ARA的商业化生产提供了方向。随后,研究了氮限制诱导紫球藻合成ARA的潜力和分子机制。结果表明,氮限制显着增强了紫球藻ARA的合成,这种强化作用归因于Δ5-去饱和酶相关蛋白（Δ5-Des）的丰度上调。研究还发现,Δ5-去饱和酶相关基因（FADSD5）的表达随着细胞的生长而增加,显示了紫球藻中ARA生物合成的巨大潜力。本研究结果可为利用分子证据阐明脂肪酸的生物合成途径提供指导,且很有可能促使对紫球藻进行遗传修饰以定向增强ARA的合成成为可能。最后,介绍了以微藻为原料的工业规模生物丁醇生产装置的选择与设计,同时介绍了发酵生产生物丁醇的生物工艺技术和生物丁醇回收方法的研究进展,并以此设计了一套经济可行的生物丁醇生产工艺。此外,还讨论了生物丁醇与石油柴油、生物柴油的比较分析,以及生物丁醇兼脂类和甲烷的共同生产策略。该研究可为蓬勃发展的生物燃料行业提供急需的推动力,最终有助于应对全球能源危机和减少二氧化碳排放。
林源锋[6]（2018）在《裂壶藻突变株高产DHA调控研究》文中指出我国在2010年批准了DHA藻油为新资源食品,包括以裂壶藻（Schizochytrium sp.）、寇氏隐甲藻（Crypthecodiniumcohnii）和吾肯氏壶藻（Ulkeniaameoboida）为来源的海洋微藻。本文以裂壶藻突变株（Schizochytrium limacinum mutant strain）为原始菌株,首先观察培养过程中裂壶藻的细胞生长发育和油脂积累过程,描述其形态学特征;然后通过添加外源化学剂研究裂壶藻突变株发酵合成脂肪酸（SFAs、PUFAs和DHA）的影响,采用基于气相色谱-质谱（GC-MS）联用技术分析脂肪酸的组成及含量。最后对裂壶藻突变株的酶法破壁工艺进行响应面优化,提高了油脂产量和DHA产量,并在最佳酶解条件下对裂壶藻突变株进行50 L发酵罐放大生产。二十二碳六烯酸（Docosahexaenoic acid）是一种多不饱和脂肪酸,简称DHA。这种多不饱和脂肪酸对人体的大脑发育具有积极的促进作用,特别对婴幼儿的健康成长起到关键作用。然而,我们人体自身难以合成这种脂肪酸,需要通过外界摄取才能获得。DHA传统上来源于深海鱼油,不但鱼油DHA是鱼类食用了含有DHA的藻类和浮游生物而累积的,而且由于海洋污染等诸多因素导致市场供应不足,无法满足人们的需求,利用微生物发酵生产DHA成为主要的研究方向。主要研究成果如下:1.观察分析裂壶藻突变株的形态特征和油脂积累通过对裂壶藻突变株生长发育过程中形态的研究,直观地对其藻落形态、显微形态和电镜形态进行了描述。可以发现,随着培养时间的延长,藻体细胞进行分裂增殖,不断地裂殖生长,细胞数目逐渐增加、体积变大,生命代谢旺盛并且胞内有油脂的积累。微藻细胞开始分裂生殖,进入对数期生长,细胞数量大量增加,培养液中的营养物质被逐渐消耗,同时培养液由于微藻的生长变得浓稠,培养液颜色变深。培养约120h后,胞内油脂越来越多,逐渐连接成片状,此时微藻细胞的生长进入稳定期,产生大量油脂。2.化学添加剂对裂壶藻突变株发酵产DHA的影响考察外源化学添加剂对裂壶藻突变株发酵合成脂肪酸（SFAs、PUFAs和DHA）的影响。首先通过实验发现裂壶藻突变株在发酵期添加适量浓度的乙醇胺（ETA）、萘氧乙酸（BNOA）和水杨酸（SA）会提高裂壶藻突变株的DHA含量。经气质分析（GC-MS）可以发现,相对于对照组来说,饱和脂肪酸量有所下降而不饱和脂肪酸量有所提高。通过单因素实验发现在发酵期添加适量的三种化学添加剂均可以提高藻株合成DHA的能力,分别添加150mg/L的乙醇胺（ETA）,10mg/L的萘氧乙酸（BNOA）和0.5mg/L的水杨酸（SA）,结果显示DHA的质量分数相比于对照组分别提高了16.81%,15.52%,17.94%。然后通过正交实验,结果发现同时添加150mg/L的乙醇胺（ETA）、10mg/L萘氧乙酸（BNOA）和1mg/L水杨酸（SA）能够提高裂壶藻突变株合成DHA的能力,DHA的产量达到了6.18g/L,比对照组提高了12.77%。3.响应面法优化裂壶藻突变株的酶法破壁条件为了探索藻油提取过程中细胞破壁技术的最佳工艺条件,采用碱性蛋白酶对裂壶藻突变株进行破壁,提取胞内油脂,并研究了酶解温度、酶解时间、酶用量、pH值对油脂产量和DHA产量的影响。然后在单因素实验的基础上设计响应面实验,筛选出最佳的破壁条件,利用气相色谱-质谱联用仪（GCMS）分析了最佳条件下藻油的脂肪酸组成及含量。结果表明,在酶解温度55℃,酶解时间9h,酶用量为生物量的3%,pH 8条件下进行摇瓶发酵培养,油脂产量和DHA产量达到最高,分别为14.52 g/L和7.12 g/L。同时进行了50 L发酵罐放大实验,油脂产量和DHA产量分别达到了26.27 g/L和12.89 g/L。
张佳[7]（2017）在《海洋真菌Schizochytrium sp.发酵产DHA油脂的代谢调控研究》文中指出二十二碳六烯酸（DHA）是一种重要的ω-3多不饱和脂肪酸,具有降血脂、增强视力、促进脑细胞发育等生理功效,广泛用于食品医药行业。海洋真菌裂殖壶菌（Schizochytrium sp.）是商业化生产DHA的理想菌种,研究其发酵产DHA油脂的调控具有重要意义。本文对Schizochytrium sp.DP-16发酵产DHA油脂过程中的氮源调控和群体感应效应进行了研究。裂殖壶菌发酵产DHA油脂的氮源调控研究结果表明,氮源对细胞生长、油脂积累、油脂脂肪酸中DHA比例均产生重要影响。谷氨酸钠有利于细胞的生长,而酵母浸粉有利于油脂合成。与单一有机氮源相比,10 g/L谷氨酸钠和10 g/L酵母浸粉的复配氮源大大提高了生物量、油脂产量和DHA百分含量,发酵96 h分别达到55.83 g/L、19.50 g/L和35.68%,而无机氮源的添加则对细胞生长和油脂产量产生不同程度的抑制。发酵时间进程研究表明,培养基中碳源充足而氮源耗尽引发裂殖壶菌胞内油脂积累的启动。油脂积累调控关键酶——苹果酸酶和异柠檬酸脱氢酶活力变化分析,为阐明裂殖壶菌DHA油脂积累的氮源调控机制提供了依据。对Schizochytrium sp.DP-16发酵产DHA油脂过程中群体感应进行研究,将40 h培养液上清中加入培养16 h菌体,继续培养8 h后测得其生物量、油脂产量和油脂含量比对照组分别提高了 12.10%、83.30%和63.55%;分别利用二氯甲烷、三氯甲烷和乙酸乙酯对40 h菌体培养液上清进行萃取和GC-MS分析,推测培养液上清中存在的群体感应信号分子可能为邻苯二甲酸二异丁酯和4-甲基-5-（β-羟乙基）噻唑。将两种物质分别添加至16 h发酵液中,并监测其发酵进程,发现邻苯二甲酸二异丁酯实验组的油脂含量始终高于对照组,而4-甲基-5-（β-羟乙基）噻唑实验组与对照组结果相差不大。本研究结果初步表明Schizochytrium sp.DP-16发酵产DHA油脂过程中存在群体感应效应,培养液上清中存在群体感应效应信号分子——邻苯二甲酸二异丁酯。
班甲,陈骏佳,王帆,胡雪梅,班雯婷[8]（2014）在《高山被孢霉生产ARA发酵条件的优化研究》文中研究表明对ARA产生菌高山被孢霉的培养条件进行了研究,通过摇瓶实验考察了碳源、碳氮比、初始pH值、接种量和微量元素等对ARA的影响。结果发现在培养基中使用葡萄糖为碳源,碳氮比维持在40:150:1之间,初始pH6,接种量10%,添加VB1 100 mg/L、VB12 0.5 mg/L、生物素0.5mg/L、泛酸钙120 mg/L和谷氨酸1 g/L是较优配方（优化培养基A）。实验同时对比了使用单一氮源及混合氮源对高山被孢霉发酵产ARA的影响,结果发现使用混合氮源更有利于高山被孢霉发酵产ARA,混合氮源得到的ARA产量是使用单一氮源的2倍,且其含量占总油脂的44.5%,在此基础上获得优化培养基B。
陆姝欢,余超,李翔宇,周强,陈祥松,张玉良,肖应国,汪志明[9]（2014）在《花生四烯酸发酵生产技术的发展现状和趋势》文中研究指明花生四烯酸是婴幼儿发育的必须脂肪酸,商业化花生四烯酸主要来源为高山被孢霉发酵获得。在分析花生四烯酸发酵技术研究现状的基础上,指出其未来技术发展趋势:寻找发酵关键控制节点,通过在线实时监控技术保证发酵的稳产及高产;全过程工艺关联协调,提高后续提炼效率;研究生产排废图谱,进行副产物开发;最终依托多项技术革新,进行知识产权布局,提高产业国际竞争力。
于爱群[10]（2012）在《毕赤酵母和高山被孢霉脂肪酸脱氢酶基因功能及表达调控的研究》文中指出多数不饱和脂肪酸，尤其是多不饱和脂肪酸在人类疾病的预防和治疗方面具有重要作用。许多微生物能够积累多不饱和脂肪酸，但是关于其在微生物中的作用的报道相对较少。一些研究证明，在微生物体内，多不饱和脂肪酸也能够行使某些特异功能。但是，对于其在细胞生长发育过程中，具体参与了哪些细胞过程，发挥了哪些细胞功能,目前尚不清楚。因此，有必要进行系统研究。随着人们对于多不饱和脂肪酸需求量的日益增加，急需为多不饱和脂肪酸的生产寻找新的可替代来源。利用产油真菌等微生物发酵生产以及利用转基因方法生产有价值的多不饱和脂肪酸具有广阔的应用前景。要利用微生物发酵技术和转基因技术实现多不饱和脂肪酸的大量和优质生产，首先需要了解该微生物多不饱和脂肪酸合成的信号系统和调控机制。然而，到目前为止，对于多不饱和脂肪酸合成的关键基因—脂肪酸脱氢酶基因表达调控的分子机制的了解还相当少。因此，从分子水平探索脱氢酶基因的表达调控机制显得尤为重要。巴斯德毕赤酵母是表达外源蛋白的理想宿主。与酿酒酵母相比，其体内具有相对完整的多不饱和脂肪酸代谢系统，是研究脂肪酸代谢理想的真核模式菌株。产油丝状真菌高山被孢霉是α-亚麻酸、二高-γ-亚麻酸、花生四烯酸和二十碳五烯酸的主要生产菌株。本文选择高山被孢霉ATCC16266作为研究对象，其α-亚麻酸产量可达总脂肪酸的20%以上，是α-亚麻酸生产的优良菌株。为了阐明各种不饱和脂肪酸在微生物生长发育过程中的作用，我们利用同源重组的方法构建毕赤酵母脱氢酶基因缺失株。Fad9A基因或Fad9B基因的单缺失并未影响菌株的正常生长；当两者同时缺失时，引起了菌株的死亡。外源添加油酸恢复了菌株的生长。△Fad12突变株的生长速度明显变慢，而△Fad15突变株生长速度基本没有变化。以上结果显示：与亚油酸和α-亚麻酸相比，油酸对于菌株的生长发育更为重要；亚油酸的缺失也会影响菌株的生长速度，而α-亚麻酸的缺失似乎对菌株的生长影响不大。这些结果也在分子水平上阐明了毕赤酵母不饱和脂肪酸的合成途径，明确了每一步骤中的催化酶类及其编码基因：Fad9A基因和Fad9B基因可能属于同源基因，两者的编码蛋白是同工酶，均能行使△9-脱氢酶的功能，催化硬脂酸生成油酸；Fad12基因编码产生了△12-脱氢酶，负责将油酸转化成亚油酸；Fad15基因编码产生了△15-脱氢酶，能够在亚油酸的基础上进一步催化脱氢生成α-亚麻酸。同时，我们证明了油酸与毕赤酵母的低温耐受性和乙醇耐受性成正相关关系，而亚油酸和α-亚麻酸可能与毕赤酵母低温耐受性和乙醇耐受性之间没有明显的关系。此外，油酸、亚油酸、α-亚麻酸与毕赤酵母的甲醇耐受性之间没有关系。通过实时定量PCR技术检测了在低温和外源添加脂肪酸条件下毕赤酵母脱氢酶基因mRNA表达水平的动态变化。结果表明，低温对于脱氢酶基因转录的激活作用和外源不饱和脂肪酸对于脱氢酶基因转录的抑制作用都是快速和短暂的，而饱和脂肪酸硬脂酸的添加对于几种脱氢酶基因的表达影响不大。通过构建Fad15基因启动子与lacZ基因的融合载体并测定β-半乳糖苷酶活性的方法来确定在低温和外源脂肪酸刺激下Fad15基因启动子转录活性的变化情况。结果表明，低温能够在短时间内增加PFAD15启动子的活性，而且这种激活作用随着时间的延长而持续增强。PFAD15启动子活性在添加饱和脂肪酸后变化不大；而添加不饱和脂肪酸后，PFAD15启动子活性明显下降，不饱和程度越高，抑制作用越强。而且，不饱和脂肪酸的浓度越高、作用时间越长，抑制作用越强。这一结果与Fad15基因在转录水平上的变化规律并不一致，这说明毕赤酵母脱氢酶基因的表达可能受到细胞内脂肪酸组成变化的反馈调节作用。通过气相色谱法比较了低温和外源脂肪酸刺激后脂肪酸组成的变化情况。结果表明，在低温刺激下，油酸在总脂肪酸中的相对比例表现为持续增加；而亚油酸和α-亚麻酸的相对含量随着时间变化并没有明显的变化规律。同时，在这两种条件下，脱氢酶基因转录水平的变化与对应脂肪酸产物的变化没有相关性。这说明低温和外源不饱和脂肪酸除了在转录水平上调控基因表达发生变化之外，可能主要是在转录后水平上介导了胞内脂肪酸组成的变化。通过同源重组介导敲除的方法构建了毕赤酵母Spt23基因缺失突变株，结果发现Spt23基因缺失严重影响了菌株的生长速度，这说明Spt23p蛋白可能在菌株生长发育过程中起到了重要作用。进一步分析表明Spt23基因缺失突变株生长变缓的原因可能是由于油酸含量的降低所致。实时定量PCR的结果说明：稳定期△Spt23菌株中Fad9A基因和Fad9B基因的相对表达量显着下降、Fad12基因和Fad15基因的相对表达量变化不大。在低温和外源添加不饱和脂肪酸条件下，Spt23基因的存在与否对于Fad12基因和Fad15基因的表达并无影响，所以这两种基因的表达可能并不受Spt23p蛋白的调控。而Spt23基因缺失株Fad9A基因和Fad9B基因的表达变化情况与野生株完全不同，低温的激活作用和外源不饱和脂肪酸的抑制作用消失，说明Spt23p蛋白可能参与了低温和外源脂肪酸对于毕赤酵Fad9A基因和Fad9B基因表达的调控作用。由于对非模式微生物的丝状真菌的遗传操作较为困难，所以，高山被孢霉等产油丝状真菌中多不饱和脂肪酸合成的调控机制至今还不清楚。我们首先利用农杆菌介导T-DNA转化的方法成功构建了高山被孢霉的遗传转化体系，从而为后续的分子遗传操作奠定基础。接下来研究了不同碳源对于高山被孢霉菌体生长、油脂产生以及脱氢酶基因表达的影响情况。结果证实了三种脱氢酶基因的表达以及多不饱和脂肪酸的合成依赖于不同的碳源类型而变化，这可能是机体在面对不同生长条件时所作出的不同的应答反应，也说明了多不饱和脂肪酸的合成同样可能也受到了不同碳源代谢网络的调控。通过实时定量PCR技术和启动子报告基因融合载体的方法，研究低温和外源不饱和脂肪酸对于高山被孢霉三种脱氢酶基因表达随时间进程的影响。实时定量PCR的结果表明：低温对于三种脱氢酶基因的转录具有激活作用，外源不饱和脂肪酸对基因转录起抑制作用，而且这两种作用都是快速响应的，随时间延长逐渐减弱并消失。脂肪酸组成测定结果证明了基因转录水平变化与对应产物变化之间没有相关性。低温能够在短时间内诱导PFAD6启动子活性增加，并随时间延长而持续增强；外源不饱和脂肪酸对PFAD6启动子活性起抑制作用，其不饱和度和浓度越高，抑制作用越强，而且抑制作用是快速且持续的。以上结果说明低温和外源不饱和脂肪酸除了在转录水平上调控脱氢酶基因表达发生变化之外，可能主要在转录后水平上介导了胞内脂肪酸组成的变化。而且，脱氢酶基因的表达可能受到胞内脂肪酸组成变化的反馈调节作用。本文首次在转录水平上对毕赤酵母和高山被孢霉脱氢酶基因的表达调控机制进行了探索，为深入了解产油菌株体内脱氢酶基因表达及多不饱和脂肪酸合成对外界信号的应答机制提供了有用信息，也对应用微生物发酵和转基因技术生产多不饱和脂肪酸具有指导意义。
二、利用生物工程生产多烯酸油脂的探讨（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、利用生物工程生产多烯酸油脂的探讨（论文提纲范文）
（1）谷氨酸代谢途径对产油真菌脂肪酸积累机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 脂肪酸概述 |
| 1.2 多不饱和脂肪酸(PUFAs)的功能 |
| 1.2.1 多不饱和脂肪酸对机体的神经系统的功能和作用 |
| 1.2.2 多不饱和脂肪酸对机体细胞膜功能的作用 |
| 1.2.3 多不饱和脂肪酸对机体免疫功能的调节作用 |
| 1.3 花生四烯酸(ARA)的功能及应用 |
| 1.3.1 花生四烯酸的功能 |
| 1.3.2 花生四烯酸的应用 |
| 1.4 微生物脂质合成研究进展 |
| 1.4.1 微生物油脂 |
| 1.4.2 产油微生物 |
| 1.4.2.1 产油细菌 |
| 1.4.2.2 产油酵母 |
| 1.4.2.3 产油藻类 |
| 1.4.2.4 产油丝状真菌 |
| 1.4.3 微生物脂质积累机制 |
| 1.5 高山被孢霉脂质合成的研究进展 |
| 1.5.1 高山被孢霉发酵产脂的研究现状 |
| 1.5.2 高山被孢霉脂质合成途径的研究 |
| 1.6 谷氨酸代谢途径对高山被孢霉肪酸积累机制的研究 |
| 1.7 高山被孢霉产ARA的发酵培养基组成优化 |
| 1.8 研究目的及意义 |
| 1.9 主要研究内容 |
| 第2章 高产花生四烯酸重组菌株的构建及关键基因的验证 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与设备 |
| 2.2.1 供试菌株和质粒 |
| 2.2.2 主要试剂 |
| 2.2.3 培养基及相关溶液 |
| 2.2.4 主要仪器和设备 |
| 2.2.5 PCR引物 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 高山被孢霉基因组生物信息学分析 |
| 2.3.2 高山被孢霉总RNA的提取 |
| 2.3.3 p5cdh基因的获取及扩增 |
| 2.3.4 载体p BIG2-ura5s-ITs的构建 |
| 2.3.5 重组质粒p BIG2-ura5s-p5cdh的构建 |
| 2.3.6 重组质粒转化大肠杆菌TOP10感受态 |
| 2.3.7 重组质粒转化根癌农杆菌 |
| 2.3.8 高山被孢霉尿嘧啶营养缺陷型菌株的构建 |
| 2.3.9 根癌农杆菌介导转化高山被孢霉 |
| 2.3.10 重组高山被孢霉的鉴定 |
| 2.3.11 p5cdh基因转录水平检测 |
| 2.3.12 1-吡咯琳-5-羧酸脱氢酶活性测定 |
| 2.3.13 NADPH/NADP水平测定 |
| 2.3.14 菌体油脂提取 |
| 2.3.15 发酵罐培养及脂肪酸组成的检测 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 p5cdh基因coding序列 |
| 2.4.2 1-吡咯啉-5-羧酸脱氢酶表达质粒的构建 |
| 2.4.3 1-吡咯啉-5-羧酸脱氢酶基因对高山被孢霉脂质合成的影响 |
| 2.5 本章小结 |
| 第3章 基于响应面法优化重组菌株MA-p5cdh-1 发酵培养基 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与设备 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 主要仪器与设备 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 培养基 |
| 3.3.2 高山被孢霉MA-p5cdh-1 液体种子培养 |
| 3.3.3 高山被孢霉MA-p5cdh-1 发酵培养 |
| 3.3.4 ARA产量分析 |
| 3.3.5 高山被孢霉MA-p5cdh-1 发酵培养基组分的优化 |
| 3.3.5.1 Plackett-Burman设计试验 |
| 3.3.5.2 最陡爬坡试验 |
| 3.3.5.3 Box-Behnken设计试验 |
| 3.3.6 数据统计分析 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 Plackett-Burman设计试验结果 |
| 3.4.2 最陡爬坡试验结果 |
| 3.4.3 Box-Behnken设计试验结果 |
| 3.4.4 响应面试验分析 |
| 3.4.5 响应面最优条件验证 |
| 3.5 本章小结 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文和参加科研 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 附录 |
（2）海洋微生物聚酮合酶途径合成不饱和脂肪酸的分子调控机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 绪论 |
| 第一节 多不饱和脂肪酸概述 |
| 1.1 多不饱和脂肪酸简介 |
| 1.2 多不饱和脂肪酸功能 |
| 第二节 DHA及 EPA的微生物来源 |
| 2.1 真菌来源 |
| 2.2 藻类来源 |
| 2.3 细菌来源 |
| 第三节 LC-PUFA生物合成途径 |
| 第四节 异源表达PKS基因簇生物合成DHA和 EPA |
| 4.1 细菌中生物合成DHA和 EPA |
| 4.2 酵母中生物合成DHA和 EPA |
| 4.3 植物生物合成DHA和 EPA |
| 第五节 基因工程手段研究PKS基因簇功能 |
| 第六节 聚酮合酶三维结构研究 |
| 第七节 课题的研究意义与内容 |
| 7.1 课题研究意义 |
| 7.2 课题研究内容 |
| 第一章 酿酒酵母重组脂肪酸聚酮合成基因簇生物合成DHA |
| 第一节 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 实验菌株 |
| 1.1.2 引物设计 |
| 1.1.3 培养基 |
| 1.1.4 主要试剂 |
| 1.1.5 主要仪器 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 Orf A,Orf B,Orf C生物信息学分析 |
| 1.2.2 裂殖壶菌基因组提取 |
| 1.2.3 Saccharomyces cerevisiae BJ5464-Npg A感受态的制备 |
| 1.2.4 E.coli DH5α感受态细胞的制备 |
| 1.2.5 基因的扩增 |
| 1.2.6 PCR产物胶回收 |
| 1.2.7 载体的双酶切 |
| 1.2.8 目的片段与载体的连接(Gibson assembly) |
| 1.2.9 重组质粒转化酵母 |
| 1.2.10 酵母质粒提取 |
| 1.2.11 大肠杆菌感受态细胞的转化 |
| 1.2.12 大肠杆菌质粒的提取 |
| 1.2.13 重组克隆载体的验证 |
| 1.2.14 重组质粒在酿酒酵母中共表达 |
| 1.2.15 油脂的提取及脂肪酸组成分析[18,120] |
| 第二节 结果与分析 |
| 2.1 生物信息学分析 |
| 2.2 裂殖壶菌基因组DNA的提取 |
| 2.3 基因的扩增结果 |
| 2.4 载体的构建 |
| 2.5 大肠杆菌重组质粒双酶切验证 |
| 2.6 重组质粒的共表达及产物的检测 |
| 第三节 本章小结 |
| 第二章 Orf ABC的表达、纯化及体外酶活验证 |
| 第一节 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 实验菌株 |
| 1.1.2 引物设计 |
| 1.1.3 培养基 |
| 1.1.4 试剂 |
| 1.1.5 主要仪器设备 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 分子克隆及蛋白表达 |
| 1.2.2 粗酶液制备与纯化 |
| 1.2.3 蛋白SDS-PAGE凝胶电泳 |
| 1.2.4 蛋白浓度测定 |
| 1.2.5 体外酶活重建PKS合成途径 |
| 第二节 结果与分析 |
| 2.1 带FLAG标签的p XW55-orf A,p XW55-orf B,p XW55-orf C重组质粒的构建 |
| 2.2 蛋白纯化及体外酶活实验 |
| 2.3 带FLAG标签的p XW02-orf B,p XW06-orf C的构建 |
| 2.4 分子筛分离Orf ABC共表达蛋白及其体外实验 |
| 2.5 粗酶液直接浓缩、脱盐进行体外实验 |
| 第三节 本章小结 |
| 第三章 代谢调控增强酿酒酵母生物合成DHA能力 |
| 第一节 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 菌种 |
| 1.1.2 培养基 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.1.4 主要仪器 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 培养方法 |
| 1.2.2 生长曲线测定(OD_(600)) |
| 1.2.3 培养条件优化 |
| 1.2.4 油脂的提取及脂肪酸组成分析 |
| 第二节 结果与分析 |
| 2.1 酿酒酵母工程菌生长曲线的测定 |
| 2.2 温度对酿酒酵母工程菌生长、产油脂及DHA的影响 |
| 2.3 装液量对酿酒酵母工程菌生长、产油脂及DHA的影响 |
| 2.4 培养基对酿酒酵母工程菌生长、产油脂及DHA的影响 |
| 2.5 KH2PO4 对酿酒酵母工程菌生长、产油脂及DHA的影响 |
| 2.6 苹果酸和柠檬酸对酿酒酵母工程菌生长、产油脂及DHA的影响 |
| 2.7 丙酮酸钠对酿酒酵母工程菌生长、产油脂及DHA的影响 |
| 2.8 支链氨基酸(Val,Leu,Ile)对酿酒酵母工程菌生长、产油脂及DHA的影响 |
| 第三节 本章小结 |
| 第四章 苹果酸增强Schizochytrium sp.生物合成DHA分子调控机制 |
| 第一节 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 实验菌株 |
| 1.1.2 培养基 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.1.4 主要仪器 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 培养方法 |
| 1.2.2 生物量的测定 |
| 1.2.3 油脂的提取及脂肪酸组成分析 |
| 1.2.4 RNA提取和文库制备 |
| 1.2.5 转录组测序和组装 |
| 1.2.6 功能注释和DEGs识别 |
| 1.2.7 实时定量PCR(RT-q PCR)测定基因的表达量 |
| 第二节 结果与分析 |
| 2.1 苹果酸对Schizochytrium sp.生长代谢的影响 |
| 2.2 Schizochytrium sp.转录组的从头组装和功能注释 |
| 2.3 基因转录谱的变化和差异基因表达(DEGs)的功能注释 |
| 2.4 差异表达基因KEGG富集散点图 |
| 2.5 与NADPH和乙酰-Co A相关的差异基因表达 |
| 2.6 与脂肪酸合成相关的基因差异表达 |
| 2.7 其它细胞过程的分析 |
| 2.8 RT-qPCR验证转录组分析结果 |
| 2.9 添加剂对Schizochytrium sp.FJU-512 生长和脂肪酸谱的影响 |
| 第三节 本章小结 |
| 第五章 Shewanella piezotolerans聚酮合酶系统中PFAD(ER)的结构与功能 |
| 第一节 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 实验菌株及质粒 |
| 1.1.2 引物设计 |
| 1.1.3 实验器材 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 Pfa A,Pfa B,Pfa C和 Pfa D蛋白的生物信息分析 |
| 1.2.2 E.coli DH5α及 E.coli BAP1 感受态细胞的制备 |
| 1.2.3 基因的扩增 |
| 1.2.4 目的基因胶回收 |
| 1.2.5 载体的双酶切 |
| 1.2.6 目的片段与载体的连接(Gibson assembly) |
| 1.2.7 E.coli感受态细胞的转化 |
| 1.2.8 大肠杆菌质粒的提取 |
| 1.2.9 重组质粒的验证 |
| 1.2.10 E.coli BAP1 感受态细胞的转化 |
| 1.2.11 重组蛋白诱导表达 |
| 1.2.12 粗酶液制备及蛋白纯化 |
| 1.2.13 His6 tag去除 |
| 1.2.14 系统发育树分析 |
| 1.2.15 蛋白质结晶 |
| 1.2.16 数据收集和结构确定 |
| 1.2.17 SpPfaD晶体结构中的底物和抑制剂结合位点预测 |
| 第二节 结果与分析 |
| 2.1 物信息学分析PfaA、PfaB、PfaC与 PfaD蛋白结构域 |
| 2.2 基因的扩增结果 |
| 2.3 PfaA、PfaB、PfaC与 PfaD蛋白的表达与纯化 |
| 2.4 烯酰还原酶的系统发育分析 |
| 2.5 SpPfaD氨基酸序列分析 |
| 2.6 SpPfaD蛋白晶体的初筛、优化及晶体衍射 |
| 2.7 结合有FMN的SpPfaD整体结构 |
| 2.8 催化机制的解析 |
| 第三节 本章小结 |
| 第六章 结论与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 展望 |
| 附录1 |
| 附录2 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间承担的科研任务与主要成果 |
| 1 科研任务(参与或主持的项目) |
| 2 科研成果 |
| 2.1 文章 |
| 2.2 专利 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（3）高含量内源性亚油酸对耶氏解脂酵母细胞的毒性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 多不饱和脂肪酸 |
| 1.1.1 概述 |
| 1.1.2 多不饱和脂肪酸的应用 |
| 1.2 亚油酸 |
| 1.2.1 亚油酸的简介 |
| 1.2.2 亚油酸的应用 |
| 1.2.3 亚油酸毒性作用机制的研究 |
| 1.3 耶氏解脂酵母简介 |
| 1.4 Δ12-脂肪酸脱氢酶 |
| 1.5 维生素C的抗氧化作用研究现状 |
| 1.6 立题依据和主要研究内容 |
| 1.6.1 立题依据 |
| 1.6.2 研究内容 |
| 第二章 高含量内源性亚油酸对耶氏解脂酵母细胞的影响 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 菌株与质粒 |
| 2.2.2 主要试剂 |
| 2.2.3 主要培养基配方及其他试剂配方 |
| 2.2.4 主要仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 Δ12-脂肪酸脱氢酶基因的提取和克隆 |
| 2.3.2 Δ12-脂肪酸脱氢酶基因片段的回收 |
| 2.3.3 质粒DNA的提取 |
| 2.3.4 目的片段与表达载体p INA1312和p INA1292 的连接 |
| 2.3.5 大肠杆菌感受态细胞的制备 |
| 2.3.6 转化及转化子的鉴定 |
| 2.3.7 耶氏解脂酵母感受态细胞的制备 |
| 2.3.8 乙酸锂法转化 |
| 2.3.9 重组酵母基因组的提取及其转化子的鉴定 |
| 2.3.10 耶氏解脂酵母重组菌株和对照菌株的发酵培养 |
| 2.3.11 生物量的测定 |
| 2.3.12 发酵液中葡萄糖浓度和NH4+含量的测定 |
| 2.3.13 油脂的提取与含量的测定 |
| 2.3.14 生存力测定及细胞形态、菌落形态观察 |
| 2.3.14.1 生存力测定 |
| 2.3.14.2 细胞形态、菌落形态观察 |
| 2.3.15 数据处理方法 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 Δ12脂肪酸脱氢酶基因的克隆及质粒表达载体的构建 |
| 2.4.1.1 Δ12脂肪酸脱氢酶基因的PCR扩增 |
| 2.4.1.2 重组质粒表达载体的构建 |
| 2.4.2 Δ12-脂肪酸脱氢酶基因在耶氏解脂酵母中的构建及转化子的筛选 |
| 2.4.2.1 重组耶氏解脂酵母菌株的构建 |
| 2.4.2.2 转化子的筛选 |
| 2.4.3 Δ12-脂肪酸脱氢酶基因过表达对耶氏解脂酵母生物量的影响 |
| 2.4.4 Δ12脂肪酸脱氢酶基因过表达对葡萄糖浓度和NH4+浓度的影响 |
| 2.4.5 Δ12-脂肪酸脱氢酶基因过表达对耶氏解脂酵母油脂积累和脂肪酸组成的影响 |
| 2.4.6 Δ12-脂肪酸脱氢酶基因过表达对耶氏解脂酵母细胞形态和数量的影响 |
| 2.5 讨论与小结 |
| 第三章 外源油脂和维生素C缓解亚油酸对细胞的毒性 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 实验菌株 |
| 3.2.2 培养基配方及其他试剂配方 |
| 3.2.3 主要试剂 |
| 3.2.4 主要仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 分别添加鱼油和菜籽油进行发酵培养 |
| 3.3.2 添加维生素C进行发酵培养 |
| 3.3.3 酵母细胞中丙二醛(MDA)的测定 |
| 3.3.4 酵母细胞中活性氧(ROS)的测定 |
| 3.3.5 酵母细胞内过氧化氢酶(CAT)活性检测 |
| 3.3.6 酵母细胞内超氧化物歧化酶(SOD)活性检测 |
| 3.3.7 数据处理 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 添加鱼油或菜籽油对酵母生长和代谢的影响 |
| 3.4.1.1 添加鱼油和菜籽油对酵母生长的影响 |
| 3.4.1.2 添加鱼油和菜籽油对酵母脂质积累及脂肪酸组成的影响 |
| 3.4.2 添加维生素C对酵母生长影响 |
| 3.4.2.1 添加维生素C对酵母生物量的影响 |
| 3.4.2.2 添加维生素C对重组菌株1292-12细胞形态的影响 |
| 3.4.3 添加维生素C对酵母细胞内丙二醛(MDA)含量的影响 |
| 3.4.4 添加维生素C对酵母细胞中活性氧(ROS)水平的影响 |
| 3.4.5 添加维生素C对酵母细胞内过氧化氢酶(CAT)活性的影响 |
| 3.4.6 添加维生素C对酵母细胞内超氧化物歧化酶(SOD)活性的影响 |
| 3.5 讨论与小结 |
| 第四章 结论与展望 |
| 4.1 结论 |
| 4.2 展望 |
| 参考文献 |
| 研究生期间主要成果 |
| 致谢 |
（4）裂殖壶菌利用聚酮合成酶途径合成ω-3多不饱和脂肪酸代谢机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 多不饱和脂肪酸 |
| 1.1.1 多不饱和脂肪酸的种类 |
| 1.1.2 多不饱和脂肪酸的功能 |
| 1.1.3 多不饱和脂肪酸的来源 |
| 1.1.4 多不饱和脂肪酸的市场需求 |
| 1.2 裂殖壶菌 |
| 1.2.1 裂殖壶菌的概述 |
| 1.2.2 裂殖壶菌产多不饱和脂肪酸 |
| 1.3 多不饱和脂肪酸合成途径 |
| 1.3.1 脂肪酸合成酶途径(Fatty Acid Synthase,FAS) |
| 1.3.2 聚酮合成酶途径(Polyketide Synthase,PKS) |
| 1.3.3 基因工程在裂殖壶菌PKS基因簇研究中的应用 |
| 1.3.4 其他微生物PKS途径合成多不饱和脂肪酸 |
| 1.3.5 组学技术在裂殖壶菌PKS途径研究中的应用 |
| 1.3.6 PKS途径和FAS途径的差异 |
| 1.4 定向驯化对裂殖壶菌产多不饱和脂肪酸的影响 |
| 1.5 外源物质添加对裂殖壶菌产多不饱和脂肪酸的影响 |
| 1.6 本论文的研究目的与研究内容 |
| 1.6.1 研究目的 |
| 1.6.2 研究内容 |
| 第二章 裂殖壶菌中过表达丙二酰辅酶A转移酶(MAT)基因对脂肪酸合成的影响机制 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 菌株 |
| 2.2.2 培养条件 |
| 2.2.3 实验试剂和仪器设备 |
| 2.2.4 裂殖壶菌MAT基因的克隆 |
| 2.2.5 MAT过表达质粒构建 |
| 2.2.6 MAT过表达体系导入裂殖壶菌 |
| 2.2.7 实时定量PCR(RT-qPCR)分析 |
| 2.2.8 MAT酶活性测定 |
| 2.2.9 生物量测定 |
| 2.2.10 葡萄糖浓度测定 |
| 2.2.11 油脂提取和组分分析 |
| 2.2.12 代谢组学分析 |
| 2.2.13 发酵罐补料分批发酵 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 MAT基因的克隆与鉴定 |
| 2.3.2 MAT基因在裂殖壶菌中的过表达分析 |
| 2.3.3 MAT过表达对裂殖壶菌细胞生长和油脂积累的影响 |
| 2.3.4 MAT过表达菌株的比较代谢组分析 |
| 2.3.5 MAT过表达对裂殖壶菌脂肪酸合成相关代谢机制的影响 |
| 2.3.6 MAT过表达菌株的补料分批发酵 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 裂殖壶菌PKS基因簇关键基因敲除及其代谢机制分析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 菌株 |
| 3.2.2 培养条件 |
| 3.2.3 实验试剂和仪器 |
| 3.2.4 裂殖壶菌PKS基因簇的克隆 |
| 3.2.5 构建DH和CLF基因敲除载体 |
| 3.2.6 敲除载体导入裂殖壶菌 |
| 3.2.7 CRISPR Cas9技术对KR和KS的基因敲除 |
| 3.2.8 定量实时PCR(RT-PCR)分析 |
| 3.2.9 油脂提取和组分分析 |
| 3.2.10 代谢组学样品的取样和检测 |
| 3.2.11 代谢组学数据分析 |
| 3.2.12 蛋白结构预测 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 DH和CLF基因敲除 |
| 3.3.2 CRISPR Cas9对KR和KS敲除 |
| 3.3.3 基于基因改造对裂殖壶菌PKS基因簇的代谢路径分析 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 裂殖壶菌的定向驯化研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 菌株 |
| 4.2.2 培养条件 |
| 4.2.3 实验试剂和仪器 |
| 4.2.4 驯化过程 |
| 4.2.5 分批发酵 |
| 4.2.6 葡萄糖测定 |
| 4.2.7 油脂提取和组分测定 |
| 4.2.8 转录组学分析 |
| 4.2.9 代谢组学分析 |
| 4.2.10 发酵罐补料分批发酵 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 高糖驯化的结果 |
| 4.3.2 抗氧化自由基(ROS)驯化的结果 |
| 4.3.3 高糖驯化菌株与ROS驯化菌株结果对比 |
| 4.3.4 高糖驯化菌株生长曲线 |
| 4.3.5 高糖驯化菌株的转录组学分析 |
| 4.3.6 高糖驯化菌株的代谢组学分析 |
| 4.3.7 高糖驯化菌株发酵罐补料分批发酵培养 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 添加苯甲酸衍生物改善裂殖壶菌油脂积累 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 菌株 |
| 5.2.2 培养条件 |
| 5.2.3 实验试剂和仪器 |
| 5.2.4 苯甲酸类衍生物的添加方式 |
| 5.2.5 油脂提取和组分分析 |
| 5.2.6 定量RT-PCR分析 |
| 5.2.7 代谢组学分析 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 不同苯甲酸衍生物对裂殖壶菌生物量的影响 |
| 5.3.2 不同苯甲酸衍生物对裂殖壶菌油脂产量的影响 |
| 5.3.3 对氨基苯甲酸(ABA)添加对裂殖壶菌油脂组分的影响 |
| 5.3.4 不同浓度的ABA添加下裂殖壶菌的代谢物分析 |
| 5.3.5 200 mg/L ABA添加下裂殖壶菌的代谢物分析 |
| 5.3.6 ABA添加对裂殖壶菌代谢路径的影响 |
| 5.4 本章小结 |
| 第六章 结论与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 创新 |
| 6.3 展望与建议 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在读期间科研成果 |
| 致谢 |
（5）微藻合成花生四烯酸和生产生物丁醇的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 微藻 |
| 1.3 微藻生物技术 |
| 1.4 微藻营养成分 |
| 1.4.1 氨基酸和蛋白质 |
| 1.4.2 糖类和碳水化合物 |
| 1.4.3 脂质和脂肪酸 |
| 1.5 花生四烯酸 |
| 1.5.1 花生四烯酸的价值 |
| 1.5.2 花生四烯酸的来源 |
| 1.5.3 花生四烯酸的生物合成途径 |
| 1.6 培养条件对微藻脂质和脂肪酸组成的影响 |
| 1.6.1 批次培养收获时间的影响 |
| 1.6.2 半连续和连续培养 |
| 1.6.3 光强和光照周期的影响 |
| 1.6.4 生长温度的影响 |
| 1.6.5 营养盐或培养基组分的影响 |
| 1.7 微藻生物燃料 |
| 1.7.1 生物柴油 |
| 1.7.2 生物乙醇 |
| 1.7.3 生物甲烷 |
| 1.7.4 生物丁醇 |
| 1.8 本论文的选题意义和研究内容 |
| 1.8.1 本论文的选题意义 |
| 1.8.2 本论文的研究内容 |
| 第二章 5-氨基乙酰丙酸对紫球藻合成花生四烯酸的影响 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.2.1 藻种及其培养条件 |
| 2.2.2 藻细胞浓度的测量 |
| 2.2.3 脂质和脂肪酸分析 |
| 2.2.4 FTIR分析化合物组分 |
| 2.2.5 光合色素的测定 |
| 2.2.6 LC-mass/mass法分析脂质组成 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 5-ALA对紫球藻细胞生长的影响 |
| 2.3.2 5-ALA对紫球藻脂肪酸的影响 |
| 2.3.3 5-ALA对总化合物含量的影响 |
| 2.3.4 5-ALA对紫球藻光合色素的影响 |
| 2.3.5 甘油脂的定量分析 |
| 2.4 本章结论 |
| 第三章 有机碳对紫球藻合成花生四烯酸的作用效果研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.2.1 微藻培养体系 |
| 3.2.2 紫球藻细胞生物量的测定 |
| 3.2.3 有机碳含量的测定 |
| 3.2.4 脂质和脂肪酸分析 |
| 3.2.5 GAMs建模 |
| 3.2.6 性状的量化计算 |
| 3.2.7 其他分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 有机碳源对紫球藻细胞生长的影响 |
| 3.3.2 有机碳源对紫球藻脂肪酸的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 有机碳源对紫球藻细胞生物量和ARA产量的影响 |
| 3.4.2 性状生态学方法在优化培养条件中的作用 |
| 3.5 本章结论 |
| 第四章 氮限制对紫球藻合成花生四烯酸的作用效果研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.2.1 微藻培养系统和生理参数测定 |
| 4.2.2 FADSD5的分离和定量以及Δ5-Des的定量 |
| 4.2.3 统计分析 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 紫球藻基本生理参数对氮限制的响应 |
| 4.3.2 紫球藻脂肪酸的合成对氮限制的响应 |
| 4.3.3 紫球藻假定去饱和酶相关基因和相关蛋白对氮限制的响应 |
| 4.3.4 生理参数与分子参数之间的关系 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 本章结论 |
| 第五章 微藻生物丁醇工艺设计—技术评估和经济分析 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 微藻原料生产 |
| 5.2.1 应用生物工程筛选微藻 |
| 5.2.2 微藻培养 |
| 5.2.3 收获和脱水方法 |
| 5.3 生物丁醇生产 |
| 5.3.1 细菌的筛选 |
| 5.3.2 ABE发酵生产生物丁醇 |
| 5.3.3 生物丁醇的分离和纯化 |
| 5.4 生物丁醇、石油柴油和生物柴油的比较分析 |
| 5.4.1 生物丁醇与石油柴油的比较 |
| 5.4.2 生物丁醇与生物柴油的比较 |
| 5.5 微藻生物量与其它原料生产生物丁醇的LCA分析 |
| 5.6 微藻同时生产生物丁醇、油脂和气体 |
| 5.6.1 单一生物丁醇生产与生物丁醇兼油脂生产的比较 |
| 5.6.2 单一生物丁醇生产与生物丁醇兼甲烷生产的比较 |
| 5.7 本章结论 |
| 第六章 结论与展望 |
| 6.1 全文总结 |
| 6.2 本论文的创新之处 |
| 6.3 不足与展望 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（6）裂壶藻突变株高产DHA调控研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 1 绪论 |
| 1.1 DHA |
| 1.1.1 DHA的结构与性质 |
| 1.1.2 DHA的生理功能 |
| 1.1.3 DHA的来源 |
| 1.1.4 DHA的应用 |
| 1.2 微生物发酵生产DHA的研究进展 |
| 1.2.1 裂壶藻的研究 |
| 1.2.2 微生物发酵工艺的优化 |
| 1.2.3 微生物中DHA的合成途径 |
| 1.2.4 微生物的诱变选育 |
| 1.2.5 脂肪酸的检测 |
| 1.3 本研究的意义和内容 |
| 1.3.1 研究意义 |
| 1.3.2 研究内容 |
| 2 裂壶藻突变株的生长发育和油脂积累 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料与试剂 |
| 2.1.2 主要仪器设备 |
| 2.1.3 实验方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 藻落形态特征 |
| 2.2.2 生物显微镜观察分析 |
| 2.2.3 电镜分析 |
| 2.3 本章小结 |
| 3 乙醇胺等对裂壶藻突变株发酵产DHA的影响 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料与试剂 |
| 3.1.2 主要仪器设备 |
| 3.1.3 实验方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 单因素试验 |
| 3.2.2 正交试验结果与分析 |
| 3.2.3 脂肪酸分析 |
| 3.3 本章小结 |
| 4 响应面法优化裂壶藻突变株的酶法破壁工艺 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 材料与试剂 |
| 4.1.2 主要仪器设备 |
| 4.1.3 实验方法 |
| 4.1.4 试验设计 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 单因素试验 |
| 4.2.2 响应面试验 |
| 4.2.3 脂肪酸分析 |
| 4.2.4 发酵罐试验 |
| 4.3 本章小结 |
| 5 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 创新之处 |
| 5.3 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
（7）海洋真菌Schizochytrium sp.发酵产DHA油脂的代谢调控研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 二十二碳六烯酸(DHA)简介 |
| 1.1.1 DHA结构与功能 |
| 1.1.2 DHA来源与现状 |
| 1.1.2.1 DHA的传统来源——鱼油 |
| 1.1.2.2 DHA的新来源——海洋微生物 |
| 1.1.3 DHA的应用 |
| 1.1.3.1 DHA在医药行业中的应用 |
| 1.1.3.2 DHA在食品行业中的应用 |
| 1.1.3.3 DHA在饲料行业中的应用 |
| 1.2 微生物发酵产DHA油脂的研究进展 |
| 1.2.1 微生物发酵产DHA油脂的代谢机理 |
| 1.2.1.1 产油微生物油脂积累的代谢途径 |
| 1.2.1.2 DHA胞内生物合成的延长去饱和途径 |
| 1.2.1.3 DHA胞内生物合成的多不饱和脂肪酸合成酶途径 |
| 1.2.2 氮源对油脂发酵的代谢调控作用 |
| 1.2.3 裂殖壶菌简介 |
| 1.2.4 裂殖壶菌发酵产DHA油脂的研究进展 |
| 1.2.5 裂殖壶菌发酵产DHA油脂过程中存在的问题 |
| 1.3 本文选题意义及研究内容 |
| 1.3.1 选题意义 |
| 1.3.2 研究内容 |
| 第二章 裂殖壶菌发酵产DHA油脂的氮源调控研究 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.1.1 菌种 |
| 2.1.1.2 培养基 |
| 2.1.1.3 仪器与设备 |
| 2.1.1.4 试剂 |
| 2.1.1.5 试剂配制 |
| 2.1.2 摇瓶发酵产DHA油脂 |
| 2.1.2.1 种子液制备 |
| 2.1.2.2 摇瓶发酵 |
| 2.1.3 氮源对发酵产DHA油脂的影响 |
| 2.1.3.1 有机氮源对发酵产DHA油脂的影响 |
| 2.1.3.2 无机氮源对发酵产DHA油脂的影响 |
| 2.1.3.3 氮源浓度对发酵产DHA油脂的影响 |
| 2.1.3.4 氮源浓度对油脂合成关键酶的影响 |
| 2.1.4 分析方法 |
| 2.1.4.1 生物量测定 |
| 2.1.4.2 葡萄糖浓度测定 |
| 2.1.4.3 溶氨浓度测定 |
| 2.1.4.4 油脂含量测定 |
| 2.1.4.5 酶活测定 |
| 2.1.4.6 油脂脂肪酸组成的GC-MS分析 |
| 2.2 结果与讨论 |
| 2.2.1 葡萄糖标准曲线的绘制 |
| 2.2.2 溶氨标准曲线的绘制 |
| 2.2.3 有机氮源种类对DHA发酵的影响 |
| 2.2.4 无机氮源种类对DHA发酵的影响 |
| 2.2.5 不同氮源含量条件下发酵产DHA油脂的时间进程 |
| 2.2.6 不同氮源含量条件下发酵产DHA油脂的酶活研究 |
| 2.3 小结 |
| 第三章 裂殖壶菌发酵产DHA油脂的群体感应效应研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.1.1 菌种 |
| 3.1.1.2 培养基 |
| 3.1.1.3 仪器与设备 |
| 3.1.1.4 试剂 |
| 3.1.1.5 试剂配制 |
| 3.1.2 DHA油脂生成的群体感应效应研究 |
| 3.1.2.1 种子液制备 |
| 3.1.2.2 群体感应效应初步研究 |
| 3.1.2.3 细胞培养液有机溶剂萃取物的GC-MS分析 |
| 3.1.2.4 不同有机溶剂萃取物对发酵的影响 |
| 3.1.2.5 添加萃取物成分对油脂含量的影响 |
| 3.1.3 分析方法 |
| 3.1.3.1 生物量测定 |
| 3.1.3.2 油脂含量测定 |
| 3.1.3.3 酶活测定 |
| 3.1.3.4 气相色谱-质谱联用分析 |
| 3.2 结果与讨论 |
| 3.2.1 磷酸香草醛法测油脂标准曲线的绘制 |
| 3.2.2 群体感应效应初步研究 |
| 3.2.3 细胞培养液有机溶剂萃取物的GC-MS分析 |
| 3.2.3.1 二氯甲烷萃取物的GC-MS分析 |
| 3.2.3.2 三氯甲烷萃取物的GC-MS分析 |
| 3.2.3.3 乙酸乙酯萃取物的GC-MS分析 |
| 3.2.4 添加三氯甲烷萃取物的发酵过程及酶活分析 |
| 3.2.5 添加乙酸乙酯萃取物的发酵过程及酶活分析 |
| 3.2.6 添加萃取物成分对油脂含量的影响 |
| 3.3 小结 |
| 第四章 结论与建议 |
| 4.1 主要结论 |
| 4.2 建议 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录A 硕士研究生期间论文发表情况 |
（8）高山被孢霉生产ARA发酵条件的优化研究（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 菌种 |
| 1.2 培养基 |
| 1.3 培养方法 |
| 1.3.1 菌种活化 |
| 1.3.2 种子培养 |
| 1.3.3 摇瓶培养 |
| 1.3.4 发酵罐培养 |
| 1.4 实验方法 |
| 1.4.1 生物量的测定 |
| 1.4.2 粗油的提取 |
| 1.4.3 ARA的测定 |
| 1.4.4 ARA标准曲线的绘制 |
| 1.4.5 发酵液中葡萄糖含量测定 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 M.alpina发酵产ARA培养基的初步研究及优化 |
| 2.1.1 培养基p H值对M.alpina生长的影响 |
| 2.1.2 接种量对M.alpina生长的影响 |
| 2.1.3 载液量对M.alpina发酵产油脂的影响 |
| 2.1.4 碳氮比对M.alpina发酵产ARA的影响 |
| 2.1.5 维生素对M.alpina发酵产ARA的影响 |
| 2.1.6 谷氨酸对ARA发酵的影响 |
| 2.1.7 氮源对ARA发酵的影响 |
| 2.2 M.alpina在基础培养基和优化培养基A中的分批发酵 |
| 2.3 M.alpina在优化培养基B中的发酵研究 |
| 2.3.1 混合氮源的摇瓶优化研究 |
| 2.3.2 响应面法优化M.alpina发酵产ARA的碳氮源 |
| 2.3.3 M.alpina在优化培养基B中的分批发酵 |
| 3 结论 |
（9）花生四烯酸发酵生产技术的发展现状和趋势（论文提纲范文）
| 1 花生四烯酸发酵产业发展历史 |
| 2 ARA发酵技术现状 |
| 3 ARA提炼工艺发展现状和趋势 |
| 4 ARA发酵废弃物处理和利用 |
| 5 ARA国内外专利申请和授权现状 |
| 6 结语 |
（10）毕赤酵母和高山被孢霉脂肪酸脱氢酶基因功能及表达调控的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 引言 |
| 第一节 多不饱和脂肪酸的研究概况 |
| 1.1.1 多不饱和脂肪酸的概述 |
| 1.1.2 多不饱和脂肪酸的功能 |
| 1.1.3 多不饱和脂肪酸的生产 |
| 第二节 多不饱和脂肪酸合成机理的研究 |
| 1.2.1 脂肪酸脱氢酶基因的克隆及序列分析 |
| 1.2.2 脂肪酸脱氢酶的总体特征 |
| 1.2.3 脂肪酸脱氢酶功能的研究 |
| 第三节 多不饱和脂肪酸合成途径的研究 |
| 1.3.1 细菌不饱和脂肪酸的合成 |
| 1.3.2 真菌不饱和脂肪酸的合成 |
| 1.3.3 哺乳动物不饱和脂肪酸的合成 |
| 第四节 多不饱和脂肪酸合成调控的研究 |
| 1.4.1 枯草芽孢杆菌脂肪酸脱氢酶基因的表达调控 |
| 1.4.2 铜绿假单胞菌脂肪酸脱氢酶基因的表达调控 |
| 1.4.3 集胞蓝细菌脂肪酸脱氢酶基因的表达调控 |
| 1.4.4 酿酒酵母脂肪酸脱氢酶基因的表达调控 |
| 1.4.5 哺乳动物脂肪酸脱氢酶基因的表达调控 |
| 1.4.6 结论和展望 |
| 第五节 选题依据和技术路线 |
| 1.5.1 选题依据 |
| 1.5.2 工作背景及研究内容 |
| 1.5.3 技术路线 |
| 第二章 毕赤酵母脂肪酸脱氢酶缺失突变株的构建及功能分析 |
| 第一节 实验材料 |
| 2.1.1 菌株和质粒 |
| 2.1.2 引物 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 第二节 实验方法 |
| 2.2.1 培养基的配制 |
| 2.2.2 试剂的配制 |
| 2.2.3 毕赤酵母基因组 DNA 的提取 |
| 2.2.4 大肠杆菌质粒的 SDS 碱裂解法提取 |
| 2.2.5 基因敲除用同源重组片段的构建 |
| 2.2.6 毕赤酵母脂肪酸脱氢酶基因的敲除 |
| 2.2.7 毕赤酵母脂肪酸脱氢酶基因敲除株的验证 |
| 2.2.8 毕赤酵母脂肪酸脱氢酶基因敲除株的表型变化 |
| 第三节 结果与分析 |
| 2.3.1 重组敲除质粒的构建 |
| 2.3.2 敲除株的分子鉴定 |
| 2.3.3 敲除株的产物鉴定 |
| 2.3.4 敲除株的表型分析 |
| 第四节 讨论 |
| 第五节 小结 |
| 第三章 不同外界刺激对毕赤酵母脂肪酸脱氢酶基因表达的影响 |
| 第一节 实验材料 |
| 3.1.1 菌株和质粒 |
| 3.1.2 引物 |
| 3.1.3 主要试剂 |
| 3.1.4 主要仪器 |
| 第二节 实验方法 |
| 3.2.1 培养基的配制 |
| 3.2.2 试剂的配制 |
| 3.2.3 毕赤酵母总 RNA 的提取 |
| 3.2.4 除去 RNA 中的基因组 DNA |
| 3.2.5 反转录反应 |
| 3.2.6 Real-time PCR |
| 3.2.7 基因相对表达量的数据分析 |
| 3.2.8 启动子报告基因重组载体的构建 |
| 3.2.9 启动子活性分析 |
| 第三节 结果与分析 |
| 3.3.1 低温刺激对脂肪酸脱氢酶基因表达和脂肪酸组成的影响 |
| 3.3.2 外源脂肪酸对脂肪酸脱氢酶基因表达和脂肪酸组成的影响 |
| 3.3.3 启动子报告基因重组载体的构建及转化 |
| 3.3.4 低温对启动子活性的影响 |
| 3.3.5 外源脂肪酸对启动子活性的影响 |
| 第四节 讨论 |
| 第五节 小结 |
| 第四章 毕赤酵母脂肪酸脱氢酶基因潜在调控蛋白的研究 |
| 第一节 实验材料 |
| 4.1.1 菌株和质粒 |
| 4.1.2 引物 |
| 4.1.3 主要试剂 |
| 4.1.4 主要仪器 |
| 第二节 实验方法 |
| 4.2.1 培养基的配制 |
| 4.2.2 试剂的配制 |
| 4.2.3 BLAST 分析 |
| 4.2.4 毕赤酵母 Spt23 基因的敲除 |
| 4.2.5 Spt23 基因缺失对脂肪酸脱氢酶基因表达的影响 |
| 第三节 结果与分析 |
| 4.3.1 BLAST 比对结果 |
| 4.3.2 Spt23 基因的缺失株的鉴定 |
| 4.3.3 Spt23 基因缺失对菌株生长的影响 |
| 4.3.4 Spt23 基因缺失对脂肪酸脱氢酶基因表达和脂肪酸合成的影响 |
| 第四节 讨论 |
| 第五节 小结 |
| 第五章 农杆菌介导高山被孢霉遗传转化体系的研究 |
| 第一节 实验材料 |
| 5.1.1 菌株和质粒 |
| 5.1.2 引物 |
| 5.1.3 主要试剂 |
| 5.1.4 主要仪器 |
| 第二节 实验方法 |
| 5.2.1 培养基的配制 |
| 5.2.2 试剂的配制 |
| 5.2.3 潮霉素 B 对高山被孢霉抑菌浓度的确定 |
| 5.2.4 紫外诱变法筛选高山被孢霉潮霉素 B 敏感菌株 |
| 5.2.5 双元载体 pBI/hpt 的构建 |
| 5.2.6 利用三亲杂交法将双元载体 pBI/hpt 转入农杆菌中 |
| 5.2.7 农杆菌转化高山被孢霉及其检测 |
| 第三节 结果与分析 |
| 5.3.1 高山被孢霉在含有潮霉素 B 的不同培养基的生长情况 |
| 5.3.2 紫外诱变筛选高山被孢霉潮霉素 B 敏感菌株 |
| 5.3.3 双元载体 pBI/hpt 的构建 |
| 5.3.4 双元载体 pBI/hpt 转化农杆菌 |
| 5.3.5 高山被孢霉转化子的 PCR 鉴定 |
| 5.3.6 高山被孢霉转化子的 Southern blot 分析 |
| 第四节 讨论 |
| 第五节 小结 |
| 第六章 不同外界刺激对高山被孢霉脂肪酸脱氢酶基因表达的影响 |
| 第一节 实验材料 |
| 6.1.1 菌株和质粒 |
| 6.1.2 引物 |
| 6.1.3 主要试剂 |
| 6.1.4 主要仪器 |
| 第二节 实验方法 |
| 6.2.1 培养基的配制 |
| 6.2.2 试剂的配制 |
| 6.2.3 高山被孢霉生物量、油脂产量及组成的测定 |
| 6.2.4 Real-time PCR 检测高山被孢霉脂肪酸脱氢酶基因的相对表达 |
| 6.2.5 高山被孢霉脂肪酸脱氢酶基因 5’端上游区域的扩增 |
| 6.2.6 报告载体的构建及转化酿酒酵母 |
| 6.2.7 启动子活性分析 |
| 第三节 结果与分析 |
| 6.3.1 不同碳源对菌株生长、油脂产生及脂肪酸脱氢酶基因表达的影响 |
| 6.3.2 低温刺激和外源脂肪酸对脂肪酸脱氢酶基因表达的影响 |
| 6.3.3 高山被孢霉 Fad6 基因 5’端上游区域的扩增 |
| 6.3.4 重组表达载体 pYEP356-PFAD6的构建及转化 |
| 6.3.5 低温对启动子活性的影响 |
| 6.3.6 外源脂肪酸对启动子活性的影响 |
| 第四节 讨论 |
| 第五节 小结 |
| 第七章 结论与展望 |
| 第一节 结论 |
| 第二节 主要创新点 |
| 第三节 相关工作的前景展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历、在学期间发表的学术论文及研究成果 |
四、利用生物工程生产多烯酸油脂的探讨（论文参考文献）
- [1]谷氨酸代谢途径对产油真菌脂肪酸积累机制研究[D]. 吴彪. 河北工程大学, 2020(05)
- [2]海洋微生物聚酮合酶途径合成不饱和脂肪酸的分子调控机制研究[D]. 张明亮. 福建师范大学, 2019(04)
- [3]高含量内源性亚油酸对耶氏解脂酵母细胞的毒性研究[D]. 肖娜. 山东理工大学, 2019(02)
- [4]裂殖壶菌利用聚酮合成酶途径合成ω-3多不饱和脂肪酸代谢机制[D]. 李志朋. 厦门大学, 2019(08)
- [5]微藻合成花生四烯酸和生产生物丁醇的研究[D]. 焦凯琳. 厦门大学, 2019
- [6]裂壶藻突变株高产DHA调控研究[D]. 林源锋. 武汉轻工大学, 2018(01)
- [7]海洋真菌Schizochytrium sp.发酵产DHA油脂的代谢调控研究[D]. 张佳. 大连工业大学, 2017(06)
- [8]高山被孢霉生产ARA发酵条件的优化研究[J]. 班甲,陈骏佳,王帆,胡雪梅,班雯婷. 食品科技, 2014(11)
- [9]花生四烯酸发酵生产技术的发展现状和趋势[J]. 陆姝欢,余超,李翔宇,周强,陈祥松,张玉良,肖应国,汪志明. 食品研究与开发, 2014(22)
- [10]毕赤酵母和高山被孢霉脂肪酸脱氢酶基因功能及表达调控的研究[D]. 于爱群. 南开大学, 2012(07)