一、人类癌细胞转化实验成功（论文文献综述）
李文杰[1]（2021）在《鸡贫血病毒VP3基因对乳腺癌干细胞的作用研究》文中研究指明鸡贫血病毒VP3基因表达的凋亡蛋白Apoptin在正常细胞中无细胞毒性,而在肿瘤细胞中能够特异性诱导细胞发生凋亡。表达鸡贫血病毒VP3基因的重组腺病毒Ad-VT与Ad-VP3能够在多种肿瘤细胞中特异性表达Apoptin蛋白并诱导肿瘤细胞凋亡,且Ad-VT可以在肿瘤细胞中特异性复制起到溶瘤作用。癌症是人类死亡的主要原因之一。2020年乳腺癌超越肺癌成为发病率第一的癌症;并且女性中乳腺癌的死亡率居女性癌症死亡率首位。目前针对乳腺癌的治疗方法副作用大,对转移患者疗效欠佳,并且患者经治疗后仍有复发的风险。因此,仍然需要继续寻找更有效地治疗手段。在癌症内部有一部分细胞被称为癌症起始细胞或癌症干细胞,这部分细胞在癌症起始、治疗抵抗、转移和复发中起关键作用。这意味着,以乳腺癌干细胞为靶标可能是根除乳腺癌的有前途的治疗策略。迄今为止,还没有针对癌症干细胞的特定药物。因此,诱导癌症干细胞分化并靶向杀伤癌症干细胞可能有助于开发针对癌症的新的治疗策略,在治疗癌症时可能具有临床优势。本研究目的是富集分选表型为CD44+CD24-的乳腺癌干细胞,对其干细胞特性进行分析。利用本课题组前期构建的表达鸡贫血病毒VP3基因的重组腺病毒Ad-VT与Ad-VP3作用于乳腺癌干细胞,分析重组腺病毒对细胞的杀伤作用、干性抑制及增加乳腺癌干细胞药物敏感性的作用。通过靶向癌症干细胞,诱导其分化,抑制其治疗抗性寻找临床癌症治疗的新策略。首先是采用无血清悬浮培养与磁珠分选方法富集分选乳腺癌干细胞,对其自我更新、分化、耐药性等进行分析;其次是利用重组腺病毒作用于乳腺癌干细胞,对乳腺癌干细胞中干细胞比例、细胞增殖能力、细胞凋亡水平、细胞迁移侵袭能力等进行检测分析;之后检测重组腺病毒对乳腺癌干细胞的体内肿瘤形成能力的影响、体内肿瘤杀伤作用;最后利用Ad-VT与紫杉醇联合应用于乳腺癌干细胞后,检测乳腺癌干细胞中干细胞比例、细胞增殖能力、细胞凋亡水平、细胞迁移侵袭能力等,分析Ad-VT是否能够使乳腺癌干细胞对化疗药的敏感性增强,从而抑制癌症干细胞的治疗抗性。本研究主要取得如下结果:1.对乳腺癌干细胞的干性特征进行检测分析后发现,无血清培养条件下,乳腺癌干细胞能够形成乳腺癌细胞球;血清诱导实验显示乳腺癌干细胞能够分化增殖,自我更新能力强于乳腺癌细胞;干细胞调控因子表达上调,过表达与人类肿瘤干细胞相关的多个基因;对化疗药紫杉醇也具有一定的耐药性。2.通过检测重组腺病毒对乳腺癌干细胞的体外抑制作用后发现,Ad-VT与Ad-VP3作用下,CD44+CD24-细胞群比例降低,干细胞调控因子表达下调,乳腺癌干细胞干性受到抑制;Ad-VT与Ad-VP3能够抑制细胞增殖;对细胞线粒体膜电位及凋亡蛋白表达进行检测,结果显示Ad-VT与Ad-VP3能够诱导乳腺癌干细胞线粒体途径的凋亡;细胞迁移与侵袭实验结果也显示乳腺癌干细胞的迁移侵袭能力受到抑制。3.检测重组腺病毒对乳腺癌干细胞的小鼠体内抑制作用。小鼠体内成瘤结果显示Ad-VT与Ad-VP3作用后的乳腺癌干细胞干性受到抑制,失去了体内肿瘤形成的能力;将状态良好的乳腺癌干细胞进行小鼠皮下注射荷瘤,重组腺病毒对荷瘤成功的小鼠进行注射治疗,结果显示Ad-VT与Ad-VP3对乳腺癌干细胞小鼠荷瘤模型具有体内杀伤作用,能够抑制小鼠体内肿瘤生长。4.Ad-VT与紫杉醇联合作用能够抑制乳腺癌干细胞耐药性,Ad-VT与紫杉醇联合使用后对乳腺癌干细胞的干性抑制、诱导细胞凋亡水平、对细胞的增殖抑制、迁移侵袭抑制均显着强于Ad-VT单独治疗组及紫杉醇单独治疗组,并且联合应用增强了对乳腺癌干细胞的小鼠体内肿瘤形成能力的抑制。综上所述,经富集分选的乳腺癌干细胞具有自我更新、分化、治疗抗性等干细胞特性,表达VP3蛋白的重组腺病毒Ad-VT与Ad-VP3对乳腺癌干细胞具有一定的体内外抑制作用,能够抑制乳腺癌干细胞干性,Ad-VT能够增强乳腺癌干细胞对药物的敏感性,抑制乳腺癌干细胞的治疗抗性,增强化疗药紫杉醇抑制乳腺癌干细胞的作用。
杨宝玉[2]（2021）在《EZH2表达调控对胃癌生长及化疗敏感性的影响》文中进行了进一步梳理目的:1.通过公共数据库、胃癌组织和胃癌细胞三方面分析EZH2在胃癌的表达情况及与临床病理参数、化疗疗效、无进展生存时间的关系。2.通过体内外实验探讨EZH2基因对胃癌生长和化疗敏感性的影响。3探索EZH2介导胃癌生长和耐药的相关分子生物学机制。方法:1.利用公共数据库生物信息学方法分析胃癌组织中EZH2基因的表达;用定量逆转录聚合酶链反应和蛋白质印迹法检测胃癌细胞株中EZH2 m RNA和蛋白的表达;免疫组化法检测胃癌组织中EZH2蛋白的表达,并分析其与临床病理参数、化疗有效率和无进展生存期的相关性。2.构建慢病毒载体sh EZH2,慢病毒感染EZH2高表达人胃癌细胞株MGC803,并筛选出稳转株,应用Real-time Q-PCR和Western blot检测干扰效果。3.体外细胞学试验,采用CCK-8增殖试验、Transwell侵袭试验和划痕试验研究人胃癌细胞株MGC803在EZH2沉默前后增殖、侵袭和迁移的变化;通过CCK-8毒性实验对比EZH2沉默前后对紫杉醇、奥沙利铂、5-氟尿嘧啶化疗敏感性的改变及EZH2小分子抑制剂GSK126与这些化疗药物是否具有协同作用。体内研究,构建EZH2沉默人胃癌细胞株裸鼠移植瘤模型,腹腔灌注紫杉醇,研究EZH2下调对胃癌生长和化疗敏感性的影响。4.首先我们以胃腺癌TCGA（The Cancer Genome Atlas,TCGA）转录组数据集进行KEGG信号通路富集分析,探讨受EZH2激活调节的下游途径;接着通过细胞转录组测序分析,进一步探索EZH2在胃癌的相关分子机制和信号通路;然后利用Western blot实验验证信号通路关键蛋白表达;最后通过Real-time Q-PCR技术检测EZH2下调对信号通路下游生长和耐药相关分子的影响,探索胃癌生长和耐药的分子机制。结果:1.公共数据库结果表明,胃癌中EZH2的表达高于正常组织或相应癌症相邻的组织;MGC803、BGC823、AGS和HGC27胃癌细胞株EZH2 m RNA和蛋白均有表达,其中MGC803表达最高;免疫组化结果显示:EZH2基因在晚期胃癌中呈现高表达,EZH2蛋白表达与病理类型及化疗疗效相关,且EZH2蛋白的表达与化疗疗效呈现负相关。EZH2高表达组中位TTP低于EZH2低表达组,具有统计学差异。2.EZH2-sh RNA慢病毒载体成功构建并转染人胃癌细胞系MGC803,应用Real-time Q-PCR和Western blot检测干扰效果,证明成功构建了稳定沉默EZH2的胃癌细胞株MGC803。3.体外细胞学实验:CCK-8增殖实验结果显示,EZH2沉默组的OD值和细胞增殖率较对照组显着下降,差异有统计学意义;Transwell实验表明,EZH2沉默组的转移细胞数量显着减少,具有统计学意义;划痕损伤实验表明,与对照组MGC803-Vector对比,MGC803-sh EZH2细胞划痕愈合率从12小时就有所下降,到36小时出现明显下降,差异均具有统计学意义。CCK8毒性实验表明,EZH2沉默使MGC803细胞对紫杉醇、奥沙利铂和5-氟尿嘧啶的敏感性提高,IC50值明显下降,具有明显统计学差异;转化为抑制率曲线图,可以看出EZH2基因沉默后紫杉醇、奥沙利铂、5-氟尿嘧啶作用于MGC803-sh EZH2细胞的抑制效果增强。药物协同研究发现,EZH2抑制剂GSK126和紫杉醇、奥沙利铂、5-氟尿嘧啶均具有协同作用;其中GSK126联合紫杉醇的CI值随着紫杉醇剂量的增加而增大,说明小剂量的紫杉醇与GSK126表现出更好的协同作用。体内裸鼠移植瘤实验发现,沉默EZH2使胃癌细胞株MGC803的裸鼠皮下成瘤能力减弱,对紫杉醇的化疗敏感性提高。4.公共数据库KEGG信号通路富集分析结果显示,EZH2通过m TOR信号传导途径、MAPK信号传导途径、P53信号传导途径及ERBB信号传导途径介导胃癌的生物学特性。细胞转录组测序分析结果显示,EZH2沉默前后筛选鉴定出1735个DEGs,其中表达上调的1131个,表达下调的604个。GO功能富集分析显示上调的DEGs主要与靶向膜蛋白翻译、细胞质翻译、核糖核酸代谢、线粒体电子传递等有关,下调的DEGs主要与生长发育的调控、信号通路的调控、磷酸化的调控、蛋白激酶C活性的调节等有关。KEGG信号通路富集分析显示具有显着性意义的信号通路有19条,其中与胃癌相关的信号通路有肿瘤途径、PI3K-Akt信号通路、Fox O信号通路、Erb B信号通路、HIF-1信号通路、TGF-β信号通路等;蛋白印迹实验证实EZH2沉默使MGC803胃癌细胞PI3K和p-Akt蛋白的表达下调,而AKT的表达总量无明显变化,说明EZH2的下调可阻断AKT的磷酸化过程,从而抑制P13K-Akt信号通路的过度活化。Real-time Q-PCR技术检测EZH2参与调控胃癌生长和耐药的相关分子机制,结果显示EZH2沉默使胃癌凋亡分子P53 m RNA表达上调、Bcl-2 m RNA表达下调;胃癌耐药相关分子MDR-1、MRP-1、LRP、BCRP、GST-πm RNA表达下调,差异均具有统计学意义。结论:1.EZH2在胃癌中呈现高表达,且高表达的EZH2可能与肿瘤进展、预后不良及化疗敏感性差有关。2.成功构建了EZH2稳定沉默的人胃癌细胞株MGC803,为后来实验奠定了基础。3.体内外实验证实EZH2沉默使胃癌生长减慢、侵袭迁徙能力下降,对化疗药物的敏感性提高。4.EZH2抑制剂GSK126与紫杉醇、奥沙利铂、5-氟尿嘧啶具有协同作用,EZH2基因有可能成为胃癌新的治疗靶点。5.EZH2激活PI3K-AKT信号通路是胃癌的重要机制之一;EZH2通过调控凋亡相关分子和耐药相关分子的表达介导胃癌的生长和耐药性。
李叙潼[3]（2021）在《基于深度学习的抗肿瘤药物作用机制研究》文中提出随着近年来生命科学领域蓬勃发展,人们对肿瘤疾病机制的认知逐渐加深。癌基因依赖理论认为,癌症细胞生存特异性地依赖某个基因,该基因的失活会导致癌细胞出现生长抑制或凋亡。据此,我们已找到多种癌症的依赖性癌基因,开发针对这类基因分子靶向药物,例如靶向蛋白激酶的小分子抑制剂,是目前抗肿瘤治疗领域的发展方向。基于高通量的基因组和转录组学等技术的得到的癌细胞系的分子特征,肿瘤药物治疗已经进入了分子分型指导的个性化治疗时代,但肿瘤药物治疗的响应率仍然有限。在精准医疗的大框架下,将人工智能（AI）技术引入抗肿瘤药物及其作用机制的研究,深入挖掘药物对肿瘤治疗靶标的活性和肿瘤细胞系的敏感性,是开发高效的新型肿瘤药物的方向。AI药物发现是药学和人工智能的深度交叉。无论对肿瘤还是其他疾病而言,传统的药物研发方式长期面临着研发周期长,失败率高,成本高等局限。高性能计算的飞速发展,人工智能算法的不断优化以及化学和生物学数据的大量积累,为AI技术在药物研发领域应用提供了基础。论文第1章对AI技术在药物发现领域的发展和应用展开了详细的讨论。随后,我们从两个方面讨论了基于AI的抗肿瘤药物研究。第2章中,我们使用多任务深度神经网络模型预测小分子化合物在人类激酶谱中的多向药理学效应和选择性。第3章中,基于组学数据和蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络,我们构建了图注意力网络模型,研究药物的体外细胞系敏感性和作用机制。蛋白激酶是癌基因依赖的主要靶标类型,开发激酶特异性的小分子抑制剂是目前抗肿瘤治疗领域的主要挑战。基于大规模生物活性数据和多任务深度神经网络（MTDNN）,我们开发了一种针对激酶的虚拟筛选模型,用于预测激酶小分子抑制剂与391种激酶的相互作用情况。激酶抑制剂具有广泛的交叉反应性,使之成为高度相关的预测任务。借由MTDNN的迁移学习效果,所获得的模型具有出色的预测能力,与过去报道的单任务随机森林方法相比始终显示出更高的性能,特别是对于活性数据不足的激酶任务仍能显示出令人振奋的高预测性。进一步地,我们对未知广谱激酶谱活性的上市和在研激酶抑制剂进行预测,并辅以严格的实验验证。结果显示,在1,410个激酶-化合物对上,模型给出了高质量的预测,au ROC达到0.75,并且成功地预测许多新颖的和治疗性的“脱靶”活性。基于预测得到的激酶谱,MTDNN还可用于描述化合物在激酶谱上的整体选择性,激酶亚家族特异的选择性及对某些疾病特异的选择性。使用训练好的MTDNN模型,我们搭建了小分子全激酶组多药理学作用的在线分析平台Kinome X。Kinome X可以对小分子在全激酶范围内的活性进行预测,并根据预测结果给出对小分子整体和激酶亚家族特异的选择性的分析。总体而言,MTDNN及基于其搭建的Kinome X提供了能够全面的研究小分子的激酶组活性和多药理学效应的有效手段,能为设计新颖的激酶抑制剂或药物重定向提供参考,并且对探索过去研究较少的激酶具有实用价值。在精准医疗的大背景下,开发基于肿瘤患者的基因组信息预测有效治疗策略的计算模型,是肿瘤治疗领域的发展方向。对此,我们使用图注意力网络（GAT）处理PPI网络,将癌细胞系的转录谱作为节点特征,用以构建药物细胞敏感性预测模型。我们使用标准化的表达谱（BEXP）作为细胞特征,跨细胞的共识基因签名（SIGN）作为药物特征,用以预测相应的药物剂量响应（AUC）。为了基于先验的生物背景对表达谱进行系统性的整合,我们采用GAT处理PPI网络,建立了两个端对端的模型,使用药物特征同时预测多个细胞系响应的多任务模型MTGAT,和使用药物和细胞系组合特征预测对应响应的多模态模型MMGAT。两种不同的框架对药物响应均有良好的预测性,预测效果全面超越了基准DNN模型。进一步地,我们使用GAT的注意力机制探索了模型的可解释性,发现注意力系数与生物机制之间存在关联。分析表明,具有更高局部注意力系数的邻居节点基因可能更多地与中心节点基因的转录和生物功能相关,而全局注意力可以有效富集到靶向药物的靶标蛋白。基于GAT的药物敏感性预测模型有助于发现未知的药物和细胞相互作用,进而发现药物响应的预测因子来揭示药物敏感性的生物机制,有希望助力抗肿瘤药物的发现和重定向。
杜华珊[4]（2021）在《STING对宫颈癌增殖、迁移和侵袭能力的作用及机制的研究》文中指出研究背景:宫颈癌是最常见的妇科癌症之一。每年全球大约有57万新发病例,31万死亡病例。大约95%的宫颈癌病例是由高危人类乳头瘤病毒（HPV）的持续感染引起的。尽管已有预防高危型HPV的疫苗,宫颈癌对妇女来说仍然是一场健康危机。因此,有必要为宫颈癌的预防和治疗提供新的视角。干扰素基因刺激因子（STING）是一种跨膜蛋白,是细胞质DNA传感通路的重要分子。越来越多的证据表明,STING通路除了能保护宿主免受多种致病性攻击外,在癌症中也起着至关重要的作用。在结直肠癌、卵巢癌、黑色素瘤中,与抗肿瘤T细胞启动和I型干扰素相关的STING信号被严重抑制以逃避免疫监视。STING在胃癌组织中低表达,与肿瘤大小、肿瘤浸润深度、淋巴转移、临床病理分期和生存率有关。敲除STING可促进胃癌细胞的增殖、克隆形成、迁移和侵袭。此外,多项研究表明,STING激动剂可以作为单药或联合手术治疗、放化疗、免疫治疗发挥抗肿瘤作用,弥补传统疗法的不足。研究目的:目前,尚不清楚STING在宫颈癌发生发展过程中的具体作用。本研究检测了人角质形成细胞、宫颈上皮永生化细胞以及四种宫颈癌细胞系中STING的表达情况。通过构建沉默STING和过表达STING的稳定转染宫颈癌细胞系,进行细胞生物学行为实验探讨STING对于宫颈癌细胞增殖、迁移、侵袭能力的影响和相关调控机制。此外,通过构建裸鼠皮下移植瘤模型进行体内实验对体外实验的结果进行验证,为宫颈癌预防和宫颈癌复发或转移的治疗提供新的思路。研究方法:第1部分:STING对宫颈癌增殖、迁移、侵袭能力影响的体外实验1、通过qRT-PCR及蛋白质免疫印迹实验检测体外培养的人角质形成细胞Ha Ca T、宫颈上皮永生化细胞H8、四种宫颈癌细胞系（He La、Si Ha、C33A、Ca Ski）的STING m RNA和蛋白表达情况;2、构建沉默STING的sh RNA慢病毒载体。选择He La、Si Ha细胞系作为沉默STING的转染细胞系。设计构建STING基因的过表达慢病毒载体,转染C33A细胞系。鉴定稳定转染细胞系中STING的表达情况;3、通过CCK8实验、平板克隆实验、细胞划痕实验和Transwell小室实验探究STING对于宫颈癌细胞的增殖、迁移、侵袭能力的影响。第2部分:STING调控宫颈癌细胞生物学行为信号通路的探索1、下调STING表达后,采用蛋白质免疫印迹实验检测β-catenin的总蛋白、活化蛋白以及核蛋白中的含量,检测Wnt通路下游靶基因（cyclin D1,c-Myc,MMP9）表达水平;2、上调STING表达后,采用蛋白质免疫印迹实验检测β-catenin的总蛋白、活化蛋白以及核蛋白中的含量,检测Wnt通路下游靶基因（cyclin D1,c-Myc,MMP9）表达水平;3、应用免疫共沉淀实验检测STING是否与β-catenin结合;4、下调STING表达的同时联用β-catenin通路抑制剂,采用蛋白质免疫印迹实验检测β-catenin的总蛋白、活化蛋白以及核蛋白中的含量,检测Wnt通路下游靶基因（cyclin D1,c-Myc,MMP9）表达水平;5、下调STING表达的同时联用β-catenin通路抑制剂,通过CCK8实验、平板克隆实验和Transwell小室实验探究下调STING表达对宫颈癌生物学行为的影响能否被β-catenin通路抑制剂所逆转。第3部分:沉默STING对宫颈癌细胞增殖能力影响的体内实验1、使用vector He La、sh STING-He La细胞系构建裸鼠皮下移植瘤模型,探究移植瘤沉默STING对裸鼠体重影响;2、通过测量裸鼠移植瘤体积和绘制肿瘤生长曲线验证下调STING表达对于宫颈癌细胞体内增殖能力的影响;3、肿瘤组织进行HE染色,探究下调STING表达是否影响肿瘤组织病理形态;4、肿瘤组织进行免疫组化染色,验证沉默STING的He La细胞在体内成瘤后是否仍保持沉默STING的特征;5、通过免疫组化染色Ki67探究沉默STING对于移植瘤增殖能力的影响。研究结果:第1部分:1、qRT-PCR及蛋白质免疫印迹实验显示在人角质形成细胞、宫颈上皮永生化细胞、4种宫颈癌细胞系中STING表达水平有差异。与正常细胞相比,HPV阴性宫颈癌细胞系C33A中的STING表达降低,其余三种HPV阳性宫颈癌细胞系（He La、Si Ha、Ca Ski）STING表达升高;2、成功合成了靶向STING的sh RNA并筛选出干扰效率最高的sh RNA片段。成功构建并验证沉默STING基因的He La和Si Ha稳转细胞系的STING蛋白、m RNA水平与对照组相比均存在显着统计学差异。STING过表达慢病毒载体构建成功,成功构建并验证过表达STING基因的C33A稳转细胞系的STING蛋白、m RNA水平与对照组相比均存在显着统计学差异;3、STING表达下调后,He La及Si Ha细胞增殖、克隆形成、迁移和侵袭能力增强。过表达STING基因后,C33A细胞体外增殖、克隆形成、迁移和侵袭的能力明显下降。第2部分:1、沉默STING后,Western blot显示β-catenin蛋白总表达量及活化的β-catenin蛋白表达量、细胞核β-catenin蛋白含量明显增加,Wnt通路下游靶基因（cyclin D1,c-Myc,MMP9）表达水平也随之升高;2、STING过表达后,Western blot显示β-catenin蛋白总表达量及活化的β-catenin蛋白表达量、细胞核β-catenin蛋白含量明显减少,Wnt通路下游靶基因（cyclin D1,c-Myc,MMP9）表达水平也随之明显降低;3、免疫共沉淀实验显示内源性STING可与β-catenin结合;4、沉默STING的同时联用β-catenin通路抑制剂,显示β-catenin蛋白总表达量及活化的β-catenin蛋白表达量、Wnt通路下游靶基因（cyclin D1,c-Myc,MMP9）表达水平与单纯沉默STING组比较明显降低;5、沉默STING的同时联用β-catenin通路抑制剂显示细胞体外增殖速度、克隆形成能力、迁移和侵袭的能力明显低于单纯沉默STING组。第3部分:1、裸鼠接种移植瘤后,sh STING-He La组裸鼠体重呈低于vector-He La组趋势,但趋势无统计学意义;2、sh STING-He La组肿瘤体积和生长速度明显大于对照组;3、HE染色显示vector-He La组形成的肿瘤病灶中细胞排列紧密、胞核深染、细胞形态呈卵圆形;sh STING-He La组形成的肿瘤病灶中细胞排列紊乱、血管组织较丰富;4、免疫组化染色显示体外构建的sh STING-He La细胞系成瘤后,STING低水平表达特征保留;5、免疫组化染色显示sh STING-He La组Ki67表达水平高于vector He La组Ki67表达水平。研究结论:1、不同类型的宫颈癌细胞STING表达水平不同,但STING的细胞生物学作用相同。STING可抑制宫颈癌细胞增殖、迁移、侵袭,在宫颈癌的发生发展中起抑癌基因作用;2、STING下调宫颈癌Wnt/β-catenin信号通路中总β-catenin蛋白、活化β-catenin蛋白、核β-catenin蛋白以及Wnt通路下游靶基因（cyclin D1,c-Myc,MMP9）蛋白表达水平;3、Wnt/β-catenin通路抑制剂ICG001可显着逆转沉默STING导致的宫颈癌细胞中Wnt/β-catenin通路相关蛋白质的表达上调。4、Wnt/β-catenin通路抑制剂ICG001可显着逆转沉默STING导致的宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的上调。5、STING通过抑制Wnt/β-catenin信号通路抑制宫颈癌的发生发展。6、沉默STING对宫颈癌细胞体内增殖能力有促进作用。
李雅娟[5]（2021）在《南蛇藤提取物通过miR-144/451靶向mTOR抑制胃癌EMT的作用及机制》文中认为胃癌（Gastric Carcinoma,GC）是最常见的消化道恶性肿瘤之一。课题组前期研究证实,与癌旁组织相比,胃癌组织中miR-144/451的表达量明显降低。运用生物信息学手段预测,哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（Mammalian Target of Rapamycin,mTOR）可能是miR-144/451的分子作用靶点。中草药南蛇藤茎乙酸乙酯提取物（Celαstrus orbiculatus Thunb,COE）为本课题组发明专利,可通过抑制胃癌细胞的上皮细胞间质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）过程,发挥抑制胃癌细胞早期转移的作用,但具体机制尚未阐明。本研究主要研究南蛇藤提取物是否通过miR-144/451靶向mTOR,进而抑制胃癌上皮间质转化过程,对新型抗肿瘤中药的研究与开发有着非常重要的意义。研究内容主要分为三个部分:第一部分 miR-144/451和mTOR与上皮间质转化的关系目的:利用 miR-144/451 敲除（Knockout,KO）小鼠,研究 miR-144/451 和 mTOR 与上皮间质转化的关系。方法:取3只miR-144/451 KO小鼠的胃组织,以同品系野生C57BL/6小鼠的胃组织为对照。提取总蛋白,用Western blot和免疫组化的方法,检测mTOR信号转导通路和EMT相关蛋白的表达量。提取总RNA,利用qRT-PCR法定量检测mTOR的mRNA表达水平。结果:与野生C57BL/6小鼠相比,miR-144/451 KO小鼠胃组织蛋白中E-cadherin的表达量明显降低,Vimentin、N-cadherin、mTOR、p-mTOR、PI3K、p-PI3K、Akt 和p-Akt蛋白的表达量均明显增高（P<0.05）;miR-144/451 KO小鼠胃组织总RNA中mTOR的表达显着升高（P<0.05）;免疫组化结果表明,miR-144/451 KO下调E-cadherin的表达,同时Vimentin、N-cadherin和mTOR相关蛋白的表达量上调（P<0.05）。结论:miR-144/451与mTOR和上皮间质转化相关蛋白的表达水平可能有密切关系。第二部分miR-144/451缺失对小鼠自发性胃癌的影响目的:利用miR-144/451 KO小鼠,构建胃炎后自发性胃癌模型,探讨miR-144/451与胃癌发生的关系及分子机制。方法:苯并芘（BaP）以玉米油配制成浓度为5 mg/mL,按10 μL/g体重剂量灌胃。小鼠40只,随机分为4组,每组10只,分别设为野生型小鼠玉米油对照组、野生型小鼠苯并芘组、miR-144/451 KO小鼠玉米油对照组、miR-144/451 KO苯并芘组。每周2次灌胃,共6周。末次灌胃后,第2周、8周、16周、24周和30周,各组随机处死1只小鼠。取小鼠全胃,沿胃大弯切开,肉眼观察。显微镜下观察组织学变化,采用Western blot和免疫组化法检测胃癌组织中mTOR相关蛋白表达情况,qRT-PCR法检测mTOR的mRNA表达量。结果:野生型C57BL/6小鼠,玉米油对照组,镜下胃粘膜、粘膜下层、肌层、浆膜层境界清晰;经BaP灌胃组有明显的炎症细胞浸润,其它未见明显变化。miR-144/451 KO小鼠,玉米油对照组,胃组织与正常C57BL/6小鼠组接近,而经BaP灌胃的miR-144/451 KO组小鼠,显微镜下发现胃部均出现异常分化现象,达到原位癌级别。Western blot、qRT-PCR和免疫组化结果显示经BaP刺激后mTOR表达水平明显增高,且miR-144/451 KO小鼠体内mTOR表达水平最高（P<0.05）。结论:敲除miR-144/451表达,mTOR的表达水平明显升高,小鼠更易发生胃癌,促进EMT进程。第三部分南蛇藤提取物对高表达miR-144/451的人胃癌细胞的影响目的:分别构建高表达miR-144和miR-451的4种人胃癌细胞模型（AGS/miR-144+、AGS/miR-451+、HGC-27/miR-144+、HGC-27/miR-451+）,研究南蛇藤提取物对高表达miR-144/451的人胃癌细胞增殖、迁移能力的影响,并探究其分子机制。方法:MTT 法检测 COE（20、40、80、160、320 μg/mL）对人胃癌 AGS/miR-144+、AGS/miR-451+、HGC-27/miR-144+、HGC-27/miR-451+细胞增殖的影响。对数生长期细胞,200 μg/mL COE处理24h后,qRT-PCR法定量mTOR mRNA的表达水平;Western blot法分析COE对mTOR信号转导通路和EMT相关蛋白的影响;Transwell迁移实验考察COE对迁移能力的影响。结果:COE 明显抑制人胃癌 AGS/miR-144+、AGS/miR-451+、HGC-27/miR-144+、HGC-27/miR-451+细胞的增殖,呈时间和浓度依赖性。COE处理后,4种细胞的迁移能力明显受到抑制,E-cadherin的表达量明显升高,同时Vimentin、N-cadherin、mTOR、p-mTOR、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、4EBP1 和 p-4EBP1蛋白的表达量均明显减低（P<0.05）。结论:COE协同miR-144/451靶向mTOR,通过P13K/Akt/mTOR信号转导通路发挥抑制胃癌细胞上皮间质转化的作用。
韩笑[6]（2021）在《盐霉素对耐顺铂人胃癌细胞增敏作用及其机制研究》文中研究指明目的:2020年全球癌症数据显示,胃癌的发病率全球第五,死亡率居于全球第四,且面临严重的预后及耐药困扰。盐霉素（SAL）是一种广谱抗菌药物,亦具有抗肿瘤特性,特别是盐霉素与化疗或放疗联合使用的协同效应是一个值得探讨的问题。目前SAL如何影响耐顺铂胃癌细胞的增殖、迁移、侵袭、凋亡,以及如何逆转癌细胞放疗抵抗及多重耐药,其机制尚不清楚,盐霉素能否对耐顺铂胃癌细胞产生较好的增敏作用目前未见报道。基于此,本实验将盐霉素（SAL）和顺铂（DDP）作用于人胃粘膜上皮细胞GES-1、胃癌细胞SGC-7901、耐顺铂胃癌细胞SGC-7901/DDP,确定盐霉素是否能在体外提高耐顺铂胃癌细胞SGC-7901/DDP对顺铂化疗的敏感性。同时初步探究盐霉素与顺铂联合作用的分子机制及盐霉素对耐顺铂胃癌细胞的增敏机制,从而为改善顺铂耐药和胃癌的治疗新方案的提出提供理论依据,为临床应用提供新的思路。方法:1.CCK-8法检测SAL对SGC-7901、SGC-7901/DDP细胞活力的影响,筛选SAL与DDP单药及联合应用的最佳浓度。2.CCK-8、Transwell及细胞划痕实验检测SAL与DDP单药及联合应用对SGC-7901及SGC-7901/DDP细胞增殖、侵袭、迁移的影响,CCK-8法同时检测SAL对GES-1细胞增殖的影响。3.流式细胞术检测SAL与DDP单药及联合应用对SGC-7901及SGC-7901/DDP细胞周期及凋亡的影响。4.免疫印迹实验及免疫组化实验检测SAL与DDP单药及联合应用对SGC-7901及SGC-7901/DDP细胞凋亡相关因子Bcl-2、Bax、Caspase 3、Caspase 9、Fas-L、NF-κBp65表达的影响,探究SAL诱导凋亡的可能机制。5.免疫印迹实验检测SAL、SAL与Wnt-C59联合处理SGC-7901及SGC-7901/DDP细胞后Wnt/β-catenin通路效应物p-GSK-3β（Ser9）、β-catenin与靶基因Axin2和CCND1、EMT标记蛋白E-cadherin、N-cadherin和Vimentin的表达;免疫荧光检测SAL、SAL与Wnt-C59联合处理SGC-7901及SGC-7901/DDP细胞后β-catenin的核定位;探究SAL作用于SGC-7901和SGC-7901/DDP细胞的化疗增敏机制。结果:1.CCK-8法筛选出SAL-8μM与DDP-3μg/m L作用24 h为最佳作用浓度和时间。2.SAL-8μM作用于GES-1细胞24 h抑制率与对照组（0μM）比较差异无统计学意义（P>0.05）;与对照组比较,SAL与DDP分别处理SGC-7901和SGC-7901/DDP细胞24 h均能显着降低两种细胞的的增殖、侵袭和迁移能力,并显着增加细胞凋亡率（P<0.01）;其中在SGC-7901细胞中,与SAL组相比,DDP组、双药组均显着降低SGC-7901细胞的增殖能力（P<0.05）、侵袭能力（P<0.05）、迁移能力（P<0.05）并显着增加细胞凋亡率（P<0.05）;在SGC-7901/DDP细胞中,与DDP组相比,SAL组、双药联合组均显着降低SGC-7901/DDP的增殖能力（P<0.05）、侵袭能力（P<0.05）、迁移能力（P<0.05）并显着增加细胞凋亡率（P<0.05）。3.在SGC-7901和SGC-7901/DDP细胞中,DDP处理组中G0/G1期细胞比例均显着高于对照组和SAL组（P<0.01）;同时,SAL处理组中S期细胞比例均显着高于对照组和DDP组（P<0.01）。4.与对照组比较,SAL和DDP分别处理24 h后,SGC-7901和SGC-7901/DDP两种细胞中Caspase 3、Caspase 9、Bax的表达量均显着上调（P<0.01）且Bcl-2的表达量均显着下调（P<0.01）;且与单药组相比,双药联合组表达量变化量更明显（P<0.01）;在SGC-7901/DDP细胞中,与DDP组相比,SAL组、双药联合组均显着升高Caspase 3、Caspase 9、Bax表达水平（P<0.01）。5.在SGC-7901细胞中,与对照组比较,SAL及DDP分别处理均增加了Fas-L、细胞质中NF-κBp65的表达,但是DDP组中Fas-L、细胞质中NF-κBp65的表达更明显,双药联合使用未见明显的协同作用;在SGC-7901/DDP细胞中,SAL及DDP分别处理均增加了Fas-L、细胞质中NF-κBp65的表达,双药联合使用表现出协同作用。6.在SGC-7901及SGC-7901/DDP细胞中,与对照组比较,SAL处理组N-cadherin、Vimentin、p-GSK-3β（Ser9）、β-catenin、Axin2、CCND1蛋白表达量均降低（P<0.01）,而E-cadherin的表达量增高（P<0.01）,β-catenin的核外移增多;与SAL组相比,SAL与Wnt-C59联合处理组两种胃癌细胞中N-cadherin和Vimentin、p-GSK-3β（Ser9）及β-catenin、Axin2和CCND1的表达量进一步下调（P<0.01）,E-cadherin的含量进一步上调（P<0.01）,β-catenin的细胞核外移进一步增多。7.与SGC-7901比较,SGC-7901/DDP耐药株SAL处理组、SAL与Wnt-C59联合处理组,N-cadherin、Vimentin、p-GSK-3β（Ser9）、β-catenin、Axin2、CCND1表达的下调和E-cadherin的上调及β-catenin的核外移程度均增强。结论:1.SAL-8μM作用24 h对人胃粘膜上皮细胞GES-1细胞的无明显抑制作用,但可以抑制胃癌细胞SGC-7901及SGC-7901/DDP的增殖。2.SAL与DDP均能抑制SGC-7901及SGC-7901/DDP细胞的增殖、侵袭、迁移和诱导凋亡,SAL可调节并增强DDP对胃癌细胞SGC-7901及顺铂耐药细胞SGC-7901/DDP增殖、侵袭、迁移的抑制作用和诱导凋亡作用,两药联合具有协同作用;与SGC-7901不同,SAL、双药联合均比DDP对SGC-7901/DDP迁移抑制、诱导凋亡作用更强。3.DDP可致胃癌细胞SGC-7901、SGC-7901/DDP周期阻滞于G0/G1期,SAL可阻滞于S期,两药可分别作用于不同周期时间点发挥细胞阻滞作用。4.SAL与DDP通过Fas-L通路,上调凋亡相关因子Caspase 3、Caspase 9、Bax、Fas-L并下调Bcl-2的表达,同时抑制核内NF-κBp65的表达来调节胃癌细胞SGC-7901及SGC-7901/DDP凋亡,且仅在SGC-7901/DDP中,两药具有明显协同作用。5.SAL通过下调Wnt/β-catenin通路效应物p-GSK-3β（Ser9）、β-catenin及靶蛋白Axin2和CCND1等的表达抑制EMT进程,从而抑制肿瘤细胞的侵袭迁移,增加肿瘤细胞对DDP的敏感性,逆转耐药细胞耐药抵抗。
徐彩霞[7]（2021）在《基于蛋白质组学对WNT5A和WNT11在癌症细胞中介导的信号通路的分析》文中指出研究背景及目的:目前医学技术快速发展,但是探究疾病发生与发展及其内在的作用机制和药物靶标仍然是一大难题。蛋白质作为执行功能的参与者,通过蛋白与蛋白之间的相互作用进而调控细胞生命活动及生物体的众多生理活动,在生命进程中发挥着重大作用。随着蛋白质组学方法映射蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络的研究方法被广泛应用,我们对生命活动进程有了更深入的了解,也对众多疾病的发病机制有了更深刻的认识。WNT信号通路在多种疾病中扮演着重要的角色。WNT5A和WNT11属于WNT家族中的两个成员,最近研究发现这两者对于WNT信号通路在体内的作用有重要的影响,且WNT5A和WNT11两者在胚胎发育,癌症和心脏发生等过程中有明显的相关性。因此,WNT5A和WNT11两种信号分子受到广泛关注。这两个分子在多种癌症中均有出现,在浆液性卵巢癌的进展过程中WNT11的表达可能受WNT5A的调节[1]。WNT5A和WNT11的表达对于肺鳞癌和肺腺癌的发展也至关重要[2]。本研究通过WNT5A和WNT11处理癌症细胞,利用甲醛固定免疫沉淀联合质谱（IP-XL/MS）技术及生物信息学技术探索WNT5A和WNT11蛋白相互作用蛋白动态变化网络,揭示与这两个蛋白存在相互作用的蛋白的生物学功能,以及介导的信号通路,进一步探索WNT蛋白的潜在靶标,为临床治疗提供更多的理论依据。技术方法:首先选择可以大量培养的HEK293s细胞,转染相关质粒,成功的表达出WNT分泌蛋白,然后通过TOP-Flash Reporter Assay鉴定到所表达的WNT蛋白是有活性的,通过免疫印迹法对CM中的WNT蛋白进行定量。接着用CM刺激实验室现有的癌症细胞,通过不同WNT蛋白的处理,利用甲醛固定免疫沉淀联合质谱（IP-XL/MS）技术富集与WNT5A和WNT11相互作用蛋白,将每个实验样品根据重轻链分为2个组分,每个组分进行75min梯度的质谱鉴定与定量。接下来,在不同时间梯度的处理下,根据转录因子响应过程富集核内相互作用蛋白,检测其动态变化,对WNT相互作用蛋白表达谱进行定量。进一步通过层次聚类、GO（Gene Ontology）分析和KEGG分析对鉴定到的蛋白进行功能分析及通路富集分析。结果:通过蛋白质组学技术我们实现了在时序上的调节和空间里的定位进行跟踪,WNT5A和WNT11相互作用蛋白。通过过表达WNT5A-v5和WNT11-v5质粒到HEK293s细胞,成功的获得了含有大量WNT5A和WNT11蛋白的培养基。经过这些培养基处理胃癌细胞,我们富集到胃癌细胞系中与WNT5A和WNT11蛋白相互作用的备选分子,包括核内蛋白和细胞全蛋白,在17种胃癌细胞系中我们选择了成功被激起WNT信号通路的2种细胞系HGC27、SNU1。应用这两种细胞系进行核内蛋白的富集,目的获得相互作用的转录因子的信息。根据富集到的上调蛋白分析其可能介导的信号通路,发现其在DNA修复、蛋白向内质网膜的转运、细胞增殖、迁移、凋亡等过程发挥作用。在卵巢癌低表达WNT5A和WNT11蛋白的A2780、OVCA42、OAW42三种细胞系中进行研究,发现其有一部分结果与胃癌细胞系中的结果相似,其也在DNA修复,蛋白转运、DNA复制等过程中有调控作用,上调蛋白根据不同WNT CM刺激其表达趋势也有相似趋势。结论:应用胃癌和卵巢癌细胞系经含有WNT5A蛋白和WNT11蛋白的CM刺激,提取细胞全蛋白或核蛋白进行富集,获得其潜在的相互作用蛋白和受其调控的核内转录因子,根据这些筛选出的上调蛋白富集参与的信号通路发现其在胃癌和卵巢癌细胞系中都介导细胞的增殖、迁移,DNA修复,内质网膜蛋白的转运,细胞周期调控等信号通路,其中两种癌症细胞中相似功能的信号通路有:R-HSA-6798695 Neutrophil degranulation,GO:1903046 meiotic cell cycle process,R-HSA-1640170 Cell Cycle,GO:0006302 double-strand break repair,R-HSA-5693532 DNA Double-Strand Break Repair。总之,我们使用的IP-XL/TFRE/MS技术能够大规模的、精准的检测到胃癌和卵巢癌细胞系中与WNT5A和WNT11相互作用的蛋白（包括瞬时作用或持久相互作用的蛋白）,根据不同WNT CM刺激时序跟踪描绘出不同癌症类型中WNT CM刺激时蛋白复合物及下游传导分子复合物的动态网络,发现新的信号通路蛋白,这些蛋白与DNA修复、细胞周期、蛋白转运、细胞增殖迁移有关迁移。
孙新锋[8]（2021）在《芪术抗癌方对肝细胞癌干性标志物影响的研究》文中提出背景:原发性肝癌是一个全球性的健康问题,其中90%为肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）,是第二位致死性肿瘤,5年生存率仅为18%,HCC早期可选择肝移植、手术切除或射频消融等根治性治疗,中晚期化疗栓塞/放射栓塞和全身系统治疗是仅存的治疗方法。和大多数肿瘤一样,HCC中存在干性癌细胞,即癌干细胞（cancer stem cell,CSC）,是具有无限增殖和分化潜能的一类特殊细胞群,特别是在HCC的复发转移过程中起着关键作用。癌干细胞标志物是一种特异性的信号分子或蛋白质受体,是利用其鉴定癌干细胞最简单的方法。很多研究表明癌干细胞表面标记物是影响HCC固有耐药性和侵袭转移能力以及调节其干性的关键因素。随着对癌干细胞的深入研究,越来越多的癌干细胞标记物被发现,在体内成瘤实验中确证过,常见的有EpCAM、CD133、CD44及SOX4等癌干细胞表面蛋白,这些标记物在上皮癌变过程中具有一定的促进作用,它的活化和显着表达与肿瘤的活性、侵袭能力和恶性程度呈正相关。最近研究表明,HCC癌干细胞的存在是影响临床疗效导致HCC患者死亡的主要原因之一。中医药是中华民族传统文化与智慧的结晶,具有毒副反应少、多组分、治疗靶点多、减毒增效等特点,能够优化HCC治疗早已形成共识,导师在传承的基础上,创新和发展传统中医宏观气血辨证论治思想,对芪术抗癌方治疗HCC宏观和微观物质基础进行了一系列研究,本方以由黄芪、莪术、炒白术、柴胡、白芍、鸡内金及炙甘草等药物组成。前期临床研观察发现,该方可显着提高HCC患者临床疗效,明显改善生存质量、减少肿瘤的复发和转移并提高患者的生存率。进一步研究发现该方能阻止癌细胞转移、诱导HepG2细胞凋亡、p53蛋白表达及p21细胞周期调控等;并通过调节JNKs信号通路促进HepG2细胞凋亡、阻止裸鼠HCC转移,及逆转TGF-β诱导的肝癌细胞EMT和干性特征减少癌细胞迁移等。故系统深入研究HCC癌干细胞的侵袭转移机制以及寻求新的治疗方法,是提高疗效、改善预后及延长生存率的关键环节。通过对癌干细胞的起源、生物学特征及作用和机制初步的阐述,进一步研究HCC转移和复发机制,探讨中药阻止HCC进展的疗效机制具有重要意义。目的:芪术抗癌方可能会影响癌细胞干性标志物表达从而影响HCC复发和转移;据此,本研究拟在导师前期工作基础上,（1）通过对HCC患者外周血淋巴细胞（PBMC）进行癌干性标志物高通量测序以验证主要干性相关标志物基因及SOX4的表达;（2）建立芪术抗癌方处理HepG2细胞损伤模型,验证芪术抗癌方对肝癌细胞株干性标志物表达的影响。（3）建立肝癌原位小鼠动物模型,验证芪术抗癌方对干性标志EpCAM、CD133、CD44表达和对SOX4基因表达的影响。本研究结果,有望在肿瘤干性标志物方面初步阐释芪术抗癌方阻止HCC进展的疗效作用机制,为中药抗癌制剂的研发和广泛的临床应用提供理论和实验依据。方法:第一部分:收集正常对照人群、HCC患者血液标本,通过PBMC高通量测序及蛋白芯片表达,研究不同分期分级HCC患者之间干性标志及SOX4表达差异,并与正常对照人群进行对比分析。1.经医院伦理委员会批准依据我国《原发性肝癌诊疗规范》（2017年版）选择确诊为肝细胞癌患者,共80例,其中年龄在30岁至70岁之间,平均年龄51.2岁。根据巴塞罗那肝癌临床分期标准（BCLC）进行分期,80例HCC患者,根据巴塞罗那肝癌临床分期标准（BCLC）进行分期:其中0期5例,A期21例,B期14例,C期25例,D期15例;为了进一步区分HCC组癌干性基因表达,我们选取了正常对照组,随机入组50例正常人群作为对照组,同时对入组进行统计学分析。2.对入组者进行外周血单个核细胞（PBMC）提取A.使用量约5ml的EDTA抗凝真空采血管进行血液采集,上下颠倒与抗凝剂混合均匀后放入4℃冰箱保存,并在2小时内完成PBMC提取。B.对入组标本进行RNA提取与检测,包括Trizol法提RNA,Thermo试剂盒法进行细胞裂解、RNA萃取、RNA清洗、Elute RNA、RNA检测,对文库构建与质控,库检合格后,把不同文库按照有效浓度及目标下机数据量的需求pooling后进行Illumina 测序。C.数据对比分析:采用Subread软件中的FeatureCounts工具对基因进行表达水平的定量,FeatureCounts主要使用-Q 10-B-C参数,分别过滤掉比对质量值低于10的reads,非成对比对上的reads,比对到基因组多个区域的reads。3.随机抽取36例肝癌患者和对照组血浆标本进行蛋白数据进行分析,包括原始数据归一化,差异蛋白筛选,差异蛋白聚类等基础分析。第二部分:芪术抗癌方体外、体内实验研究1.芪术抗癌方对癌细胞干性标志表达影响的体外肝癌细胞研究通过体外实验,观察芪术抗癌方是否影响TGF-β1诱导的肝癌细胞干性标志物表达。利用TGF-β1诱导Huh7细胞干性表达,加入芪术抗癌方浸提液共培养,Western blot检测癌细胞干性相关蛋白表达水平,验证芪术抗癌方对癌细胞干性标志表达的影响。2.芪术抗癌方对癌细胞干性标志及SOX4基因表达影响的体内肝癌动物模型研究2.1肝癌原位模型造模小鼠肝包膜下种植SMMC7721-luc制备肝癌模型,4周后进行活体成像仪查看荧光情况来确认小鼠是否造模成功。2.2分组用耳标法将30只肝癌模型小鼠和5只空白小鼠进行编号,然后将肝癌模型小鼠随机等量分为5组（肝癌模型组、索拉非尼组、芪术抗癌低剂量、中剂量、高剂量组）。空白小鼠则做为对照组。2.3取材给药30天后用安乐处死小鼠,剪开小鼠腹部皮肤2cm,分离肌肉,取出小鼠肝脏、拍照。然后肝脏和肿瘤备用。2.4 HE染色及免疫组织化学染色2.5 PCR定量检测根据实验说明书从肝脏肿瘤组织中提取的总RNA,以RNA为模板,按照说明书配制逆转录反应体系,总体积为20μl,37℃,60min;98℃,10min,合成cDNA第一链,并收集备用;加入特定引物,在PCR反应条件下:94℃ 2min,94℃ 20s,58℃ 20s,72℃ 20s,40循环。PCR产物的特异性通过熔解曲线分析证实。基因表达相对定量与ΔΔCt方法实现（Ct值）。2.6肝癌组织标本进行Western Blot和免疫组化检测。结果:第一部分:收集健康对照组、肝细胞癌患者血液标本,通过PBMC基因测序及蛋白芯片表达,对比健康对照组与HCC、HCC不同分期组之间干性标志物基因、蛋白及SOX4基因表达。本研究中对纳入的80例HCC患者,根据巴塞罗那肝癌临床分期标准（BCLC）进行分期:其中0期5例,A期21例,B期14例,C期25例,D期15例;同时纳入50例健康人群作为对照组。通过采用RNA-Seq对HCC患者和正常健康对照组外周血淋巴细胞（PBMC）进行高通量测序,及生物信息学方法分析,发现在HCC患者和健康对照者验证队列中,使用qRT-PCR对9个干性基因表达进行验证对比发现,在两者组人群中都存在 CD13、CD24、CD44、CD47、EPCAM、CD133、SOX2、SOX4、CD90等基因表达,并且以CD13、CD24、CD44、CD47、CD133、SOX4表达更显着。对HCC巴塞罗那分期0-B期和C-D期,进一步进行RNA-Seq测序结果分层分析比较,发现在9个癌干性基因表达中,CD13、CD24、CD44、CD47、CD133、SOX4、EpCAM在两组中亦均明显表达,同时发现C-D级较0-B期HCC患者CD133基因表达更为显着,而EpCAM表达0-B期较C-D期患者基因表达有较为明显的表达,同时我们还发现在两组患者中具有同等水平的SOX4的表达。HCC患者和对照组的干性基因表达聚类图进一步分析发现,SOX4基因在HCC组呈现明显的高表达,同样HCC患者PBMC中CD24、CD47、CD13基因表达和健康对照组比较存在显着差异。通过HCC患者血浆蛋白芯片检测,发现HCC患者存在CD44、EpCAM基因高表达。本研究部分,通过RNA-seq技术及血浆芯片蛋白检测技术,确证人PBMC中存在部分干细胞标志物基因表达,通过进一步比较发现,CD133、CD44、EpCAM在肝癌患者中表达明显,且与分期呈现负相关,并发现癌细胞干性调节基因SOX4在HCC患者中高表达,提示,HCC患者PBMC中存在癌干细胞与疾病进展和不良预后相关。第二部分:通过体外、体内实验观察芪术抗癌方对癌干细胞中CD133、CD44、EpCAM及SOX4表达的影响,初步探讨在癌干细胞方面中医药治疗肝癌的作用。1.芪术抗癌方对Huh7肝癌细胞干性标志表达的影响我们体外研究发现,通过对TGF-β1诱导的癌细胞干性标志基因蛋白表达发现,芪术抗癌方干预Huh7肝癌细胞后,能抑制EpCAM和CD133表达,表明该中药复方可以在体外通过抑制癌细胞中EpCAM和CD133干性表达而阻止HCC进展。2.芪术抗癌方对肝癌动物模型癌细胞干性标志及SOX4基因表达的影响EpCAM、CD133、CD44、SOX4等细胞表面蛋白的活化和高表达与肿瘤的活性、侵袭能力和恶性程度呈正相关。我们已对HCC患者PBMC进行了高通量测序研究,发现EpCAM、CD133、CD44、SOX4等干性相关基因,在HCC患者PBMC中表达,及体外实验亦证实了芪术抗癌方可以抑制部分干性标志及SOX4基因表达。由此,我们进行了进一步体内实验研究,验证芪术抗癌方对HCC癌细胞干性标志及SOX4基因表达的影响,初步探索芪术抗癌方阻止HCC进展的疗效机制。我们对实验成功的肝癌原位小鼠动物模型进行分组和处理,并进行PCR、Western Blot及免疫组化染色研究分析,发现芪术抗癌方可以降低癌干细胞EpCAM、CD133和CD44,以及癌细胞干性调节基因SOX4在肝癌肿瘤组织中的表达,并且作用优于索拉菲尼,验证了我们的假设,芪术抗癌方可以通过影响癌细胞干性标志物表达从而阻止HCC进展,其疗效机制可能与调节SOX4基因表达相关。结论:在本研究中,首先通过对临床HCC患者PBMC进行RNA-seq及血浆芯片蛋白检测研究,发现了人PBMC中存在部分干细胞标志物基因表达,通过进一步比较发现,CD133、CD44、EpCAM在肝癌患者中表达明显,且与分期呈现负相关,并发现癌细胞干性调节基因SOX4在HCC患者中高表达,提示,HCC患者PBMC中存在癌干细胞与疾病进展和不良预后相关,而中医药可能通过调节SOX4基因影响干性标志表达。其次,通过体外实验研究发现芪术抗癌方可影响Huh7肝癌细胞中CD133、CD44、EpCAM干性标志表达。最后,我们通过对实验成功的肝癌原位小鼠动物模型进行分组和处理,并进行PCR、Western Blot及免疫组化染色分析研究,发现芪术抗癌方可以降低癌干细胞EpCAM、CD133和CD44,以及癌细胞干性调节基因SOX4在肝癌肿瘤组织中的表达,并且作用优于索拉非尼,验证了我们的假设,芪术抗癌方在体内外实验中能通过影响癌细胞干性标志物表达阻止HCC进展,其疗效机制可能与调节SOX4基因表达相关,为芪术抗癌方进一步深入的疗效机制研究提供了较好的临床及试验证据,为中医药在HCC治疗的临床广泛应用提供了研究依据。
徐芬[9]（2021）在《含铜胺氧化酶1（AOC1）在胃癌进展中的作用及分子机制研究》文中指出目的:胃癌（gastric cancer）是世界上第五大常见的恶性肿瘤,每年大约有100万例新增确诊病例;也是第三大癌症相关死亡原因,每年的死亡病例超过72万例。目前,胃癌仍然是严重的全球健康负担和死亡威胁。含铜胺氧化酶1（Amine oxidase copper-containing 1,AOC1）是一种含铜的酶,负责催化短链脂肪二胺的氧化脱氨化,主要底物为腐胺和组胺。目前,未有研究报道AOC1在癌症进展中扮演的角色。本研究旨在探究AOC1在胃癌组织和细胞中的表达模式、具体生物学功能以及调控的分子机制。方法:1、利用GEPIA在线数据库分析、q RT-PCR和western blot等方法,分析并检测AOC1在人胃癌样本组织中的m RNA和蛋白表达模式。2、胃癌细胞系AGS和MKN45被挑选作为体外研究细胞模型。特异性si RNA被设计、合成并转染进细胞以敲低AOC1在细胞中的表达。pc DNA3.1重组质粒被设计并转染进细胞以过表达AOC1在细胞中的表达。3、CCK-8、克隆形成、流式细胞术、Transwell、western blot等方法被用于检测AOC1表达变化对AGS和MKN45细胞增殖、生长、凋亡、迁移和侵袭等细胞生物学功能的影响。4、AKT通路激动剂IGF-1和抑制剂Ipatasertib（GDC-0068）被用于进行拯救实验。5、使用Illumina Hiseq平台对转染空pc DNA3.1质粒或转染pc DNA3.1-AOC1过表达质粒的AGS细胞进行高通量转录组测序,以寻找AOC1在胃癌细胞中过表达后引起的转录组改变。结果:1、与GEPIA收纳的211例正常胃上皮组织相比,AOC1 m RNA水平在GEPIA收纳的408例人胃腺癌（stomach adenocarcinoma,STAD）组织中被显着上调。同样,与邻近的癌旁组织相比,在临床收集的30例人胃癌组织中,AOC1 m RNA和蛋白表达水平均被显着上调。2、AOC1表达下调显着抑制了AGS和MKN45细胞的增殖、生长、迁移、侵袭和上皮-间充质转化（epithelial–mesenchymal transition,EMT）,并诱导了细胞凋亡;AOC1过表达显着促进了AGS细胞的增殖、生长、迁移、侵袭和EMT过程,并抑制了细胞凋亡。3、敲低AOC1降低了AGS和MKN45细胞中AKT的磷酸化水平及其下游效应器p70S6K和Cyclin D1的表达;与之相反,AOC1过表达增强了AKT的磷酸化水平及其下游效应器p70S6K和Cyclin D1的表达。而IGF-1的处理拯救了AOC1敲低对细胞增殖、迁移和侵袭的影响。与此同时,Ipatasertib的处理阻碍了AOC1过表达对细胞增殖、迁移和侵袭的影响。4、高通量转录组测序结果表明每个样品平均产出6.29 Gb数据,平均每个样品检测到14705个基因。在AOC1过表达AGS细胞中,鉴定到182个差异表达的基因,其中,表达显着上调的基因152个,表达显着下调的基因30个。结论:综上所述,本研究发现AOC1在胃癌组织中的表达被显着上调,并通过激活AKT信号通路发挥关键的促癌因子功能,显着促进了胃癌细胞的进展。靶向AOC1的特异性抗体或小分子抑制剂将有利于未来胃癌的治疗。
王子月[10]（2021）在《表观遗传生物标志物的超灵敏检测方法研究》文中认为表观遗传是指DNA不发生变化而基因表达或细胞表型发生可遗传变化的现象。表观遗传一般发生在有丝分裂或减数分裂过程中,能够通过控制基因的表达和转录来调控生物体的胚胎形成和基因组印记等过程。大量研究表明,人类细胞表观遗传水平异常可导致发育障碍、老年痴呆和癌症等疾病的发生。所以,表观遗传可以为重大疾病的诊断、治疗和预防提供新的机遇。研究者已经研究了多种生物表观遗传的分子学基础,并且发现了一系列表观遗传生物标志物,其中主要包括DNA甲基化、DNA羟甲基化、非编码RNA（noncoding RNA,ncRNA）、RNA甲基化和组蛋白修饰等。准确检测这些表观遗传生物标志物,不仅对表观遗传学相关的生物化学研究具有重要意义,而且对癌症的诊断、预后和治疗也具有极大价值。用于表观遗传生物标志物检测的传统方法主要包括印迹法、同位素测定法、质谱法和免疫吸附法。但它们存在灵敏度较低、耗时长、样品量大、需要放射性物质、涉及昂贵的仪器、样品制备复杂、操作耗费劳力等不足。本文以DNA甲基化、DNA羟甲基化、ncRNA、RNA甲基化为研究对象,结合量子点（quantum dot,QD）、磁珠（magnetic bead,MB）等新型材料与核酸扩增、荧光光谱分析、单分子检测等技术,发展了一系列操作简单、灵敏度高、选择性好的表观遗传生物标志物检测方法。具体研究内容如下:1、发展了一种基于单个QD的纳米传感器,该传感器可以利用三环连接酶链式反应（ligase chain reaction,LCR）和荧光共振能量转移（fluorescence resonance energy transfer,FRET）,实现超灵敏检测胞嘧啶/鸟嘌呤二核苷酸（cytosine/guanine dinucleotides,CpG）岛和非CpG岛的DNA甲基化。我们设计了两组DNA探针（X和Y,X’和Y’）,在热稳定DNA连接酶存在时,探针X和Y可以与甲基化的DNA相邻杂交来获得连接的XY产物,该连接的XY产物可以作为探针X’和Y’的模板来产生X’Y’产物。所得到的X’Y’产物又可以作为模板来连接探针X和Y,导致继续产生XY产物。在热变性条件下,不断的相邻杂交将诱导三环LCR扩增产生大量的XY产物。随后我们将XY产物与捕获探针和报告探针杂交,形成三明治杂交物。该杂交物可以聚集在605QD表面来获得605QD-寡核苷酸-Cy5纳米结构,从而诱导从605QD到Cy5的高效FRET和Cy5信号的发射。该纳米传感器可以在单个5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine,5mC）分辨率下检测DNA甲基化,且检测限（limit of detection,LOD）低至1.00×10-17M,动态范围可达7个数量级。此外,该纳米传感器可以区分低至0.01%的甲基化水平,还可以检测到人类肺癌细胞中的DNA甲基化,在准确的表观遗传学评估和早期癌症诊断方面具有巨大的潜力。2、发展了一种无标记的荧光生物传感器,利用5-羟甲基胞嘧啶（5-hydroxymethylcytosine,5hmC）选择性氧化为5-甲酰基胞嘧啶（5-formylcytosine,5f C）、随后转化为尿嘧啶（uracil,U）的原理,结合连接介导的滚环扩增（rolling circle amplification,RCA）技术,实现了对5hmC和5mC的区分。5hmC-DNA先被高钌酸钾（KRuO4）氧化,然后被重亚硫酸盐/氢氧化钠（NaOH）处理,5hmC将会变成U。随后该探针作为挂锁探针连接的模板来启动等温RCA反应,生成大量长度不同的单链DNA片段,最终使用SYBR green II荧光染料进行定量。该方法灵敏度高,LOD为3.48×10-14f M,甚至可以在混合物中区分低至0.01%的5hmC-DNA,并且能够在血清样本分析中表现出良好的性能。该实验为超灵敏的5hmC检测开辟了一条新途径,对甲基化/去甲基化调控的研究具有重要意义。3、发展了一种基于单个QD-FRET的纳米传感器,利用无铜和无酶循环点击化学介导LCR的原理检测micro RNAs（miRNAs）。我们设计了两种分别用叠氮化物（azide,N3）和二苯并环辛炔（dibenzocyclooctyne,DBCO）修饰的DNA探针（DNA探针1和2）,在miRNA存在的情况下进行无铜和无酶点击化学反应,并产生探针1-2连接产物。我们又设计了另外两种用N3和DBCO修饰的DNA探针（DNA探针3和4）,使得与探针1-2连接产物杂交并产生探针3-4连接产物。然后,探针1-2连接产物和探针3-4连接产物都能作为模板,引发循环点击化学介导的三环LCR扩增,扩增获得的产物被基于单个QD的FRET纳米传感器检测。该实验不涉及任何逆转录、铜催化剂和连接酶,灵敏度高(LOD为3.87×10-17 M)、特异性强,甚至可以区分单碱基错配。此外,该实验还可以进一步在单个细胞水平上检测miRNA-155,并且可以区分miRNA-155在健康人和非小细胞肺癌（nonsmall cell lung cancer,NSCLC）患者组织中的表达水平。4、发展了一种单分子计数生物传感器,利用N6-甲基腺苷（methylation of adenosines at the N6 position,m6A）修饰敏感的核酸内切酶和末端脱氧核苷酸转移酶（terminal deoxynucleotidyl transferase,TdT）介导的扩增,超灵敏检测信使RNA（messenger RNA,m RNA）的m6A。m6A位点阻断了毒素蛋白（Maz F）内切酶对目标序列的切割,导致目标序列可以与捕获探针和引物探针杂交,形成三明治杂交结构。接下来,MB与三明治杂交结构进行结合,然后引入TdT酶,驱动大量带有荧光基团的单核苷酸高效聚合到三明治杂交结构上进行信号扩增反应,最后经过MB的分离、核酸外切酶I（exonuclease I,Exo I）的消化,实现对荧光基团的单分子计数检测。该方法特异性好、灵敏度高,LOD为2.24×10-17M,并且具有在1.00×10-16M到1.00×10-9M 7个数量级之间的大动态范围。该方法可以从m6A-m RNA和对照m RNA混合物中区分出低至0.01%的m6A-m RNA水平,甚至可以准确地对血清样品中和3个细胞中的m6A-m RNA水平进行量化。该实验为超灵敏m6A检测开辟了一条新途径,对甲基化/去甲基化调控的研究具有重要意义。
二、人类癌细胞转化实验成功（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、人类癌细胞转化实验成功（论文提纲范文）
（1）鸡贫血病毒VP3基因对乳腺癌干细胞的作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 中英文缩略词 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 凋亡素 |
| 1.2 溶瘤腺病毒与肿瘤治疗 |
| 1.3 癌症干细胞研究进展 |
| 1.3.1 癌症干细胞的概念 |
| 1.3.2 CSCs的鉴定 |
| 1.3.3 CSCs的特征 |
| 1.3.4 CSCs转录因子的标志 |
| 1.3.5 CSCs与癌症转移 |
| 1.3.6 CSC与临床治疗 |
| 1.3.7 CSCs与细胞凋亡 |
| 第二章 乳腺癌干细胞干性特征分析 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 细胞 |
| 2.1.2 试剂和材料 |
| 2.1.3 仪器和设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 乳腺癌干细胞MCF7-CSC分选培养与传代 |
| 2.2.2 MCF7-CSC血清诱导分化 |
| 2.2.3 细胞克隆形成能力 |
| 2.2.4 Western Blot检测MCF7-CSC干细胞调控因子表达水平 |
| 2.2.5 PCR Array检测人类肿瘤干细胞相关干性基因表达 |
| 2.2.6 MCF7-CSC的耐药性检测 |
| 2.2.7 数据处理 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 MCF7-CSC分选培养 |
| 2.3.2 MCF7-CSC血清诱导分化能力 |
| 2.3.3 MCF7-CSC细胞克隆形成能力 |
| 2.3.4 MCF7-CSC干细胞调控因子表达 |
| 2.3.5 MCF7-CSC人类肿瘤干细胞相关干性基因表达 |
| 2.3.6 MCF7-CSC的耐药性检测 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 重组腺病毒对MCF7-CSC的抑制作用 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 细胞、毒株 |
| 3.1.2 试剂和材料 |
| 3.1.3 仪器和设备 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 重组腺病毒制备、纯化与毒价测定 |
| 3.2.2 重组腺病毒对MCF7-CSC干性抑制 |
| 3.2.3 重组腺病毒对MCF7-CSC的增殖抑制 |
| 3.2.4 重组腺病毒对MCF7-CSC的凋亡诱导作用 |
| 3.2.5 重组腺病毒对MCF7-CSC迁移侵袭能力的抑制 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 重组腺病毒对MCF7-CSC的干性抑制 |
| 3.3.2 CFSE检测重组腺病毒对MCF7-CSC的增殖抑制 |
| 3.3.3 重组腺病毒对MCF7-CSC的凋亡诱导作用 |
| 3.3.4 重组腺病毒对MCF7-CSC迁移侵袭能力的抑制 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 重组腺病毒对MCF7-CSC的小鼠体内抑制 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 毒株和动物 |
| 4.1.2 试剂和材料 |
| 4.1.3 仪器和设备 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 重组腺病毒对MCF 7-CSC小鼠体内成瘤能力的抑制 |
| 4.2.2 重组腺病毒对MCF 7-CSC小鼠体内肿瘤杀伤作用 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 MCF 7-CSC小鼠体内成瘤能力的检测 |
| 4.3.2 重组腺病毒对MCF 7-CSC的小鼠体内杀伤作用 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 Ad-VT与 MCF7-CSC药物敏感性 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 毒株和动物 |
| 5.1.2 试剂和材料 |
| 5.1.3 仪器和设备 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 Ad-VT与紫杉醇对MCF7-CSC的干性抑制 |
| 5.2.2 Ad-VT与紫杉醇对MCF7-CSC的增殖抑制 |
| 5.2.3 Ad-VT与紫杉醇对MCF7-CSC的凋亡诱导 |
| 5.2.4 Ad-VT与紫杉醇对MCF7-CSC的迁移侵袭能力抑制 |
| 5.2.5 Ad-VT与紫杉醇对MCF7-CSC的小鼠体内肿瘤形成能力抑制 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 Ad-VT促进紫杉醇对MCF7-CSC的干性抑制 |
| 5.3.2 Ad-VT促进紫杉醇对MCF7-CSC的增殖抑制 |
| 5.3.3 Ad-VT促进紫杉醇对MCF7-CSC的凋亡诱导 |
| 5.3.4 Ad-VT促进紫杉醇对MCF7-CSC的迁移侵袭能力抑制 |
| 5.3.5 Ad-VT促进紫杉醇对MCF7-CSC的小鼠体内成瘤能力抑制 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 结论与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 展望 |
| 6.3 主要创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
（2）EZH2表达调控对胃癌生长及化疗敏感性的影响（论文提纲范文）
| 英文略缩词 |
| 中文摘要 |
| abstract |
| 前言 |
| 第一部分 EZH2 基因在胃癌组织和胃癌细胞的表达 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 慢病毒介导沉默EZH2 基因稳转细胞株的构建和鉴定 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第三部分 EZH2 基因沉默对胃癌生长和化疗敏感性的影响 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第四部份EZH2 基因对人胃癌细胞生长及耐药性的相关机制探讨 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 全文总结 |
| 问题和展望 |
| 参考文献 |
| 综述 EZH2基因与胃癌相关性研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（3）基于深度学习的抗肿瘤药物作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 人工智能的兴起与发展 |
| 1.2 人工智能在药物发现中的应用 |
| 1.2.1 分子表征 |
| 1.2.2 基于结构的虚拟筛选 |
| 1.2.3 基于配体的虚拟筛选 |
| 1.2.4 从头药物设计 |
| 1.2.5 药物重定向 |
| 1.3 人工智能助力抗肿瘤药物发现 |
| 1.3.1 抗肿瘤药物的研发现状 |
| 1.3.2 抗肿瘤药物重定向 |
| 1.4 本章小结及论文总体安排 |
| 第2章 基于深度学习的化合物激酶谱预测方法研究 |
| 2.1 研究背景 |
| 2.1.1 激酶抑制剂的研究现状 |
| 2.1.2 化合物激酶谱的计算预测模型 |
| 2.2 研究方法 |
| 2.2.1 数据收集和整理 |
| 2.2.2 多任务深度神经网络 |
| 2.2.3 超参数优化 |
| 2.2.4 聚类交叉验证 |
| 2.2.5 模型评价 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 模型优化 |
| 2.3.2 模型在外部测试集上的评价 |
| 2.3.3 模型比较 |
| 2.3.4 模型的实验验证 |
| 2.3.5 模型应用于选择性预测 |
| 2.4 全激酶组多药理学作用在线应用平台Kinome X |
| 2.5 本章小结 |
| 第3章 基于深度学习的药物细胞敏感性预测方法研究 |
| 3.1 研究背景 |
| 3.1.1 基因组表征数据集 |
| 3.1.2 药物敏感性的计算预测模型 |
| 3.1.3 图神经网络简介 |
| 3.2 研究方法 |
| 3.2.1 数据收集及处理 |
| 3.2.2 图注意力网络 |
| 3.2.3 模型评价 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 模型优化与表现 |
| 3.3.2 模型比较 |
| 3.3.3 模型的可解释性 |
| 3.4 本章小结 |
| 第4章 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果 |
（4）STING对宫颈癌增殖、迁移和侵袭能力的作用及机制的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第1章 引言 |
| 第2章 综述 cGAS-STING信号在癌症免疫和免疫治疗中的作用 |
| 2.1 CGAS-STING信号通路抗肿瘤机制 |
| 2.1.1 细胞质DNA如何积聚? |
| 2.1.2 cGAS-STING通路消除癌细胞机制 |
| 2.2 CGAS-STING通路在治疗中的应用 |
| 2.2.1 单药治疗 |
| 2.2.2 STING激动剂联合疗法 |
| 2.3 STING免疫疗法:一把双刃剑 |
| 2.4 结论 |
| 第3章 STING对宫颈癌增殖、迁移、侵袭能力影响的体外实验 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 主要仪器设备 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要试剂配制 |
| 3.2 实验流程 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 细胞来源和细胞培养条件 |
| 3.3.2 细胞复苏 |
| 3.3.3 细胞换液 |
| 3.3.4 细胞传代 |
| 3.3.5 细胞冻存 |
| 3.3.6 细胞计数 |
| 3.3.7 Trizol法提取HaCaT、H8、HeLa、SiHa、C33A、CaSki细胞的RNA |
| 3.3.8 RNA逆转录 |
| 3.3.9 定量实时聚合酶链式反应(real-time quantitativepolymerase chain reaction, qRT-PCR) |
| 3.3.10 HaCaT、H8、HeLa、SiHa、C33A、CaSki细胞的蛋白样品制备 |
| 3.3.11 蛋白质免疫印迹实验(Western Blot,WB) |
| 3.3.12 短发夹RNA慢病毒载体的构建及转导 |
| 3.3.13 过表达慢病毒载体的构建及转染 |
| 3.3.14 Trizol法提取vector HeLa、shSTING-Hela、vectorSiHa、shSTING-SiHa、vector C33A、C33A-STING细胞的RNA |
| 3.3.15 RNA逆转录 |
| 3.3.16 定量实时聚合酶链式反应 |
| 3.3.17 vector HeLa、shSTING-Hela、vector SiHa、shSTING-SiHa、vector C33A、C33A-STNG细胞的蛋白样品制备 |
| 3.3.18 蛋白质免疫印迹实验 |
| 3.3.19 宫颈癌细胞增殖实验 |
| 3.3.20 宫颈癌细胞平板克隆实验 |
| 3.3.21 宫颈癌细胞划痕实验 |
| 3.3.22 宫颈癌细胞Transwell小室迁移实验 |
| 3.3.23 宫颈癌细胞侵袭实验 |
| 3.3.24 统计分析 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 STING在人角质形成细胞、宫颈上皮永生化细胞以及四种宫颈癌细胞系中的表达 |
| 3.4.2 稳定的沉默STING细胞系、STING过表达细胞系的鉴定 |
| 3.4.3 STING沉默或过表达对宫颈癌细胞系细胞增殖和克隆形成的影响 |
| 3.4.4 STING沉默或过表达对宫颈癌细胞迁移能力的影响 |
| 3.4.5 STING沉默或过表达对宫颈癌细胞侵袭能力的影响 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 第4章 STING调控宫颈癌细胞生物学行为信号通路的探索 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验设备 |
| 4.1.2 实验试剂 |
| 4.1.3 主要溶液配制 |
| 4.2 实验流程 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 细胞培养、冻存、传代、计数 |
| 4.3.2 总蛋白提取和免疫印迹实验 |
| 4.3.3 核蛋白提取和免疫印迹实验 |
| 4.3.4 免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,co-IP)和免疫印迹实验 |
| 4.3.5 细胞培养、冻存、传代、计数 |
| 4.3.6 总蛋白提取和免疫印迹实验 |
| 4.3.7 CCK8实验 |
| 4.3.8 平板克隆 |
| 4.3.9 Transwell小室迁移 |
| 4.3.10 Transwell小室侵袭 |
| 4.3.11 统计学方法 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 STING对经典Wnt/β-catenin信号通路的作用 |
| 4.4.2 过表达STING对经典Wnt/β-catenin信号通路的影响 |
| 4.4.3 STING调控宫颈癌Wnt/β-catenin信号通路机制探讨 |
| 4.4.4 β-catenin通路抑制剂对沉默STING介导的宫颈癌细胞的增殖、迁移和侵袭作用的影响(rescue实验) |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 小结 |
| 第5章 沉默STING促进宫颈癌细胞增殖的体内实验 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 实验设备 |
| 5.1.2 实验试剂 |
| 5.1.3 主要溶液配制 |
| 5.1.4 实验动物 |
| 5.2 实验流程 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 细胞的复苏、传代及培养 |
| 5.3.2 裸鼠皮下移植瘤模型的建立 |
| 5.3.3 裸鼠体重测量 |
| 5.3.4 裸鼠移植瘤组织大小的测量 |
| 5.3.5 肿瘤组织脱水及包埋 |
| 5.3.6 苏木精和伊红染色技术(Hematoxylin and eosin dyeingtechniques,HE) |
| 5.3.7 免疫组织化学染色技术(Immunohistochemistry,IHC) |
| 5.3.8 统计学方法 |
| 5.4 实验结果 |
| 5.4.1 沉默STING的宫颈癌细胞移植瘤对裸鼠体重的影响 |
| 5.4.2 沉默STING对裸鼠移植瘤体积的影响 |
| 5.4.3 裸鼠肿瘤组织HE染色结果 |
| 5.4.4 裸鼠肿瘤组织STING免疫组化染色结果 |
| 5.4.5 裸鼠肿瘤组织免疫组化Ki67染色结果 |
| 5.5 讨论 |
| 5.6 小结 |
| 第6章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（5）南蛇藤提取物通过miR-144/451靶向mTOR抑制胃癌EMT的作用及机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 miR-144/451和mTOR与上皮间质转化的关系 |
| 1. 材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 主要仪器及耗材 |
| 1.4 引物及序列 |
| 1.5 主要试剂配制 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 Western blot实验 |
| 2.2 qRT PCR实验 |
| 2.3 免疫组织化学方法 |
| 2.4 统计学处理 |
| 3. 结果 |
| 3.1 miR-144/451 KO小鼠胃组织EMT相关蛋白的表达量 |
| 3.2 miR-144/451 KO小鼠胃组织mTOR信号转导通路相关蛋白的表达 |
| 3.3 miR-144/451 KO小鼠胃组织mTOR mRNA的表达 |
| 4. 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分miR-144/451缺失对小鼠自发性胃癌的影响 |
| 1. 材料 |
| 1.1 实验药品 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 实验试剂 |
| 1.4 主要仪器及耗材 |
| 1.5 引物及序列 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 药品准备 |
| 2.2 构建miR-144/451敲除的C57BL/6小鼠胃炎模型 |
| 2.3 小鼠培养 |
| 2.4 Western blot实验 |
| 2.5 qRT-PCR实验 |
| 2.6 免疫组织化学方法 |
| 2.7 统计学处理 |
| 3. 结果 |
| 3.1 小鼠胃组织的外观变化 |
| 3.2 miR-144/451 KO对小鼠发生自发性胃癌的影响 |
| 3.3 EMT相关蛋白的表达变化 |
| 3.4 胃组织mTOR相关蛋白的表达变化 |
| 3.5 mTOR mRNA的表达情况 |
| 4. 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 南蛇藤提取物对高表达的miR-144/451的人胃癌细胞的影响 |
| 1. 材料 |
| 1.1 实验细胞 |
| 1.2 实验药物 |
| 1.3 实验试剂 |
| 1.4 主要仪器耗材 |
| 1.5 主要试剂的配制 |
| 1.6 引物及序列 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 细胞培养 |
| 2.2 细胞总RNA提取 |
| 2.3 miRNA反转录 |
| 2.4 PCR实验 |
| 2.5 MTT实验 |
| 2.6 Western blot实验 |
| 2.7 Transwell小室迁移实验 |
| 2.8 数据处理 |
| 3. 结果 |
| 3.1 成功构建高表达miR-144/451的人胃癌AGS和HGC-27细胞 |
| 3.2 高表达miR-144/451的人胃癌细胞中mTOR mRNA的表达水平 |
| 3.3 南蛇藤提取物对高表达miR-144/451的人胃癌细胞增殖能力的影响 |
| 3.4 南蛇藤提取物对高表达miR-144/451的人胃癌细胞中mTOR的mRNA的影响 |
| 3.5 南蛇藤提取物对高表达miR-144/451的人胃癌细胞中mTOR相关蛋白的影响 |
| 3.6 南蛇藤提取物对高表达miR-144/451的人胃癌细胞中EMT相关蛋白的影响 |
| 3.7 南蛇藤提取物对高表达miR-144/451的人胃癌细胞迁移能力的影响 |
| 4. 讨论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 miRNA在胃癌相关mTOR信号通路中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（6）盐霉素对耐顺铂人胃癌细胞增敏作用及其机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 中英文对照缩略表 |
| 引言 |
| 第一章 材料与方法 |
| 1.材料 |
| 1.1 药品及试剂 |
| 1.2 主要溶液的配制 |
| 1.3 主要实验仪器 |
| 1.4 细胞来源 |
| 2.方法 |
| 2.1 SGC-7901、GES-1 细胞培养 |
| 2.2 人胃癌顺铂耐药株SGC-7901/DDP细胞培养 |
| 2.3 细胞的冻存 |
| 2.4 CCK-8 实验 |
| 2.5 细胞周期实验 |
| 2.6 细胞凋亡实验 |
| 2.7 细胞侵袭实验 |
| 2.8 细胞划痕实验 |
| 2.9 蛋白免疫印迹实验 |
| 2.10 免疫组化实验 |
| 2.11 免疫荧光实验 |
| 2.12 统计分析 |
| 第二章 实验结果 |
| 1.SGC-7901/DDP耐药株的耐药鉴定 |
| 2.CCK-8 法进行SAL作用浓度及时间点筛选 |
| 3.SAL及 DDP对胃癌细胞增殖、侵袭、迁移的影响 |
| 4.流式细胞术检测SAL及 DDP对胃癌细胞凋亡的影响 |
| 5.流式细胞术检测SAL及 DDP对胃癌细胞周期的影响 |
| 6.SAL及 DDP诱导胃癌细胞凋亡的机制研究 |
| 7. SAL 对胃癌细胞 Wnt/ β-catenin 通路效应物及 EMT 标记物表达的影响 |
| 第三章 讨论 |
| 第四章 总结与展望 |
| 1.结论 |
| 2.创新点 |
| 3 后续研究工作及展望 |
| 参考文献 |
| 综述 盐霉素的生物作用综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士期间科研成果 |
（7）基于蛋白质组学对WNT5A和WNT11在癌症细胞中介导的信号通路的分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 WNT5A和 WNT11 的发现 |
| 1.2 WNT5A和 WNT11 蛋白的功能 |
| 1.3 WNT5A和 WNT11 在癌症中的作用 |
| 1.4 WNT5A和 WNT11 作用的相关性 |
| 1.5 蛋白质组学技术 |
| 1.6 课题研究方法 |
| 1.7 研究目的及意义 |
| 第二章 WNT5A和 WNT11 蛋白的表达 |
| 2.1 实验材料及试剂 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 主要实验仪器 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 溶液配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 WNT5A-V5质粒和WNT11-V5 质粒的扩增 |
| 2.2.2 WNT CM的获得 |
| 2.2.3 WNT蛋白的鉴定 |
| 2.2.4 实验结果 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 WNT5A和 WNT11 蛋白活性测定 |
| 3.1 实验材料及试剂 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 主要实验仪器 |
| 3.1.3 实验试剂 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 TOP-Flash质粒和Renilla质粒转染 |
| 3.2.2 荧光素酶报告基因检测 |
| 3.2.3 实验结果 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 WNT CM中蛋白的动态变化 |
| 4.1 实验材料及试剂 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 主要实验仪器 |
| 4.1.3 实验试剂 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 WNT CM肽段样品的制备 |
| 4.2.2 质谱检测 |
| 4.2.3 实验结果 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 WNT5A和 WNT11 CM刺激下胃癌细胞中膜蛋白复合物的动态变化 |
| 5.1 实验材料及试剂 |
| 5.1.1 实验材料 |
| 5.1.2 主要实验仪器 |
| 5.1.3 实验试剂 |
| 5.1.4 溶液配制 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 IP-XL |
| 5.2.2 胶内酶解 |
| 5.2.3 质谱(Mass Spectrometry,MS)检测 |
| 5.2.4 数据处理 |
| 5.2.5 实验结果 |
| 5.2.6 HGC27 细胞系中IP实验富集的结果 |
| 5.3 讨论 |
| 第六章 WNT CM刺激后胃癌细胞HGC27和SNU1 中的转录因子动态变化 |
| 6.1 实验材料及试剂 |
| 6.1.1 实验材料 |
| 6.1.2 主要实验仪器 |
| 6.1.3 实验试剂 |
| 6.1.4 溶液配制 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 TFRE实验过程 |
| 6.2.2 数据筛选 |
| 6.2.3 实验结果 |
| 6.3 讨论 |
| 第七章 WNT5A和 WNT11 在卵巢癌细胞里激活的通路变化 |
| 7.1 实验结果 |
| 7.2 讨论 |
| 第八章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（8）芪术抗癌方对肝细胞癌干性标志物影响的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 文献研究 |
| 第一节 肝癌研究概况 |
| 一、肝癌流行病学现况 |
| 二、肝癌病因研究 |
| 三、肝癌发病机制 |
| 四、肝癌的治疗现状 |
| 五、肝癌发生发展与肝癌干细胞的关系 |
| 六、肝癌干细胞与上皮间质转化(EMT) |
| 第二节 肝癌中医药基础理论的形成和发展及芪术抗癌方研究概况 |
| 一、肝癌的渊源及病因病机 |
| 二、肝癌辨证治疗 |
| 三、芪术抗癌方中医气血辨证治疗肝癌的理论依据 |
| 四、芪术抗癌方临床疗效、机制及微观物质基础研究 |
| 第二章 芪术抗癌方对肝癌干细胞的影响 |
| 第一节 临床研究 |
| 一、资料与方法 |
| 二. 数据分析结果 |
| 三、结论 |
| 第二节 体外、体内实验研究 |
| 一、芪术抗癌方对癌细胞的干性表达体外研究 |
| 二、芪术抗癌方对癌细胞干性表达体内研究 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在校期间发表论文和参与课题情况 |
| 致谢 |
| 统计学审核证明 |
（9）含铜胺氧化酶1（AOC1）在胃癌进展中的作用及分子机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 引言 |
| 第2章 方法 |
| 2.1 化学药品及试剂 |
| 2.2 材料、设备及软件 |
| 2.3 组织样本收集、处理及检测 |
| 2.3.1 患者及组织样本收集 |
| 2.3.2 组织样本处理 |
| 2.3.3 RNA分离和q RT-PCR检测 |
| 2.3.4 总蛋白提取和western blot |
| 2.4 细胞系培养及构建 |
| 2.4.1 细胞培养 |
| 2.4.2 AOC1 敲低细胞系的构建 |
| 2.4.3 AOC1 过表达细胞系的构建 |
| 2.4.4 AOC1 敲低/过表达细胞系的检测 |
| 2.5 细胞及分子实验方法 |
| 2.5.1 CCK-8实验 |
| 2.5.2 克隆形成实验 |
| 2.5.3 Transwell实验 |
| 2.5.4 细胞凋亡检测 |
| 2.5.5 数据统计与分析 |
| 2.6 转录组高通量测序 |
| 2.6.1 样品处理及检测 |
| 2.6.2 信息分析流程 |
| 第3章 结果 |
| 3.1 AOC1 在胃癌临床组织样本中的表达模式 |
| 3.1.1 GEPIA在线数据库分析AOC1 在人胃癌组织中的m RNA表达水平 |
| 3.1.2 q RT-PCR检测AOC1 在人临床胃癌组织样本中的m RNA表达水平 |
| 3.1.3 Western blot检测AOC1 在人临床胃癌组织样本中的蛋白表达水平 |
| 3.2 AOC1 表达下调对胃癌细胞恶性增殖和侵袭的影响 |
| 3.2.1 敲低AOC1 在胃癌细胞系AGS和 MKN45 中的表达水平 |
| 3.2.2 AOC1 表达下调抑制了AGS和 MKN45 细胞的增殖和生长 |
| 3.2.3 AOC1 表达下调诱导了AGS和 MKN45 细胞的凋亡 |
| 3.2.4 AOC1 调控凋亡相关蛋白表达 |
| 3.2.5 AOC1 表达下调抑制了AGS和 MKN45 细胞的迁移和侵袭 |
| 3.2.6 AOC1 表达下调抑制了AGS和 MKN45 细胞的EMT过程 |
| 3.3 AOC1 过表达对胃癌细胞恶性增殖和侵袭的影响 |
| 3.3.1 AOC1 在胃癌细胞系AGS中过表达 |
| 3.3.2 AOC1 过表达促进了AGS细胞的增殖和生长 |
| 3.3.3 AOC1 过表达抑制了AGS细胞的凋亡 |
| 3.3.4 AOC1 过表达促进了AGS细胞的迁移和侵袭 |
| 3.4 AOC1 通过激活AKT信号通路,调控胃癌细胞行为 |
| 3.4.1 AOC1 激活AKT信号通路 |
| 3.4.2 AOC1 通过激活AKT信号通路参与对胃癌细胞生物学功能的调节 |
| 3.5 AOC1 过表达胃癌细胞的高通量转录组测序 |
| 3.5.1 测序数据统计 |
| 3.5.2 参考基因组比对分析 |
| 3.5.3 表达水平分析 |
| 3.5.4 差异表达分析 |
| 3.5.5 SNP检测 |
| 第4章 讨论 |
| 4.1 AOC1 表达以及作为疾病生物标志物的潜力 |
| 4.2 AOC1 是否仅作为二胺氧化酶参与胃癌细胞生物学功能的调控 |
| 4.3 AOC1 参与胃癌细胞生物学功能调控的分子机制 |
| 4.4 AOC1 的表达调控 |
| 第5章 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读博士学位期间的研究成果 |
| 综述 AOC1与含铜胺氧化酶 |
| 参考文献 |
（10）表观遗传生物标志物的超灵敏检测方法研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 表观遗传概述 |
| 1.2 表观遗传生物标志物 |
| 1.2.1 DNA甲基化 |
| 1.2.2 DNA羟甲基化 |
| 1.2.3 非编码RNA(ncRNA) |
| 1.2.4 RNA甲基化 |
| 1.2.5 组蛋白修饰 |
| 1.3 表观遗传生物标志物研究意义 |
| 1.4 表观遗传生物标志物检测方法 |
| 1.4.1 传统检测方法 |
| 1.4.2 新型检测方法 |
| 1.5 本论文解决的科学问题和研究内容 |
| 1.5.1 解决的科学问题 |
| 1.5.2 研究内容 |
| 第二章 基于单个量子点的纳米传感器实现超灵敏检测5-甲基化胞嘧啶 |
| 2.1 介绍 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 试剂和材料 |
| 2.2.2 亚硫酸氢盐处理DNA |
| 2.2.3 三环LCR扩增 |
| 2.2.4 ExoⅠ和ExoⅢ处理 |
| 2.2.5 凝胶电泳 |
| 2.2.6 杂交反应 |
| 2.2.7 稳态荧光测量 |
| 2.2.8 基于全内反射荧光(TIRF)的单分子检测 |
| 2.2.9 细胞培养和基因组DNA的提取 |
| 2.3 结果和讨论 |
| 2.3.1 检测DNA甲基化的原理 |
| 2.3.2 方案原理的可行性验证 |
| 2.3.3 反应条件的优化 |
| 2.3.4 单分子展示图 |
| 2.3.5 灵敏度分析 |
| 2.3.6 混合物中DNA甲基化水平的检测 |
| 2.3.7 细胞DNA甲基化水平的检测 |
| 2.4 结论 |
| 第三章 连接介导的滚环扩增技术选择性检测DNA 5-羟甲基胞嘧啶 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 试剂和仪器 |
| 3.2.2 连接介导的RCA |
| 3.2.3 荧光光谱测定和凝胶电泳分析 |
| 3.2.4 对血清样本中5hmC-DNA的检测 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 选择性检测5hmC的原理 |
| 3.3.2 方案原理的可行性验证 |
| 3.3.3 反应条件的优化 |
| 3.3.4 灵敏度分析 |
| 3.3.5 检测有两个5hmC位点的5hmC-DNA-2 |
| 3.3.6 选择性分析 |
| 3.3.7 实际样品中回收率检测 |
| 3.4 结论 |
| 第四章 点击化学介导的单个量子点纳米传感器精确检测组织中的micro RNA |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 试剂和仪器 |
| 4.2.2 无酶无铜点击化学介导的三环LCR |
| 4.2.3 荧光光谱测定和凝胶电泳分析 |
| 4.2.4 实际样本中mi RNA-155 的检测 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 检测miRNA的原理 |
| 4.3.2 凝胶电泳和荧光测定验证 |
| 4.3.3 反应条件的优化 |
| 4.3.4 灵敏度分析 |
| 4.3.5 特异性分析 |
| 4.3.6 实际样品中miRNA-155的分析 |
| 4.4 结论 |
| 第五章 基于毒素蛋白和末端脱氧核苷酸转移酶介导的扩增超灵敏检测N~6-甲基腺苷修饰 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验部分 |
| 5.2.1 试剂和仪器 |
| 5.2.2 MazF介导的切割反应和杂交反应 |
| 5.2.3 杂交产物与链霉亲和素包裹的MB的结合 |
| 5.2.4 TdT介导的延伸反应和Exo I辅助的探针消化反应 |
| 5.2.5 荧光光谱的测量 |
| 5.2.6 单分子检测和数据分析 |
| 5.2.7 凝胶电泳 |
| 5.2.8 混合物中的m~6A-mRNA甲基化水平检测 |
| 5.2.9 序列的特异性检测 |
| 5.2.10 FTO去甲基化能力的检测 |
| 5.2.11 在血清样本中检测m~6A-mRNA |
| 5.2.12 细胞培养和mRNA的提取 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 检测m~6A-mRNA的原理 |
| 5.3.2 方案原理的可行性验证 |
| 5.3.3 反应条件的优化 |
| 5.3.4 灵敏度分析 |
| 5.3.5 序列的特异性分析 |
| 5.3.6 甲基化水平分析 |
| 5.3.7 去甲基化能力的分析检测 |
| 5.3.8 实际样品的分析检测 |
| 5.4 结论 |
| 第六章 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间的科研成果 |
| 一、已发表学术论文14篇 |
| 二、申请发明专利5项 |
| 三、参与基金3项 |
| 四、获国家级、省级、校级奖项 21项 |
| 致谢 |
四、人类癌细胞转化实验成功（论文参考文献）
- [1]鸡贫血病毒VP3基因对乳腺癌干细胞的作用研究[D]. 李文杰. 广西大学, 2021(01)
- [2]EZH2表达调控对胃癌生长及化疗敏感性的影响[D]. 杨宝玉. 福建医科大学, 2021(02)
- [3]基于深度学习的抗肿瘤药物作用机制研究[D]. 李叙潼. 中国科学院大学(中国科学院上海药物研究所), 2021(08)
- [4]STING对宫颈癌增殖、迁移和侵袭能力的作用及机制的研究[D]. 杜华珊. 吉林大学, 2021(01)
- [5]南蛇藤提取物通过miR-144/451靶向mTOR抑制胃癌EMT的作用及机制[D]. 李雅娟. 扬州大学, 2021
- [6]盐霉素对耐顺铂人胃癌细胞增敏作用及其机制研究[D]. 韩笑. 延安大学, 2021(09)
- [7]基于蛋白质组学对WNT5A和WNT11在癌症细胞中介导的信号通路的分析[D]. 徐彩霞. 河北大学, 2021(11)
- [8]芪术抗癌方对肝细胞癌干性标志物影响的研究[D]. 孙新锋. 广州中医药大学, 2021(02)
- [9]含铜胺氧化酶1（AOC1）在胃癌进展中的作用及分子机制研究[D]. 徐芬. 南昌大学, 2021(01)
- [10]表观遗传生物标志物的超灵敏检测方法研究[D]. 王子月. 山东师范大学, 2021(12)