一、利用细菌冰核基因构建促冻杀虫基因工程菌（论文文献综述）
阿依谢姆古丽·亚库普,安尼瓦尔·库尔班,郭文超[1]（2017）在《丁香假单胞菌对亚洲玉米螟幼虫抗寒能力的影响》文中进行了进一步梳理本文用丁香假单胞菌Pseudomonas syringae处理亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis（Guenée）幼虫,使用过冷却仪测定过冷却点,分析该菌株对参试幼虫耐寒能力的影响。结果表明,亚洲玉米螟5龄非滞育幼虫抗寒能力比其他龄期非滞育幼虫强。亚洲玉米螟滞育5龄幼虫抗寒能力比非滞育5龄幼虫强。使用丁香假单胞菌处理亚洲玉米螟5龄非滞育和滞育幼虫,24 h后非滞育幼虫的过冷却点和结冰点分别提高了5.14和2.83℃。5龄滞育幼虫过冷却点和结冰点分别提高了11.25和4.65℃。丁香假单胞菌菌悬液（浓度为8×108 cfu/m L）对亚洲玉米螟具有较好的杀虫效果,非滞育5龄幼虫在（15±1）℃条件下处理24 h后平均死亡率39.1%。
姚润贤,袁哲明[2]（2013）在《冰核细菌Erwinia ananas 110冰核基因iceA的原核表达及冰核活性分析》文中研究说明为获得具有高冰核活性的基因工程菌,从冰核细菌Erwinia ananas 110扩增冰核基因iceA,将其克隆到pMD19–T载体上,转化大肠杆菌DH5α,单、双酶切鉴定并测序;阳性克隆目的片段亚克隆到表达载体pET–23a（+）上,转化大肠杆菌DH5α,单、双酶切鉴定重组质粒;阳性重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）pLysS,并经IPTG诱导表达。SDS–PAGE电泳检测表明,冰核基因iceA能够并以包涵体形式表达,相对分子质量约为180 000。冰核活性测定结果表明,重组菌BL21（DE3）pLysS/pET–ice的冰核活性与野生冰核细菌Erwinia ananas 110在–5、–4、–3、–2℃下无明显差别。
姚润贤[3]（2013）在《含冰核基因重组杆状病毒构建及其应用》文中指出冰核细菌（ice nucleation activity bacteria, INA细菌）可在低温条件下催化过冷却水形成细腻规则冰晶,已在促冻杀虫、病原微生物高敏检测、作物抗寒育种、植物冻害防除、食品冷藏保鲜和冷冻浓缩等多个领域有广泛应用。冰核细菌可显着提高不耐结冰型害虫的过冷却点,增加其冻杀死亡率,但野生冰核细菌、含冰核基因工程菌难以直接防治田间越冬害虫。本文结合昆虫杆状病毒安全性好、对人畜无害；不污染环境、专一性强,对非目标生物很少杀伤；能造成疾病的流行传播,持效性强；害虫不易产生抗药性等优点,从冰核细菌Erwinia ananas110中PCR获得高冰核活性的冰核基因iceA,将其插入苜蓿夜蛾核型多角体病毒（Autographa Califonica mutiple nuclear polyhedrosis virus,AcMNPV）多角体基因（polyhedrin,polh）下游构建重组杆状病毒AcMNPV-ice。结果如下：（1）高冰核活性iceA获得：将从冰核细菌Erwinia ananas110扩增的冰核基因iceA插入pET-23a（+）,构建重组表达载体pET-23a（+）-ice,在大肠杆菌BL21（DE3）pLysS经IPTG诱导表达和SDS-PAGE分析及小液滴冻结法冰核活性测定：冰核蛋白分子量约为180KD,并以包涵体形式存在；重组菌BL21/pET-ice冰核活性与野生冰核细菌Erwinia ananas110在温度-5、-4、-3℃冻滴率均为100%,在-2℃下冻滴率均为0%,经IPTG诱导的BL21在温度-5、-4、-3、-2℃下冻滴率均为0%。表明所扩增冰核基因iceA与野生冰核细菌冰核活性无明显差别,且表现为A型冰核活性。（2）重组杆状病毒Bacmid/polh-ice构建与应用：利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统将iceA基因和polh基因插入转移质粒pFASTBacTM Dual,构建重组转移质粒pFASTBacTMual-polh-ice,转化含穿梭载体（Bacmid）和辅助质粒的DH10Bac感受态细胞,经转座得到重组穿梭载体Bacmid/polh-ice;经PCR检测,iceA和polh插入位置正确。Bacmid/polh-ice经转染sf9细胞,收集重组杆状病毒（命名为AcV/polh-ice）上清,对获得的细胞沉淀进行SDS-PAGE电泳检测表明多角体蛋白条带约29KD,与预测分子量相一致；对注射AcV/polh-ice上清的20头甜菜夜蛾3龄幼虫,4天后虫体全部液化死亡,而作对照的20头未作处理甜菜夜蛾可继续继代繁殖。
年洪娟,陈丽梅,李昆志[4]（2009）在《Tn5转座突变技术在革兰氏阴性细菌分子遗传研究中的应用》文中认为随着广宿主载体系统的发展,Tn5及其衍生载体已经广泛应用于革兰氏阴性细菌的分子遗传学研究。主要综述了Tn5转座突变技术在生防细菌生防机理研究、细菌必需基因的鉴定、病原细菌毒力相关基因研究、代谢调控基因研究和菌株的遗传改良方面的应用研究进展。
李茜茜[5]（2009）在《利用冰晶核蛋白构建细菌细胞表面展示体系及其应用研究》文中认为冰晶核蛋白（Ice nucleation protein,简称为INP）是一种分泌型表面蛋白质,存在于丁香假单胞菌、欧文氏菌等十余种革兰氏阴性菌中。近十年来,冰晶核蛋白作为细菌细胞表面展示系统的运载蛋白受到了广泛重视,被用来展示不同种类的外源蛋白,逐渐被探索应用于各种生物技术领域。本研究通过克隆实验室自行分离的一株丁香假单胞菌高冰核活性菌株MB03的冰核基因（inaQ）,对其表达特性、表达产物的跨膜分泌活性、作为运载蛋白的表面展示性能及重组菌株在无机磷吸附和抑制软腐病原菌侵染的应用性能进行了研究,结果如下：1.冰核基因的克隆用EcoR I/Pst I酶切MB03菌株总DNA,回收4-5 kb的酶切片段构建基因文库。根据已发表inp基因的保守序列设计简并性杂交探针,通过原位杂交法从大肠杆菌文库中筛选并克隆到包含启动子序列和完整编码框的冰核基因,命名为inaQ （GenBank:EU360731）。序列比对分析表明,inaQ基因与另外3种报道的丁香假单胞菌冰核基因inaK、inaV和inaZ的序列相似性分别为89.2%、93.9%和93.4%,编码1200个氨基酸的蛋白质（InaQ）。序列结构预测表明InaQ具有冰晶核蛋白典型的三个结构域,N末端域（InaQ-N,175 aa）,C末端域（InaQ-C,49 aa）和中间重复单元结构域（976aa）。其中InaQ-N中有2个跨膜信号分子序列,而InaQ-C含有较多的亲水性氨基酸。2.InaQ表达活性和跨膜分泌活性分析通过检测大肠杆菌和恶臭假单胞菌重组菌冰核活性,证实全长inaQ在外加启动子的启动下能在宿主菌中表达并赋予宿主菌较高的冰核活性。以绿色荧光蛋白基因gfp作为报告基因构建inaQ/gfp融合基因,经NcoI/EcoRI双酶切后连接至大肠杆菌表达载体pTrcHis-C,携带该融合基因的大肠杆菌重组菌经IPTG诱导表达,对表达产物进行蛋白酶、SDS和EDTA敏感性分析以及流式细胞仪分析,结果表明InaQ/GFP融合蛋白经跨膜分泌后在宿主菌表面展示效率达到60%以上信号肽预测分析显示InaQ的N末端无明显信号肽序列,但前18位氨基酸与蛋白的分泌性质相关。利用PCR的方法构建缺失N末端前18个aa编码序列的inaQ-N’融合基因inaQ-N’/gfp,导入大肠杆菌受体菌后,经荧光显微镜镜检和流式细胞仪检测重组菌的细胞表面GFP荧光强度,结果证明InaQ-N’/GFP融合蛋白只能在细胞内表达,但无法定位于细胞表面；而对表达InaQ的C末端与GFP蛋白融合的大肠杆菌重组菌细胞表面的荧光强度测定结果表明,InaQ的C末端无法锚定于细胞表面,从而证明InaQ蛋白的跨膜转运只与N末端结构域相关。3.利用InaQ构建大肠杆菌和恶臭假单胞菌细胞表面展示系统与性能分析将inaQ-N/gfp融合基因分别插入大肠杆菌JM109表达载体pTrcHis-C和大肠杆菌-假单胞菌穿梭表达载体pYMBP的Ncol/EcoRI酶切位点,并转化大肠杆菌JMl 09和恶臭假单胞菌AB92019受体菌,得到相应重组菌株。通过免疫荧光显微镜镜检,细胞分级分离,Western Blot分析,蛋白酶、SDS和EDTA敏感性分析以及流式细胞仪分析等实验结果表明InaQ-N/GFP融合蛋白能定位于大肠杆菌和恶臭假单胞菌细胞外膜上,且表面展示效率均可达到40%以上进一步分别构建了2个和3个串联重复inaQ-N和gfp的融合基因,并分别导入大肠杆菌JM109和恶臭假单胞菌中表达。经细胞分级分离、Western Blot分析、流式细胞仪分析以及荧光显微镜镜检,结果显示以多拷贝串联重复InaQ-N结构域作为锚定单元展示GFP蛋白时,表面展示效率均提高到60%以上。因此,多个InaQ-N结构域具有协同作用,且提高了融合蛋白在两宿主菌表面的表达效率并增强了与外膜固着性能。4.大肠杆菌和恶臭假单胞菌细胞表面展示磷酸盐吸附蛋白与工程菌吸磷能力分析从大肠杆菌K-12中PCR扩增得到磷酸盐吸附蛋白（PBP）的编码基因phoS,并构建inaQ-N/phoS融合基因,然后经连接至相应表达载体后,分别导入大肠杆菌和恶臭假单胞菌受体菌中表达。经Western Blot、流式细胞仪分析以及荧光显微镜镜检,结果证明融合蛋白InaQ-N/PBP分别成功展示在大肠杆菌和恶臭假单胞菌细胞表面。通过磷酸盐吸附能力实验表明5小时内,构建的工程菌的磷酸盐吸附量分别达到80 mg/L和60 mg/L,约是两宿主菌的100倍和3倍。同时3拷贝InaQ-N融合PBP在恶臭假单胞菌表面表达时,磷酸盐吸附量高达110 mg/L,是宿主菌6倍。此外,经42℃烘干致死的大肠杆菌和恶臭假单胞菌工程菌仍具有一定的磷酸盐吸附能力。5.在恶臭假单胞菌细胞表面展示AiiA蛋白与重组菌抑制软腐病性能的初步分析从苏云金芽胞杆菌BM171中由PCR扩增得到AHL内酯酶（AiiA）的编码基因aiiA,经BglⅡ/EcoRI双酶切后替换恶臭假单胞菌表面展示体系中的gfp基因,筛选得到表达inaQ-N/aiiA融合基因的重组菌。该菌株对作用于马铃薯片上并形成软腐病病斑的胡萝卜软腐欧文氏菌表现出一定程度的抑制效果,而细胞分级分离成分测定结果显示,该重组菌细胞质和细胞外膜组分均表现出抑菌活性。尽管冰晶核蛋白作为细胞表面展示的载体蛋白已应用于多个领域,但对其跨膜分泌锚定功能相关结构域以及分泌锚定机制尚缺乏研究。本研究对克隆得到的inaQ基因及表达蛋白质InaQ的分析表明,InaQ的N末端与蛋白质的分泌锚定性能相关,这为进一步研究InaQ的分泌锚定机制提供了依据。以N末端即可作为锚定单元行使分泌锚定功能,高效展示外源蛋白于大肠杆菌和恶臭假单胞菌细胞表面,缩短了锚定单元的大小,并为展示分子量更大的外源蛋白提供了可能。磷酸盐吸附蛋白的成功展示可为目前应用研究最为广泛的强化生物除磷法在有氧、高碳和低COD条件下除磷效果低的不足,提供一种补偿性的新技术途径,而AHL内酯酶的成功展示则对细胞表面展示体系在生物防治植物软腐病领域进行了探索。
黄晓琴[6]（2009）在《山东茶树冰核细菌的分离、鉴定及其与霜冻害关系研究》文中研究表明茶树原产于我国西南地区,是一种生长在温带、亚热带和热带地区的叶用作物,低温冻害是茶树经常遭遇的农业气象灾害之一。随着茶叶种植区域的北移和近年来早生品种的推广,茶树经常会受到霜冻害的影响,茶树遭受霜冻害后,一方面会影响生长势,导致茶叶减产甚至绝收,另一方面,茶叶品质会受到影响,制成的成茶滋味和香气降低。研究表明,茶树遭受霜冻危害的轻重程度除了与低温强度及其持续时间和植物抗霜冻能力强弱有关,还与茶树叶表INA细菌数量的多少有关。冰核细菌的存在能诱发和加重霜冻害的发生,冰核活性细菌（Ice nucleation active bacteria,简称冰核细菌）可在-2℃～-5℃诱发植物细胞水结冰而发生霜冻;无冰核细菌存在的植物,一般可耐受-7℃～-8℃的低温而不发生霜冻。本研究主要对山东茶树上冰核细菌的种类进行了分离和鉴定,对冰核细菌在山东茶树上的分布规律和年消长动态进行了研究,进一步对冰核细菌与茶树霜冻害的关系进行了初步探索,并对茶树上冰核细菌的防治提出了初步研究和建议。取得的研究结果如下:对山东主产茶区日照、青岛、泰安等地茶树上的冰核细菌进行了分离调查,在山东茶树上共分离到22株具冰核活性的细菌,通过16SrDNA序列分析和生理生化培养特征,鉴定山东茶树上的冰核细菌是属于泛菌属的两个种,分别为菠萝泛菌（Pantoea ananatis）和成团泛菌（Pantoea agglomerans）。其中,菠萝泛菌共分离到15株,占68.2%,成团泛菌共分离到7株,占31.8%。两个种的菌株在泰安、日照、青岛茶区的茶树上都有分布,其中以Pantoea ananatis菌为优势种。通过对分离到的冰核细菌的冰核活性进行测定,发现山东茶树上冰核细菌的冰核活性可划分为两个等级,强冰核活性菌株（103～104/冰核）和中等冰核活性菌株（105～106/冰核）。在茶树的不同发育部位,冰核细菌的分布密度和频率是不一样的。从初展叶上较易分离到冰核细菌,其出现频率为83.3%,而老叶则较难分离得到冰核细菌,出现频率仅有14.3%。其次,各部位冰核细菌存在的密度也不相同,可以看到,冰核细菌存在的最高密度是:初展叶（芽）﹥嫩叶﹥老叶。从不同地区冰核细菌分离情况看,青岛比泰安更容易分离到冰核细菌。从冰核细菌年周期内分布规律看,在易发生秋霜冻和春霜冻时期,茶树上均存在较高密度的冰核细菌,在湿度大,降雨量多的春霜冻时期,茶树上冰核细菌的密度更高。对接菌的茶树叶片和不接菌的茶树叶片的过冷却点进行了测定,无菌茶树叶片的过冷却点是-3℃,而接菌的茶树叶片结冰的平均温度是-1.4℃,比不接菌叶片提高了1.6℃,可见冰核细菌的存在明显提高了茶树叶片的过冷却点。冰核细菌的存在,会加重茶树叶片细胞质膜的损伤,具体表现为细胞膜透性增加,相对电导率增大,SOD、POD酶活性由最初的被激活到活性下降,丙二醛含量增多。采用室内试验和室外盆栽苗试验对防治冰核细菌的方法进行了探索,发现一些药剂能破坏茶树上冰核细菌的冰核活性物质并对具有杀灭作用,筛选到了代森锰锌和福美双两种能防治冰核细菌的药剂。
谢翔,王玉,刘汉林,王贵学[7]（2006）在《冰核细菌及冰核基因的应用研究进展》文中指出引起水由液态变为固态的物质称为冰核或成核剂。冰核种类繁多,目前已发现4属23种或变种的细菌、4属11种或变种的真菌和1种病毒,它们都具成冰活性。细菌冰核是一类蛋白质,也称冰蛋白,由细菌冰核基因编码。作为生物冰核领域的研究重点,冰核细菌的研究已涉及到促冻杀虫、防霜冻、植物病害等多个领域;同时冰核细菌已成功地应用于人工降雪、制冷和高敏检测等方面,具有广阔的应用前景。主要对冰核细菌的应用研究现状和发展进行综述。
刘静,陈庆森[8]（2006）在《冰核活性细菌基因的研究进展及其应用》文中指出冰核活性细菌是一类可以诱导过冷水结冰而导致霜冻灾害的细菌,它已成为一种重要的生物资源获得广泛的研究与开发,在基础理论和应用研究方面取得了较大进展。近些年来,许多国家的学科研究者对于冰核基因的研究与开发开展了大量的工作。自1985年克隆出了第一个冰核基因后,目前已经从冰核细菌中克隆了8个冰蛋白基因并完成了测序。冰核活性细菌及基因资源具有广阔的研究开发的价值,且具有良好的应用前景。所以,对于冰核活性基因的结构特点及近年来的研究现状有个总体了解是很有必要的。本文主要介绍了冰核活性基因及其应用方面的研究进展情况。
刘静[9]（2006）在《大规模生产冰核蛋白制品及冰核活性基因的扩增研究》文中认为研究的意义:由于冰核细菌在许多方面都有着广阔的应用前景,因此大规模生产冰核活性蛋白,扩增冰核活性基因,用于含冰核基因检测,能够具有很好的经济前景和社会效益。研究的方法:（1）使用发酵法依次在摇瓶水平、5L罐及30L罐水平上,对完善培养基配方,提高冰核活性细菌生物量进行了研究,并且使用机械破碎和化学抽提的方法实现较大量的提取冰核活性蛋白。（2）使用PCR扩增技术对冰核细菌冰核活性基因的体外扩增体系和扩增条件进行了初步的研究。本论文分别使用Xanthomonas ampelinaTS206和Erwinia herbicola（A25）作为实验用菌种,主要研究内容有以下几个方面:（1）在摇瓶水平的实验中发现转速是获得较高生物量和较低副产品黄原胶的关键因素,对于细菌生物量来说,影响程度大小的顺序依次为转速>装液量>培养基的糖浓度。对细菌的产黄原胶量来说,影响程度大小的顺序依次为转速>培养基的糖浓度>装液量。在调整后的培养基条件下,菌体发酵粘度有大幅度下降,且产黄原胶能力不强,虽然发酵结束后,菌体生物量有所下降,但胶量/菌量的值较大幅下降,且降低了发酵液处理的难度。（2）采用超声波破碎和TritonX-100抽提相结合,建立了适合大规模提取Xanthomonas ampelinaTS206中冰核活性蛋白的实验路线。经过该实验可以得到,每10克当天得到的新鲜菌体,可以抽提所能得的冰核蛋白制品湿重约为1.2克,即得率为12%左右（。3）建立了本实验室提取Erwinia herbicola（A25）细菌全基因的实验方法;摸索确立了较适合本实验室菌种Erwiniaherbicola（A25）细菌全基因序列为模板的50μL反应体系的各组成量和最佳扩增条件。经过实验,建立了以Erwinia herbicola（A25）DNA为模板,使用KOD Dash酶作为扩增酶,获得4.2kb目的片段的方法,这在国外报道的Erwiniaherbicola group细菌冰核活性基因PCR扩增产物片段大小范围内。
岳思君,王文举[10]（2005）在《冰核活性细菌研究进展及其在防霜技术中的应用》文中提出冰核细菌是诱发和加重植物霜冻的重要因子,通过减少和控制冰核细菌,在霜冻防治研究方面取得了一定效果.细菌冰核是一类蛋白质,称冰蛋白,由细菌冰核基因编码,据报道已有11种冰核细菌的冰核基因被克隆并在大肠杆菌中得到表达.综述了冰核细菌生物学及分子生物学特性,以及冰核细菌在防霜技术中的应用,阐述了冰核细菌的种类、影响冰核活性的成冰因素及冰核细菌和霜冻害的关系.药剂和生防菌能够防除植物上的冰核细菌,减轻或控制霜冻危害,是防御植物霜冻的一条新途径.
二、利用细菌冰核基因构建促冻杀虫基因工程菌（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、利用细菌冰核基因构建促冻杀虫基因工程菌（论文提纲范文）
（1）丁香假单胞菌对亚洲玉米螟幼虫抗寒能力的影响（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 供试昆虫 |
| 1.2 幼虫龄期的判定 |
| 1.3 滞育诱导及判断 |
| 1.4 亚洲玉米螟过冷却点的测定 |
| 1.5 丁香假单胞菌的培养 |
| 1.5.1 培养基的配制 |
| 1.5.2 菌液的准备 |
| 1.6 丁香假单胞菌对不同龄期亚洲玉米螟幼虫抗寒能力的影响 |
| 1.7 丁香假单胞菌处理亚洲玉米螟的控制效果 |
| 1.8 检测玉米秸秆内部温度变化和试验箱内部温度差别 |
| 1.9 数据统计与分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 非滞育亚洲玉米螟各龄期幼虫抗寒能力的比较 |
| 2.2 丁香假单胞菌对亚洲玉米螟滞育幼虫抗寒能力的影响 |
| 2.3 丁香假单胞菌对亚洲玉米螟5龄非滞育幼虫抗寒能力的影响 |
| 2.4 丁香假单胞菌对亚洲玉米螟的控制效果 |
| 3 讨论 |
（2）冰核细菌Erwinia ananas 110冰核基因iceA的原核表达及冰核活性分析（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 供试菌株 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 冰核细菌基因组的提取 |
| 1.2.2 冰核基因ice A的PCR扩增 |
| 1.2.3 重组克隆载体p MD19–T–ice的构建 |
| 1.2.4 重组表达载体p ET–23a (+) –ice的构建 |
| 1.2.5 p ET–23a (+) –ice、p ET–23a (+) 转化大肠杆菌BL21 (DE3) p Lys S |
| 1.2.6 蛋白表达和SDS–PAGE分析 |
| 1.2.7 冰核活性测定 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 冰核基因ice A扩增和重组克隆载体p MD19–T–ice鉴定 |
| 2.2 重组克隆载体p ET–23a (+) –ice鉴定 |
| 2.3 蛋白表达与SDS–PAGE分析 |
| 2.4 表达蛋白冰核活性分析 |
| 3 讨论 |
（3）含冰核基因重组杆状病毒构建及其应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1 冰核细菌概述 |
| 1.1 冰核蛋白结构 |
| 1.2 冰核蛋白成冰核机制 |
| 1.3 其他组分对冰核活性影响 |
| 1.4 冰核蛋白糖脂复合物组装 |
| 1.5 冰核细菌的应用 |
| 2 杆状病毒表达系统 |
| 2.1 杆状病毒基本结构 |
| 2.2 杆状病毒的生活史 |
| 2.3 杆状病毒基因的表达 |
| 2.4 Bac-to-Bac杆状病毒表达系统 |
| 第二章 一般材料与方法 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌种和载体 |
| 1.2 昆虫和病毒 |
| 1.3 工具酶 |
| 1.4 抗生素和试剂盒 |
| 1.5 其他试剂 |
| 1.6 常用培养基和缓冲液 |
| 2 方法 |
| 2.1 细菌DNA提取 |
| 2.2 质粒DNA提取 |
| 2.3 感受态制备 |
| 2.4 琼脂糖凝胶切胶回收DNA目的片段 |
| 2.5 SDS-PAGE胶配制 |
| 2.6 SDS-PAGE电泳 |
| 第三章 冰核细菌Erwinia ananas 110冰核基因iceA的原核表达及冰核活性分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 冰核细菌基因组提取 |
| 1.2 冰核基因iceA的PCR扩增 |
| 1.3 重组克隆载体pMD19-T-ice构建 |
| 1.4 重组表达载体pET-23a(+)-ice构建 |
| 1.5 pET-23a(+)-ice、pET-23a(+)转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS |
| 1.6 蛋白表达和SDS-PAGE分析 |
| 1.7 冰核活性测定 |
| 2. 结果与分析 |
| 2.1 冰核基因iceA基因扩增和重组克隆载体pMD19-T-ice鉴定 |
| 2.2 重组克隆载体pET-23a(+)-ice鉴定 |
| 2.3 蛋白表达与SDS-PAGE分析 |
| 2.4 表达蛋白冰核活性分析 |
| 3 讨论 |
| 第四章 含冰核基因iceA重组杆状病毒AcV/polh-ice构建 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 polyhedrin基因合成 |
| 1.2 iceA基因扩增 |
| 1.3 重组转移质粒pFASTBac~(TM)Dual-polh构建 |
| 1.4 重组转移质粒pFASTBac~(TM)Dual-polh-ice构建 |
| 1.5 重组穿梭载体Bacmid构建 |
| 1.6 Bacmid/polh-ice转染sf9细胞 |
| 1.7 病毒株扩增 |
| 1.8 表达蛋白检测 |
| 1.9 AcV/polh-ice对甜菜夜蛾影响 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 重组转移质粒pFASTBac~(TM)Dual-polh的鉴定 |
| 2.2 重组转移质粒pFASTBac~(TM)Dual-polh-ice的鉴定 |
| 2.3 重组穿梭载体Bacmid/polh-ice鉴定 |
| 2.4 感染sf9细胞与收获病毒株 |
| 2.5 表达蛋白分析 |
| 2.6 甜菜夜蛾感染 |
| 3 讨论 |
| 第五章 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 附录A：Erwinia ananas 110冰核蛋白序列 |
| 附录B：polh基因合成序列 |
| 附录C：氨基酸符号 |
| 附录D：缩略语 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（4）Tn5转座突变技术在革兰氏阴性细菌分子遗传研究中的应用（论文提纲范文）
| 1 Tn5转座子突变技术的应用 |
| 1.1 生防细菌生防机理的研究 |
| 1.1.1 抗生素合成基因的研究 |
| 1.1.2 嗜铁素合成基因的研究 |
| 1.1.3 根部定殖与运动特性的研究 |
| 1.2 细菌必需基因的鉴定 |
| 1.3 病原细菌毒力相关基因的研究 |
| 1.3.1 植物病原细菌毒力相关基因与功能的研究 |
| 1.3.2 动物病原细菌毒力相关基因与功能的研究 |
| 1.4 代谢调控的研究 |
| 1.4.1 对有机硫的代谢 |
| 1.4.2 对N源的利用 |
| 1.4.3 对有害污染物代谢的研究 |
| 1.5 菌株的遗传改良 |
| 1.5.1 杀虫工程菌株的构建 |
| 1.5.2 抗病工程菌株的构建 |
| 1.5.3 降解多种农药工程菌的构建 |
| 2 结语和展望 |
（5）利用冰晶核蛋白构建细菌细胞表面展示体系及其应用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语表 |
| 1 前言 |
| 1.1 细菌细胞表面展示技术进展 |
| 1.1.1 细菌细胞表面展示技术概述 |
| 1.1.2 细菌细胞表面展示体系的结构组成 |
| 1.1.3 存在的问题及展望 |
| 1.2 冰晶核蛋白研究进展 |
| 1.2.1 植物霜冻害 |
| 1.2.2 冰晶核蛋白概述 |
| 1.2.3 冰晶核蛋白的结构和功能 |
| 1.2.4 冰晶核蛋白的应用 |
| 1.2.5 冰晶核蛋白的细胞表面展示 |
| 1.3 无机磷酸盐吸附研究进展 |
| 1.3.1 化学除磷法 |
| 1.3.2 吸附法除磷 |
| 1.3.3 人工湿地系统 |
| 1.3.4 生物除磷法 |
| 1.3.5 大肠杆菌磷酸盐吸附蛋白 |
| 1.4 细菌AiiA研究进展概述 |
| 1.4.1 细菌的群体感应系统简介 |
| 1.4.2 软腐病致病原理简介 |
| 1.4.3 AHL内酯酶(AiiA)简介 |
| 1.5 研究的目的和意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株和质粒 |
| 2.1.2 培养基配方及培养条件 |
| 2.1.3 实验动物 |
| 2.1.4 试剂和仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 DNA操作 |
| 2.2.2 重组质粒的转化和转化子的筛选鉴定 |
| 2.2.3 菌落原位杂交 |
| 2.2.4 PCR扩增 |
| 2.2.5 细菌细胞表面定位实验方法 |
| 2.2.6 冰核活性测定实验 |
| 2.2.7 磷酸盐吸附实验 |
| 2.2.8 抑制软腐病能力实验 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 冰晶核蛋白基因的克隆、蛋白质结构预测分析与异源表达的跨膜分泌活性 |
| 3.1.1 丁香假单胞菌冰晶核蛋白基因的克隆 |
| 3.1.2 冰晶核蛋白编码基因的序列分析 |
| 3.1.3 冰晶核蛋白氨基酸序列分析 |
| 3.1.4 冰晶核蛋白基因在大肠杆菌中的表达和重组菌跨膜分泌活性检测 |
| 3.2 利用冰晶核蛋白构建大肠杆菌细胞表面展示系统与性能分析 |
| 3.2.1 大肠杆菌展示载体的构建 |
| 3.2.2 大肠杆菌展示体系的优化 |
| 3.2.3 细胞表面定位分析 |
| 3.2.4 多拷贝串联重复InaQ-N展示载体的构建 |
| 3.2.5 多拷贝串联重复InaQ-N展示体系的细胞表面定位分析 |
| 3.3 利用冰晶核蛋白构建恶臭假单胞菌表面展示系统与性能分析 |
| 3.3.1 恶臭假单胞菌细胞表面展示载体的构建 |
| 3.3.2 恶臭假单胞菌展示体系的优化 |
| 3.3.3 细胞表面定位分析 |
| 3.3.4 多拷贝串联重复InaQ-N展示载体的构建 |
| 3.3.5 多拷贝串联重复InaQ-N展示体系的细胞表面定位分析 |
| 3.4 在大肠杆菌细胞表面展示磷酸盐吸附蛋白与工程菌生物吸磷性能 |
| 3.4.1 表面展示载体的构建 |
| 3.4.2 细胞表面定位分析 |
| 3.4.3 磷酸盐标准曲线的测定 |
| 3.4.4 磷酸盐溶液初始浓度及检测时间的确定 |
| 3.4.5 磷酸盐吸附能力的测定 |
| 3.5 在恶臭假单胞菌细胞表面展示磷酸盐吸附蛋白与工程菌生物吸磷性能 |
| 3.5.1 表面展示载体的构建 |
| 3.5.2 细胞表面定位分析 |
| 3.5.3 磷酸盐吸附能力的测定 |
| 3.6 在恶臭假单胞菌细胞表面展示AiiA蛋白与工程菌抑制胡萝卜软腐病性能 |
| 3.6.1 表面展示载体的构建 |
| 3.6.2 融合蛋白的表达 |
| 3.6.3 抑制软腐病分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 冰晶核蛋白InaQ的分析 |
| 4.2 冰晶核蛋白InaQ与分泌锚定相关结构域的确定 |
| 4.3 InaQ-N展示性能分析 |
| 4.4 磷酸盐吸附能力检测 |
| 4.5 抑制软腐病性能分析 |
| 5 总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录1 发表论文情况 |
| 附录2 冰核基因inaQ及其编码氨基酸序列 |
（6）山东茶树冰核细菌的分离、鉴定及其与霜冻害关系研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一章 前言 |
| 1 霜冻的含义与分类 |
| 2 霜冻给农业生产带来严重的经济损失 |
| 3 霜冻对茶树的影响 |
| 4 茶树霜冻害机理研究 |
| 5 茶树霜冻害影响的因素 |
| 6 茶树霜冻害的防治 |
| 7 本研究的目的意义 |
| 第二章山东茶树上INA 细菌种类及其鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 标样的采集 |
| 1.2 分离培养 |
| 1.3 冰核活性的测定方法 |
| 1.4 冰核细菌种类的鉴定 |
| 1.5 主要试剂与仪器 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 菌株形态特征 |
| 2.2 菌株的16SrDNA 鉴定 |
| 2.3 菌株的生理生化培养特征 |
| 3 讨论 |
| 第三章 山东茶树上冰核细菌的冰核活性及其分布规律 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 样品的采集 |
| 1.1.2 样品的处理 |
| 1.1.3 培养基 |
| 1.1.4 主要实验仪器 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 冰核细菌的分离方法 |
| 1.2.2 冰核活性的测定方法 |
| 1.2.3 冰核细菌冰核活性等级划分方法 |
| 2. 结果与分析 |
| 2.1 山东茶树上冰核细菌分离概况 |
| 2.2 山东茶树上冰核细菌的冰核活性 |
| 2.3 冰核细菌在茶树不同发育部位的分布 |
| 2.4 冰核细菌在不同品种上的分布规律 |
| 2.5 冰核细菌在不同地区的分布 |
| 2.6 冰核细菌在茶树上的消长动态 |
| 3 讨论 |
| 第四章 INA 细菌与茶树霜冻关系的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 冰核细菌对茶树过冷却点的影响 |
| 2.2 冰核细菌对茶树质膜透性的影响 |
| 2.3 冰核细菌对膜保护酶SOD 活性的影响 |
| 2.4 冰核细菌对膜保护酶POD 活性的影响 |
| 2.5 冰核细菌对茶树MDA 含量的影响 |
| 2.6 冰核细菌对茶树可溶性糖含量的影响 |
| 3 讨论 |
| 第五章 茶树上INA 细菌的防治研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 破坏INA 细菌冰核活性物质效果测定 |
| 2.2 药剂对冰核细菌的杀灭效果测定 |
| 2.3 抑菌圈法药剂效果测定 |
| 2.4 药剂防治茶树霜冻试验结果 |
| 3 讨论 |
| 第六章 综合讨论与结论 |
| 图版 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的主要论文 |
（7）冰核细菌及冰核基因的应用研究进展（论文提纲范文）
| 1 引言 |
| 2 冰核细菌的应用 |
| 2.1 冰核细菌与防霜冻技术 |
| 2.1.1 冰核细菌诱发植物霜冻机理 |
| 2.1.2 药剂防霜 |
| 2.1.3 生防方法防霜 |
| 2.1.3.1 拮抗菌防霜 |
| 2.1.3.2 基因工程菌防霜 |
| 2.1.4 噬菌体防霜 |
| 2.2 冰核细菌与植物病害 |
| 2.3 冰核细菌在其它方面的应用 |
| 2.3.1 人工降雪 |
| 2.3.2 食品冷冻浓缩 |
| 2.3.3 促冻杀虫 |
| 2.3.4 海水淡化 |
| 3 冰核基因的应用 |
| 3.1 细菌细胞表面展示 |
| 3.2 促冻杀虫 |
| 3.3 报告基因 |
| 3.4 微生物高敏检测 |
| 4 展望 |
（8）冰核活性细菌基因的研究进展及其应用（论文提纲范文）
| 1 冰核活性基因的结构特点及研究现状 |
| 1.1 冰核活性细菌及冰核基因的研究 |
| 1.2 冰核活性基因的研究进展 |
| 2 冰核蛋白活性基因应用现状 |
| 2.1 冰核基因作为报告基因的应用 |
| 2.2 冰核基因在防霜方面的应用 |
| 2.3 防御冻害方面的应用 |
| 2.4 贮粮防害方面的应用 |
| 2.5 病原微生物检测方面的应用 |
| 2.6 食品工业的应用 |
| 3 展望 |
（9）大规模生产冰核蛋白制品及冰核活性基因的扩增研究（论文提纲范文）
| 第一章 前言 |
| (一) 引言 |
| 1.1 冰核活性细菌及其冰核蛋白的研究现状 |
| 1.2 冰核活性蛋白表现冰核活性的结构基础 |
| 1.3 冰核活性细菌发酵生产冰核活性蛋白的研究现状 |
| 1.4 冰核活性细菌及冰核活性基因的应用研究现状 |
| (二) 开展本课题的依据 |
| (三) 开展本课题论文的意义 |
| 第二章 材料和方法 |
| 第一部分 大规模发酵生产冰核活性蛋白制品 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 第二部分 冰核活性基因的扩增研究 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 第三章 实验结果 |
| 第一部分 大规模发酵生产冰核活性蛋白制品 |
| 1. 摇瓶水平培养条件进一步摸索 |
| 2. 30L发酵罐发酵结果 |
| 3. 分离、破碎菌体,抽提冰核活性蛋白制品 |
| 第二部分 冰核活性基因的扩增研究 |
| 1. 模板的提取 |
| 2. 扩增条件的确定 |
| 3. PCR 污染情况检测 |
| 4. 扩增比较实验 |
| 第四章 分析与讨论 |
| 第五章 结论 |
| 本论文创新点 |
| 今后工作的展望 |
| 参考文献 |
| 论文、参加科研情况说明以及学位论文使用授权申明 |
| 致谢 |
（10）冰核活性细菌研究进展及其在防霜技术中的应用（论文提纲范文）
| 1 冰核活性细菌生物学及分子生物学特性的研究 |
| 1.1 冰核活性细菌简介 |
| 1.2 冰核细菌的分子生物学 |
| 1.2.1 冰核细菌的冰核基因 |
| 1.2.2 成冰核蛋白 |
| 2 影响INA细菌成冰活性的因素 |
| 2.1 菌液浓度 |
| 2.2 温度 |
| 2.3 pH值 |
| 2.4 培养基组分 |
| 2.5 其他因素 |
| 3 冰核细菌和霜冻害的关系 |
| 4 防霜技术的研究开发和利用 |
| 4.1 药剂防治 |
| 4.2 生物防治 |
| 4.2.1 拮抗菌防霜 |
| 4.2.2 基因工程菌防霜 |
| 4.2.3 噬菌体防霜 |
四、利用细菌冰核基因构建促冻杀虫基因工程菌（论文参考文献）
- [1]丁香假单胞菌对亚洲玉米螟幼虫抗寒能力的影响[J]. 阿依谢姆古丽·亚库普,安尼瓦尔·库尔班,郭文超. 中国生物防治学报, 2017(05)
- [2]冰核细菌Erwinia ananas 110冰核基因iceA的原核表达及冰核活性分析[J]. 姚润贤,袁哲明. 湖南农业大学学报(自然科学版), 2013(04)
- [3]含冰核基因重组杆状病毒构建及其应用[D]. 姚润贤. 湖南农业大学, 2013(07)
- [4]Tn5转座突变技术在革兰氏阴性细菌分子遗传研究中的应用[J]. 年洪娟,陈丽梅,李昆志. 中国生物工程杂志, 2009(12)
- [5]利用冰晶核蛋白构建细菌细胞表面展示体系及其应用研究[D]. 李茜茜. 华中农业大学, 2009(05)
- [6]山东茶树冰核细菌的分离、鉴定及其与霜冻害关系研究[D]. 黄晓琴. 山东农业大学, 2009(03)
- [7]冰核细菌及冰核基因的应用研究进展[J]. 谢翔,王玉,刘汉林,王贵学. 生物技术通报, 2006(S1)
- [8]冰核活性细菌基因的研究进展及其应用[J]. 刘静,陈庆森. 生物技术, 2006(02)
- [9]大规模生产冰核蛋白制品及冰核活性基因的扩增研究[D]. 刘静. 天津商学院, 2006(10)
- [10]冰核活性细菌研究进展及其在防霜技术中的应用[J]. 岳思君,王文举. 农业科学研究, 2005(02)