一、K物质对离体大鼠心脏功能的影响（论文文献综述）
汪煜[1]（2021）在《羟考酮通过SIRT3/SOD2/NF-κB通路减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤》文中提出目的:既往研究发现阿片类受体激动剂（如吗啡）具有诱导心肌组织缺氧耐受的作用,这一效应与激动δ、κ受体相关,但具体作用机制尚不明确。急诊PCI中,为了减少急性心肌梗死病人剧烈胸痛所致心肌耗氧增加、并稳定呼吸,常皮下注射吗啡来镇静止痛。然而,吗啡存在心脏骤停、循环抑制、癫痫发作、呼吸抑制、昏迷及死亡等多种严重不良反应。此外,多项研究发现吗啡与P2Y12抑制剂联合应用时,P2Y12抑制剂血药浓度和抗血小板作用显着降低,影响医师对术中抗凝药物使用的判断,不利于急性心肌梗死的抗血小板治疗。因此,研发并合成无干扰抗血小板治疗的阿片类受体激动剂成为目前迫切的需求。羟考酮是一种含有三个苯环的新型阿片受体激动剂,临床研究发现羟考酮与吗啡相比,小剂量即能发挥优于吗啡的镇痛效果,且未有干扰P2Y12抑制剂作用的相关报道。多项研究表明其在镇痛的有效性及安全性方面明显优于吗啡。因此,急诊PCI中羟考酮是否能作为除吗啡外的另一种选择值得研究。本研究以此为立题依据,旨在探讨羟考酮是否通过调节SIRT3/SOD2/NF-κB通路来保护大鼠心肌缺血再灌注损伤,并推测其介导心脏保护效应的相关信号通路,为在临床中的应用提供参考。方法:健康雄性SPF级SD大鼠随机分为5组（每组16只）:假手术组（Shame operation group,S组）、缺血再灌注组（Ischemia-reperfusion group,I组）、羟考酮后处理组（Oxycodone post-treatment group,O组）、吗啡后处理组（Morphine post-treatment group,M组）和羟考酮+κ受体阻断剂后处理组（Oxycodone+kappa receptor antagonist post-treatment,K组）。通过在活体大鼠内阻断心脏冠状动脉左前降支（LAD）45 min,并于再灌注前5 min通过尾静脉注射相应药物后,再通左前降支180 min以建立大鼠心肌缺血再灌注（Myocardial ischemia-reperfusion injury,MIRI）模型。完成上述过程后,经大鼠腹主动脉抽取动脉血离心后应用酶联免疫吸附测定（ELISA）血清肌钙蛋白I（c Tn I）水平;摘除大鼠心脏,分离左心室后应用苏木精-伊红（HE）染色法观察各组心肌组织形态学特征;免疫组织化学（IHC）染色法检测心肌细胞TLR4、p65和心肌细胞线粒体SOD2蛋白水平;蛋白质印迹法（WB）检测心肌细胞TLR4、磷酸化p65和心肌细胞线粒体SIRT3蛋白水平。结果:组织形态学检查结果显示缺血再灌注组出现心脏间叶组织断裂,并伴有不同程度中性粒细胞聚集,可见部分心肌细胞胞质出现透亮或皱缩。而羟考酮后处理组心脏间叶组织未见明显断裂,心肌细胞胞质无明显透亮或皱缩。此外,血清c Tn I水平检测结果显示,与非假手术组比较,羟考酮后处理组心肌组织损伤有所减轻（P<0.05）。免疫组织化学染色结果显示,与非假手术组比较,羟考酮后处理组心肌细胞TLR4、p65表达水平下降,心肌细胞线粒体SOD2表达水平上升（P<0.05）。蛋白质印迹法结果显示,与非假手术组比较,羟考酮后处理组TLR4和磷酸化p65的表达水平下降,SIRT3的表达水平上升（P<0.05）。结论:羟考酮比吗啡能更有效地减轻心肌缺血再灌注损伤,其机制可能涉及激动κ受体来调节SIRT3/SOD2/NF-κB通路,减轻氧化应激并抑制炎性因子释放。
王文俊[2]（2021）在《腺苷激酶及4-羟基壬烯醛在心脏缺血再灌注损伤中作用及机制研究》文中认为研究背景急性心肌梗死（Acute myocardial infarction,AMI）可能导致恶性心律失常、心源性休克、猝死等严重不良心血管事件,是威胁人类健康的主要原因之一。再灌注治疗,如溶栓和经皮冠状动脉介入治疗,能够开通堵塞的冠状动脉,恢复心脏组织血运,挽救缺血心脏组织,减少心肌梗死面积,改善患者预后。因此,再灌注治疗成为治疗AMI最有效的手段。然而,再灌注治疗本身也可对心脏组织产生损伤,即定义为心脏缺血再灌注损伤（Myocardial ischemia-reperfusion injury,MIRI）。MIRI主要表现为包括室性期前收缩、室性心动过速等在内的心律失常、心功能持续障碍、微血管阻塞和程序性心肌细胞死亡。在MIRI中程序性心肌细胞的死亡方式包括细胞凋亡、程序性坏死、焦亡、铁坏死等多种,其中以细胞凋亡和程序性坏死最为重要。已经证明再灌注引起的程序性心肌细胞的死亡可能会导致心肌梗死的面积最终增加近一倍。因此,减少再灌注引起的心肌细胞的死亡是减少缺血再灌注损伤的关键。但现仍未找到有效的减少心肌细胞死亡的方式。由此深入探讨心肌缺血再灌注损伤中细胞死亡发生与调节的机制,寻找有效的减轻缺血再灌注损伤的靶点和方法,是目前心肌保护领域的研究热点。腺苷激酶（Adenosinekinase,ADK）是人体内代谢腺苷的关键酶类之一。腺苷能够在缺血、低氧、创伤等条件下发挥细胞保护作用,有效防止缺血再灌注引起的心肌损伤。由于腺苷在体内半衰期很短等原因,因此腺苷至今仍未能有效地在临床用于预防心肌缺血再灌注损伤的治疗。ADK是哺乳动物细胞中表达量最多的核苷激酶之一,广泛表达在心脏、肝、脑等器官组织中。ADK可以将心肌细胞中大约90%的腺苷经转化为单磷酸腺苷（Adenosinemonophosphate,AMP）,因此,ADK活性的高低决定了心肌中腺苷的浓度。除此之外,ADK还有调节炎性物质表达,以及潜在的磷酸化激酶的作用。已经有研究证明ADK在癫痫发作、脑缺血过程中发挥了重要的作用。腺苷激酶在MIRI中是如何变化的,以及发挥了怎样的作用,如何发挥作用还未可知。研究目的本课题的主要目的在于探讨:1.抑制ADK对于MIRI的保护作用。2.抑制ADK是否可以减少MIRI中的细胞死亡。3.抑制ADK如何影响MIRI中的细胞死亡。研究方法我们在小鼠心脏缺血再灌注模型中抑制ADK活性或减少ADK表达后,以探究ADK对MIRI后心脏损伤以及心功能的影响,之后又探究了抑制ADK后对MIRI中细胞程序性死亡的作用。使用H9c2（大鼠心肌细胞系）以及乳大鼠原代心肌细胞构建缺氧/复氧（Hypoxia/reoxygenation,H/R）模型,围绕抑制ADK活性如何调节MIRI中细胞程序性死亡展开研究。（一）动物实验1.动物实验方案:方案一抑制ADK酶活性:将小鼠随机分为4组,分别为假手术组（sham组）,药物注射组（ABT702组）,缺血再灌注组（IR组）和缺血再灌注加药物注射组（ABT702+IR）。对于ABT702组和ABT702+IR组,在手术操作前半小时,给予ADK激酶抑制剂ABT702（2 mg/Kg）腹腔内注射。对于sham组和IR组在术前半小时给予同等剂量的DMSO。方案二减少ADK在体表达:将小鼠随机分为3组,分别为假手术组（sham组）,病毒对照组（AAV9-GFP+IR）,病毒组（AAV9-shADK+IR）。对于病毒组在术前3周,给小鼠经尾静脉注射带有心脏特异性启动子的AAV9-shADK,病毒对照组注射AAV9-GFP。在实验方案中,依据不同研究目调整最后取材时间。于MIRI后2 h取血测量LDH指标。于MIRI后24h取材测量心功能。其他指标于MIRI后4h取材进行检测。2.小鼠MIRI模型建立:选取6-8周龄左右成年C57BL/6雄性小鼠,开胸暴露心脏后用结扎线结扎左前降支30 min后,打开活结。对于假手术组,仅将线穿过动脉,但并不结扎,其余操作相同。分别于再灌注2h、4h、24h后,用0.8%戊巴比妥钠再次麻醉小鼠并取材。3.心功能的检测:使用小动物心脏彩超评价心功能。在小鼠MIRI后24 h进行测定,在小动物心脏超声M超模式下进行测定,通过检测数据计算心脏左室射血分数（Left ventricular ejection fraction,LVEF）和短轴缩短率（Left ventricular fraction shortening,LVFS）进行判断。4.心梗死面积和缺血危险区检测:心脏MIRI取材后,采用伊文氏蓝（Evansblue,EBD）和2,3,5-三苯基氯化四氮唑（2,3,5-triphenyltetrazolium chloride,TTC）染色的方法观察心肌缺血危险区和梗死区。5.血浆乳酸盐脱氢酶（Lactate dehydrogenase,LDH）和腺苷同型半胱氨酸（S-adenosylhomocysteine,SAH）检测:用EDTA抗凝采血管采血,将全血在4℃以2500 g离心15 min,收集上清后使用相应ELISA试剂盒检测。6.电镜检测:小鼠MIRI后于缺血再灌注区域取1立方微米心肌组织后用戊二醛溶液进行固定后,在山东大学电子显微镜中心使用透射电镜进行检测。7.心肌细胞凋亡检测:在动物实验中,将心肌组织取材后首先将组织浸泡于4%多聚甲醛进行固定,之后用石蜡包埋、切片。采用TUNEL免疫组化染色的方法检测凋亡心肌细胞数量。8.心肌细胞坏死检测:心肌组织中采用EBD和微囊蛋白（Caveolin 3,CaV3）联合免疫荧光染色法测定坏死细胞。9.蛋白检测:用心肌组织提取30μg蛋白后,利用10%-15%SDS-PAGE电泳进行分离、转膜、一抗、二抗孵育后进行检测。10.mRNA检测:提取心肌组织中RNA,通过RT-qPCR进行检测。11.统计分析:计量资料数据以均数±标准误（Means±SEM）表示,应用GraphPad Prism软件对面积大小、分子表达、活性等数据进行统计学分析,包括t检验、方差分析等,P<0.05为差异具有统计学意义。（二）细胞实验1.细胞实验方案:为了研究ADK对于MIRI中细胞死亡的作用及其机制,我们使用H9c2细胞和大鼠原代心肌细胞建立缺氧/复氧（Hypoxia/reoxygenation,H/R）模型,通过TUNEL染色和细胞流式术检测凋亡和坏死的细胞,此外检测了凋亡通路和坏死通路重要蛋白的调节情况。为了确定ADK是否通过连锁凋亡抑制蛋白（X-linked inhibitor of apoptosis protein,XIAP）来调节 MIRI 中的细胞死亡,我们使用XIAP蛋白的小干扰RNA,之后再检测细胞凋亡和程序性坏死比例以及凋亡和程序性坏死通路重要蛋白的调节情况。为了确定是通过腺苷通路上哪个受体发挥作用,首先通过PCR检测了 MIRI后受体的变化情况,之后用A2B受体的抑制剂,继而检测发生程序性坏死和凋亡的细胞数量。最后为了检测,ADK对MIRI中线粒体的影响,检测了线粒体膜电位,线粒体ROS产生以及线粒体通道转化孔的开放情况。2.细胞H/R处理:细胞饥饿12 h后放入缺氧培养箱（气体成分为94%氮气+5%二氧化碳+1%氧气）。将细胞放入缺氧培养箱培养12h后,放入正常培养箱后再培养1-4h,收取细胞。3.通过小干扰减少小鼠体内XIAP蛋白:通过对细胞转染XIAP小干扰,减少XIAP蛋白含量。4.线粒体活性氧的检测:使用MitoSOXRed检测线粒体ROS水平。5.线粒体膜电位检测:使用JC-1染色检测线粒体膜电位水平。6.细胞坏死检测:对于心肌细胞,用Annexin V/PI染色后用细胞流式分析仪分析测定坏死细胞。7.细胞凋亡检测:在细胞实验中,细胞爬片后,经过H/R刺激,用TUNEL免疫荧光方法进行H9c2心肌细胞的凋亡检测。8.ATP含量检测:细胞经相应处理后充分裂解并收集,使用ATP检测试剂盒对ATP进行检测,反应完成后使用多功能酶标仪对吸光度进行检测,并通过标准曲线标化后计算结果。9.线粒体通道转化孔检测:通过Calcein-AM和Cocl2共同染色检测线粒体通道转化孔开放的情况。10.蛋白、RNA检测:同动物实验步骤。11.统计分析:同动物实验步骤。研究结果1.在MIRI中抑制ADK活性可以减少心梗面积,改善心功能ADK在再灌注2-4 h一过性升高,在再灌注后6 h恢复正常。使用ADK激酶抑制剂ABT-702或干扰ADK体内表达可以明显减少MIRI后心肌梗死面积。ADK抑制剂同样可以减少血浆中LDH水平和改善心脏LVEF,LVFS指标。同样,电镜观察发现ADK抑制剂可以改善MIRI后肌节和线粒体损伤。此外我们也观察到,ADK抑制剂会减慢小鼠的心率,但对血压没有影响。2.抑制ADK活性可以减少小鼠MIRI中细胞凋亡和程序性坏死TUNEL染色发现,抑制ADK活性可以减少心脏组织缺血危险区凋亡细胞数量。此外抑制ADK活性可以减少caspase-8,caspase-9,caspase-3的增加,但对caspas-12没有影响。再者抑制ADK活性对Bax和Bcl-2的蛋白量没有调节作用,但是可以提高p-P38蛋白含量。EBD-CaV3染色发现ADK抑制剂使坏死细胞减少。且 ADK 抑制剂可以减少 RIP3,p-RIP3,MLKL,p-MLKL,p-CaMKII蛋白量,但是对RIP1,p-RIP1,CaMKⅡ蛋白量没有影响。3.抑制ADK活性可以减少H9c2 H/R模型中细胞凋亡和程序性坏死在细胞实验中我们同样可以观察到,抑制ADK活性可以减少凋亡细胞。且可以减少活化的caspase-9,caspase-8和caspase-3蛋白量。同样ADK抑制剂可以减少P38 MAPK的磷酸化,但对Bax,Bcl-2和MAPK的含量没有明显作用。细胞流式发现,ADK抑制剂减少了 H/R诱导的细胞程序性坏死,同时减少了程序性坏死通路的RIP3,p-RIP3,MLKL,p-MLKL和p-CaMKII蛋白量。4.抑制ADK活性对细胞凋亡和程序性坏死的调控是通过XIAP介导为了探讨ADK是如何调控细胞凋亡和坏死,实验结果发现,抑制ADK活性可以增加XIAP,p-XIAP的蛋白含量。此外ADK活性抑制可以增加p-AKT的蛋白含量。而使用AKT抑制剂MK-2206可以减少ADK抑制剂对XIAP,p-XIAP的作用。而使用siRNA干扰XIAP的表达后,也可以削弱ADK抑制剂对凋亡以及程序性坏死的调控。5.抑制ADK活性对于H/R诱导的细胞死亡的调节作用是由腺苷受体来介导使用腺苷受体抑制剂后可发现抑制ADK活性后对XIAP以及p-XIAP的调节作用消失。RT-qPCR检测小鼠组织和心肌细胞发现A2B的mRNA变化最为明显,其次为A1受体。使用A2B受体拮抗剂后发现抑制ADK活性后对XIAP和p-Akt、p-XIAP的调节作用以及对细胞凋亡和坏死的调节作用下降。6.抑制ADK活性可以改善H/R后线粒体功能,并且可以减少ROS的产生使用ADK活性抑制剂后可发现细胞H/R后线粒体膜电位的去极化减弱。Calcein-AM染色发现mPTP孔道的开放减少,此外线粒体ROS的生成减少,ATP的生成也可以被改善。电镜观察也可以发现抑制ADK活性可以改善心肌细胞处线粒体损伤和肿胀。研究结论1.抑制ADK激酶活性可以在MIRI中发挥保护心脏作用。2.抑制ADK减少MIRI中心肌细胞的凋亡和程序性坏死。3.抑制ADK可以通过腺苷受体A2B/Akt/XIAP发挥作用。4.ADK可以成为治疗MIRI的潜在靶点。研究背景由前述可知,再灌注治疗是急性心肌梗死（Acute myocardial infarction,AMI）最有效的治疗手段。然而再灌注本身也可导致心肌的损伤称为心脏缺血再灌注损伤（Myocardial ischemia-reperfusion injury,MIRI）。针对 MIRI 进行治疗,对于改善AMI患者愈后,减少患者心衰的发生具有重要的意义。而心肌细胞程序性死亡是MIRI中重要的环节,针对MIRI中的心肌细胞程序性死亡对于减轻MIRI损伤具有重要意义,而程序性坏死又是心肌细胞程序性死亡的重要的方式之一。4-羟基壬烯醛（4-hydroxynonenal,4-HNE）是细胞内毒性最强的醛类物质之一。4-HNE是脂质过氧化的重要产物。具有超强的生物反应活性,生成后可以迅速和细胞内磷脂,核酸,蛋白发生加成反应,影响其生物功能。在生理状态下4-HNE的浓度为0.3-5 μM,并在多种生理功能中起到信号调节因子的作用。在氧化应激的情况下,4-HNE可以增加10-100倍,并通过抑制基因表达和修饰蛋白从而发挥细胞毒性作用。在MIRI损伤中,4-HNE可以增加为原来的6倍。已知.4-HNE对于MIRI中细胞凋亡、自噬都有着调节作用,但其对MIRI中细胞程序性坏死的调节作用以及如何发挥这种调节作用还未可知。研究目的本课题的主要目的在于探讨:1.在MIRI中程序性坏死和4-HNE的变化。2.4-HNE是否调节MIRI中程序性坏死。3.4-HNE通过何种机制调节MIRI中程序性坏死。研究方法我们采用小鼠心脏缺血再灌注模型以及离体心脏灌流模型研究了减少或增加4-HNE后对MIRI中细胞程序性坏死的影响;使用大鼠心肌细胞系H9c2,围绕提高4-HNE如何调节MIRI中细胞程序性坏死展开研究。（一）动物实验1.动物实验方案:在体小鼠心脏缺血再灌注模型:将6-8周C57BL/6小鼠（Wide type,WT）和乙醛脱氢酶过表达小鼠（ALDH2-transgenic,ALDH2-Tg）随机分为3组,分别为假手术组（sham组）,缺血再灌注组（I/R组）和乙醛脱氢酶过表达+缺血再灌组（ALDH2-Tg+I/R）。离体小鼠灌流模型:将6-8周C57BL/6小鼠随机分为2组,分别为假手术组（sham 组）,4-HNE 灌流组。2.小鼠心脏缺血再灌注模型的建立:同前构建小鼠缺血再灌注模型和假手术模型。在结扎后30 min,恢复冠脉血流,之后4 h用0.8%戊巴比妥钠麻醉小鼠并取材。3.离体小鼠心脏灌流模型:取6-8周成年雄性C57BL/6小鼠,注射戊巴比妥钠肝素溶液,将小鼠进行麻醉以及肝素化。小鼠固定后,由剑突下开胸并迅速分离心脏。将心脏置于4℃Krebs-Henseleit（KH）液中清洗并分离主动脉。将主动脉连接到Langendorff离体心脏灌流系统,以恒温（37℃）KH缓冲液进行灌流。切开左心耳,将充水的乳胶球囊插入,另一端连接压力转换器,并由Labchart对信号进行分析。将心脏固定到Langendorff离体心脏灌流系统后稳定20 min,继而根据分组不同用含有4-HNE或者安慰剂的KH液进行灌流。稳定灌流1 h后收集心脏。4.心功能的检测:用小动物心脏超声机检测小鼠心脏LVFS,LVEF指标,反应检测小鼠MIRI后24 h心功能情况。5.心梗死面积和缺血危险区检测:心脏MIRI取材后,采用伊文氏蓝（Evansblue,EBD）和 2,3,5-三苯基氯化四氮唑染色（2,3,5-triphenyltetrazolium chloride,TTC）的方法观察心肌缺血危险区和梗死区。6.血浆乳酸盐脱氢酶（Lactate dehydrogenase,LDH）检测:用EDTA抗凝采血管采血,将全血在4℃以2500 g离心15 min,收集上清后使用相应ELISA试剂盒检测。7.心肌细胞坏死检测:心肌组织中采用EBD和微囊蛋白（Caveolin 3,CaV3）联合免疫荧光染色法测定坏死细胞。8.免疫组化:心脏组织经石蜡包埋切片后,经烤片、梯度酒精脱蜡后,牛血清白蛋白（Bovine serum albumin,BSA）封闭后,一抗、二抗孵育。最后3,3氮二氨基联苯胺盐酸盐（3,3N-diaminobenzidine tetrahydrochloride,DAB）显色后苏木素染核。显微镜观察后拍照分析。9.蛋白检测:提取30μg蛋白后,利用10%-15%SDS-PAGE电泳、转膜、一抗、二抗孵育后进行检测。10.免疫共沉淀:通过免疫共沉淀的方法检测蛋白-蛋白之间相互作用。通过正常步骤提取蛋白后,将蛋白先后和一抗、beads共同孵育。孵育结束后,离心弃上清,加入稀释好的1xloadingbuffer,加热后同上蛋白检测步骤进行检测。11.mRNA检测:取心肌组织中RNA,通过RT-qPCR进行检测。12.统计分析:计量资料数据以均数±标准误（MeanSEM）表示,应用GrapPad Prism软件对面积大小、分子表达、活性等数据进行统计学分析,包括t检验、方差分析等,P<0.05为差异具有统计学意义。（二）细胞实验1.细胞实验方案:为了研究4-HNE对于MIRI中细胞程序性死亡的作用及其机制,我们使用H9c2细胞并给予不同浓度和不同时间梯度的4-HNE刺激,检测了细胞程序性坏死以及程序性坏死通路相关蛋白的调节情况。为了确定4-HNE是否通过RIP1蛋白来调节MIRI中的细胞死亡,我们使用RIP1蛋白的小干扰RNA,之后再检测细胞坏死情况以及程序性坏死通路上相关蛋白的调节情况。之后为了明确,4-HNE是如何调节RIP1蛋白含量的,检测了 RIP1蛋白的mRNA水平以及蛋白代谢率还有其泛素化修饰情况。2.细胞4-HNE处理:细胞饥饿12 h后根据实验目的给予不同浓度4-HNE（20μM,40 μM,60 μM,80 μM）培养 1-6 h,收取细胞。3.细胞缺氧/复氧（H/R）模型建立:细胞饥饿12 h后放入缺氧培养箱（气体成分为94%氮气+5%二氧化碳+1%氧气）进行缺氧处理。将细胞缺氧培养12 h后,在正常条件下再培养1-6h,收取细胞。4.心肌细胞坏死检测:对于心肌细胞,用Annexin V/PI染色后用细胞流式分析仪分析测定坏死细胞。5.通过小干扰减少小鼠体内RIP1蛋白:通过对细胞转染RIP1小干扰,减少RIP1蛋白含量。6.蛋白检测和免疫共沉淀:同动物实验。7.统计分析:同动物实验。研究结果1.MIRI增加了小鼠心脏中的细胞程序性坏死和4-HNE产生EBD-CaV3双染结果显示,MIRI后,心肌坏死面积增加。此外,体内体外结果显示坏死通路 RIP1,p-RIP1,RIP3,p-RIP3,MLKL,p-MLKL,p-CaMKII在MIRI后均升高。同时,我们用免疫印迹的方法和免疫组化的方法证明了 MIRI后心脏组织处4-HNE的上升。在细胞实验中也应证了这个结果。2.减少4-HNE水平可以减轻MIRI中的程序性坏死在ALDH2-Tg小鼠中,MIRI损伤后4-HNE含量下降。同时,ALDH2-Tg可以改善MIRI后心功能。此外,ALDH2过表达可以减少MIRI后心梗面积和血浆LDH含量。EBD-CaV3染色显示MIRI后心脏坏死面积在ALDH2-Tg小鼠中缩小。与此同时,RIP1,p-RIP1,RIP3,p-RIP3,MLKL,p-MLKL,p-CaMKII也在ALDH2-Tg小鼠中下降。免疫共沉淀显示,MIRI后坏死小体的形成也在ALDH2-Tg小鼠中下降。3.在离体灌流模型中,4-HNE刺激增加离体心脏中的细胞程序性坏死免疫组化以及免疫荧光显示在4-HNE灌流的心脏中,4-HNE的含量明显上升。此外,LVDP,dp/dt结果显示4-HNE灌流后心功能下降。同时,免疫印迹显示 4-HNE 灌流增加了心脏组织中RIP1,p-RIP1,p-RIP3,MLKL,p-MLKL,和p-CaMKII的蛋白含量以及坏死小体的形成。4.4-HNE刺激增加H9c2细胞的程序性坏死细胞流式结果显示,4-HNE刺激后造成H9c2细胞坏死增加。同时不同时间梯度4-HNE进行刺激时,RIP1,p-RIP1,和p-RIP3呈梯度递增。而以不同浓度4-HNE 刺激时,RIP1,p-RIP1,p-RIP3,MLKL,p-MLKL,和 p-CaMKII 呈梯度递增。5.4-HNE刺激对心肌程序性坏死的调节是通过RIP1介导的为了明确RIP1蛋白的作用,用RIP1小干扰减少RIP1蛋白表达。细胞流式术显示减少RIP1蛋白可以减低4-HNE刺激下细胞程序性坏死的发生。通过蛋白免疫印迹法也可发现4-HNE刺激下p-RIP1,p-RIP3,MLKL,p-MLKL和p-CaMKII等蛋白的上升可以被RIP1 siRNA减弱。6.4-HNE刺激可以减少RIP1蛋白的泛素依赖性降解RT-qPCR发现4-HNE刺激后RIP1 mRNA含量没有明显改变。用放线菌酮（Cycloheximide,CHX）抑制DNA转录后发现4-HNE可以减少RIP1蛋白的降解。同时蛋白共沉淀检测RIP1蛋白的k-48多聚泛素化发现4-HNE可以减少RIP1的K-48多聚泛素化修饰。同时我们检测了 cIAP1,cIAP2E3泛素连接酶和RIP1蛋白的结合,发现4-HNE并不影响RIP1蛋白和泛素连接酶之间的结合。因此可以推断4-HNE可以减少RIP1和泛素之间的结合。同时,4-HNE可以使RIP1蛋白的羰基化修饰增加。研究结论1.4-HNE可以增加MIRI中细胞程序性坏死。2.4-HNE通过提高RIP1增加MIRI中细胞程序性坏死。3.4-HNE通过减少RIP1蛋白的K-48多聚泛素化依赖性途径降解,增加细胞程序性坏死。
乔扬[3]（2021）在《14-3-3η对心肌缺氧/复氧损伤不同阶段自噬的双重调节》文中认为第一部分引言缺血性心脏病严重威胁人类的健康,其发病率在世界范围内逐年增高。心肌缺血/缺氧是缺血性心脏病的直接诱因,而恢复改善供血是必要的治疗手段,但是再灌注本身会导致心肌损伤加重以及心肌梗死面积增加。本研究团队在前期研究中,发现并证实14-3-3s为内源性保护蛋白,诱导其上调表达,可有效对抗多种急性心肌损伤,但是否与心肌细胞自噬活动有关,尚未见报道。本研究中,首先构建高/低表达14-3-3η转基因心肌细胞,经过急性缺氧以及急性缺氧/复氧损伤后,确定14-3-3η不同表达在心肌细胞急性缺氧/复氧损伤不同阶段调节自噬的作用;通过免疫印迹、免疫共沉淀以及免疫荧光等方法,初步阐明14-3-3η在此二阶段调节自噬活动的分子机制;为探讨14-3-3η保护心肌细胞的作用机制,对心肌细胞内氧化应激水平以及线粒体功能等相关指标进行检测;为验证14-3-3η在大鼠离体心脏急性缺氧/复氧损伤不同阶段的自噬调节作用,给予大鼠心室壁多点注射p AD/Flag-14-3-3η以及p AD/sh-14-3-3η,构建高/低表达14-3-3η的大鼠模型;行离体心脏灌流术,采用免疫印迹、透射电镜以及TUNEL等手段验证14-3-3η的心肌保护作用;最后,预处理给予心肌细胞人参皂苷Rg1,初步探讨人参皂苷Rg1的心肌保护机制,为今后深入研究14-3-3η与人参皂苷Rg1在缺血性心脏病等心血管疾病中的作用及意义奠定理论与实验基础。第二部分14-3-3η对心肌细胞急性缺氧/复氧损伤不同阶段自噬的双重调节作用目的:探讨14-3-3η不同表达对心肌细胞急性缺氧/复氧损伤不同阶段自噬双重调节作用。方法:通过对细胞存活率以及乳酸脱氢酶活性的检测,确定14-3-3η的心肌保护作用;免疫印迹方法检测14-3-3η以及LC3Ⅱ蛋白的表达;透射电镜观察自噬活动的改变;激光共聚焦显微镜下观察自噬溶酶体。结果:14-3-3η高表达可增加细胞存活率,降低乳酸脱氢酶活性,保护心肌细胞;免疫印迹,透射电镜以及激光共聚焦结果显示:14-3-3η高表达在急性缺氧损伤阶段可诱导自噬增加;而在急性缺氧/复氧损伤阶段,14-3-3η高表达可抑制心肌细胞内过度的自噬活动;14-3-3η低表达则反之。结论:14-3-3η高表达对心肌细胞急性缺氧/复氧损伤不同阶段自噬具有双重调节作用。第三部分14-3-3η对心肌细胞急性缺氧/复氧损伤不同阶段自噬双重调节作用机制目的:探讨14-3-3η在急性缺氧/复氧损伤不同阶段双重调节自噬的潜在机制。方法:免疫印迹法检测14-3-3η、LC3Ⅱ、AMPKα、m TOR、ULK1、p70S6K、Raptor、Akt以及beclin1等蛋白的表达;免疫共沉淀法探讨14-3-3η与beclin1之间是否存在相互作用;免疫荧光法观察14-3-3η、beclin1以及vimentin之间的共定位情况。结果:在心肌细胞急性缺氧损伤阶段,14-3-3η高表达激活AMPKα、ULK1,抑制m TOR,激活自噬;14-3-3η低表达激活m TOR,增加Raptor以及p70S6K的表达,部分抑制雷帕霉素激活自噬的作用;在心肌细胞急性缺氧/复氧损伤阶段,14-3-3η高表达激活Akt,抑制beclin1,抑制过度的自噬活动。结论:在心肌细胞急性缺氧损伤阶段,14-3-3η高表达激活AMPKα-m TORC1/ULK1通路诱导自噬;在急性缺氧/复氧阶段,14-3-3η高表达激活Akt-beclin1通路抑制心肌细胞内过度的自噬活动。第四部分14-3-3η对心肌细胞急性缺氧/复氧损伤不同阶段氧化应激影响目的:探讨14-3-3η不同表达心肌细胞经急性缺氧/复氧损伤不同阶段氧化应激水平的改变。方法:流式细胞术检测胞内/线粒体内ROS生成水平;激光共聚焦显微镜下观察细胞内/线粒体内ROS的改变;酶标法检测GSH-Px、SOD、Catalase的活性,MDA的含量以及GSH/GSSG的改变。结果:14-3-3η高表达可减少心肌细胞内由急性缺氧以及复氧引起的ROS过量生成;增加心肌细胞内GSH-Px、SOD、Catalase的活性,降低MDA的含量,增加GSH的含量以及GSH/GSSG的比值,降低GSSG的含量;14-3-3η低表达则反之。结论:在心肌细胞急性缺氧/复氧损伤的不同阶段,14-3-3η高表达降低细胞内氧化应激水平,保护心肌细胞;该保护作用与其双向调节自噬有关。第五部分14-3-3η对心肌细胞急性缺氧/复氧损伤不同阶段线粒体功能影响目的:探讨14-3-3η不同表达对心肌细胞急性缺氧/复氧损伤不同阶段线粒体功能影响。方法:透射电镜下观察心肌细胞线粒体形态的改变;免疫印迹法检测心肌细胞线粒体复合物Ⅰ和复合物Ⅲ的表达;海马仪检测氧消耗速率以及胞外酸化速率;流式细胞术检测线粒体膜电位的改变;酶标法检测m PTP的开放情况;TUNEL法以及流式细胞术检测细胞凋亡;酶标法检测Caspase 3的活性结果:14-3-3η高表达增加心肌细胞内NDUFB8蛋白和UQCRC2蛋白的表达;增加ATP生成,维持线粒体有氧呼吸;降低糖酵解,抑制乳酸堆积;维持线粒体膜电位稳定;减少m PTP开放;减少细胞凋亡;14-3-3η低表达则反之。结论:在急性缺氧/复氧损伤的不同阶段,14-3-3η高表达可维持心肌细胞内线粒体功能的稳定,保护心肌细胞;该保护作用与其双向调节自噬有关。第六部分14-3-3η抗大鼠离体心脏急性缺氧/复氧不同阶段损伤机制研究目的:在动物水平,验证14-3-3η不同表达对大鼠离体心脏急性缺氧/复氧损伤不同阶段自噬的双重调节作用以及心肌保护作用。方法:构建高/低表达14-3-3η大鼠模型,行离体心脏灌流术,建立急性缺氧以及急性缺氧/复氧损伤模型;Power Lab软件收集离体心脏心率、左室收缩压、左室压力上升最大速率以及左室压力下降最大速率;取不同时间点灌流液行乳酸脱氢酶活性测定;取下心脏,脱水、包埋、切片,行TTC染色,TUNEL;取左室乳头肌,行透射电镜观察超微结构;取部分组织,提取组织蛋白,采用免疫印迹法进行自噬相关蛋白的检测;取部分组织,采用酶标法,测定caspase-3活性。结果:在急性缺氧/复氧损伤的不同阶段,14-3-3η高表达可显着改善上述心功能指标;降低乳酸脱氢酶活性;降低心肌梗死面积;维持线粒体形态以及心肌结构;抑制大鼠离体心脏心肌组织中细胞凋亡;在急性缺氧损伤阶段,14-3-3η高表达增加LC3Ⅱ表达;而在急性缺氧/复氧损伤阶段,14-3-3η高表达抑制LC3Ⅱ表达;14-3-3η低表达则反之。结论:在动物水平上,验证14-3-3η高表达对大鼠离体心脏急性缺氧/复氧损伤不同阶段自噬的双重调节作用以及心脏保护作用。第七部分人参皂苷Rg1通过上调14-3-3η调控心肌细胞急性缺氧/复氧损伤不同阶段的自噬水平目的:初步探讨人参皂苷Rg1的心肌保护机制。方法:预处理给予心肌细胞人参皂苷Rg1,建立急性缺氧以及缺氧/复氧损伤模型;CCK-8法检测心肌细胞存活率;酶标法测定乳酸脱氢酶活性;免疫印迹法检测14-3-3η以及LC3Ⅱ蛋白的表达;采用TUNEL法检测心肌细胞凋亡以及酶标法测定caspase-3活性。结果:在心肌细胞急性缺氧/复氧损伤不同阶段,人参皂苷Rg1均可上调14-3-3η表达;增加细胞存活率;降低乳酸脱氢酶活性;在急性缺氧损伤阶段,上调LC3Ⅱ表达;在急性缺氧/复氧损伤阶段,抑制LC3Ⅱ表达;在此二阶段均抑制细胞凋亡。结论:在心肌细胞急性缺氧/复氧损伤不同阶段,人参皂苷Rg1通过上调14-3-3η表达,双重调节自噬,保护心肌细胞。
文超[4]（2021）在《三七三醇皂苷抗心肌缺血再灌注损伤机制研究及三七总皂苷对PCI心肌保护作用的系统评价》文中研究说明研究目的1.实验部分通过Langendorff实验装置,建立大鼠离体心脏的缺血再灌注损伤模型,并观察三七三醇皂苷对大鼠心脏缺血再灌注损伤造成的影响,同时探究其是否通过PI3K/Akt信号通路及其相关的机制发挥作用。2.临床部分采用Meta分析研究方法,系统评价三七总皂苷治疗急性冠脉综合征患者经PCI后心肌缺血再灌注损伤的疗效及安全性,旨在提供进一步的循证医学证据。研究方法1.实验部分实验一:将40只健康雄性Wistar大鼠采用随机数字表法,随机分为对照组、I/R模型组和低、中、高剂量三七三醇皂苷组（PTSL组、PTSM组、PTSH组）,各8只。对照组穿线,但不结扎冠状动脉,以K-H液持续灌流105min;IR模型组穿线并结扎冠状动脉左前降支近分支30 min后松开结扎线,以K-H液复灌75 min;PTSL组、PTSM组、PTSH组穿线并结扎冠状动脉左前降支近分支处30 min后,分别给予含5、10、20 mg/L三七三醇皂苷的K-H液复灌75 min。收集5组大鼠平衡灌注20 min、心肌缺血30 min和再灌注15min、再灌注75 min的灌流液,检测大鼠灌流液中肌酸激酶同工酶（CK-MB）和乳酸脱氢酶（LDH）水平。比较5组平衡灌注20 min、局部缺血30 min、再灌注15min和再灌注75 min通过多导生理仪记录的心脏血流动力学参数水平,包括心率（HR）、左心室收缩末压（LVESP）、左心室舒张末压（LVEDP）、左心室发展压（LVDP）、左心室内压上升/下降最大速率（±dp/dtmax）,以及LVESP、LVDP、+dp/dtmax与平衡末差值占比。实验二:将40只健康雄性Wistar大鼠采用随机数字表法,分为对照组、I/R组、PTS组、LY294002组、LY294002+PTS组,各8只。通过Langendorff离体心脏灌流装置建立心脏缺血/再灌注模型,对照组只穿线不结扎,平衡20min后以K-H液持续灌流105 min;I/R模型组平衡20min后穿线结扎冠状动脉左前降支近分支处,令左前降支局部停灌30 min,开放结扎线,K-H液复灌75 min。LY294002组平衡20min后,穿线结扎冠状动脉左前降支近分支处30min,后开放结扎线,以含15 μmol/L LY294002的K-H液复灌75min。PTS组平衡20min后,穿线结扎冠状动脉左前降支近分支处30min,后开放结扎线,以含10mg/L三七三醇皂苷的K-H液复灌75min。LY+PTS组平衡20min后,穿线结扎冠状动脉左前降支近分支处30min,后开放结扎线,先以含15 μmol/LLY294002的K-H液复灌15min,再以含10mg/L PTS的K-H液复灌60min。收集不同时刻的灌流液测量心肌酶学指标（CK-MB、LDH）,并记录不同时刻左心室血流动力学参数（HR、LVESP、LVEDP、LVDP、±dp/dtmax）;Western-blot 检测心肌组织中 Akt、p-Akt、GSK-3β、p-GSK-3β的表达,免疫组化检测Bax、Bcl-2、Caspase-3的表达。2.临床部分评价三七总皂苷治疗冠心病急性冠脉综合征PCI患者的有效性和安全性。通过全面搜索 CNKI、WanFang Date、Sinomed、VIP、PubMed、Embase 数据库。筛选并纳入自建库到2021年1月1日以来三七总皂苷联合西医常规治疗冠心病急性冠脉综合征PCI患者的随机对照试验,后根据Cochrane协作网系统评价员5.1.0版进行评估,并对相关结局指标利用RevMan5.3软件进行Meta分析。研究结果1.实验部分实验一:I/R模型组再灌注15、75 min灌流液中CK-MB和LDH水平均高于对照组[CK-MB:（234±51）U/L 比（12±6）U/L,（203±63）U/L 比（14±3）U/L;LDH:（63.9±9.4）U/L 比（6.2±4.6）U/L,（52.1±9.5）U/L比（6.3±4.8）U/L];PTSL、PTSM、PTSH组再灌注75 min灌流液CK-MB水平和再灌注15 min LDH水平均低于IR模型组,PTSL、PTSH组再灌注75 min LDH水平均低于I/R模型组（均P<0.05）。对照组不同时刻灌流液心肌酶指标水平比较差异均无统计学意义（均P>0.05）。与对照组比较,I/R模型组再灌注15、75 min LVDP、+dp/dtmax 均降低,LVEDP、-dp/dtmax 以及 LVESP、LVDP、+dp/dtmax 与平衡末差值占比均升高（均P<0.05）。与I/R模型组比较,PTSL组、PTSM组、PTSH组再灌注15 min LVEDP,PTSL 组再灌注 75 min LVEDP 均降低,PTSM 组再灌注 75 min LVDP、+dp/dtmax均升高,局部缺血30 min,再灌注75 min-dp/dtmax均降低,PTSL组、PISM组、PTSH组LVESP,LVDP、+dp/dtmax与平衡末差值占比均显着降低（均P<0.05）。PTSL组、PTSH组心率在平衡灌注20 min,PTSM组在平衡灌注20 min,局部缺血30 min和再灌注15、75 min均高于IR模型组（均P<0.05）。实验二:（1）血流动力学参数:对照组HR不同时点无明显变化（P>0.05）,其余各组均不同程度上升,且I/R模型组、LY组、PTS组、LY+PTS组在再灌注75min时均无明显差异（P>0.05）。对照组不同时点LVESP、LVEDP、LVDP、±dp/dtmax无明显变化,其余各组随时间延长出现不同程度下降。再灌注75min时,PTS组明显低于模型组（P<0.05）,而LY294002+PTS组与模型组无明显差异,与PTS组差异显着（P<0.05）。（2）CK-MB、LDH:对照组不同时点无显着变化,其余各组再灌注后心肌酶水平均较缺血30min有显着提升（P<0.05）。各组平衡20min时无明显差异（P>0.05）;局部缺血30min时,各组CK-MB无统计学差异（P>0.05）,而各组LDH较对照组有所升高（P<0.05）;再灌注15min、75min时,各组均较对照组明显升高,PTS组明显低于模型组,LY294002+PTS组高于PTS组（P均<0.05）。（3）Akt、pAkt、GSK-3β、pGSK-3β的表达:缺血再灌注损伤后,各组心肌组织Akt、GSK-3β表达无统计学差异（P>0.05）,pAkt、pGSK在PTS组中表达较模型组有显着提高（P<0.05）,在应用LY294002的2组中表达较模型组显着下降（P<0.05）,且LY294002+PTS 与 PTS 组差异存在统计学意义（P<0.05）。（4）Bax、Bcl-2、Caspase-3 的表达:模型组 Bax、Caspase-3 显着高于对照组（P<0.05）,PTS 与 LY+PTS2 组 Bax、Caspase-3表达低于模型组（P<0.05）。对照组Bcl-2强阳性,模型组显着低于对照组（P<0.05）,PTS组较模型组显着提高（P<0.05）,LY294002+PTS组显着低于PTS组（P<0.05）。2.临床部分最终纳入35篇研究,研究地点均在中国,累计病例共计2963例,其中观察组1488例,对照组1475例,共涉及三七总皂苷制剂4种。统计结局指标:CK-MB、cTnT、LVEF、LVEDD、BNP、hs-CRP、IL-6、TNF-α、TC、TG、LDL-C、HDL-C、冠脉灌注 TIMI血流分级进行连续性变量的Meta分析,结果分别为:CK-MB（SMD=-2.09,95%CI:[-3.04,-1.13],I2=97%,P<0.0001）、cTnT（SMD=-2.37,95%CI:[-3.31,-1.43],I2=97%,P<0.00001）、LVEF（WMD=3.97,95%CI:[2.58,5.36],I2=83%,P<0.00001）、LVEDD（WMD=-3.18,95%CI:[-4.33,-2.04],I2=85%,P<0.00001）、BNP（SMD=-1.89,96%CI:[-2.68,-1.11],I2=96%,P<0.00001）、hs-CRP（SMD=-1.46,95%CI:[-2.02,-0.90],I2=96%,P<0.00001）、IL-6（SMD=-1.87,95%CI:[-2.33,-1.41],I2=91%,P<0.00001）、TNF-α（SMD=-1.22,95%CI:[-1.85,-0.59],I2=94%,P<0.0001）、TC（WMD=-0.57,95%CI:[-0.87,-0.27],I2=84%,P=0.0002）、TG（WMD=-0.27,95%CI:[-0.46,-0.08],I2=84%,P=0.005）、LDL-C（WMD=-0.32,95%CI:[-0.61,-0.03],12=85%,P=0.03）、HDL-C（WMD=0.02,95%CI:[-0.13,0.17],I2=84%,P=0.75）、冠脉灌注 TIMI 血流分级（WMD=0.34,95%CI:[0.26,0.42],I2=30%,P<0.00001）。MACEs 发生率、不良反应发生率进行二分类变量的Meta分析,结果分别为:MACEs发生率（RR=0.48,95%CI:[0.33,0.70],I2=4%,P=0.0002）、不良反应发生率（RR=0.73,95%CI:[0.51,1.04],I2=0%,P<0.08）。提示PNS制剂联合西医常规治疗对PCI患者心肌存在一定的保护作用,尤其是在改善冠脉再灌注情况、降低心血管不良事件发生率方面作用显着。但是纳入研究数量偏少、样本量较小、方法学质量偏低,为进一步评价PNS制剂治疗MIRI的有效性,仍需要未来有更多大样本、高质量的随机对照研究提供更可靠的循证医学证据。研究结论1.在大鼠离体心脏局部I/R损伤模型中,三七三醇皂苷具有减少心肌酶的释放、减轻左心室收缩和舒张功能障碍的作用,可能与其调节PI3K/Akt信号通路有关。2.三七总皂苷制剂对PCI患者心肌保护作用疗效肯定,尤其是在改善冠脉灌流、心血管不良事件方面作用显着。
何可[5]（2021）在《高盐环境下内皮素受体介导的冠状动脉平滑肌损伤的机制研究》文中提出背景高盐饮食是高血压发生发展的关键性因素,高盐环境引起的冠状动脉张力功能障碍的机制尚不清楚。以往的研究表明,冠状动脉痉挛往往是由内皮素-1（endothelin-1,ET-1）和血栓环素（thromboxane A2,TXA2）引起的,会促进血管纤维化导致心肌缺血。高盐饮食可能会引起神经体液因素通过冠脉内受体机制影响血管张力,表达于冠脉平滑肌层的内皮素受体可能关键性的介导了冠脉的收缩,其上游调节因素包括内源性内皮素和血栓环素,可激活内皮素受体介导的IP3受体-SOCE信号通路。钙库操纵的钙内流(store-operated Ca2+entry,SOCE)保持内质网Ca2+的稳态,是维持血管平滑肌收缩功能的重要环节。然而,高盐和高血压状态会引起动脉重构主要表现为血管中膜层纤维化,血管平滑肌细胞（VSMCs）会进行表型转化,并可能导致SOCE作用失衡而影响冠脉血管张力。因此,本研究分别通过在体内建造高盐饮食动物模型和体外模拟细胞外高盐环境,探讨高盐环境下冠状动脉收缩张力变化及机制,为高盐高血压相关缺血性心脏病临床治疗提供新的思路。目的探讨高盐饮食大鼠及细胞外高盐环境下内皮素受体介导的大鼠冠状动脉平滑肌收缩功能的变化及其机制。方法本研究在体内建造4%高盐饮食4周大鼠模型,分为正常饮食组及高盐饮食组,用无创血压系统测量大鼠的收缩压水平,用ELISA实验测定大鼠血清中ET-1浓度,采用二维M型超声心动图测量大鼠心脏结构,评估心脏射血功能,急性分离大鼠冠状动脉并去除内皮后,用离体血管张力实验检测U46619、ET-1和SOCE诱导的冠脉平滑肌收缩功能,并分别通过蛋白质免疫印迹及免疫组化实验检测IP3R-SOCE信号通路相关蛋白ETA、ETB、IP3R、STIM1和Orai1在大鼠冠状动脉平滑肌中的表达水平,用Masson染色和天狼星红染色检测大鼠冠状动脉平滑肌中胶原分布及表达情况;在体外分别用不同浓度高盐培养大鼠离体冠状动脉24 h,分为正常盐培养组（137.65 m M[Na Cl]）及高盐培养组（147.65–167.65 m M[Na Cl]）,用离体血管张力实验按上述方法检测冠脉平滑肌收缩功能,用免疫组化实验检测上述IP3R-SOCE信号通路相关蛋白表达水平,用钙成像检测高盐培养的大鼠冠脉平滑肌细胞中SOCE诱导的Ca2+内流情况。结果4%高盐饮食4周使大鼠血压升高,血清ET-1浓度升高,心脏室间隔及左室后壁明显增厚,心率增加,冠脉平滑肌层I型胶原蛋白表达增加,I/III型胶原比值增加,表明高盐饮食大鼠冠脉发生纤维化表现,高盐饮食大鼠冠状动脉平滑肌中内皮素受体介导的IP3R-SOCE信号通路相关蛋白ETA、ETB、IP3R、STIM1和Orai1表达下调,由ET-1、U46619及SOCE诱导的高盐饮食大鼠冠状动脉平滑肌收缩功能下降;而体外高盐培养后大鼠冠状动脉平滑肌IP3R-SOCE途径相关蛋白表达水平增强,SOCE诱导的Ca2+内流增强,冠脉平滑肌收缩功能增强。结论体外高盐培养后,细胞外高钠环境使大鼠冠状动脉平滑肌中内皮素受体介导的IP3R-SOCE途径ETA、IP3R、STIM1和Orai1蛋白表达水平升高,导致冠状动脉平滑肌收缩功能增强,而短期高盐饮食后大鼠血压升高、血清ET-1含量上升导致冠脉纤维化,引起的上述IP3R-SOCE途径相关蛋白水平下调推测为代偿性机制,并进一步导致冠状动脉平滑肌收缩功能下降,但随着病程迁延最终可能失代偿。
张静[6]（2020）在《OGT介导的RIPK3 O-GlcNAc糖基化在七氟醚后处理抑制心肌缺血再灌注损伤时程序性坏死中的作用》文中研究指明背景和目的:吸入麻醉药对心肌缺血再灌注损伤（myocardial ischemia reperfusion injury,MIRI）能够发挥明确的心肌保护作用。之前研究已经明确吸入麻醉通过O-Glc NAc糖基化修饰线粒体电压依赖性阴离子通道,发挥对MIRI的保护作用。O-Glc NAc糖基化修饰对心肌细胞程序性坏死具有保护作用。虽然目前临床上有多种挥发性麻醉药应用,但是在心胸外科手术中使用最为广泛的挥发性麻醉药仍是七氟醚。心胸外科手术强调围术期,尤其是麻醉诱导和麻醉苏醒阶段的血流动力学平稳,而七氟醚的药效特点能与此吻合。之前有大量的临床和基础课题关注于七氟醚后处理（sevoflurane postconditioning,SPC）的心肌保护作用,但就其保护作用的机制研究并不够全面。本研究的目的是探讨OGT介导的RIPK3 O-Glc NAc糖基化上调和程序性坏死信号通路下调是否是SPC发挥心肌保护作用的重要机制。方法:本研究建立在体和离体MIRI模型,并将在体模型中60只大鼠随机分为四组:假手术组（SHAM组）,单纯七氟醚组（SEVO组）,缺血再灌注组（IR组）和七氟醚后处理组（SPC组）。在Langendorff离体模型中45只大鼠随机分为五组:SHAM组,IR组,SPC组,SPC+溶剂（DMSO）组,SPC+抑制剂（OSMI-1）组。其中除SHAM组和SEVO组外,其它各组每只大鼠心脏均经历持续缺血30min后恢复血流2h的过程。实验过程中持续监测大鼠血流动力学变化,并在平衡期末（T0）,恢复血流后30min（T1）,恢复血流后60min（T2）,恢复血流后90min（T3）,恢复血流后2h（T4）时进行记录。利用小动物心脏彩超仪监测在体实验中各组大鼠心功能指标。在再灌注末,利用1%氯化三苯基四氮唑（triphenyltetrazolium chloride,TTC）染色检测心肌梗死范围,参照酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA）法检测血清或冠脉漏出液中乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase,LDH）浓度,利用HE染色后光镜下观察各组大鼠的心肌组织病理片,利用荧光显微镜观察程序性坏死的心肌,利用Western Blot方法检测O-Glc NAc糖基化水平和程序性坏死标记蛋白的表达水平。另外,为了进一步的机制研究,通过免疫共沉淀技术检测O-Glc NAc糖基化蛋白和程序性坏死信号通路相关蛋白之间的结合情况。结果:1、在体MIRI模型中,通过监护仪连续监测并记录大鼠T0、T1、T2、T3和T4不同时间点四组大鼠HR、MAP和RPP,结果显示SPC改善了MIRI后的血流动力学变化;2、在体MIRI模型中,利用小动物心脏超声仪采集大鼠超声心动图并测量心功能参数,表明SPC能够改善IR损伤后的心脏收缩功能不全,减轻心脏结构的改变和逆转心室肥厚;3、在体MIRI模型中,检测各组大鼠心肌梗死范围和HE染色的结果表明SPC能够降低IR损伤后的大鼠心肌梗死范围,改善IR损伤后心肌细胞紊乱排列;4、在体MIRI模型中,监测血清LDH浓度,发现SPC能够降低IR损伤后血清心肌程序性坏死标记酶LDH浓度;5、在体MIRI模型中,通过荧光显微镜观察程序性坏死的心肌细胞,结果表明SPC能够降低IR损伤后的程序性坏死心肌细胞;6、在体MIRI模型中,检测程序性坏死相关蛋白的结果表明SPC能够下调p-RIPK3、RIPK3、p-MLKL和MLKL蛋白表达水平;7、在体MIRI模型中,检测O-Glc NAc糖基化蛋白的结果表明SPC能够上调IR损伤后总蛋白O-Glc NAc糖基化和OGT蛋白表达水平;8、在体MIRI模型中,通过蛋白免疫共沉淀实验检测心肌细胞中O-Glc NAc、RIPK3和MLKL之间是否存在相互作用,结果表明SPC能够上调IR损伤后O-Glc NAc糖基化RIPK3,并且抑制RIPK3和MLKL的结合;9、离体MIRI模型中,通过监护仪连续监测并记录大鼠T0、T1、T2、T3和T4不同时间点五组大鼠HR、LVSP、LVEDP和±dp/dtmax,结果显示SPC改善了MIRI后的血流动力学,但给予OGT抑制剂OSMI-1后减弱了SPC改善血流动力学的心肌保护作用;10、离体MIRI模型中,通过1%TTC染色测定心肌梗死范围,结果表明SPC能够减少IR损伤后的心肌梗死范围,但给予OSMI-1后减弱了SPC降低心肌梗死的心肌保护作用;11、离体MIRI模型中,监测冠脉漏出液LDH浓度,发现SPC能够降低IR损伤后冠脉漏出液LDH浓度,但给予了OSMI-1后冠脉漏出液LDH浓度明显升高;12、离体MIRI模型中,检测糖基化相关蛋白的结果表明SPC能够上调IR损伤后总蛋白O-Glc NAc糖基化和OGT蛋白表达水平,但给予OSMI-1后总蛋白O-Glc NAc糖基化和OGT蛋白表达水平明显下调;13、离体MIRI模型中,检测程序性坏死相关蛋白的结果表明SPC能够下调p-RIPK3和p-MLKL蛋白表达水平,但给予OSMI-1后p-RIPK3和p-MLKL蛋白表达水平均明显上调。结论:1、SPC通过抑制MIRI时RIPK3/MLKL介导的程序性坏死发挥心肌保护作用;2、SPC通过促进MIRI时OGT介导的O-Glc NAc糖基化修饰水平升高,进一步增加RIPK3的O-Glc NAc糖基化修饰水平;3、SPC能够上调MIRI时RIPK3的O-Glc NAc糖基化水平,进而抑制RIPK3/MLKL复合物形成,最终减轻MIRI所致的程序性坏死。
刘志沛[7]（2020）在《异莲心碱和人参皂苷Rb1的抗心律失常机制》文中进行了进一步梳理心律失常是心脏疾病的主要并发症,严重的心律失常如室速、室颤会导致心源性猝死,因此心律失常是危害人类生命健康的一个公共卫生问题。心律失常的治疗主要有两类方式,一种是器械和手术治疗,比如植入起搏器、植入式心律转复除颤器,心脏射频消融术;另一种是抗心律失常药物治疗,比如胺碘酮、维拉帕米。虽然器械和手术治疗效果比较好,但也存在各种问题,因此抗心律失常药物治疗仍然是治疗心律失常最常见的策略。目前常用的抗心律失常药物大多数是西药,但是西药有一个棘手的问题,就是副作用较大,因此很多人尝试从传统中草药中开发抗心律失常药物。相较于西药,直接开发中草药及其活性单体优势很多,如中草药在中国乃至亚洲地区已应用数千年,其临床使用、毒性和副作用等方面都比较清楚,因此其开发成本低且安全性较高。炙甘草汤是抗心律失常的名方,在它的基础上研发了许多抗心律失常中成药,例如心速宁等。中成药心速宁由甘草、黄连、莲子心、人参、半夏、茯苓、枳实、常山、苦参、青蒿和麦冬等十一味中草药组成。这些药材的大多数活性成分都做过抗心律失常方面的研究,但有些活性成分在抗心律失常方面的研究不够完整。异莲心碱和人参皂苷Rb1分别提取自莲子心和人参,据报道它们具有多种药理活性,尤其是对心血管具有保护作用。根据上述资料,我们推测异莲心碱和人参皂苷Rb1可能具有抗心律失常的潜质,但其抗心律失常的机制需要深入研究。我们运用全细胞膜片钳技术,记录家兔左心室肌细胞的锋钠电流、晚钠电流、L型钙电流、多种钾电流和动作电位,观察异莲心碱和人参皂苷Rb1对这些电流和动作电位的作用。我们还记录了心室肌细胞的钙瞬变,观察人参皂苷Rb1对心室肌细胞内钙的影响。在细胞层面,也建立了多种病理模型,从缺氧-复氧模型中观察人参皂苷Rb1在缺氧后再复氧的条件下如何影响细胞内钙离子;从海葵毒素Ⅱ（ATX-II）诱导的早期后除极和细胞外高钙诱导的晚期后除极模型中观察异莲心碱和人参皂苷Rb1对后除极这种与心律失常密切相关的病理活动的影响。最后,还观察了人参皂苷Rb1对缺血再灌注损伤引起的心律失常的作用。实验结果显示,异莲心碱浓度依赖性地抑制锋钠电流,半抑制浓度为5.43μmol/L,8μmol/L的异莲心碱使锋钠电流稳态激活曲线右移,稳态失活曲线左移,同时也使锋钠电流时间依赖性复活曲线右移。异莲心碱也能浓度依赖性地抑制L型钙电流,半抑制浓度为1.18μmol/L,2μmol/L的异莲心碱使L型钙电流稳态失活曲线左移,但不影响稳态激活曲线和时间依赖性复活曲线。异莲心碱（1、5、10μmol/L）还能抑制ATX-II诱导增大的晚钠电流,但20μmol/L的异莲心碱不影响内向整流钾电流和延迟整流钾电流的大小。异莲心碱对动作电位的作用表现为抑制动作电位幅度和最大上升速率,缩短动作电位时程,但不影响静息膜电位水平。异莲心碱可以消除ATX-II诱导的早期后除极和细胞外高钙（3.6 mmol/L）诱导的晚期后除极。人参皂苷Rb1浓度依赖性地抑制锋钠电流,半抑制浓度为13.22μmol/L,20μmol/L的人参皂苷Rb1使锋钠电流稳态失活曲线左移,但不影响稳态激活曲线。人参皂苷Rb1也能浓度依赖性地抑制L型钙电流,半抑制浓度为41.89μmol/L,80μmol/L的人参皂苷Rb1使L型钙电流稳态失活曲线左移,但不影响稳态失活曲线。人参皂苷Rb1（40、80、160μmol/L）对内向整流钾电流和延迟整流钾电流的大小无影响。人参皂苷Rb1对动作电位的作用表现为抑制动作电位幅度和最大上升速率,缩短动作电位时程,但不影响静息膜电位水平。人参皂苷Rb1不仅可以降低细胞内钙浓度,抑制缺氧-复氧引起的钙超载的发生,还能消除细胞外高钙（3.6 mmol/L）诱发的晚期后除极。40μmol/L人参皂苷Rb1降低了缺血再灌注损伤引发的室性早搏的次数,延迟了室性早搏的首发时间,也降低了室性心动过速的发生率。综上所述,异莲心碱通过抑制锋钠电流、L型钙电和晚钠电流,消除早期后除极和晚期后除极的发生来发挥抗心律失常的作用;人参皂苷Rb1通过抑制锋钠电流、L型钙电流,降低细胞内钙水平和抑制钙超载的发生来发挥抗心律失常的作用。
张肖怡[8]（2020）在《脂肪酸对糖尿病大鼠神经损伤和心肌易损性增加的影响和机制》文中研究指明背景:糖尿病神经病变和心血管病变是糖尿病常见又严重的并发症,一旦发生很难逆转,但至今其发病机制仍不明确。以往的研究主要集中在糖尿病高血糖对神经元和心肌细胞的损伤作用,而糖尿病病变中脂肪酸的影响往往容易被忽视。我们的研究发现辣椒素受体（transient receptor potential vanilloid type1,TRPV1）在糖尿病大鼠背根神经节（dorsal root ganglia,DRG）和心肌的表达量显着降低,饮食中给予辣椒或者辣椒素缓慢激活TRPV1,可以明显改善糖尿病大鼠神经病变和心肌缺血-再灌注损伤的易损性;降钙素基因相关肽（calcitonin gene-related peptide,CGRP）和P物质（substance P,SP）体外作用也可以保护心肌的缺氧复氧损伤,因此,TRPV1-CGRP/SP的激活在糖尿病神经病变和心血管病变中发挥了重要的保护作用。同时根据文献报道,糖尿病患者体内升高的脂肪酸中有些具有抑制TRPV1的作用,那么这部分脂肪酸对糖尿病神经病变和心肌缺血-再灌注损伤是否具有损伤作用,其作用是否通过抑制TRPV1-CGRP轴,从而抑制了机体的保护作用,具体的作用机制是什么?这是我们实验的主要目的。本实验主要通过对文献中发现报道的糖尿病人体内增多的脂肪酸做筛选,并验证其对TRPV1的作用。用相应的脂肪酸作用于糖尿病大鼠的DRG神经元和对心脏进行体外缺血-再灌注,观察DRG神经元的生长情况和心肌功能的变化,最后进一步探讨其可能的作用机制。目的:（1）检测不同浓度的油酸（oleic acid,OA）对DRG神经元TRPV1通道的作用。（2）用OA作用于糖尿病神经病变大鼠DRG神经元,检测其对TRPV1及其下游降钙素基因相关肽（CGRP）和P物质（SP）以及神经生长因子（NGF）的表达的影响。同时检测DRG神经元氧化应激损伤、线粒体功能、凋亡和轴突的生长情况。用辣椒素（capsaicin）激活TRPV1,检测是否能逆转OA的作用。（3）因为capsaicin激活TRPV1后会刺激释放CGRP,那么CGRP对糖尿病神经病变大鼠DRG神经元是否有保护作用?通过外源性给予CGRP或者慢病毒介导的过表达CGRP后,检测SP和NGF的表达;同时检测糖尿病DRG神经元氧化应激、凋亡、线粒体膜电位和轴突生长情况。（4）用OA体外灌流正常大鼠的心脏,并进行缺血-再灌注（I/R）,检测心功能的变化。进一步给予PI3K/Akt信号通路的抑制剂LY294002,简单说明TRPV1在大鼠心脏I/R的作用机制。方法:（1）分离正常和糖尿病成年SD大鼠DRG,原代培养DRG神经元细胞。用钙成像（Fluo4-AM离子探针）的方法检测不同浓度的capsaicin和OA对DRG神经元内Ca2+浓度变化的影响。（2）用STZ诱导产生糖尿病大鼠模型,分离培养其DRG神经元,用capsaicin和OA作用于糖尿病大鼠DRG神经元,检测DRG细胞损伤（LDH检测）、活性氧（ROS）、线粒体膜电位（JC-1）和凋亡（TUNEL）以及轴突的生长情况（anti-βⅢtubulin antibody）;最后检测TRPV1、CGRP、SP和NGF的m RNA和蛋白的表达情况（PCR、western blot和ELISA）。（3）用过表达CGRP的慢病毒（LV-CGRP）或者体外给予CGRP作用于糖尿病大鼠DRG神经元,检测DRG细胞损伤（LDH检测）、活性氧（ROS）、线粒体膜电位（JC-1）和凋亡（TUNEL）以及轴突的生长情况（anti-βⅢtubulin antibody）,最后检测CGRP、SP和NGF的m RNA和蛋白的表达情况（PCR、ELISA）。（4）采用Langendorff灌流装置进行离体心脏缺血-再灌注（停灌30min,复灌60min）。给予OA、capsaicin和PI3K的抑制剂LY294002,记录缺血-再灌注后心脏功能:左心室主动收缩压（left ventricular development pressure,LVDP）,左室舒张末期压力（left ventricular end-diastolic pressure,LVEDP）,心率（heart rate,HR）,左心室内压最大上升和下降速率（±dp/dtmax）以及室性心律失常的发生情况（室性早搏、室速和室颤）。同时检测心肌缺血区PI3K/Akt通路中p-Akt的表达情况（western blot）。结果:（1）体外原代培养大鼠DRG神经元,用PGP9.5对DRG神经元进行鉴定,可以发现DRG神经元生长良好,细胞贴壁后慢慢长出轴突。并且TRPV1和CGRP、SP、NGF在DRG神经元上都有共表达。（2）体外分离、培养正常和糖尿病大鼠DRG神经元,培养24h后进行Ca2+成像。在正常大鼠DRG神经元中,10-7,10-6,10-5 mol/L的辣椒素（capsaicin,Cap）可以浓度依赖性地升高细胞内Ca2+浓度（P<0.001）。用最适浓度10-6 mol/L的Cap分别作用于正常和糖尿病大鼠DRG神经元,糖尿病大鼠DRG神经元内Ca2+浓度增加小于正常大鼠DRG神经元,也验证了糖尿病大鼠DRG中TRPV1的表达减少。先用5×10-8,5×10-7,5×10-6mol/L的油酸（oleic acid,OA）和10-6mol/L辣椒平（capsazepine,Cpz）分别作用于正常大鼠DRG神经元,5×10-6mol/L的OA和10-6mol/L Cpz的作用类似,细胞内Ca2+浓度变化没有明显差别（P>0.05）。相对于Cpz和5×10-6mol/L的OA,5×10-8,5×10-7mol/L的OA均可以升高细胞内Ca2+浓度（P<0.001）。接着给予10-6mol/L Cap,TRPV1受体近一步被激活。Cpz和5×10-6mol/L的OA在Cap作用后,细胞内Ca2+浓度均没有明显的变化（P>0.05）;相对于Cpz和5×10-6mol/L的OA,5×10-8,5×10-7mol/L的OA在Cap作用下,细胞内Ca2+浓度均明显升高（P<0.001）。说明低浓度的OA对TRPV1有一定的激活作用,高浓度的OA作用类似TRPV1的拮抗剂Cpz,对TRPV1受体有抑制作用。（3）OA对糖尿病大鼠DRG神经元的作用:糖尿病大鼠DRG神经元培养液中的乳酸脱氢酶（LDH）浓度升高（P<0.01）,活性氧（ROS）生成增多（P<0.01）,线粒体膜电位（MMP）降低（P<0.01）,细胞凋亡率增加（P<0.01）,DRG神经元轴突增生受损（P<0.01）,再生能力减弱。同时TRPV1、CGRP、SP和NGF的表达不论在蛋白还是m RNA水平均减少（P<0.05）。10-6 mol/L的Cap可以缓解糖尿病大鼠DRG神经元的损伤（P<0.05）,拮抗剂辣椒平（capsazepine,Cpz）可以取消capsaicin的保护作用（P>0.05）。用5×10-6mol/L的OA作用于糖尿病DRG神经元,神经元的损伤没有进一步的增加（P>0.05）,但是用Cap作用后,Cap的保护作用消失（P>0.05）;TRPV1、CGRP、SP和NGF的表达在蛋白和m RNA水平也没有增加（P>0.05）。说明5×10-6mol/L的OA发挥了类似TRPV1拮抗剂的作用,取消了Cap激活TRPV1后对糖尿病大鼠DRG神经元的保护作用。（4）CGRP对糖尿病大鼠DRG神经元的作用:用外源性10-8mol/L的CGRP作用于糖尿病DRG神经元,可以改善糖尿病DRG神经元的损伤,使得细胞的损伤减少（P<0.05）,ROS的生成减少（P<0.01）,升高MMP（P<0.05）,神经元凋亡率减少（P<0.01）,轴突增生增加（P<0.01）;同时10-7mol/L拮抗剂CGRP8-37可以取消CGRP的保护作用（P>0.05）。那么CGRP的作用是否依赖于SP和NGF呢,用LV-CGRP感染糖尿病DRG神经元,DRG神经元的损伤减小（P<0.01）,轴突的增生增加（P<0.01）,同时检测SP和NGF的表达,SP和NGF的m RNA和蛋白的表达都没有明显的增加（P>0.05）。说明CGRP对糖尿病大鼠DRG神经元的损伤具有保护作用,并且其保护作用不依赖SP和NGF。（5）OA缺血预处理对离体大鼠心脏I/R的影响:在缺血前,10-6 mol/L Cap作用后心脏LVDP、HR和±dp/dtmax明显增加（P<0.01）,LVEDP降低（P<0.01）;5×10-6mol/L OA作用后LVDP、HR和±dp/dtmax明显降低（P<0.05）,LVEDP增加（P<0.05）,再给予10-6 mol/L Cap,可以抑制OA对心功能的影响（P>0.05）。再灌注后Cap明显改善I/R对心功能的损伤,LVDP、HR和±dp/dtmax明显升高（P<0.01）,LVEDP降低（P<0.01）。同时Cap可以改善OA对心功能的损伤,LVDP、HR和±dp/dtmax降低（P<0.05）,LVEDP升高（P<0.05）。先给予PI3K的拮抗剂LY294002,再给予Cap,发现Cap的保护作用被取消（P>0.05）。在整个I/R期间,10-6 mol/L Cap作用后,室性早搏的发生次数增加（P<0.05）,室速和室颤的发生次数没有明显的变化（P>0.05）;5×10-6mol/L OA单独作用后,室性早搏的发生次数明显增加（P<0.01）,室速和室颤的发生次数增加（P<0.05）;在OA的基础上再给予Cap,心脏室性早搏（P<0.01）、室速（P<0.01）和室颤（P<0.05）的发生次数均减少。和单独给予Cap相比,给予LY294002后再给予Cap,室性早搏的发生次数减少（P<0.05）。检测心肌缺血区p-Akt的表达,Cap作用后p-Akt的表达增加（P<0.01）,OA和LY294002均可以抑制capsaicin诱导的p-Akt的增加（P<0.01）。说明OA可以通过抑制TRPV1-CGRP轴,抑制PI3K/Akt信号通路,从而加重心肌I/R损伤。结论:（1）OA对TRPV1的作用与浓度有关,低浓度可以轻度激活TRPV1,高浓度抑制TRPV1。（2）糖尿病神经病变大鼠DRG神经元中,TRPV1以及其下游的感觉神经肽CGRP、SP和NGF的表达减少,外源性的给予capsaicin可以改善糖尿病DRG神经元的氧化应激损伤,促进轴突再生。外源性给予大剂量的OA,并不加重糖尿病DRG神经元的损伤,但是减弱了TRPV1激活后的保护作用。（3）CGRP可以保护糖尿病神经病变DRG神经元,并且保护作用并不通过SP和NGF发挥作用。（4）正常大鼠离体心脏缺血-再灌注损伤中,OA可以加重损伤,并且抑制capsaicin激活TRPV1对I/R损伤的保护,其作用可能是通过PI3K/AKT信号通路来实现的。综上所述:大剂量的OA可以抑制TRPV1受体,从而抑制了TRPV1-CGRP轴激活后对糖尿病大鼠神经病变和心脏缺血-再灌注损伤的保护作用,可能是通过抑制PI3K/Akt信号通路来实现的。
杨小琪[9]（2020）在《定心藤活性成分抗心肌缺血再灌注损伤的作用及机制研究》文中认为目的:通过建立大鼠Langendorff离体心肌缺血再灌注动物模型,研究定心藤活性成分TL（3α-5α-tetrahydrodeoxycordifoline lactam）抗心肌缺血再灌注损伤的药效学研究和相关机制,探讨定心藤活性成分TL对缺血再灌注损伤大鼠心肌的保护作用是否通过线粒体KATP通道和抗氧化途径介导表达而实现的。方法:1.定心藤活性成分抗心肌缺血再灌注损伤药效研究SD大鼠30只随机分为5组:sham组、I/R组、定心藤活性成分TL高、中、低剂量组（给药剂量分别为14.4、4.8、1.44mg/kg）,每组6只。实验前先给大鼠一周的适应时间,然后给与sham组和I/R组生理盐水腹腔注射,定心藤活性成分TL组给予高中低剂量腹腔注射一周,然后用langendorff离体心脏模型进行心脏灌流,连接生理信号记录分析系统记录各数据,对大鼠离体心脏给与平衡20min,停灌20min,复灌180min处理,观察平衡期、复灌期各组大鼠+dp/dtmax（左心室内最大上升速率）、-dp/dtmax（左心室内最大下降速率）、LVDP（左室发展压）、LVEDP（左室舒张末期压）、冠状动脉血流量的血流动力学指标的变化。在复灌120min时收集心脏流出液,并使用LDH试剂盒测定流出液LDH的浓度。复灌180min后通过TTC对各分组大鼠心脏进行染色并测定梗死面积。2.定心藤活性成分抗心肌缺血再灌注损伤作用机制研究SD大鼠60只随机分为5组:sham组、I/R组、定心藤中剂量组（给药剂量4.8mg/kg）I/R+TL组、定心藤中剂量组+5-HD组（5-羟基癸酸,一种线粒体KATP通道阻滞剂）I/R+TL+5-HD组、I/R+5-HD组,每组12只。实验前先给大鼠一周的适应时间,然后给与sham组、I/R组和I/R+5-HD组生理盐水腹腔注射,定心藤中剂量组和定心藤中剂量组+5-HD组给予定心藤活性成分TL腹腔注射一周,然后用langendorff离体心脏模型进行心脏灌流,连接生理信号记录分析系统记录各数据,对大鼠离体心脏给与平衡20 min,停灌20 min,复灌180 min处理,对于I/R+TL+5-HD组和TL+5-HD组在停灌前10 min给予10分钟的5-HD预处理。Western Blot方法检测心脏组织中Bax、Bcl-2、HO-1、细胞色素C（cytochrome C,CYTC）、Caspase-3、MN-SOD、Catalase蛋白的表达水平。采用MTS法利用试剂盒测定心脏组织Caspase 3和Caspase 9的酶活性。结果:1.定心藤活性成分抗心肌缺血再灌注损伤药效研究Langendorff离体心脏缺血再灌注损伤实验中,血流动力学结果显示,定心藤活性成分TL的高中剂量组可提高缺血再灌注末期的+dp/dt、-dp/dt、LVDP、LVEDP和冠脉血流量水平,但在定心藤中剂量组时效果更好。复灌后120 min流出物通过LDH试剂盒检测,结果显示定心藤中剂量组可减少LDH的水平;TTC染色结果显示定心藤中剂量组可以明显减少大鼠的心肌梗死面积。2.定心藤活性成分抗心肌缺血再灌注损伤作用机制研究由于定心藤活性成分TL抗心肌缺血再灌注损伤药效学显示定心藤中剂量组的药效最为显着,因此选择中剂量组进行后续实验机制研究。流动力学结果显示,5-HD预处理10分钟阻止定心藤活性成分TL改善缺血再灌注末期的+dp/dt、-dp/dt、LVDP、LVEDP和冠脉血流量水平;复灌后120 min流出物通过LDH试剂盒检测,结果显示定心藤活性成分TL组缺血后LDH水平明显低于I/R组。用5-HD预处理10分钟阻止定心藤活性成分TL改善缺血再灌注末期LDH活性;单独的5-HD未显示和I/R组心脏功能的任何变化。定心藤活性成分TL显着减少了再灌注损伤引起的梗塞面积,5-HD完全阻断了这种效应。Western Blot结果显示I/R导致MN-SOD、Catalase、HO-1蛋白水平降低,Bax、Cytochrome C和Caspase-3蛋白水平的增加,以及Bcl-2水平的降低,其被定心藤活性成分TL处理逆转,5-HD减弱了定心藤活性成分TL的作用,5-HD本身对这些蛋白水平无显着影响。结论:定心藤活性成分TL对大鼠心肌缺血再灌注损伤具有保护作用,且该作用是与线粒体KATP通道和抗氧化途径介导表达有关。
彭兰[10]（2019）在《附子配甘草对离体心脏的作用及其指纹图谱研究》文中指出目的:本文以附子甘草作为研究对象,研究附子甘草合煎及单煎后合并对离体心脏的作用及其物质基础。制备离体蛙心（正常和心衰）模型,比较附子、甘草单煎及其配伍对离体蛙心作用的差异。研究附子单煎及其配伍对离体大鼠衰竭心脏的作用,比较3种煎液对离体大鼠衰竭心脏作用的差异;通过总量统计矩法分析10批附子、10批甘草及其配伍的指纹图谱,比较其差异。运用总量统计矩方法得出合煎液、单煎后合并液的HPLC指纹图谱总量统计矩参数,分析其成分差异。综合以上方法,研究附子甘草合煎及单煎后合并可能的机理。旨在阐明中药的配伍机理。方法:1.采用斯氏插管法制备离体蛙心模型,使用低钙任氏液制备蛙心心衰模型。用附子单煎、甘草单煎、合煎及单煎后合并水提液分别对正常和心衰离体蛙心进行干预。通过生物机能实验系统观察并记录离体蛙心心肌收缩力的变化,观察药物对正常和心衰离体蛙心的作用及其量效关系。2.使用低钙K-H液灌流制备离体大鼠衰竭心脏模型。用附子单煎、附子甘草合煎及单煎后合并水提液分别对离体心脏进行干预。采用左室内压（LVSP）、左室内压变化速率(±dp/dtmax)为指标,观察药物对离体大鼠心脏的作用及其量效关系。3.通过总量统计矩法研究附子单煎,甘草单煎,附子甘草合煎及附子甘草单煎后合并液的HPLC指纹图谱及变化。采购10批附子和甘草药材,分别制备附子单煎供试液、甘草单煎供试液、合煎供试液、单煎后合并供试液。通过高效液相色谱仪检测,采集4种供试液的指纹图谱信息。运用总量统计矩加合性分析合煎及单煎后合并液的HPLC指纹图谱,探讨其作用的差异。结果:1.在生药浓度为10,20,40 mg·mL-1时,附子甘草合煎或合并中甘草均能增强附子对心衰离体蛙心的强心作用。附子在不同浓度水平下按1∶1配伍甘草时,无论两者合煎或单煎后合并,对离体蛙心的作用均与附子单煎液不同。2.若附子、甘草按1∶1配伍,在附子生药量为0.1 mg和0.2 mg时,配伍甘草能够增加其强心作用;在附子生药量为0.4 mg、0.8 mg或1.6 mg时,配伍甘草则减弱其强心作用。附子及其配伍对离体大鼠衰竭心脏模型的强心作用不同。3.通过计算附子单煎、甘草单煎、合煎、单煎后合并HPLC指纹图谱的总量统计矩参数及总量统计矩相似度,提示同一产地10批附子和甘草的成分与含量存在一定差异。合煎液的数学期望和方差与单煎后合并的数学期望和方差加合性差异较大,则提示合煎与单煎后合并比较,附子甘草共煎煮过程中化学成分及含量发生了明显变化。结论:从药效而言,两种附子甘草煎液（附子甘草合煎液,附子甘草合并液）对离体心脏的强心作用不同。釆用指纹图谱总量统计矩法研究附子甘草合煎及单煎后合并液的化学组成及含量变化,结果显示附子甘草合煎及单煎后合并液的成分及含量不同,这可能是引起其在药效上有差别的原因。
二、K物质对离体大鼠心脏功能的影响（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、K物质对离体大鼠心脏功能的影响（论文提纲范文）
（1）羟考酮通过SIRT3/SOD2/NF-κB通路减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 第一章 绪论 |
| 第二章 资料与实验方法 |
| 2.1 主要实验设备 |
| 2.2 主要实验试剂 |
| 2.3 主要配制试剂 |
| 2.4 实验动物及分组 |
| 2.5 实验过程 |
| 2.5.1 建立SD大鼠心肌缺血再灌注损伤模型 |
| 2.5.2 ELISA法测定血清cTnI水平 |
| 2.5.3 HE染色观察心肌组织形态学特征 |
| 2.5.4 IHC检测心肌细胞TLR4、p65 蛋白表达 |
| 2.5.5 WB检测心肌细胞TLR4、p65、p-p65 蛋白表达 |
| 2.5.6 线粒体试剂盒提纯心肌细胞线粒体 |
| 2.5.7 IHC检测心肌细胞线粒体SOD2 蛋白表达 |
| 2.5.8 WB 检测心肌细胞线粒体 SIRT3 蛋白表达 |
| 2.6 统计学方法 |
| 第三章 结果 |
| 3.1 血清cTnI水平结果 |
| 3.2 HE染色心肌组织形态学结果 |
| 3.3 IHC检测心肌细胞TLR4、p65 蛋白表达结果 |
| 3.4 WB检测心肌细胞TLR4、p65、p-p65 蛋白表达结果 |
| 3.5 IHC检测心肌细胞线粒体SOD2 蛋白表达结果 |
| 3.6 WB检测心肌细胞线粒体SIRT3 蛋白表达结果 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 第六章 研究的不足和展望 |
| 参考文献 |
| 综述 阿片类受体激动剂的心脏保护作用研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介及攻读学位期间取得的研究成果 |
（2）腺苷激酶及4-羟基壬烯醛在心脏缺血再灌注损伤中作用及机制研究（论文提纲范文）
| 论文Ⅰ 腺苷激酶在心脏缺血再灌注损伤中的作用及机制研究 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语/符号说明 |
| 1.前言 |
| 2.材料与方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 6.附图 |
| 7.创新性与局限性 |
| 8.参考文献 |
| 论文Ⅱ 4-羟基壬烯醛在心脏缺血再灌注损伤中的作用及机制研究 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语/符号说明 |
| 1.前言 |
| 2.材料与方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 6.附图 |
| 7.创新性与局限性 |
| 8.参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士期间发表的SCI论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 外文论文1 |
| 外文论文2 |
（3）14-3-3η对心肌缺氧/复氧损伤不同阶段自噬的双重调节（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1部分 引言 |
| 第2部分 14-3-3η对心肌细胞急性缺氧/复氧损伤不同阶段自噬的双重调节作用 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 主要材料和试剂 |
| 2.1.3 主要仪器和设备 |
| 2.1.4 主要试剂的配制 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 原代心肌细胞的提取与培养 |
| 2.2.2 腺病毒感染 |
| 2.2.3 心肌细胞急性缺氧及A/R模型的建立 |
| 2.2.4 实验分组及处理 |
| 2.2.5 CCK-8 法检测心肌细胞存活率 |
| 2.2.6 乳酸脱氢酶(LDH)活性的测定 |
| 2.2.7 细胞蛋白的提取与定量 |
| 2.2.8 免疫印迹 (Western blot)法检测蛋白表达 |
| 2.2.9 透射电镜观察细胞内自噬情况 |
| 2.2.10 细胞内溶酶体酸化水平的检测 |
| 2.2.11 数据处理及统计学分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 不同14-3-3η表达转基因细胞对急性A/R损伤不同阶段细胞存活率以及LDH活性的影响 |
| 2.3.2 急性A/R损伤不同阶段,心肌细胞内自噬的改变 |
| 2.3.3 不同14-3-3η表达转基因细胞对急性A/R损伤不同阶段自噬的调节作用 |
| 2.3.4 不同 14-3-3η 表达转基因细胞对急性 A/R 损伤不同阶段溶酶体酸化的影响 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第3部分 14-3-3η对心肌细胞急性缺氧/复氧损伤不同阶段自噬双重调节的作用机制 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 主要材料和试剂 |
| 3.1.3 主要仪器和设备 |
| 3.1.4 主要试剂的配制 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 原代细胞的提取与培养 |
| 3.2.2 腺病毒感染 |
| 3.2.3 心肌细胞急性缺氧及A/R损伤模型的建立 |
| 3.2.4 实验分组及处理 |
| 3.2.5 细胞蛋白的提取与定量 |
| 3.2.6 免疫印迹法检测相关蛋白的表达 |
| 3.2.7 免疫共沉淀(co-immunoprecipitation,CO-IP)法检测蛋白之间的相互作用 |
| 3.2.8 细胞免疫荧光(Immunofluorescence,IF)检测 |
| 3.2.9 数据处理及统计学分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 在急性缺氧损伤阶段,14-3-3η高表达对AMPKα-m TOR/ULK1通路的影响 |
| 3.3.2 在急性缺氧损伤阶段,14-3-3η对 m TORC1 通路的影响 |
| 3.3.3 在急性A/R损伤阶段,14-3-3η高表达对Akt-beclin1 通路的影响 |
| 3.3.4 14-3-3η与 beclin1 之间相互作用关系之确认 |
| 3.3.5 在急性A/R损伤阶段,14-3-3η、beclin1 与 vimentin 之间相互作用关系之确认 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第4部分 14-3-3η对心肌细胞急性缺氧/复氧损伤不同阶段氧化应激的影响 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 实验动物 |
| 4.1.2 主要材料和试剂 |
| 4.1.3 主要仪器和设备 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 原代细胞的提取与培养 |
| 4.2.2 腺病毒感染 |
| 4.2.3 心肌细胞急性缺氧及A/R损伤模型的建立 |
| 4.2.4 实验分组及处理 |
| 4.2.5 心肌细胞中活性氧(ROS)的检测 |
| 4.2.6 心肌细胞线粒体内活性氧(ROS)的检测 |
| 4.2.7 心肌细胞中GSH-Px的测定 |
| 4.2.8 心肌细胞中SOD的测定 |
| 4.2.9 心肌细胞中catalase的测定 |
| 4.2.10 心肌细胞中MDA的测定 |
| 4.2.11 心肌细胞中GSH和 GSSG的测定 |
| 4.2.12 数据处理及统计学分析 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 14-3-3η不同表达转基因细胞对急性A/R损伤不同阶段ROS水平的影响 |
| 4.3.2 14-3-3η 不同表达转基因细胞对急性 A/R 损伤不同阶段线粒体 ROS(Mito-ROS,mtROS)水平的影响 |
| 4.3.3 14-3-3η不同表达转基因细胞对急性A/R损伤不同阶段GSH-Px、SOD、Catalase活性以及MDA含量的影响 |
| 4.3.4 14-3-3η不同表达转基因细胞对急性A/R损伤不同阶段GSH以及GSSG水平的影响 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第5部分 14-3-3η对心肌细胞急性缺氧/复氧损伤不同阶段线粒体功能的影响 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 实验对象 |
| 5.1.2 主要材料和试剂 |
| 5.1.3 主要仪器和设备 |
| 5.1.4 主要试剂的配制 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 原代细胞的提取与培养 |
| 5.2.2 腺病毒感染 |
| 5.2.3 心肌细胞急性缺氧及A/R损伤模型的建立 |
| 5.2.4 实验分组及处理 |
| 5.2.5 细胞蛋白的提取与定量 |
| 5.2.6 免疫印迹法检测相关蛋白的表达 |
| 5.2.7 检测心肌细胞氧消耗速率(OCR)以及胞外酸化速率(ECAR) |
| 5.2.8 心肌细胞中线粒体膜电位(△Ψm)的测定 |
| 5.2.9 提取心肌细胞的线粒体 |
| 5.2.10 心肌细胞中线粒体通透性转换孔(mPTP)开放的测定 |
| 5.2.11 Bradford法测定蛋白浓度 |
| 5.2.12 细胞凋亡蛋白酶-3(Caspase-3)活性的测定 |
| 5.2.13 流式细胞术检测心肌细胞凋亡 |
| 5.2.14 TUNEL法检测心肌细胞凋亡 |
| 5.2.15 数据处理及统计学分析 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 14-3-3η不同表达转基因细胞对急性A/R损伤不同阶段线粒体复合物Ⅰ和复合物Ⅲ的影响 |
| 5.3.2 14-3-3η不同表达转基因细胞对急性A/R损伤不同阶段OCR的影响 |
| 5.3.3 14-3-3η不同表达转基因细胞对急性A/R损伤不同阶段ECAR的影响 |
| 5.3.4 14-3-3η不同表达转基因细胞对急性A/R损伤不同阶段线粒体膜电位的影响 |
| 5.3.5 14-3-3η不同表达转基因细胞对急性A/R损伤不同阶段m PTP开放的影响 |
| 5.3.6 14-3-3η双向调节自噬的作用对急性A/R损伤不同阶段心肌细胞凋亡的影响 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 第6部分 14-3-3η对大鼠离体心脏急性缺氧/复氧损伤不同阶段自噬的影响 |
| 6.1 材料 |
| 6.1.1 实验动物 |
| 6.1.2 主要试剂和材料 |
| 6.1.3 主要仪器和设备 |
| 6.1.4 主要试剂的配制 |
| 6.2 方法 |
| 6.2.1 大鼠在体心脏腺病毒载体转染模型的构建 |
| 6.2.2 大鼠离体心脏急性缺氧以及A/R损伤模型的构建 |
| 6.2.3 实验分组及处理 |
| 6.2.4 Langendorff仪器及Power Lab软件准备 |
| 6.2.5 灌流液中LDH活性的测定 |
| 6.2.6 心肌组织TTC染色法 |
| 6.2.7 透射电镜观察心肌细胞内的自噬情况以及线粒体形态 |
| 6.2.8 组织蛋白的提取与定量 |
| 6.2.9 免疫印记法检测相关蛋白的表达 |
| 6.2.10 Caspase-3 活性的检测 |
| 6.2.11 TUNEL法检测心肌细胞凋亡率 |
| 6.2.12 数据处理及统计学分析 |
| 6.3 结果 |
| 6.3.1 在急性A/R损伤不同阶段,不同14-3-3η的表达对心功能的影响 |
| 6.3.2 在急性A/R损伤不同阶段,不同14-3-3η表达对心肌梗死面积以及LDH活性的影响 |
| 6.3.3 在急性A/R损伤不同阶段,不同14-3-3η表达对大鼠心肌组织病理变化的影响 |
| 6.3.4 在急性A/R损伤不同阶段,14-3-3η不同表达对心肌内自噬活动的影响 |
| 6.3.5 在急性A/R损伤不同阶段,14-3-3η不同表达对心肌凋亡的影响 |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 小结 |
| 第7部分 人参皂苷RG1 通过上调14-3-3η调控心肌细胞急性缺氧/复氧损伤不同阶段的自噬水平 |
| 7.1 材料 |
| 7.1.1 实验对象 |
| 7.1.2 主要试剂和材料 |
| 7.1.3 主要仪器和设备 |
| 7.2 方法 |
| 7.2.1 原代细胞的提取与培养 |
| 7.2.2 腺病毒感染 |
| 7.2.3 心肌细胞急性缺氧及缺氧/复氧模型的建立 |
| 7.2.4 实验分组及处理 |
| 7.2.5 CCK-8 法检测心肌细胞存活率 |
| 7.2.6 乳酸脱氢酶(LDH)活性的测定 |
| 7.2.7 免疫印迹法检测相关蛋白的表达 |
| 7.2.8 Bradford法测定蛋白浓度 |
| 7.2.9 心肌细胞内Caspase-3 活性的检测 |
| 7.2.10 TUNEL法检测心肌细胞凋亡 |
| 7.2.11 数据处理及统计学分析 |
| 7.3 结果 |
| 7.3.1 人参皂苷Rg1 最佳预处理浓度的确定 |
| 7.3.2 预处理人参皂苷Rg1 对心肌细胞急性A/R不同阶段损伤细胞存活率及LDH活性的影响 |
| 7.3.3 预处理人参皂苷Rg1 对心肌细胞急性A/R损伤不同阶段自噬的双重调节作用 |
| 7.3.4 预处理人参皂苷Rg1 对急性A/R损伤不同阶段心肌细胞凋亡的影响 |
| 7.4 讨论 |
| 7.5 小结 |
| 第8部分 结论与展望 |
| 8.1 结论 |
| 8.2 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 综述 自噬在心肌缺血再灌注损伤中的分子机制及生理意义 |
| 参考文献 |
（4）三七三醇皂苷抗心肌缺血再灌注损伤机制研究及三七总皂苷对PCI心肌保护作用的系统评价（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一 心肌缺血再灌注损伤与PI3K/Akt信号通路 |
| (一) PI3K/Akt信号通路的结构与功能 |
| (二) PI3K/Akt信号通路的研究进展 |
| (三) 小结 |
| 参考文献 |
| 综述二 三七总皂苷与三七三醇皂苷抗心肌缺血再灌注损伤研究进展 |
| (一) 三七总皂苷抗心肌缺血再灌注损伤机制的研究进展 |
| (二) 三七三醇皂苷抗心肌缺血再灌注损伤机制的研究进展 |
| (三) 小结 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 第二部分 实验研究 三七三醇皂苷抗心肌缺血再灌注损伤的机制研究 |
| 1 实验材料 |
| 2 药品及试剂的配置 |
| 实验一 探讨不同剂量PTS对大鼠离体心脏MIRI的保护作用 |
| 1 方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验二 基于PI3K/Akt信号通路探讨PTS对MIRI的作用 |
| 1 方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 临床研究 三七总皂苷对PCI患者心肌保护作用的系统评价 |
| 1 方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 致谢 |
| 在学期间主要研究成果 |
（5）高盐环境下内皮素受体介导的冠状动脉平滑肌损伤的机制研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词对照表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 综述 冠状动脉舒缩功能影响因素的研究进展 |
| 参考文献 |
（6）OGT介导的RIPK3 O-GlcNAc糖基化在七氟醚后处理抑制心肌缺血再灌注损伤时程序性坏死中的作用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 引言 |
| 第一部分 七氟醚后处理对心肌缺血再灌注损伤的保护作用 |
| 一、前言 |
| 二、材料与方法 |
| 1.实验动物 |
| 2.主要仪器和设备 |
| 3.主要试剂及其配置 |
| 3.1 主要试剂 |
| 3.2 主要试剂配制 |
| 三、实验方法 |
| 1.在体心肌缺血再灌注损伤模型 |
| 2.实验分组与处理 |
| 3.心肌梗死范围测定 |
| 4.血清LDH浓度测定 |
| 5.HE染色 |
| 6.统计学处理 |
| 四、实验结果 |
| 1.各组血流动力学 |
| 2.各组心肌梗死范围 |
| 3.各组心功能指标 |
| 4.各组心肌组织病理学 |
| 5.各组血清LDH浓度 |
| 五、讨论 |
| 六、结论 |
| 第二部分 七氟醚后处理对心肌缺血再灌注损伤时程序性坏死和RIPK3O-GlcNAc糖基化的影响 |
| 一、前言 |
| 二、材料与方法 |
| 1.实验动物 |
| 2.主要仪器和设备 |
| 3.主要试剂及其配置 |
| 3.1 主要试剂 |
| 3.2 主要试剂配置 |
| 三、实验方法 |
| 1.在体心肌心肌缺血再灌注损伤模型 |
| 2.实验分组与处理 |
| 3.伊文思蓝染色与荧光成像 |
| 4.心肌组织中提取蛋白 |
| 5.BCA法测定蛋白浓度 |
| 6.聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)蛋白凝胶电泳与转膜 |
| 7.蛋白质印记抗体标记与显色 |
| 8.心肌细胞的免疫共沉淀反应 |
| 9.统计学处理 |
| 四、实验结果 |
| 1.各组坏死心肌细胞表达水平 |
| 2.各组程序性坏死相关蛋白表达水平 |
| 3.各组总蛋白O-GlcNAc糖基化、OGT和 OGA蛋白表达水平 |
| 4.各组O-GlcNAc、RIPK3和MLKL的相互作用 |
| 五、讨论 |
| 六、结论 |
| 第三部分 OGT介导的RIPK3 O-GlcNAc糖基化及其调控的程序性坏死在七氟醚后处理抑制心肌缺血再灌注损伤中的作用 |
| 一、前言 |
| 二、材料与方法 |
| 1.实验动物 |
| 2.主要仪器和设备 |
| 3.主要试剂及其配置 |
| 3.1 主要试剂 |
| 3.2 主要试剂配置 |
| 三、实验方法 |
| 1.离体Langendorff心肌缺血再灌注损伤模型 |
| 2.实验分组与处理 |
| 3.心肌梗死范围测定 |
| 4.冠脉漏出液LDH浓度 |
| 5.心肌组织中提取蛋白 |
| 6.BCA法测定蛋白浓度 |
| 7.聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)蛋白凝胶电泳与转膜 |
| 8.蛋白质印记抗体标记与显色 |
| 9.统计学处理 |
| 四、实验结果 |
| 1.各组血流动力学 |
| 2.各组心肌梗死范围 |
| 3.各组冠脉漏出液LDH浓度 |
| 4.各组总蛋白O-GlcNAc糖基化、OGT和 OGA蛋白表达水平 |
| 5.各组程序性坏死相关蛋白表达水平 |
| 五、讨论 |
| 六、结论 |
| 不足之处与创新点 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 综述 程序性坏死在心血管疾病中作用的研究进展 |
| 参考文献 |
（7）异莲心碱和人参皂苷Rb1的抗心律失常机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 综述 炙甘草汤和心速宁及两者活性成分的抗心律失常研究概况 |
| 参考文献 |
| 第二章 前言 |
| 第三章 材料和方法 |
| 3.1 家兔左心室肌细胞的制备 |
| 3.2 实验中所使用的溶液和试剂 |
| 3.2.1 药品试剂 |
| 3.2.2 实验中用到的溶液的配方 |
| 3.3 离子通道电流和动作电位的记录方法 |
| 3.3.1 锋钠电流的记录 |
| 3.3.2 晚钠电流的记录 |
| 3.3.3 L型钙电流的记录 |
| 3.3.4 内向整流钾电流的记录 |
| 3.3.5 延迟整流钾电流的记录 |
| 3.3.6 动作电位的记录 |
| 3.4 心室肌细胞钙瞬变的记录方法 |
| 3.5 离体心脏心电图记录方法 |
| 3.6 数据分析 |
| 第四章 结果 |
| 4.1 药物的筛选 |
| 4.2 异莲心碱的抗心律失常机制 |
| 4.2.1 异莲心碱对锋钠电流的作用 |
| 4.2.2 异莲心碱对ATX-II诱导增大的晚钠电流的作用 |
| 4.2.3 异莲心碱对L型钙电流的作用 |
| 4.2.4 异莲心碱对内向整流钾电流和延迟整流钾电流的作用 |
| 4.2.5 异莲心碱对动作电位、早期后除极和晚期后除极的作用 |
| 4.3 人参皂苷Rb1 的抗心律失常机制 |
| 4.3.1 人参皂苷Rb1 对锋钠电流的作用 |
| 4.3.2 人参皂苷Rb1 对L型钙电流的作用 |
| 4.3.3 人参皂苷Rb1 对内向整流钾电流和延迟整流钾电流的作用 |
| 4.3.4 人参皂苷Rb1 对动作电位和晚期后除极的作用 |
| 4.3.5 人参皂苷Rb1 对缺氧-复氧情况下细胞内钙的影响 |
| 4.3.6 人参皂苷Rb1 对缺血再灌注损伤导致的室性心律失常的作用 |
| 第五章 讨论 |
| 第六章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录1 攻读博士学位期间取得的科研成果 |
| 附录2 攻读博士学位期间参加的科研项目 |
（8）脂肪酸对糖尿病大鼠神经损伤和心肌易损性增加的影响和机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 常用缩写词中英文对照表 |
| 前言 |
| 第一部分 大鼠背根神经节(DRG)神经元分离培养 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 实验仪器 |
| 1.4 实验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 细胞生长状态和鉴定 |
| 2.2 TRPV1和CGRP、SP、NGF在 DRG神经元上共表达情况 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第二部分 油酸在糖尿病大鼠DRG神经元损伤中的作用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验分组 |
| 1.3 实验试剂 |
| 1.4 实验仪器 |
| 1.5 实验溶液配方 |
| 1.6 实验方法 |
| 1.7 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 DRG内 Ca2+浓度的变化 |
| 2.2 各组TRPV1 的表达 |
| 2.3 各组CGRP的表达 |
| 2.4 各组SP的表达 |
| 2.5 各组NGF的表达 |
| 2.6 各组LDH的表达 |
| 2.7 各组凋亡情况 |
| 2.8 各组活性氧(ROS)生成情况 |
| 2.9 各组线粒体膜电位(MMP)变化 |
| 2.10 各组DRG神经元轴突增生情况(neurite outgrowth) |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第三部分 CGRP在糖尿病大鼠DRG神经元损伤中的作用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验分组 |
| 1.3 实验试剂 |
| 1.4 实验仪器 |
| 1.5 实验方法 |
| 1.6 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 CGRP对糖尿病DRG神经元活性的影响 |
| 2.2 CGRP对糖尿病DRG神经元凋亡的作用 |
| 2.3 CGRP对糖尿病DRG神经元活性氧生成的作用 |
| 2.4 CGRP对糖尿病DRG神经元线粒体膜电位的作用 |
| 2.5 CGRP对糖尿病DRG神经元轴突生长的作用 |
| 2.6 LV-CGRP转染糖尿病DRG神经元 |
| 2.7 LV-CGRP对糖尿病DRG神经元活性的影响 |
| 2.8 LV-CGRP对糖尿病DRG神经元轴突生长的作用 |
| 2.9 LV-CGRP对 DRG神经元SP和 NGF蛋白表达的影响 |
| 2.10 LV-CGRP对 DRG神经元SPmRNA和 NGFmRNA表达的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第四部分 OA在大鼠离体心脏缺血-再灌注损伤的作用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 实验仪器 |
| 1.4 实验方法 |
| 1.5 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 各项心脏功能指标及意义 |
| 2.2 OA对正常大鼠离体心脏心功能的影响 |
| 2.3 I/R室性心律失常 |
| 2.4 心肌缺血区p-Akt的表达 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（9）定心藤活性成分抗心肌缺血再灌注损伤的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 中英文对照表 |
| 引言 |
| 一、定心藤活性成分TL抗心肌缺血再灌注损伤药效研究 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验耗材 |
| 1.4 药品与试剂 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 主要溶液的配制 |
| 2.2 定心藤活性成分TL的配制 |
| 2.3 大鼠Langendorff离体心脏再灌注模型建立 |
| 2.4 大鼠离体心脏的制备 |
| 2.5 大鼠离体心脏灌注 |
| 2.6 实验分组与给药 |
| 2.7 观察指标 |
| 2.7.1 心脏血流动力学检测 |
| 2.7.2 心脏流出物乳酸脱氢酶(LDH)活性检测 |
| 2.7.3 心肌梗塞面积测定 |
| 2.8 统计处理 |
| 3 结果 |
| 3.1 定心藤活性成分TL对心肌缺血再灌注损伤血流动力学影响 |
| 3.2 定心藤活性成分TL对心肌缺血再灌注损伤LDH影响 |
| 3.3 定心藤活性成分TL对心肌缺血再灌注损伤心脏梗死面积影响 |
| 4 小结 |
| 二、定心藤活性成分TL抗心肌缺血再灌注损伤作用机制研究 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 药品与试剂 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 主要溶液的配制 |
| 2.2 大鼠离体心脏灌注 |
| 2.3 实验分组与给药 |
| 2.4 观察指标 |
| 2.4.1 心脏血流动力学检测 |
| 2.4.2 心脏流出物乳酸脱氢酶(LDH)活性检测 |
| 2.4.3 心肌梗塞面积测定 |
| 2.4.4 Caspase 3活性检测试剂盒检测酶活性 |
| 2.4.5 Caspase 9活性检测试剂盒检测酶活性 |
| 2.4.6 Western blot检测 |
| 2.5 统计处理 |
| 3 结果 |
| 3.1 定心藤活性成分TL基于5-HD对心肌缺血再灌注损伤的血流动力学影响 |
| 3.2 定心藤活性成分TL基于5-HD对心肌缺血再灌注损伤LDH的影响 |
| 3.3 定心藤活性成分TL基于5-HD对心肌缺血再灌注损伤的心脏梗死面积影响 |
| 3.4 定心藤活性成分TL基于5-HD对心肌缺血再灌注损伤的抗氧化指标的影响 |
| 3.5 定心藤活性成分TL基于5-HD对抗心肌缺血再灌注损伤凋亡的影响 |
| 4 小结 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 定心藤活性成分抗心肌缺血再灌注损伤的作用和机制研究 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
（10）附子配甘草对离体心脏的作用及其指纹图谱研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 前言 |
| 第一章 附子配甘草对离体蛙心心肌收缩力的影响 |
| 1 材料 |
| 1.1 试药 |
| 1.2 仪器设备 |
| 1.3 动物 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 任氏液和低钙任氏液的配置 |
| 2.2 提取液的制备 |
| 2.3 动物分组 |
| 2.4 离体蛙心制备 |
| 2.5 给药方法 |
| 2.5.1 正常组 |
| 2.5.2 心衰组 |
| 2.6 指标检测 |
| 2.7 统计学方法 |
| 3 结果 |
| 4 小结 |
| 第二章 附子配甘草对离体大鼠衰竭心脏的影响 |
| 1 材料 |
| 1.1 试药 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 动物 |
| 2 方法与结果 |
| 2.1 附子甘草对大鼠离体心脏的影响研究 |
| 2.1.1 K-H液和低钙K-H液的配置 |
| 2.1.2 药液制备 |
| 2.1.3 分组与给药 |
| 2.1.4 指标检测与数据处理 |
| 3 小结 |
| 第三章 附子配甘草指纹图谱总量统计矩分析 |
| 1 材料 |
| 1.1 药材及试剂 |
| 1.2 仪器 |
| 2 药物HPLC指纹图谱的研究 |
| 2.1 药液制备 |
| 2.2 供试液的制备 |
| 2.2.1 供试品溶液的制备 |
| 2.2.2 对照品溶液的制备 |
| 2.3 色谱条件 |
| 2.4 方法学考察 |
| 2.5 附子甘草指纹图谱积分条件的确定 |
| 3 结果 |
| 3.1 10 批附子、甘草及其配伍的指纹图谱测定 |
| 3.2 指纹图谱测定 |
| 3.3 总量统计矩法分析 |
| 3.3.1 总量统计矩参数计算 |
| 3.3.2 总量统计矩参数分析 |
| 3.3.3 总量统计矩相似度计算及分析 |
| 3.3.4 加合参数处理 |
| 4 小结 |
| 总结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录1 综述 |
| 参考文献 |
| 附录2 攻读学位期间参与的课题与发表的论文 |
四、K物质对离体大鼠心脏功能的影响（论文参考文献）
- [1]羟考酮通过SIRT3/SOD2/NF-κB通路减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤[D]. 汪煜. 河北大学, 2021(09)
- [2]腺苷激酶及4-羟基壬烯醛在心脏缺血再灌注损伤中作用及机制研究[D]. 王文俊. 山东大学, 2021(11)
- [3]14-3-3η对心肌缺氧/复氧损伤不同阶段自噬的双重调节[D]. 乔扬. 南昌大学, 2021(01)
- [4]三七三醇皂苷抗心肌缺血再灌注损伤机制研究及三七总皂苷对PCI心肌保护作用的系统评价[D]. 文超. 北京中医药大学, 2021(01)
- [5]高盐环境下内皮素受体介导的冠状动脉平滑肌损伤的机制研究[D]. 何可. 安徽医科大学, 2021(01)
- [6]OGT介导的RIPK3 O-GlcNAc糖基化在七氟醚后处理抑制心肌缺血再灌注损伤时程序性坏死中的作用[D]. 张静. 南昌大学, 2020(01)
- [7]异莲心碱和人参皂苷Rb1的抗心律失常机制[D]. 刘志沛. 武汉科技大学, 2020(01)
- [8]脂肪酸对糖尿病大鼠神经损伤和心肌易损性增加的影响和机制[D]. 张肖怡. 山西医科大学, 2020(12)
- [9]定心藤活性成分抗心肌缺血再灌注损伤的作用及机制研究[D]. 杨小琪. 江西中医药大学, 2020(05)
- [10]附子配甘草对离体心脏的作用及其指纹图谱研究[D]. 彭兰. 湖南中医药大学, 2019