一、异氟醚对人肺泡巨噬细胞趋化因子和细胞因子mRNA表达的影响（论文文献综述）
蔡甜甜[1]（2021）在《健脾益肺Ⅱ号治疗慢阻肺临床疗效及减轻香烟暴露联合流感病毒感染小鼠肺炎症作用研究》文中研究表明目的:1.通过一项探索性临床研究,采用随机、双盲安慰剂对照临床试验方法,观察健脾益肺Ⅱ号方中医药早期干预治疗COPD的有效性和安全性,探讨中医药早期干预能否延缓COPD病情进展,避免或减少急性加重的发生,为中医药防治COPD提供循证医学依据,为进一步研发针对COPD的中药新药提供临床研究基础。2.通过观察香烟暴露对呼吸道病毒感染后小鼠宿主免疫应答的影响,以及呼吸道病毒感染在诱发COPD急性加重过程中的免疫病理改变,建立符合慢阻肺急性加重的急性气道炎症模型,为后续中药减少病毒感染诱发慢阻肺急性加重的药理学研究提供实用性工具。3.利用熏烟联合流感病毒感染的小鼠动物模型,以健脾益肺Ⅱ号减少急性加重为出发点,探讨健脾益肺Ⅱ号减少熏烟联合流感病毒感染小鼠肺部炎症的主要环节和作用机制,探讨中医培土生金法的现代科学内涵,为研发针对预防COPD急性加重的药物提供研究基础。方法:1.随机对照探索性临床试验:健脾益肺Ⅱ号治疗COPD稳定期Ⅰ-Ⅱ级探索性临床研究探索性临床研究,采用随机双盲安慰剂平行对照研究方法,纳入符合COPD稳定期Ⅰ-Ⅱ级患者,采用健脾益肺Ⅱ号与健脾益肺Ⅱ号安慰剂进行疗效比较,随机分为治疗组和安慰剂组,治疗组给予健脾益肺Ⅱ号方颗粒剂,每日1剂,分成2袋,每次1袋,1天2次;安慰剂组给予健脾益肺Ⅱ号方安慰颗粒剂,每日1剂,分成2袋,每次1袋,1天2次。筛查期2周,治疗12周,随访12周。记录并测定两组患者治疗前后组间急性加重频次以及急性加重发生率,并且评估组间治疗前后肺功能、SGRQ、CAT量表、mMRC评分、BODE指数改变情况,探索健脾益肺Ⅱ号方干预治疗COPD的疗效并观察药物使用的安全性,探讨中医药干预能否延缓COPD病情进展,避免或减少急性加重的发生,为中医药防治慢阻肺提供循证医学依据。2.基础研究:健脾益肺Ⅱ号方减轻香烟暴露联合病毒感染小鼠肺部炎症的主要环节和作用机制（1）香烟暴露对低剂量流感病毒诱导的气道免疫细胞的影响选取SPF级雌性Balb/c小鼠,随机分成4组:假熏烟假攻毒组,熏烟假攻毒组,假熏烟攻毒组,熏烟联合攻毒组。第1-4天对小鼠进行熏烟处理,3次/天,每次3支香烟,烟雾用60ml注射器注入熏烟箱中。于9am,12am,3pm进行,每次1h;第5天进行攻毒,用1ml注射器共抽取2ml异氟烷均匀洒在麻醉瓶中,随后将小鼠置于麻醉瓶中旋紧瓶盖,待小鼠出现深快呼吸后取出,迅速向小鼠鼻内滴注PR8病毒30ul/只。假熏烟小鼠放入另一干净且相同大小的塑料箱内,不做熏烟处理;假攻毒组鼻内滴注MEM培养基30ul/只,其余操作同上,分别观察攻毒后5天小鼠变化。第10天取材留取小鼠支气管肺泡灌洗液,检测细胞计数和细胞分类计数:留取小鼠肺组织用实时定量PCR法检测小鼠肺组织细胞因子、趋化因子、金属蛋白酶、病毒复制水平及干扰素mRNA表达水平。（2）健脾益肺Ⅱ号方对香烟暴露、低剂量流感病毒感染及二者联合诱导的气道免疫细胞的影响选取SPF级雌性Balb/c小鼠,随机分成8组:分别为假熏烟假攻毒组;假熏烟假攻毒+JPYFⅡ治疗组;假熏烟攻毒组;假熏烟攻毒+JPYFⅡ治疗组;熏烟假攻毒组;熏烟假攻毒+JPYFⅡ治疗组;熏烟联合攻毒组;熏烟联合攻毒+JPYFⅡ治疗组,每组10只。熏烟、攻毒方法同上。药物干预组,造模方法同熏烟联合攻毒组,从第1天开始进行药物干预,连续给药10天。第10天部分进行小鼠肺功能检测;其余小鼠取材,留取小鼠支气管肺泡灌洗液,用于检测细胞计数和细胞分类计数;留取小鼠肺组织实时定量PCR法检测各组肺组织细胞因子、趋化因子以及金属蛋白酶、病毒NP以及干扰素mRNA表达情况;化学发光法检测各组小鼠支气管肺泡灌洗液ROS的产生,Western Blot法检测各组小鼠肺组织gp91和HO-1的蛋白表达;病毒空斑实验观察健脾益肺Ⅱ号方对小鼠病毒载量的影响;以及观察健脾益肺Ⅱ号方对小鼠肺功能的影响。（3）熏烟期间给药对熏烟联合低剂量流感病毒感染小鼠持续预防作用的研究选取SPF级雌性Balb/c小鼠60只,随机分成6组:分别为假熏烟假攻毒组;熏烟联合攻毒（3天）组;熏烟联合攻毒（3天）+PYFⅡ治疗组;假熏烟假攻毒组;熏烟联合攻毒（5天）组;熏烟联合攻毒（5天）+JPYFⅡ治疗组;每组10只。熏烟联合攻毒组第1-4天进行熏烟处理,第5天进行攻毒,分别观察攻毒后3天和5天小鼠情况。熏烟联合攻毒+JPYFⅡ治疗组,造模方法同前,从第1天开始进行药物干预,连续给药5天。假熏烟假攻毒组,标准饲养8、10天,不做任何干预。留取小鼠支气管肺泡灌洗液,用于检测细胞计数和细胞分类计数;Real-time PCR法检测肺组织中细胞因子、病毒复制水平,观察健脾益肺Ⅱ号方对熏烟联合病毒感染小鼠持续预防作用。结果:1.临床研究:本次探索性临床试验共入组慢阻肺患者62例,纳入全分析集患者共62例,治疗组和安慰剂组各31例,其中安慰剂组脱落2例。对比治疗组和安慰剂组两组患者性别、年龄,体重指数,两组患者慢阻肺严重程度,包括两组患者基线时CAT、SGRQ、mMRC、BODE指数、6WMT;以及慢阻肺基线肺功能情况,包括舒张前后FEV1、FVC的情况。经过治疗组和安慰剂组的基线情况比较,两组间各指标差异均无统计学意义,具有可比性（P>0.05）。治疗组较安慰剂组可显着性降低患者CAT评分（P<0.05）、SGRQ评分（P<0.05）、mMRC评分（P<0.05）,减少慢阻肺急性加重发生频次（P<0.05）,一定程度降低急性加重发生率（P>0.05）;治疗组对运动耐力具有一定程度的改善作用,但治疗后在BODE指数改善与安慰剂比较无显着性差异（P>0.05）。对于肺功能改善方面,与安慰剂相比,健脾益肺Ⅱ号颗粒剂对于舒张后FVC和舒张后FEV1/FVC具有改善趋势,但组间差异无统计学意义（P>0.05）。治疗组和安慰剂组都有不良事件发生,但两组患者不良事件发生率均较低,且与用药无因果关系。2.基础研究:（1）香烟暴露对低剂量流感病毒诱导的气道免疫细胞的影响①熏烟、病毒感染及熏烟联合流感病毒感染对小鼠支气管肺泡灌洗液中细胞计数的影响攻毒5天后,与假熏烟假攻毒组相比,熏烟假攻毒组、假熏烟攻毒组小鼠支气管肺泡灌洗液细胞总数、巨噬细胞均显着性增多（P<0.05）;熏烟联合攻毒组小鼠细胞总数、中性粒细胞数较假熏烟假攻毒与熏烟假攻毒组显着性升高（P<0.05）;熏烟联合攻毒组小鼠支气管肺泡灌洗液细胞总数、巨噬细胞数较假熏烟假攻毒组与假熏烟攻毒组显着性增多（P<0.05）。②熏烟、病毒感染及熏烟联合流感病毒感染对小鼠肺组织中炎症因子、趋化因子、金属蛋白酶及对支气管肺泡灌洗液ROS产生的影响与假熏烟假攻毒组相比,假熏烟攻毒组小鼠肺组织中IL-6表达水平显着性升高（P<0.01）;与熏烟假攻毒组相比,假熏烟攻毒组小鼠肺组织IL-6、MMP12表达显着性增多（P<0.05）;与熏烟假攻毒组、假熏烟攻毒组相相比,熏烟攻毒组小鼠肺组织MMP12表达水平显着性升高（P<0.01）。假熏烟攻毒组、熏烟攻毒组小鼠支气管肺泡灌洗液R0S产生速率较假熏烟假攻毒与熏烟假攻毒组显着性升高（P<0.05）;与假熏烟攻毒组相比,熏烟联合攻毒组小鼠支气管肺泡灌洗液R0S产生速率显着性升高（P<0.05）。熏烟攻毒小鼠肺组织CXCL1、CXCL5、CCL2表达水平较假熏烟假攻毒与熏烟假攻毒组显着性升高（P<0.05）;与假熏烟攻毒组相比,熏烟攻毒组小鼠肺组织CXCL5表达水平显着性升高（P<0.01）。③熏烟、病毒感染及熏烟联合流感病毒感染对小鼠肺组织肺部病毒复制水平及干扰素表达的影响与熏烟假攻毒组相比,假熏烟假攻毒组、假熏烟攻毒组、熏烟联合攻毒组小鼠肺组织IFN α、IFN β表达水平有显着性升高（P<0.05）。熏烟联合攻毒组小鼠肺组织Influenza matrix、NP表达水平较假熏烟假攻毒与熏烟假攻毒组均显着性升高（P<0.05）。（2）健脾益肺Ⅱ号方对香烟暴露、低剂量流感病毒感染及二者联合诱导的气道免疫细胞的影响①健脾益肺Ⅱ号可减轻熏烟联合流感病毒诱导的气道炎性细胞浸润与熏烟联合攻毒组相比,健脾益肺Ⅱ号可显着性减少小鼠细胞总数、中性粒细胞数（P<0.01）。②健脾益肺Ⅱ号可降低香烟暴露、低剂量流感病毒感染及二者联合诱导的肺组织炎症因子、趋化因子及金属蛋白酶表达与熏烟攻毒组相比,健脾益肺Ⅱ号可显着性降低小鼠肺组织IL-6、CXCL1、CXCL2表达水平（P<0.05）,也可降低小鼠肺组织CXCL5、CCL2表达,但无统计学差异（P>0.05）。③健脾益肺Ⅱ号方可减轻香烟暴露、低剂量流感病毒感染及二者联合诱导的肺部氧化应激攻毒5天后,与熏烟联合攻毒组相比,健脾益肺Ⅱ号可显着降低小鼠支气管肺泡灌洗液中ROS表达水平,可显着性降低熏烟联合攻毒小鼠肺组织HO-1、gp91的表达水平（P<0.05）。④健脾益肺Ⅱ号可减少香烟暴露、流感病毒感染及二者联合小鼠肺部病毒复制水平及干扰素表达病毒空斑实验发现,与熏烟联合攻毒组相比,健脾益肺Ⅱ号可显着性降低熏烟联合攻毒小鼠病毒载量（P<0.05）。与熏烟联合攻毒组相比,健脾益肺Ⅱ号可显着性降低小鼠肺组织NP表达水平（P<0.01）。⑤健脾益肺Ⅱ号方增加香烟联合流感病毒感染小鼠吸气量（IC）和用力肺活量（VC）小鼠肺功能实验发现,与假熏烟假攻毒组相比,熏烟联合攻毒组小鼠功能残气量FRC有显着性升高（P<0.01）;与熏烟联合攻毒组相比,健脾益肺Ⅱ号可显着性升高小鼠IC深吸气量、VC肺活量（P<0.05）。（3）熏烟期间给药对熏烟联合低剂量流感病毒感染小鼠持续预防作用的研究①健脾益肺Ⅱ号对熏烟联合病毒感染小鼠支气管肺泡灌洗液细胞总数持续作用的影响健脾益肺Ⅱ号未能降低熏烟联合攻毒小鼠支气管肺泡灌洗液细胞总数,与之前结果相反,健脾益肺Ⅱ号增加了攻毒后第5天细胞总数的数量。②健脾益肺Ⅱ号对熏烟联合病毒感染小鼠肺组织炎症因子、Influenza matrix持续作用的影响与熏烟联合攻毒组相比,感染前给予健脾益肺Ⅱ号未能改善感染后第3天和第5天免疫细胞浸润与炎症因子的表达。与之前结果相反,健脾益肺Ⅱ号增加了攻毒后第5天小鼠肺组织IL-1 β和IL-6的表达水平。结论:1.本研究为一项随机、双盲安慰剂对照的探索性临床研究,通过观察健脾益肺Ⅱ号对急性加重发生的影响,发现健脾益肺Ⅱ号颗粒剂可减少患者急性加重的频次,提高早期慢阻肺患者生活质量、改善临床症状,疗效优于安慰剂,且具有良好的安全性。早期对COPD患者进行干预,特别是稳定期有效干预,将改善患者生存质量,是减少COPD急性加重的重要手段,对于延缓疾病进展以及减轻患者经济负担具有重要的意义。本研究证实健脾益肺Ⅱ号可减少慢性肺病人急性加重,基于这一发现我们对健脾益肺Ⅱ号在减少慢阻肺急性加重发生方面的潜在作用机制将进行深入探讨。2.香烟暴露联合低剂量流感病毒感染会增加小鼠支气管肺泡灌洗液炎症细胞数量,尤其是诱导小鼠气道以巨噬细胞和中性粒细胞增多为主的气道炎症,伴随急性炎症因子升高,过氧化物的增多和金属蛋白酶表达升高,且气道炎症浸润、氧化应激、金属蛋白酶以及肺部病毒载量水平明显高于单纯熏烟或单纯病毒感染小鼠。本研究一方面明确了香烟烟雾暴露和流感病毒感染是小鼠发生气道炎症重要的致病因素,初步探讨了香烟暴露对病毒诱导气道炎症的影响;另一方面通过熏烟联合病毒感染,成功建立了慢阻肺气道炎症模型,为后续中药减少病毒感染诱发慢阻肺急性加重的药理学研究提供实用性工具。3.健脾益肺Ⅱ号方减少了熏烟联合病毒感染小鼠气道炎症细胞的浸润,尤其中性粒细胞下调明显,并可抑制熏烟联合病毒感染小鼠促炎细胞因子、趋化因子的表达,减少了肺组织免疫细胞的募集,对氧化应激起到了抑制作用,并可减少流感病毒的复制。表明健脾益肺Ⅱ号方对熏烟联合病毒感染小鼠肺部炎症、氧化应激具有抑制作用,可能与健脾益肺Ⅱ号方的抗病毒作用密切相关。从而可保护小鼠肺组织免受病毒感染所引起的炎症攻击,可能具有治疗流感病毒诱发慢性阻塞性肺疾病急性加重的作用。4.健脾益肺Ⅱ号方未能在熏烟阶段通过改善肺部损伤及炎症状态,从而减少病毒诱导的急性炎症;健脾益肺Ⅱ号方减少流感病毒诱导的熏烟小鼠气道炎症和氧化应激的主要环节可能在于流感病毒感染阶段;此外单纯的抗病毒作用,可能不足以改善病毒诱导的熏烟小鼠肺组织急性炎症。
王明哲[2]（2021）在《固本止咳中药对COPD模型小鼠呼吸道损伤修复的调控机制研究》文中进行了进一步梳理背景:慢性阻塞性肺疾病（Chronic Obstructive Pulmonary Disease,COPD）是一种以持续呼吸道症状和气流受限为特征的疾病,通常是由于明显暴露于有毒颗粒或气体引起的气道和/或肺泡异常所致,其发病机制目前尚未完全阐明,临床疗效欠佳。目前对于COPD的治疗主要以对症治疗为主,治疗效果不理想且需要终身控制疾病的发展。中医以整体观念、辨证施治为纲,可以通过“扶正”、“固卫”起到未病先防,已病防变的作用,从而更好的预防和控制COPD的发生与发展。“固本止咳中药”源于国医大师、中医内科呼吸病专家晁恩祥教授多年诊治COPD的临床经验。晁恩祥教授十分重视人体正气在疾病发病和病情进展中的地位和作用,强调“正气存内,邪不可干”,提出“扶正固卫”理论,因而以经典方剂“玉屏风散”为基础,加减化裁创制固本止咳中药。前期临床研究表明,固本止咳中药在改善患者肺功能等方面有较好效果,并可通过调控T细胞亚群发挥调节人体免疫功能的作用。大量的前期动物实验表明,固本止咳中药可改善COPD模型小鼠肺功能情况、呼吸道病理损伤及炎性因子的过度表达、并降低肺组织αβT细胞/γδT细胞比例、增加肺组织中KGF,KGFR蛋白和基因表达含量等。因此,进一步开展固本止咳中药治疗COPD模型小鼠的疗效及作用机制研究具有一定的意义。目的:损伤修复是在各类细胞生长因子共同作用下的协调有序过程,分为炎症反应、细胞增殖、基质沉积及组织重塑四个时期。呼吸道损伤修复是COPD的主要发病机制之一,贯穿了慢阻肺疾病的全程。本研究从呼吸道的黏膜炎症损伤修复、呼吸道结构损伤修复及异常的呼吸道损伤修复这三个方面入手,研究固本止咳中药对于COPD呼吸道损伤修复的调控作用,从而更好的阐释中医“扶正固卫”、“肺主皮毛”的理论。方法:本研究将100只健康ICR小鼠按体重随机分为空白组（n=30）、模型COPD组（n=35）和固本止咳中药组（n=35）。除正常对照组以外,其余各组均被制成COPD模型。本研究采用被动吸烟加鼻腔滴入LPS的方法进行COPD小鼠造模。治疗组于第61天开始予固本止咳中药灌胃,空白对照组和模型对照组使用蒸馏水以同样方法灌胃,共28天。第一部分:体重监测和肺功能检测明确COPD模型小鼠的模型制备情况和固本止咳中药的药效。在固本止咳中药对COPD模型小鼠的呼吸道黏膜炎性损伤修复的调控作用研究方面,本研究首先通过抗体芯片法对小鼠呼吸道40种炎性因子进行系统检测,并采用免疫组化法对抗体芯片结果中COPD组明显变化和固本止咳中药组发挥明显调控作用的炎性因子进行验证。在固本止咳中药对COPD模型小鼠呼吸道结构损伤修复的调控以及对异常的损伤修复的作用研究方面,本研究通过病理学评判、免疫组化法和透射电镜进行检测,以判断香烟烟雾暴露+LPS滴鼻对小鼠呼吸道结构、肺泡结构、细胞外基质和Ⅱ型上皮细胞的结构损伤情况以及固本止咳中药对COPD模型对相应结构损伤修复及异常的损伤修复的调控情况。第二部分:基于质谱技术,对固本止咳中药的成分分析研究,从固本止咳中药的化学成分入手,探讨其发挥损伤修复作用机制的原理。此外,本研究对各组小鼠肺组织进行label-free蛋白组学检测,明确固本止咳中药治疗COPD模型小鼠的靶点及通路。阐释其对于COPD模型小鼠呼吸道损伤修复多成分-多靶点-多通路整体调控的机制。第三部分:基于western-blot和RT-qPCR技术,对第一部分和第二部分结果富集出现的JAK-STAT信号通路进行验证研究,对通路中JAK1,p-JAK1,STAT3,p-STAT3和SOCS3的蛋白表达水平以及JAK1 mRNA,JAK2mRNA,JAK3mRNA,STAT1 mRNA,STAT3 mRNA,SOCS3mRNA的表达水平进行测定。结果:1)体重监测:固本止咳中药可改善COPD模型小鼠体重增长缓慢的情况。2)肺功能检测:COPD 组较空白组 FEV 0.05,FEV0.1,FEV0.2,PEF,Crs,Cst均明显下降（P<0.01）;Rrs,Ers,Rn均明显升高（P<0.01）;G,H均无统计学差异（P>0.05）。固本止咳中药组较COPD组FEV0.05,FEV0.1,FEV0.2,Crs均明显升高（P<0.05）;Rrs,Ers,Rn均明显下降（P<0.05）;PEF,G,H,Cst均无统计学差异（P>0.05）。3)病理形态学:HE染色结果表明,COPD组小鼠病理形态符合COPD的特征,固本止咳中药可改善COPD模型小鼠50-100μm直径气道、呼吸性细支气管和肺泡的病理形态。透射电镜结果表明,COPD组小鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞板层小体出现空泡化,线粒体肿胀,嵴断裂或消失。固本止咳中药组小鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞部分板层小体出现空泡化,线粒体肿胀,但程度与COPD组相比明显减轻。4)抗体芯片检测:在40个炎性因子中,COPD组与空白组相比,共有8个显着升高的炎性因子,分别为 IL-6,GM-CSF,TNF-α,IFN-γ,IL-1β,IL-3,IL-17 和 IL-12p70（P<0.05）;固本止咳中药组与COPD组相比,共有7个显着降低的因子,分别为IL-6,GM-CSF,TNF-α,IFN-γ,IL-1β,IL-3 和 TCA-3（P<0.05）。5)免疫组化检测:与空白组相比,COPD组IL-6,GM-CSF,TNF-α,IFN-γ,α-SMA,MMP-9,TIMP-1,MMP-9/TIMP-1,HIF-1α 在肺组织中的表达均明显升高（P<0.05）。与 COPD 组相比,固本止咳中药组 IL-6,GM-CSF,TNF-α,IFN-γ,α-SMA,MMP-9,TIMP-1,MMP-9/TIMP-1,HIF-1α在肺组织中的表达均明显下降（P<0.05）。空白组和COPD组,固本止咳中药组与COPD组之间Collegen 1均无统计学差异（P>0.05）。6)中药成分分析:共鉴定出固本止咳中药的41个成分,其中的多种成分被证明可通过抗炎、抗氧化、抑制气道重塑等参与呼吸道损伤修复的调控。7)label-free蛋白组学检测:在COPD组和空白组之间共发现287个差异蛋白,固本止咳中药组和COPD组之间共发现184个差异蛋白。通过对差异蛋白的GO富集分析、KEGG富集分析和REACTOME富集分析发现:固本止咳中药可通过中性粒细胞脱颗粒、补体通路、细胞外基质、JAK-STAT信号通路等多个途径以及多个参与COPD进展的生物标志物,从整体上参与COPD呼吸道损伤修复的调控。8)JAK-STAT信号通路的实验:本研究通过RT-PCR法对各组小鼠肺组织JAK1,JAK2,JAK3,STAT1,STAT3和SOCS3进行了测定,结果表明:与空白组相比,COPD模型小鼠肺组织中 JAK1 mRNA,JAK2 mRNA,JAK3 mRNA,STAT3 mRNA 和 SOCS3 mRNA表达均明显升高（P<0.05）,STAT1 mRNA两组间无统计学差异（P>0.05）。与COPD组相比,固本止咳中药组小鼠肺组织中JAK1 mRNA,STAT3 mRNA表达明显下降（P<0.05）,且 SOCS3 mRNA 表达明显升高（P<0.05）,JAK2mRNA,JAK3 mRNA,STAT1 mRNA与COPD组相比均无统计学差异（P>0.05）。本研究采用western-blot法对各组小鼠肺组织JAK1,p-JAK1,STAT3,p-STAT3,SOCS3进行测定。与空白组相比,COPD 模型小鼠肺组织中 p-JAK1,p-STAT3,p-JAK1/JAK1,p-STAT3/STAT3 明显升高（P<0.05）;JAK1,STAT3,SOCS3与空白组相比均无统计学差异（P>0.05）。与COPD组相比,固本止咳中药组小鼠肺组织中p-JAK1,p-STAT3,p-STAT3/STAT3明显降低（P<0.05）,SOCS3 明显升高（P<0.05）;JAK1,STAT3,P-JAK1/JAK1 与 COPD组相比均无统计学差异（P>0.05）。结论:1)固本止咳中药可通过减少COPD模型小鼠肺组织炎性因子的过度表达,发挥调控呼吸道黏膜炎症损伤修复的作用;并通过改善COPD模型小鼠呼吸道结构、肺泡Ⅱ型上皮细胞超微结构以及细胞外基质的损伤,发挥调控呼吸道结构损伤修复和减少异常的呼吸道损伤修复的作用。体现了中医扶正固卫,肺主皮毛的理论。2)固本止咳中药在COPD损伤修复机制的整体调控中具有多成分-多靶点-多通路的特点,体现了中医整体观念的特点。3)固本止咳中药可通过下调JAK1和STAT3的磷酸化水平,上调SOCS3的表达从而抑制JAK-STAT信号通路。是固本止咳中药基于扶正固卫、肺主皮毛理论调控呼吸道损伤修复在机制上的具体体现。
夏良君[3]（2021）在《脂肪间充质干细胞外泌体改善小鼠急性肺损伤的作用机制研究》文中进行了进一步梳理背景:急性肺损伤（Acutelunginjury,ALI）是一种以严重的低氧血症,气道功能障碍和肺部不受控制的炎症为表现的急性临床综合征。越来越多的研究发现巨噬细胞的激活和M1表型的转化在肺部炎症的发展中起着重要的作用。线粒体作为一种与能量代谢密切相关的细胞器,无论是细胞的存活还是凋亡均与其功能密切相关。有研究认为,用脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）和IFN-γ刺激巨噬细胞时,巨噬细胞线粒体会发生明显的代谢重编程,这种代谢重编程对于巨噬细胞介导的免疫功能至关重要。基于间充质干细胞（Mesenchymal stem cells,MSCs）的细胞疗法逐渐成为治疗ALI有希望的候选者,MSCs在调控巨噬细胞炎症反应的同时,巨噬细胞也可以调节干细胞的自我更新,并动员干细胞向炎症部位募集,进而提高MSCs的炎症负调控作用。最近的研究表明,在各种疾病模型中,MSCs和MSCs衍生的外泌体都有减轻肺损伤和炎症的潜力。外泌体可以通过旁分泌机制与其他细胞相互作用,介导细胞间的调控基因进行通信,或者通过细胞间相互作用而被内在化,并通过配体-受体途径导致生物学反应。与干细胞移植相比,外泌体具有更稳定和可储存,没有非整倍性的风险以及免疫排斥可能性更低的优势,已具有构成安全、有效的无细胞治疗的潜力。有多项研究集中于MSCs的外泌体对免疫细胞的作用,包括巨噬细胞,T淋巴细胞,树突状细胞和自然杀伤细胞等;但是,关于脂肪来源的MSCs（Adipose Mesenchymal Stem Cells,AdMSCs）外泌体与巨噬细胞之间的串扰却知之甚少,两者的相互作用机制值得我们进一步去探索。目的:验证脂肪间充质干细胞来源的外泌体对急性肺损伤的治疗作用,探讨外泌体通过调控巨噬细胞线粒体代谢,提高巨噬细胞抑炎作用的效应分子机制,为外泌体治疗免疫炎症疾病提供可靠科学证据,以期为外泌体治疗免疫相关炎症疾病找寻新的研究思路和方案。方法:1)从人体脂肪组织中分离扩增AdMSCs,并采用差速离心法从细胞培养上清中收集AdMSC-exos。30只健康清洁级成年雄性C57BL/6小鼠随机分成三组:正常对照组（Ctrl组）、模型对照组（PBS组）、AdMSC-exos移植组。除Ctrl组外,其余两组通过气管内滴注LPS溶液诱导小鼠肺损伤急症模型,造模后4小时分别通过尾静脉移植PBS或AdMSC-exos。造模24小时后,获取肺脏组织行H&E染色,通过流式细胞术检测肺泡灌洗液中炎症细胞分类,ELISA和qPCR观察小鼠支气管肺泡灌洗液（Bronchoalveolar lavage fluid,BALF）及肺组织中IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-10等炎症因子表达水平。同时利用MH-S（肺泡巨噬细胞细胞系）细胞开展体外实验,qPCR观察AdMSC-exos对LPS刺激后MH-S细胞中IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-10等炎症因子表达水平及巨噬细胞极化的影响;Western blot检测LPS刺激后在AdMSC-exos作用下MH-S细胞中NF-κB、MAPKs等炎症激活相关信号通路的变化。2)利用MH-S细胞开展体外实验,将AdMSC-exos预先加在培养MH-S细胞的培养上清中,半小时后加入LPS诱导MH-S炎症反应,观察AdMSC-exos对LPS刺激后的MH-S细胞线粒体功能的影响。通过透射电子显微镜观察MH-S细胞线粒体超微结构的变化。检测AdMSC-exos对MH-S增殖、凋亡的影响,以及细胞线粒体中mtDNA拷贝数、ATP含量、细胞ROS产量以及线粒体功能的影响,使用海马细胞能量/生物能量代谢实时测定仪（Seahorse XF Extracellular Flux Analyzers）分析细胞的耗氧量以及胞外产酸率。同时开展体内实验,首先将30只雄性C57BL/6小鼠随机分成三组:正常对照组（Ctrl组）、模型对照组（PBS组）、AdMSC-exos移植组。除Ctrl组外,其余两组通过气管内滴注LPS溶液诱导小鼠肺损伤急症模型,造模后4小时分别通过尾静脉注射PBS和AdMSC-exos。造模24小时后,使用共聚焦显微镜观察荧光标记的AdMSC-exos在小鼠肺部的分布情况,通过肺泡灌洗获得肺泡内的免疫细胞,将它们贴壁培养2小时后获得小鼠原代肺泡巨噬细胞（Alveolar macrophages,A:Ms）,进一步检测各组小鼠AMs中mtDNA拷贝数、ATP含量,通过流式细胞术检测AMs中细胞ROS产量、功能线粒体受损数量。再利用氯磷酸脂质体清除肺泡巨噬细胞,观察AdMSC-exos对肺泡巨噬细胞耗竭后小鼠的肺部保护作用。通过过继转移AdMSC-exos处理后的骨髓来源巨噬细胞（Bone marrow-derived macrophages,BMDM）,进一步观察外泌体对巨噬细胞线粒体代谢的影响。3)通过qPCR和Western blot检测外泌体中线粒体呼吸链复合物的表达。使用全能核酸酶降解AdMSC-exos 中的核酸成分,观察降解后的 AdMSC-exos 对 MH-S 炎症反应的抑制作用。通过 Western blot观察AdMSC-exos对小鼠肺泡巨噬细胞线粒体生物合成和转运的影响。体外实验中,将AdMSC-exos预先加在培养MH-S细胞的培养上清中,半小时后加入LPS诱导MH-S炎症反应,通过qPCR和western blot观察AdMSC-exos对LPS刺激后的MH-S细胞线粒体呼吸链复合物的影响。4)观察姜黄素预处理24小时后对AdMSCs及其衍生的外泌体的影响。使用CCK8法检测AdMSCs的活力,流式细胞术检测干细胞表面标志物CD105、CD90、CD45、CD34及干细胞凋亡情况,并观察姜黄素对干细胞多向分化能力的影响。通过差速离心法收集姜黄素预处理前后AdMSCs培养上清中的外泌体,Western blot检测外泌体常用标志物CD9、CD63、TSG101的表达,通过透射电镜、NTA粒径分析仪观察外泌体的表征形态和浓度。通过qPCR、Western blot检测姜黄素预处理后AdMSC-exos对LPS诱导MH-S细胞炎症反应的影响及NF-κB、MAPKs信号通路蛋白的表达。结果:1)经过脂肪间充质干细胞外泌体治疗后的ALI模型小鼠肺损伤症状得到有效缓解,肺部及全身的炎症反应减轻,肺组织及BALF中促炎性细胞因子水平降低,抑炎性细胞因子表达水平增高。AdMSC-exos移植后还可提高肺泡灌洗液中小鼠原代肺泡巨噬细胞（Alveolarmacrophages,AMs）数量,减少中性粒细胞和单核巨噬细胞的数量。体外实验中,AdMSC-exos可以促进MH-S细胞向M2型巨噬细胞分化,抑制炎症信号通路NF-κB、MAPKs上相关蛋白的磷酸化水平,增强巨噬细胞抵抗炎症反应的能力,减轻细胞炎症。2)AdMSC-exos将线粒体转移至MH-S细胞,并与MH-S线粒体内膜共定位。外泌体通过线粒体的转移对MH-S细胞线粒体功能有良好的促进作用。AdMSC-exos预处理可以改善LPS刺激后线粒体被破坏的现象,增加线粒体嵴的数量,恢复其正常结构,并提高MH-S细胞线粒体mtDNA拷贝数,增加线粒体ATP的产生,使线粒体功能受损的程度减轻,进一步促进细胞增殖减少凋亡,并且还提高了巨噬细胞氧化磷酸化和糖酵解能力。动物实验结果也表明,携带干细胞线粒体的AdMSC-exos可以被内化到小鼠肺组织巨噬细胞中。AdMSC-exos可以提高小鼠AMs细胞中mtDNA拷贝数,LPS刺激后细胞低ATP含量的形式被有效逆转。流式细胞仪分析结果显示,AdMSC-exos可以减少LPS刺激后AMs细胞ROS产量,线粒体功能受损的数量也大大下降。而对于耗竭掉AMs的ALI模型小鼠,AdMSC-exos 对肺组织损伤和炎症抑制 的保护作用明显减弱。使用 AdMSC-exos 预处理的 BMDM细胞过继转移后,也可以有效抑制LPS诱导的肺损伤和炎症反应。3)实验发现线粒体呼吸链复合物Ⅰ亚基NDUFV2以核酸和蛋白质两种形式存在于AdMSCs外泌体中。进一步的实验结果发现,当AdMSC-exos中核酸物质降解后,其调控受体巨噬细胞炎症反应的能力有所下降。qPCR和Western blot结果表明,LPS刺激会导致细胞线粒体呼吸链复合物上亚基Ⅰ～V的缺失,尤其是复合物INDUFV2的下调最为明显,而施用AdMSC-exos可以有效提高细胞线粒体复合物的表达。qPCR、流式细胞术等实验结果表明,当线粒体呼吸链复合物INDUFV2敲减后,AdMSC-exos对巨噬细胞的免疫抑制和改善线粒体代谢的能力被削弱。4)姜黄素预处理对干细胞的生长、形态、表型均无影响,也不会改变其衍生的外泌体表征。此外,姜黄素处理AdMSCs后,可以显着提高干细胞分泌的外泌体含量。在抑制炎症反应方面,使用姜黄素预处理AdMSCs后,可以增强AdMSC-exos降低炎症信号通路NF-κB、MAPKs上相关蛋白磷酸化水平的作用,有效减轻细胞炎症反应。结论:人脂肪间充质干细胞衍生的外泌体通过调控NF-κB、MAPKs信号通路抑制炎症反应,促进活化的巨噬细胞由促炎的M1型向抑炎的M2型极化,有效缓解LPS诱导的小鼠急性肺损伤;AdMSC-exos通过线粒体转移恢复巨噬细胞线粒体的结构完整性和生物遗传学,进一步促进内毒素应激的巨噬细胞向抗炎表型的功能转变,从而减轻ALI模型小鼠肺组织的损伤和炎症,AdMSC-exos的保护作用在很大程度上取决于线粒体转移和肺泡巨噬细胞的代谢重编程;AdMSC-exos中包含AdMSCs细胞中的线粒体呼吸链复合物NDUFV2片段,并通过转移定位到受体巨噬细胞的线粒体内膜上,继而调整巨噬细胞由于线粒体呼吸链复合物缺失引起的线粒体功能障碍,起到抑制炎症反应的作用。同时,姜黄素预处理AdMSCs后可以增加干细胞外泌体的产量,极大地提高了外泌体的提取效率,并且还可提高AdMSC-exos抵抗巨噬细胞炎症反应的能力。总的来说,外泌体治疗代表了一种有前景的无细胞疗法,包含线粒体片段转移的外泌体也为临床治疗线粒体功能障碍相关的疾病提供了新的见解,中医药与干细胞疗法的联合运用可以起到相辅相成的作用,这一思路也为临床上治疗多种免疫炎症疾病提供更多选择。
朱长乐[4]（2020）在《清金化痰汤及黄芩苷通过TLR4/MyD88/NF-κB/NLRP3通路抑制LPS诱导的急性肺损伤的研究》文中研究表明本论文分为综述和实验研究两部分综述综述一对中药复方及中药单体治疗急性肺损伤的国内外相关文献进行了综述。综述二对急性肺损伤的病因、临床表现等相关文献进行了综述,并对急性肺损伤的发病机制进行了重点综述。实验研究实验研究分为两部分,第一部分主要研究了清金化痰汤对急性肺损伤的干预作用,分为四个实验;第二部分主要研究了黄芩苷对急性肺损伤的干预作用,分为五个实验。第一部分:清金化痰汤对急性肺损伤的干预作用实验一目的:通过LPS干预建立急性肺损伤大鼠模型,评价清金化痰汤对急性肺损伤大鼠炎症反应的影响。方法:采用气道滴注LPS溶液的方式建立急性肺损伤模型并给予低剂量清金化痰汤、高剂量清金化痰汤和克拉霉素灌胃。检测肺湿/干比、BALF蛋白质浓度、炎症因子分泌情况、肺组织病理变化。结果:气道滴注LPS可显着上调大鼠肺重量的湿/干比和大鼠BALF的蛋白质浓度,增加肺泡毛细血管膜通透性,促进炎症因子CXCL-1、IL-6和MPO的释放,诱导中性粒细胞的聚集浸润,引起肺泡壁增厚、支气管上皮细胞水肿。清金化痰汤可显着降低肺重量湿/干比和大鼠BALF的蛋白质浓度,减轻ALI大鼠的肺泡毛细血管膜通透性,减少蛋白质由毛细血管、间质向肺泡的渗透,减少中性粒细胞聚集,抑制炎症因子CXCL-1、IL-6和MPO的分泌,与模型组相比差异有统计学意义（P<0.05）。实验二目的:通过LPS干预建立急性肺损伤大鼠模型,评价清金化痰汤对急性肺损伤大鼠炎症反应的影响。方法:采用气道滴注LPS溶液的方式建立急性肺损伤模型并给予低剂量清金化痰汤、高剂量清金化痰汤和克拉霉素灌胃。WB法检测蛋白表达变化、IHC检测肺组织蛋白表达改变。结果:气道滴注LPS可显着促进TLR4、MYD88、NLRP3的蛋白表达的升高和NF-κB磷酸化。清金化痰汤可显着降低TLR4、MYD88、NLRP3蛋白的表达,抑制了 NF-κB的磷酸化,与模型组相比差异有统计学意义（P<0.05）。实验三目的:探索清金化痰汤含药血清冻干粉对BEAS-2B细胞损伤炎症因子表达的影响。方法:使用冻干机将含药血清冻干为含药血清冻干粉。以空白含药血清冻干粉、清金化痰汤含药血清冻干粉、克拉霉素含药血清冻干粉干预支气管上皮细胞。采用CCK8法检测各药物的细胞毒性,并检测各药物抑制炎症因子分泌的效果。结果:清金化痰汤含药血清冻干粉和克拉霉素含药血清冻干粉可以引起细胞明显的水肿,细胞内可见黑色颗粒物质,并且无明显抑制炎症因子IL-8、IL-6、TNF-α、MPO分泌的作用,与模型组相比差异有统计学意义（P<0.05）。实验四目的:分析中药复方清金化痰汤的主要化学成分及入血成分。方法:大鼠灌胃纯水、清金化痰汤和克拉霉素7天后采血、离心,制备含药血清。采用液质联用技术检测并分析各药物及其含药血清的主要化学成分。结果:清金化痰汤中含有9个化学成分,分别为黄芩苷、伪麻黄碱、绿原酸、咖啡酸、芦丁、连翘苷、大黄酸、甘草酸铵、齐墩果酸,其中3个为入血成分,分别为黄芩苷、伪麻黄碱、甘草酸铵。第二部分:黄芩苷对急性肺损伤的干预作用实验五目的:探索黄芩苷对LPS诱导BEAS-2B细胞损伤的炎症因子表达的影响。方法:以黄芩苷标准品、克拉霉素标准品干预支气管上皮细胞。采用CCK8法检测各药物的细胞毒性,并检测各药物抑制炎症因子分泌的效果。结果:黄芩苷标准品浓度在10μg/ml及以下时,对细胞存活率无明显影响,细胞生长状态较好,细胞扁平,呈多边形。黄芩苷用药对炎症因子IL-8、IL-6、TNF-α、MPO的表达有一定的抑制作用。实验六目的:探索黄芩苷对LPS诱导BEAS-2B细胞损伤的炎症反应的影响。方法:以黄岑苷标准品、克拉霉素标准品干预LPS诱导的上皮细胞急性损伤模型,检测细胞培养上清中的炎症因子的含量、观察细胞形态、用Transwell小室检测上皮细胞趋化中性粒细胞的作用。结果:LPS干预BEAS-2B细胞可显着促进细胞因子IL-8、IL-6、TNF-α、IFN-γ、IL-1β和GM-CSF的分泌,刺激支气管上皮细胞趋化中性粒细胞,诱导上皮细胞损伤。黄芩苷可显着地抑制IL-8、IL-6、TNF-α、IFN-γ、IL-1β和GM-CSF等炎症因子的分泌,减少中性粒细胞的迁移数量。实验七目的:探索黄芩苷对LPS诱导的BEAS-2B细胞损伤的TLR4信号通路的影响。方法:以黄芩苷标准品、克拉霉素标准品干预LPS诱导的上皮细胞急性损伤模型,检测细胞中TLR4、MYD88、TRIF、NF-κB、NLRP3蛋白含量及mRNA表达情况。结果:LPS干预BEAS-2B细胞可激活TLR4信号通路,显着上调TLR4、MyD88、NLRP3蛋白的表达和NF-κB的磷酸化,黄芩苷可显着地下调TLR4、MyD88、p-NF-κB和NLRP3蛋白含量和mRNA的表达,与模型组相比差异有统计学意义（P<0.05）。实验八目的:探索黄芩苷对急性肺损伤大鼠炎症反应的影响。方法:气道滴注LPS溶液建立急性肺损伤大鼠模型并给予低剂量黄芩苷、高剂量黄芩苷和克拉霉素灌胃。检测肺湿/干比、BALF蛋白质浓度、炎症因子分泌情况、肺组织病理变化。结果:LPS干预上调了 BALF和血清中的炎症因子CXCL-1、IL-6、IL-1β、TNF-α和MPO的分泌,增加了肺泡毛细血管膜通透性。黄芩苷干预可显着降低大鼠肺组织重量的湿/干比和BALF的蛋白质浓度,抑制大量中性粒细胞浸润到肺泡间质和肺泡间隙,减轻支气管上皮细胞的水肿,抑制上皮细胞的黏液分泌,抑制BALF和血清中炎症因子CXCL-1、IL-6、IL-1β、TNF-α和MPO的分泌,与模型组相比差异有统计学意义（P<0.05）。实验九目的:探索黄芩苷对急性肺损伤大鼠TLR4和MAPK信号通路的影响。方法:气道滴注LPS溶液建立急性肺损伤大鼠模型并给予低剂量黄芩苷、高剂量黄芩苷和克拉霉素灌胃。WB法检测蛋白表达变化、IHC检测肺组织蛋白表达改变。结果:LPS干预促进TLR4信号通路和MAPK信号通路的激活。黄芩苷可以显着地抑制TLR4、MYD88、P-NF-κB、NLRP3、P-ERK和P-p38蛋白的表达,与模型组相比差异有统计学意义（P<0.05）。结论1.气道滴注5mg/kg的LPS溶液可诱导大鼠的肺泡毛细血管通透性增加、炎症因子分泌增加、肺组织病理变化,符合急性肺损伤的病理改变,可以用于急性肺损伤的实验研究。2.清金化痰汤能够通过抑制TLR4/MYD88/NF-κB/NLRP3信号通路的激活,抑制炎症因子分泌和炎性细胞的浸润,减轻LPS诱导的炎症反应,缓解急性肺损伤模型大鼠的肺泡毛细血管通透性的增加和大鼠的急性肺损伤。3.清金化痰汤的主要化学成分之一黄芩苷可显着抑制LPS诱导BEAS-2B细胞的损伤以及炎症因子的分泌。4.黄芩苷可以抑制LPS诱导的急性大鼠肺损伤模型炎症因子的分泌和炎性细胞的浸润,减轻LPS诱导的炎症反应,缓解急性肺损伤模型大鼠的肺泡毛细血管通透性的增加、肺水肿和大鼠的急性肺损伤。5.黄芩苷可通过抑制TLR4/MYD88/NF-κB/NLRP3信号通路的激活与转录,减少炎症因子、趋化因子的分泌,抑制炎症细胞的聚集以及炎症风暴的爆发。6.黄芩苷能够通过抑制MAPK信号通路的激活,减少炎症因子、趋化因子的分泌,抑制炎症细胞的聚集以及炎症反应的扩大。
五且昆·吐尔逊[5]（2020）在《干扰素调节因子家族成员在流感病毒诱导的局部和全身炎症反应中的表达模式》文中研究表明流感病毒感染可诱发急性肺损伤（ALI）与其介导的大量I型干扰素（IFN-I）产生关系密切。干扰素调节因子（IRF）是负责IFN-I产生的转录因子家族,包括IRF1-9。尽管IRF3和IRF7被普遍认为是调控IFN-I产生的主要转录因子,IRF家族所有成员都能识别/结合其靶基因启动子上富含GAAA序列元件的特征提示可能都对流感病毒感染应答。本文以流感病人鼻咽上皮细胞和流感模型小鼠肺组织作为局部应答组织、流感模型小鼠外周血白细胞及其他组织如心、肠、肝、肾、脾、胃作为全身应答组织,观察了IRF家族成员对流感病毒应答的表达谱变化,并用专职产生IFN-I的人p DC样CAL-1细胞研究了流感病毒诱导IRF家族表达谱的变化规律及可能调控机制。本研究为流感病毒诱发急性免疫损伤如ALI的诊断和防治提供了分子靶标。
杨易[6]（2020）在《Wnt5a与SOX2信号对BCG感染肺泡上皮细胞后凋亡和炎性反应的调控作用》文中提出结核病（Tuberculosis,TB）是结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis,Mtb）感染而引起的慢性致死性人畜共患传染病。结核病发病机制研究大多集中在Mtb与肺泡巨噬细胞、树突状细胞之间的相互作用,也有研究表明肺泡上皮细胞（Alveolar Epithelial Cells,AEC）同样是Mtb的靶细胞,在抗结核分枝杆菌感染中起着至关重要的作用,但肺泡上皮细胞与结核分枝杆菌相互作用的分子机理尚未阐明。最新研究发现,肺泡上皮细胞Wnt信号可通过与膜受体蛋白结合发挥免疫调控作用。Wnt5a是分泌型糖蛋白类Wnt家族中的重要成员之一,可激活非经典Wnt信号通路,参与细胞炎性反应的分子调控;而SOX2与包括Wnt信号在内的多种细胞信号都有交互式相互作用,是细胞自噬、炎症、凋亡、发育等过程的重要调节器。为揭示Wnt5a信号在肺泡上皮细胞抗结核菌感染中的免疫调控作用,本研究主要解决的关键科学问题为:1.结核分枝杆菌感染肺泡上皮细胞后是否激活Wnt5a和SOX2信号?2.Wnt5a信号和SOX2信号是否参与调控结核分枝杆菌感染肺泡上皮细胞的凋亡过程及TLR信号介导的炎性反应?二者间相互作用的分子机制是什么?本研究在结核分枝杆菌疫苗株BCG感染肺泡上皮细胞A549基础上,分别采用Wnt5a条件培养基、JNK抑制剂SP600125激活或抑制Wnt5a/JNK信号通路,慢病毒过表达SOX2转染A549细胞方式,结合MTT比色法、实时荧光定量PCR、蛋白免疫印迹、流式细胞术和酶联免疫吸附测定等技术,检测Wnt5a信号通路相关蛋白、TLR信号通路相关蛋白及炎性细胞因子、细胞凋亡相关蛋白的表达水平,探究Wnt5a、SOX2在Mtb感染肺泡上皮细胞A549中的调控作用及其机制,取得如下研究结果:1.Mtb感染A549细胞后,Wnt5a信号通路的关键分子Wnt5a、Ror2、JNK和CamKⅡ在mRNA水平的表达显着上调;与未感染对照组相比,在Wnt5a或BCG单独刺激下,A549细胞中Wnt5a、PKC、CamKⅡ、Fzd5、Ror2和JNK蛋白表达水平显着上调,且Wnt5a与BCG共处理组中Wnt5a、PKC、Fzd5和JNK的表达显着高于BCG单独处理组（P<0.05）;在抑制剂SP600125处理BCG、Wnt5a单独或共同作用的A549细胞后,与对照组相比,各处理组中Wnt5a、Ror2、JNK、p-JNK和AP-1蛋白表达水平均下调,差异极显着（P<0.01）。结果表明:Wnt5a能有效促进BCG感染A549细胞后Wnt5a信号通路的开启,而阻断Wnt5a/JNK信号通路,对BCG单独或与Wnt5a协同作用激活的Wnt5a信号具有抑制作用。2.分别用Wnt5a、BCG单独作用或共同作用A549细胞后,对TLR信号关键分子及炎性细胞因子进行检测,BCG 组和 Wnt5a+BCG 组中 TLR2、TLR6、MyD88、NF-κB、磷酸化 NF-κBp65和IRF5的表达均显着上调,与未感染对照组相比差异极显着（P<0.01）,且Wnt5a+BCG组的表达水平高于BCG组。采用抑制剂SP600125处理A549细胞后,BCG组、Wnt5a+BCG组分别与未处理对照组相比,TLR2、TLR6、MyD88、NF-κB、磷酸化NF-κBp65和IRF5的表达均显着下调（P<0.05）。与未感染对照组相比,Wnt5a+BCG组、Wnt5a和BCG组炎性因子IL-6和TNF-α表达均显着上升,且Wnt5a+BCG组共同处理组表达最高,差异极显着（P<0.01）。研究结果表明,Wnt5a能有效促进BCG感染A549细胞后TLR信号通路的开启,进而促进BCG感染引起的炎性反应,而阻断Wnt5a/JNK信号通路,对BCG单独或与Wnt5a协同作用激活的TLR信号具有抑制作用。3.分别用Wnt5a、BCG单独作用或共同作用A549细胞后,对SOX2蛋白的表达进行检测,Wnt5a组、BCG组和Wnt5a+BCG组中A549细胞SOX2蛋白表达水平均高于对照组,差异极显着（P<0.01）;采用抑制剂阻断JNK信号后,Wnt5a组、BCG组中的SOX2表达水平显着下调。研究结果表明,BCG和Wnt5a可通过Wnt5a/JNK信号途径激活A549细胞中SOX2的表达。4.Wnt5a与BCG作用于A549细胞后的细胞凋亡率及细胞凋亡相关蛋白的表达进行检测,结果表明:A549细胞内凋亡小体的数量、细胞凋亡率、促凋亡蛋白Bax的表达水平、线粒体膜电位下降幅度,细胞内ROS水平,Caspase-3、活化的Caspase-3（C-caspase3）及Cyto C的表达水平均表现为Wnt5a+BCG共处理组>BCG感染组>对照组,而抑凋亡蛋白Bcl-xl的表达水平与之相反。与未感染对照组相比,BCG、Wnt5a单独处理组及共处理组A549细胞内的ROS释放量大幅升高,且NAC预处理组较未处理对照组ROS水平有所下降。研究结果表明,Wnt5a/JNK信号通过增强A549细胞内ROS产生经线粒体凋亡途径促进BCG诱导的A549细胞凋亡。5.在过表达SOX2的A549细胞中,Wnt5a、JNK、p-JNK、CamKⅡ和NAFT蛋白表达较对照组下调;经BCG感染A549细胞后,Wnt5a、JNK、p-JNK和NAFT蛋白表达上调,而过表达SOX2+BCG感染组较BCG单独感染组Wnt5a关键蛋白的表达水平下降;在过表达SOX2的A549细胞中,TLR2、TLR4、TBK-1、TRAF3、IRF3、AP-1和NF-KB p65蛋白表达较对照组上调,BCG感染A549细胞同样表现为TLRs关键蛋白表达上调,而BCG+过表达SOX2组TLR2、IRF-5、NF-κB p65、AP-1、TRAF3、TBK-1和IRF-3蛋白及炎性细胞因子IL-6、TNF-α的表达水平高于未感染对照组但低于BCG单独感染组;与未感染对照组相比,BCG+过表达SOX2组及BCG感染组A549后Bax/Bcl-2、C-Cas3、C-Cas8、C-Cas9表达均上调,而BCG+过表达SOX2组的表达水平低于BCG单独感染组。结果表明,过表达SOX2负反馈抑制了 BCG感染A549细胞后的凋亡及TLR信号介导的炎性反应。综上研究结果,Wnt5a和SOX2在结核分枝杆菌感染肺泡上皮A549细胞的调控作用机制是:结核分枝杆菌感染肺泡上皮A549细胞后,Wnt5a表达上调,激活了 Wnt5a/JNK非经典信号通路,进而促进了 TLR信号的级联放大,诱导细胞凋亡以清除病原菌的感染;同时,Wnt5a信号通路的激活进一步上调了 SOX2的表达。当SOX2过度表达时,能够负反馈抑制BCG感染的肺泡上皮细胞Wnt5a信号、TLR信号介导的炎性反应及细胞凋亡,从而维持上皮组织细胞的稳态。这些发现将为深入研究结核分枝杆菌与宿主肺泡上皮细胞的相互作用机理,阐明宿主上皮细胞抗结核分枝杆菌感染的免疫应答调控机制提供新的研究思路。
章倩晖[7]（2020）在《小麦阿拉伯木聚寡糖对LPS诱导的猪肺泡巨噬细胞炎症因子分泌的影响及作用机制》文中提出我国是小麦生产大国,但小麦加工副产品尚未得到充分利用,资源浪费现象严重。近年来,国际对小麦加工副产品的研究愈加深入,产品广泛应用于各个行业,而我国在此方面尚有欠缺。小麦阿拉伯木聚糖（AX）在小麦麸皮中存在较为丰富,是小麦饲粮中非淀粉多糖（NSP）的主要组成部分,研究发现在小麦饲粮中添加木聚糖酶能够有效消除其抗营养作用,使AX在动物体内发挥益生元作用。大量研究表明,机体对小麦阿拉伯木聚糖与其降解产物阿拉伯木聚寡糖（AXOS）的利用机制不同,近年来,部分学者对AXOS的提取和制备开展了研究,发现AXOS能提高小鼠的机体免疫功能,但其作用机制尚不明确。关于小麦AXOS作为饲料添加剂的使用未见报道,其对猪的免疫功能影响也有待研究。巨噬细胞在机体中扮演非常重要的角色,其可塑性大,根据环境刺激的不同能够分化成不同种群,发挥不同作用。在受到刺激后,巨噬细胞大量分泌炎症因子以清除机体炎症,但炎症因子分泌量过大时对机体本身也会造成伤害,因此,促进炎症因子的适度分泌十分重要。本试验以猪肺泡巨噬细胞为研究对象,以脂多糖（LPS）诱导产生炎症模型,探讨小麦AXOS对巨噬细胞炎症因子分泌的影响及其作用机制。试验一小麦AXOS对LPS诱导的巨噬细胞炎症因子及NF-κB基因表达的影响本试验旨在研究小麦阿拉伯木聚寡糖对LPS诱导的猪肺泡巨噬细胞炎症因子分泌的影响及其可能的作用机制。本试验采用细胞体外培养方法,利用LPS构建体外猪肺泡巨噬细胞炎症模型,研究小麦阿拉伯木聚寡糖对巨噬细胞炎症因子和NF-κB基因表达的影响。试验分为3个处理,每处理3个重复,分别为:1)对照处理,无处理;2)LPS处理,0.1 μg/ml LPS刺激;3)LPS+AXOS处理,0.1 μg/ml LPS 刺激+不同浓度 AXOS（31.25、62.5、125、250 μg/ml）,分别处理2h、4h、6h。结果表明:1)与LPS处理相比,小麦AXOS在31.25μg/ml和125μg/ml浓度处理4小时,62.5 μg/ml浓度处理6小时显着下调了 IL-6的含量（P<0.05）;2)与LPS处理相比,250 μg/ml浓度处理2小时,125及250 μg/ml浓度处理4小时,各浓度处理6小时显着下降TNF-α含量（P<0.05）;3)LPS+AXOS处理较LPS处理的IL-4含量显着下降（P<0.05）;4)除31.25 μg/ml浓度外处理2小时,各浓度处理4小时,31.25 μg/ml及62.5 μg/ml浓度处理6小时显着下调IL-10的含量（P<0.05）。5)LPS+AXOS处理2小时,TNF-α的mRNA表达量显着低于 LPS 处理（P<0.05）;6)LPS+AXOS 处理 4 小时,IL-10、TNF-α 的mRNA表达量显着下降（P<0.05）;7)处理6小时,IL-10的mRNA表达量显着下降（P<0.05）。与LPS处理相比,LPS+AXOS处理的NF-κB p65表达量均显着上升（P<0.05）。结果提示,AXOS能够调节巨噬细胞的部分炎症因子分泌,且AXOS处理后NF-κB的mRNA表达量显着增加,推测其可能通过NF-κB发挥作用。试验二抑制NF-κB对小麦AXOS调节猪肺泡巨噬细胞炎症因子分泌的影响本试验旨在研究NF-κB信号通路在小麦AXOS调节LPS诱导的猪肺泡巨噬细胞炎症因子分泌过程中的作用,探索NF-κB信号通路参与小麦AXOS控制巨噬细胞炎症因子分泌的分子机制。本试验采用细胞体外培养方法,利用NF-κB通路抑制剂（BAY11-7082）建立抑制模型,研究NF-κB对小麦AXOS调节巨噬细胞炎症因子分泌的影响。试验分为3处理,每处理3个重复,分别为:1)对照处理,无处理;2)LPS处理,0.1 μg/ml LPS刺激;3)NF-κB抑制组,NF-κB抑制剂预处理1小时+0.1μg/ml LPS刺激+不同浓度（31.25、62.5、125、25μg/ml）AXOS分别处理2h、4h、6h。结果表明:1)抑制NF-κB信号通路后,与LPS相比LPS+AXOS处理IL-6、及TNF-α分泌水平无明显变化（P>0.05）;2)抑制NF-κB信号通路后,与LPS处理相比,LPS+AXOS处理2小时除250μg/ml浓度外IL-4的分泌量均显着上升（P<0.05）,但处理4小时和6小时时分泌量无显着变化（P>0.05）;3)与LPS处理相比,LPS+AXOS处理在31.25μg/ml浓度处理2小时和4小时,62.5 μg/ml浓度水平处理2小时和4小时,125 μg/ml浓度处理2小时,IL-10的分泌量显着上升（P<0.05）。4)细胞因子的mRNA表达量结果表明,抑制NF-κB信号通路后,与LPS处理相比LPS+AXOS处理的IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α的mRNA表达量无显着变化（P>0.05）;4)蛋白水平结果显示,LPS+AXOS处理较LPS处理NF-κB p65蛋白的表达显着降低（P<0.05）,抑制组表达量较LPS处理也显着降低（P<0.05）。结果提示:AXOS可以通过NF-κB调节巨噬细胞部分炎症因子分泌。
范文韬[8]（2019）在《雌激素受体对玉米赤霉烯酮诱导的肠道炎症反应的影响及其调控机制研究》文中认为玉米赤霉烯酮（Zearelenone,ZEA）是一种由镰刀菌属菌株产生的霉菌毒素,广泛存在于饲料和谷物中,严重威胁人类、家禽及家畜的健康。目前关于ZEA毒性的研究主要集中在其生殖毒性的研究,而关于ZEA的其他毒性研究仍比较匮乏。众所周知,肠道是机体营养物质消化吸收的重要部位,也是抵御病原体、食物污染物、化学药物以及天然毒素的第一道屏障。在长期的进化过程中,动物肠道建立了完备免疫系统。当外源致炎物质（如细菌细胞壁、病毒、毒素等）通过消化道进入机体后,可以刺激肠道上皮细胞过度分泌细胞因子,并导致肠道炎症反应的发生。那么饲料中污染的ZEA是否能够激活机体肠道炎症反应并损害肠道的屏障功能尚不清楚。本文首先对ZEA引起的猪小肠上皮细胞（IPEC-J2）细胞氧化应激及炎症反应进行研究;然后建立ZEA致小鼠肠道炎症反应模型,并利用该模型探究了 ZEA导致肠道炎症反应的作用机理。基于上述结果,进一步研究了 ZEA对葡聚糖硫酸钠（Dextran sodium sulfate,DSS）诱导的小鼠肠道炎症反应的影响。与预期相反,结果显示ZEA没有促进3%DSS诱导的肠道炎症反应,反而缓解了 3%DSS诱导的肠道炎症,并且抑制了 NOD样受体蛋白3（NOD-like receptor protein 3,NLRP3）炎性小体表达,另外研究表明ZEA协同3%DSS处理小鼠时表现的炎症缓解作用与雌激素受体（Estrogen receptor,ER）亚型表达差异有关。进一步,通过染色质免疫共沉淀、凝胶阻滞和双荧光素酶报告基因实验证明了 ERα可以直接调控NLRP3基因的转录,而ERβ对NLRP3基因的转录无明显调控作用。而且蛋白质免疫印迹和蛋白免疫荧光实验证实ERα的特异性激动剂可以促进NLRP3炎性小体（NLRP3、ASC、Procaspase-1）表达和组装。本课题主要研究内容和结果如下:1.ZEA诱导猪小肠上皮细胞炎症反应本研究首先通过细胞活性试验确定ZEA在IPEC-J2细胞中的半数抑制浓度（IC50）为13.59±0.044 μg/mL,且ZEA浓度<6 μg/mL时,几乎无细胞毒性,而ZEA浓度>8μg/mL时,有明显的细胞毒性（P<0.05）。另外细胞内抗氧化酶（CAT、T-SOD、GSH-PX）活性随ZEA浓度增加而显着降低（P<0.05）,而脂质过氧化物丙二醛（MDA）随ZEA浓度增加而明显增加（P<0.05）。细胞内氧化还原失衡就会导致活性氧（ROS）的大量累积,并对线粒体膜结构尤其是线粒体内膜的损伤最严重,最终导致线粒体膜电位下降、通透性增加、线粒体损伤。本研究利用荧光探针DCFH-DA和JC-1分别进行细胞内活性氧和线粒体膜电位检测。结果显示,高剂量ZEA（8 μg/mL）孵育细胞24 h后,ROS显着升高（P<0.05）,细胞皱缩,低剂量组较对照组变化不明显。高浓度ZEA显着降低了细胞线粒体膜电位（P<0.05）,透射电镜结果也显示线粒体内外膜融合,线粒体嵴少且紊乱,部分线粒体肿胀,损伤线粒体数增加。研究表明,ROS和受损的线粒体会激活NLRP3炎性小体,加工并使半胱天冬酶-1（Caspase-1）成熟,调节白介素-1β（IL-1β）和白介素-18（IL-18）等促炎细胞因子的成熟与释放。免疫印迹和ELISA试验结果显示,高浓度的ZEA可以显着激活IPEC-J2细胞中NLRP3炎性小体（NLRP3、ASC、Caspase-1）的表达（P<0.05）,并促进 IL-1β 和 IL-18 的释放（P<0.05）。综上所述,在IPEC-J2细胞中,ZEA可以通过降低抗氧化酶活性,破坏机体的氧化平衡,引起机体氧化应激和线粒体损伤,并进一步激活NLRP3炎性小体,促进炎性细胞因子成熟释放。2.ZEA诱导小鼠肠道炎症反应本部分试验利用3%DSS诱导的小鼠肠道炎症反应为阳性模型,研究了高浓度ZEA（4.5mg/kg）对小鼠肠道炎症反应的作用。结果显示,ZEA处理小鼠的疾病活动指数（disease activity index,DAI）显着增加（P<0.05）,ZEA 处理小鼠的 DAI 低于 3%DSS处理小鼠。ZEA处理小鼠的结肠明显缩短（P<0.05）,小鼠的肠道组织的隐窝萎缩、断裂,炎性细胞浸润增加,黏膜层和黏膜下层都有明显的炎性灶。炎性细胞因子IL-1β和IL-18及中性粒细胞标志物MPO含量也显着升高（P<0.05）,进一步炎性小体表达检测结果也显示NLRP3炎性小体（NLRP3、ASC、Caspase-1）的表达明显增加（P<0.05）。综上结果表明高浓度ZEA可以引起小鼠肠道组织明显的炎症反应,且该炎症反应由NLRP3炎性小体信号通路介导。为了验证小鼠肠道组织炎症反应中NLRP3炎性小体激活的机制,本研究分离了小鼠的腹腔巨噬细胞,并检测了 ZEA处理后小鼠腹腔巨噬细胞中炎症反应情况。结果显示炎性细胞因子IL-1 β和IL-18含量显着升高（P<0.05）,NLRP3炎性小体（NLRP3、ASC、Caspase-1）的表达也明显增加（P<0.05）。对小鼠腹腔巨噬细胞的氧化应激研究显示,细胞中的抗氧化酶活性、MDA含量、活性氧水平变化趋势与IPEC-J2细胞结果一致,且变化显着（P<0.05）。高浓度ZEA也引起小鼠腹腔巨噬细胞线粒体明显的损伤。当细胞中加入抗氧化剂（NAC）后,炎性细胞因子IL-1β和IL-18含量,NLRP3炎性小体（NLRP3、ASC、Caspase-1）的表达都明显降低（P<0.05）。综上所述,体内外试验结果共同表明ZEA被摄入后会引起机体的氧化应激和线粒体损伤,并进一步激活NLRP3炎性小体,促进炎性细胞因子成熟和释放,最终导致肠道炎症反应。这些结果表明,养殖场中非传染性持续性腹泻可能与饲料中ZEA污染有关。3.ZEA对3%DSS诱导的肠道炎症反应的影响本部分试验进一步建立了 ZEA协同3%DSS处理IPEC-J2细胞和小鼠的肠道炎症反应模型。结果却显示ZEA协同3%DSS处理小鼠的DAI较3%DSS单独处理组显着降低（P<0.05）,剖检结果显示,ZEA协同3%DSS处理小鼠的结肠明显长于3%DSS单独处理组小鼠结肠（P<0.05）。病理组织的染色结果表明ZEA协同3%DSS处理小鼠的结肠隐窝萎缩、断裂,炎性细胞浸润增加情况减轻。体内外试验中炎性细胞因子IL-1β和IL-18及中性粒细胞标志物MPO含量结果也比单独处理组显着降低（P<0.05）,进一步炎性小体表达检测结果则显示NLRP3炎性小体中NLRP3表达受到显着抑制（P<0.05）,而ASC、Caspase-1的表达无显着变化。综上,ZEA并没有增加3%DSS引起的肠道炎症反应,反而具有一定的缓解作用,且该缓解作用是由于NLRP3表达受到抑制。ZEA不同于其他真菌毒素的特殊之处是该毒素具有类雌激素样作用,能激活不同雌激素受体（ERα,ERβ）的表达。因此本部分试验进一步检测了 ER在不同ZEA处理中的表达情况,结果显示正常组、低浓度ZEA组和3%DSS组仅ERα表达,而高浓度ZEA组和ZEA+3%DSS组仅ERβ表达。4.雌激素受体对NLRP3炎性小体信号通路调控研究本部分试验首先通过生物信息学分析发现NLRP3启动子序列中有ER的识别基序（AGGTCACNNNNTGGCCT）,也就是NLRP3可能是ER的靶基因。进一步通过染色质免疫共沉淀实验（ChIP-qPCR）,凝胶阻滞实验（EMSA）和双荧光素酶报告基因实验证明了 ERα可以直接调控NLRP3基因的转录,而ERβ对NLRP3基因的转录无明显调控作用。采用蛋白质免疫印迹和蛋白免疫荧光实验证实ERα的特异性激动剂可以促进NLRP3炎性小体（NLRP3、ASC、Procaspase-1）表达和组装。综上研究证明ER是NLRP3的一种转录调节因子,可以直接调控NLRP3的转录。此外ER还可以进一步促进NLRP3炎性小体各配体的表达和组装,进一步调节炎性反应。为了进一步验证试验结论,我们观察了特异性ERα拮抗剂（AZD9496）对3%DSS处理的小鼠结肠炎的影响,发现特异性ERα拮抗剂可以显着缓解3%DSS引起的肠道炎症反应。综上所述,本研究证明了 ZEA可以通过引起机体氧化应激和线粒体损伤,激活NLRP3炎性小体并引起肠道炎症反应;而当机体内炎症反应增强时,ZEA会改变ER亚型的表达情况。基于此,本研究初步阐明了 ER对NLRP3基因的转录调控机制及对NLRP3炎性小体表达和组装的影响。该课题进一步完善了 ZEA的肠道免疫毒性以及ER对肠道炎症反应的调控机制,并为临床中ZEA毒性研究及人类炎症性肠病的合理用药提供理论依据。
梁亚峰[9]（2019）在《肺泡巨噬细胞内IL-33/STAT3/MMP-2，9通路在LPS诱导的急性肺损伤中的作用机制研究》文中研究说明第一部分:LPS诱导的大鼠急性肺损伤模型构建及其支气管肺泡灌洗液中炎症因子水平研究研究背景:急性肺损伤（ALI）/急性呼吸系统窘迫综合征（ARDS）是一种严重的呼吸障碍性疾病,其通过剧烈且失控的系统性炎症反应直接或间接导致肺损伤。其中,肺泡巨噬细胞在ALI/ARDS的炎症反应中发挥了重要作用。LPS诱导的动物模型能够通过吸入或系统性暴露于LPS短时间内重现肺组织上皮和内皮屏障的急性损伤以及肺泡内的急性炎症反应,因此,其是模拟及研究人ALI/ARDS病理机制的理想模型。研究目的:探究LPS诱导的大鼠急性肺损伤模型中炎症因子的水平变化研究方法:1.利用腹腔注射法构建LPS诱导的大鼠急性肺损伤模型。2.通过检测大鼠肺组织湿干重比（wet/dryratio）、支气管肺泡灌洗液（BALF）蛋白浓度以及炎症细胞数量评估肺损伤程度。3.通过HE染色法检测大鼠肺组织的病理学变化。4.通过酶联免疫法（ELISA）检测BALF或细胞培养基中炎症因子水平。5.利用流式细胞法分离BALF中的巨噬细胞。6.利用荧光定量PCR法（qPCR）检测从BALF中分离的巨噬细胞内IL-33 mRNA水平。7.利用免疫印迹法（Western blot）检测肺泡巨噬细胞内ST2和IL-1RAP蛋白水平。研究结果:1.LPS处理的大鼠肺组织湿干重比（wet/dry ratio）、BALF蛋白浓度以及BALF中总细胞和巨噬细胞数量明显升高。2.经LPS处理的大鼠肺组织内存在肺泡壁增厚、肺泡萎陷以及炎症细胞浸润等病理学变化。3.LPS诱导的急性肺损伤大鼠BALF 中 IL-33、TNF-α、MMP-2、MMP-9 和 TIMP1 的含量显着升高。4.从 LPS 诱导的急性肺损伤大鼠BALF中分离得到的巨噬细胞中IL-33 mRNA水平上调。作为IL-33受体分子,ST-2蛋白水平明显上调,而IL-1RAP没有显着变化。5.经LPS处理的原代肺泡巨噬细胞的培养基上清中IL-33、TNF-α、MMP-2和MMP-9的含量显着升高。6.LPS处理后原代巨噬细胞中ST-2表达上调,而IL-1RAP没有显着变化。7.LPS 处理后 NR8383 细胞分泌的 IL-33、TNF-α、MMP-2、MMP-9 和 TIMP1 的浓度明显升高。其中,TNF-α、MMP-2、MMP-9和TIMP1的上调具有时间依赖性,而IL-33的分泌在LPS处理12小时后达到最高,随后下降。结论:LPS诱导的大鼠急性肺损伤模型中肺泡巨噬细胞促进了多种炎症因子的分泌。第二部分:IL-33/STAT3信号通路在LPS诱导肺泡巨噬细胞分泌MMP-2和MMP-9过程中的作用机制研究研究背景:作为促炎症因子,IL-33在先天性免疫、过敏性炎症以及组织损伤过程中发挥重要作用。在患有哮喘、慢性阻塞性肺疾病、特发性肺纤维化以及风湿性关节炎的病人血清或组织中IL-33水平升高。我们的前期研究也发现,急性肺损伤患者血清IL-33水平显着高于正常人,提示IL-33和ALI/ARDS之间存在潜在关联。STAT3属于胞内信号传导分子,其可以被各种胞外刺激因子激活,从而在炎症反应中发挥重要的信号转导作用。作为基质金属蛋白酶家族成员,MMP-2和MMP-9的高表达被认为促进了肺组织的急性损伤。研究目的:探究炎症因子IL-33在LPS诱导肺泡巨噬细胞分泌MMP-2和MMP-9过程中的作用机制研究方法:1.通过酶联免疫法（ELISA）检测肺泡巨噬细胞NR8383培养基中炎症因子水平。2.利用免疫印迹法（Western blot）检测NR8383细胞内相应基因蛋白水平。3.利用荧光定量PCR法（qPCR）检测NR8383细胞内相应基因mRNA水平。研究结果:1.IL-33诱导NR8383细胞表达并分泌MMP-2和MMP-9。2.利用p-STAT3抑制剂或靶向STAT3的siRNA阻断STAT3信号抑制了 IL-33诱导的MMP-2和MMP-9的表达和分泌。3.利用特异性抗体中和培养基中的IL-33抑制了 LPS诱导的MMP-2和MMP-9分泌。结论:IL-33/STAT3信号通路在LPS诱导肺泡巨噬细胞分泌MMP-2和MMP-9过程中发挥了重要作用。第三部分:IL-33中和抗体对LPS诱导的急性肺损伤的保护作用研究研究背景:IL-33表达的改变已经在临床前急性肺损伤动物模型中被广泛讨论。在呼吸机诱导的肺损伤模型中,大鼠肺内IL-33水平显着升高。IL-33能够促进外周血单核细胞、肺泡内皮细胞以及上皮细胞分泌IL-8和IL-6,从而诱导中性粒细胞进入肺泡中。除了调控细胞因子的表达,IL-33也能够增加肺泡内皮屏障的通透性以及诱导肺泡上皮细胞的死亡。这些IL-33带来的影响都直接促进了肺损伤的发展。研究目的:体内验证IL-33中和抗体对LPS诱导的急性肺损伤的保护作用研究方法:1.通过检测大鼠肺组织湿干重比（wet/dry ratio）、支气管肺泡灌洗液（BALF）蛋白浓度以及炎症细胞数量评估肺损伤程度。2.通过酶联免疫法（ELISA）检测BALF中MMP-2和MMP-9水平。3.通过HE染色法检测大鼠肺组织的病理学变化。4.通过免疫组化法检测大鼠肺组织中p-STAT3、MMP-2和MMP-9水平。研究结果:1.IL-33抗体抑制了 LPS诱导的大鼠肺组织湿干重比（wet/dry ratiO）、BALF蛋白浓度以及BALF中总细胞和巨噬细胞数量的升高。2.IL-33抗体显着降低了 LPS诱导的急性肺损伤大鼠BALF中MMP-2和MMP-9的浓度。3.LPS处理后大鼠肺组织发生了明显的病理学变化（肺泡壁增厚、肺泡萎陷以及炎症细胞浸润）,同时其p-STAT3、MMP-2和MMP-9水平升高。而IL-33抗体的加入在一定程度上逆转了 LPS诱导的肺组织形态学改变,同时降低了 p-STAT3、MMP-2和MMP-9水平。结论:IL-33抗体能够降低LPS诱导的急性肺损伤程度,同时抑制MMP-2和MMP-9的分泌。
闫小逸[10]（2017）在《METRNL在支气管哮喘中表达上调并促进支气管上皮细胞CCR3的表达》文中研究说明[背景]:支气管哮喘是由多种细胞、炎症因子参与的气道慢性炎性疾病,而其发病的具体机制仍未完全清楚。METRNL蛋白是近年来新发现的一个分泌蛋白,主要表达在皮肤黏膜等屏障组织、神经系统、脂肪细胞以及活化的巨噬细胞等部位,参与胰岛素抵抗、脂肪组织产热、神经生长等生理功能。最近研究表明METRNL在牛皮癣、类风湿性关节炎中表达升高,给小鼠皮下脂肪组织注射过表达METRNL基因的病毒可以引起皮下脂肪组织嗜酸性粒细胞的聚集增加,提示METRNL可能参与炎症、免疫性疾病,我们推测METRNL很可能参与了支气管哮喘的发病。[目的]:研究METRNL在支气管哮喘中的表达和作用。[方法]:通过ELISA法检测支气管哮喘患者及健康对照者血清、呼出气冷凝液（EBC）以及支气管哮喘模型小鼠血清、肺泡灌洗液（BALF）中METRNL水平;H&E染色及肺泡灌洗液计数鉴定小鼠肺组织炎症情况;免疫组化检测小鼠肺组织METRNL表达和分布;RT-PCR及WB、细胞增殖实验（CCK-8）等方法研究小鼠肺泡巨噬细胞（MH-S）METRNL表达的调控机制以及其在支气管哮喘中的功能。[结果]:我们研究发现支气管哮喘患者血清METRNL水平较健康对照明显升高,其升高水平和哮喘患者肺功能指标如FEV1、FEV1%、FEV1/FVC、PEF呈负相关,和BMI、年龄等无关,同时血清METRNL水平和哮喘患者病情控制水平相关,与健康对照组相比,部分控制组和未控制组哮喘患者血清METRNL水平明显升高,而控制组哮喘患者血清METRNL无明显升高。哮喘患者EBC中METRNL水平较健康对照组有升高趋势,但无显着差异。急性哮喘模型小鼠BALF及血清中METRNL水平较对照组均明显升高。哮喘小鼠肺组织免疫组化染色（连续切片抗CD68+抗METRNL双染）显示METRNL主要表达在肺组织增多的巨噬细胞,肺泡上皮细胞也有少量表达。细胞实验研究显示IL-4及IL-13能上调小鼠肺泡巨噬细胞（MH-S）mRNA和蛋白的表达,并有浓度和时间依懒性;IL-4及IL-13可以上调MH-S细胞METRNL蛋白的分泌。进一步研究发现IL-4及IL-13调控MH-S细胞METRNL的表达可能和JAK-STAT信号通路有关,加入JAK-STAT通路抑制剂Ruxolitinib后,IL-4及IL-13上调MH-S细胞METRNL表达的作用被抑制,同时JAK-STAT通路中STAT6的磷酸化被抑制。METRNL蛋白对人支气管上皮细胞（16HBE）及小鼠肺泡巨噬细胞（MH-S）细胞增殖无明显影响;但METRNL蛋白可以上调人支气管上皮细胞趋化因子受体CCR3的表达。[结论]:METRNL在支气管哮喘中巨噬细胞表达上调,并可能通过调控支气管上皮细胞趋化因子受体CCR3的表达参与支气管哮喘的发病过程。
二、异氟醚对人肺泡巨噬细胞趋化因子和细胞因子mRNA表达的影响（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、异氟醚对人肺泡巨噬细胞趋化因子和细胞因子mRNA表达的影响（论文提纲范文）
（1）健脾益肺Ⅱ号治疗慢阻肺临床疗效及减轻香烟暴露联合流感病毒感染小鼠肺炎症作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 文献综述 |
| 第一节 慢性阻塞性肺疾病研究背景 |
| 第二节 慢性阻塞性肺疾病防治策略 |
| 一、慢性阻塞性肺疾病早期干预 |
| 二、中医药防治慢性阻塞性肺疾病作用机制研究 |
| 三、健脾益肺Ⅱ号防治慢性阻塞性肺疾病前期基础 |
| 第三节 慢性阻塞性肺疾病急性加重与呼吸道病毒感染的关系 |
| 一、呼吸道病毒感染在诱发慢阻肺急性加重过程中的免疫病理改变 |
| 二、吸烟对呼吸道病毒感染后宿主免疫应答的影响 |
| 第四节 气道炎症反应在慢性阻塞性肺疾病急性加重中的作用 |
| 一、慢阻肺炎症反应过程中的免疫细胞 |
| 二、炎症反应过程中的炎症介质 |
| 第五节 慢性阻塞性肺疾病急性加重动物模型的研究概况 |
| 一、病毒及其模拟物致慢性阻塞性肺疾病急性加重动物模型 |
| 二、细菌感染致慢性阻塞性肺疾病急性加重动物模型 |
| 三、熏烟联合LPS致慢性阻塞性肺疾病急性加重动物模型 |
| 第二章 健脾益肺Ⅱ号干预治疗COPD Ⅰ-Ⅱ级患者探索性临床研究 |
| 一、研究目标 |
| 二、研究对象 |
| 三、治疗方案 |
| 四、数据管理 |
| 五、统计分析 |
| 六、研究结果 |
| 七、讨论 |
| 第三章 健脾益肺Ⅱ号减少熏烟联合流感病毒感染小鼠肺部炎症的主要环节和作用机制 |
| 第一节 香烟暴露对低剂量流感病毒诱导的气道炎症的影响 |
| 一、实验仪器及材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 第二节 健脾益肺Ⅱ号方对香烟暴露、低剂量流感病毒感染及二者联合诱导的气道免疫细胞的影响 |
| 一、实验仪器及材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 第三节 熏烟期间给药对熏烟联合低剂量流感病毒感染小鼠持续预防作用的研究 |
| 一、实验仪器及材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 结语 |
| 一、研究总结 |
| 二、研究创新点 |
| 三、不足与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在校期间发表论文情况、参与课题与获奖情况 |
| 致谢 |
| 附件 |
（2）固本止咳中药对COPD模型小鼠呼吸道损伤修复的调控机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 文献综述一 扶正固卫、肺主皮毛理论与慢性阻塞性肺疾病呼吸道损伤修复 |
| 参考文献 |
| 文献综述二 蛋白质组学在中医药中的应用研究 |
| 参考文献 |
| 第一部分 固本止咳中药对COPD模型小鼠的治疗作用和调控呼吸道损伤修复作用研究 |
| 前言 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 基于组学的固本止咳中药调控COPD模型小鼠呼吸道损伤修复机制的整体研究 |
| 前言 |
| 实验一 基于质谱技术的固本止咳中药成分分析 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 实验二 基于蛋白组学的固本止咳中药调控COPD模型小鼠损伤修复机制研究 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第三部分 基于JAK-STAT信号通路的固本止咳中药调控COPD模型小鼠呼吸道损伤修复机制研究 |
| 前言 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（3）脂肪间充质干细胞外泌体改善小鼠急性肺损伤的作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 绪论(前言) |
| 参考文献 |
| 第一章 理论研究 |
| 综述 间充质干细胞来源的细胞外囊泡治疗肺部疾病的研究进展 |
| 参考文献 |
| 第二章 脂肪间充质干细胞外泌体改善小鼠急性肺损伤的实验研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 外泌体通过改善肺泡巨噬细胞线粒体代谢抑制炎症反应 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 线粒体复合物INDUFV2是外泌体调控炎症反应的关键分子 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 姜黄素预处理可提高外泌体免疫抑制功能的效应研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 附录 |
| 攻读博士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（4）清金化痰汤及黄芩苷通过TLR4/MyD88/NF-κB/NLRP3通路抑制LPS诱导的急性肺损伤的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语 |
| 文献综述 |
| 综述一 中医药防治急性肺损伤的研究进展 |
| 1 中医对急性肺损伤的认识 |
| 2 急性肺损伤的病因病机 |
| 3 中药复方药干预急性肺损伤的研究 |
| 4 中药单体干预急性肺损伤的研究 |
| 5 结语 |
| 参考文献 |
| 综述二 急性肺损伤发病机制及治疗药物的研究进展 |
| 1 病因与临床表现 |
| 2 病理特征 |
| 3 ALI的发病机制 |
| 4 ALI的治疗药物 |
| 5 结语 |
| 参考文献 |
| 实验研究 |
| 第一部分 清金化痰汤干预急性肺损伤的研究 |
| 前言 |
| 实验一 清金化痰汤对急性肺损伤大鼠炎症反应的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验二 清金化痰汤对急性肺损伤大鼠TLR4信号通路的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验三 清金化痰汤含药血清冻干粉对BEAS-2B细胞损伤炎症因子表达的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验四 质谱分析清金化痰汤及其含药血清的主要成分 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 黄芩苷对急性肺损伤干预作用的研究 |
| 前言 |
| 实验五 黄芩苷对LPS诱导BEAS-2B细胞损伤的炎症因子表达的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验六 黄芩苷对LPS诱导BEAS-2B细胞损伤的炎症反应的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验七 黄芩苷对LPS诱导BEAS-2B细胞损伤的TLR4信号通路的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验八 黄芩苷对急性肺损伤大鼠炎症反应的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验九 黄芩苷对急性肺损伤大鼠TLR4和MAPK信号通路的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 不足及展望 |
| 致谢 |
| 在学期间主要研究成果 |
（5）干扰素调节因子家族成员在流感病毒诱导的局部和全身炎症反应中的表达模式（论文提纲范文）
| 提要 |
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第一篇 文献综述 |
| (一)流感病毒感染与其相关免疫应答 |
| 1.1 流感病毒简介 |
| 1.2 流感病毒与固有免疫 |
| 1.3 干扰素及其信号转导途径 |
| 1.4 Ⅰ型干扰素与炎症反应 |
| (二)干扰素调节因子家族成员及其免疫调节作用 |
| 2.1 IRF家族成员的结构特征 |
| 2.2 IRF家族成员的生物学功能 |
| 2.3 IRF3、IRF5和IRF7是TLR及 RLR信号传导中Ⅰ型 IFN表达的主要调控因子 |
| (三)寡脱氧核苷酸(oligodeoxynucleotides,ODN)的研究进展 |
| 3.1 免疫刺激性寡脱氧核苷酸的结构特征与功能 |
| 3.2 免疫抑制性寡脱氧核苷酸的结构特征与功能 |
| 课题设计思路 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 流感病毒感染后对局部和全身IRF家族成员表达水平的影响 |
| 前言 |
| 第一节 流感病毒感染人局部组织中IRFs的表达水平变化 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.1.1 患者鼻咽拭子标本采集 |
| 1.1.2 鼻咽拭子标本的病毒检测和分类 |
| 1.1.3 IAV、IBV和非呼吸道感染者临床指标采集 |
| 1.2 实验试剂与器材 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.3.1 IAV、IBV和非呼吸道感染患者鼻咽拭子标本的收集及研究流程图 |
| 1.3.2 鼻咽拭子标本的处理和病毒检测 |
| 1.3.3 Trizol法提取IAV、IBV和非呼吸道感染者鼻咽上皮细胞内总RNA并逆转录成cDNA |
| 1.3.4 RT-qPCR法检测流感病毒感染患者鼻咽拭子标本中IRF家族成员的m RNA表达水平 |
| 1.4 统计分析 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 不同流感病毒感染的鼻咽上皮细胞分类 |
| 2.2 IAV、IBV和非呼吸道感染患者临床资料分析 |
| 2.3 流感病毒感染患者鼻咽上皮细胞中IRF家族成员的m RNA水平检测 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二节 流感病毒感染小鼠局部和全身组织中IRFs的表达水平变化及GAAA ODN对其的调节作用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物和细胞 |
| 1.2 流感病毒 |
| 1.3 寡脱氧核苷酸 |
| 1.4 实验试剂与器材 |
| 1.5 实验方法 |
| 1.5.1 流感病毒的扩增和血凝效价的测定 |
| 1.5.2 流感病毒在MDCK细胞上半数组织细胞感染剂量(TCID50)的检测 |
| 1.5.3 流感病毒感染小鼠LD50的检测 |
| 1.5.4 流感病毒感染小鼠模型的建立 |
| 1.5.5 流感病毒感染小鼠肺及其他重要脏器组织中IRF家族m RNA水平的检测 |
| 1.5.6 流感病毒感染小鼠经GAAA ODN M1 干预处理后,小鼠肺及其他重要脏器组织中IRF家族m RNA水平的检测 |
| 1.6 统计分析 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 H1N1流感病毒的扩增和血凝效价的测定 |
| 2.2 H1N1流感病毒在MDCK细胞上半数组织细胞感染剂量的测定 |
| 2.3 流感病毒感染BALB/c小鼠的LD50测定 |
| 2.4 H1N1感染小鼠肺等脏器中IRF家族的m RNA表达谱及GAAA ODN M1对IRFs表达的调控作用 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二章 流感病毒感染人pDC样 CAL-1 细胞后对IRFs,TLR3/7,RIG-Ⅰ及其下游信号分子表达的影响 |
| 前言 |
| 第一节 流感病毒感染人pDC样 CAL-1 细胞IRF-IFN-Ⅰ信号通路相关因子的表达 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 细胞 |
| 1.2 流感病毒 |
| 1.3 实验试剂与器材 |
| 1.4 实验方法 |
| 1.4.1 流感病毒H1N1 感染不同时间对人pDC样 CAL-1 细胞IRF家族表达谱的影响 |
| 1.4.2 流感病毒H9N2 感染不同时间对人pDC样 CAL-1 细胞IRF家族表达谱的影响 |
| 1.4.3 流感病毒H1N1 感染不同时间对IRFs上游PRR受体信号通路(TLR3、TLR7、RIG-Ⅰ)和下游IFN-Ⅰ及炎症因子表达影响 |
| 1.4.4 分别用人重组干扰素(rIFN-α2b)和重组rIFN-γ处理CAL-1 细胞对IRFs及ISGs表达的影响 |
| 1.4.5 统计分析 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 流感病毒H1N1 感染对人pDC样 CAL-1 细胞IRF家族表达谱的影响 |
| 2.2 流感病毒H9N2 感染不同时间对人pDC样 CAL-1 细胞IRF家族表达谱的影响 |
| 2.3 流感病毒H1N1 感染不同时间对IRFs上游PRR受体信号通路(TLR3、TLR7、RIG-Ⅰ)和下游IFN-Ⅰ及炎症因子表达影响 |
| 2.4 分别用人重组干扰素(rIFN-α2b)和重组rIFN-γ处理CAL-1 细胞对IRFs及 ISGs表达的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二节 流感病毒对CAL-1 细胞IRF家族及其上下游信号分子表达调控的可能机制探讨 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 细胞 |
| 1.2 流感病毒 |
| 1.3 寡脱氧核苷酸 |
| 1.4 实验试剂与器材 |
| 1.5 实验方法 |
| 1.5.1 流感病毒感染人pDC样 CAL-1 细胞用人重组干扰素(rIFN-α2b)处理对IRF家族表达水平的影响 |
| 1.5.2 流感病毒感染人pDC样 CAL-1 细胞用人重组干扰素(rIFN-α2b)处理对TLR3/7及其下游信号分子表达水平的影响 |
| 1.5.3 流感病毒感染人pDC样 CAL-1 细胞同时用不同浓度的氯喹处理对IRF家族表达水平的影响 |
| 1.5.4 流感病毒感染人pDC样 CAL-1 细胞同时用不同浓度的氯喹处理对TLR3/7 及其下游信号分子表达水平的影响 |
| 1.5.5 流感病毒感染人pDC样 CAL-1 细胞同时用不同浓度的GAAA ODN A1 处理对IRF家族表达水平的影响 |
| 1.5.6 流感病毒感染人pDC样 CAL-1 细胞同时用不同浓度的GAAA ODN A1 处理对TLR3/7及其下游信号分子表达水平的影响 |
| 1.5.7 统计分析 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 重组rIFN-α2b,氯喹和GAAA ODN A1对H1N1感染的CAL-1 细胞中IRF家族表达谱的影响 |
| 2.2 重组IFN-α2b,氯喹和GAAA ODN A1对H1N1感染的CAL-1 细胞中TLR3/7 及其下游信号分子表达的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三节 流感病毒感染CAL-1 细胞后对IRF3、IRF5和IRF7 磷酸化水平的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 细胞 |
| 1.2 流感病毒 |
| 1.3 寡脱氧核苷酸 |
| 1.4 实验试剂与器材 |
| 1.5 实验方法 |
| 1.5.1 流感病毒感染人pDC样 CAL-1 及用GAAA ODN A1 处理对IRF3,IRF5,IRF7 的表达和磷酸化水平的影响 |
| 1.5.2 GAAA ODN A1对H1N1感染CAL-1细胞中IRF5核转位的影响 |
| 1.5.3 统计分析 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 流感病毒感染人pDC样 CAL-1 细胞及用GAAA ODN A1 处理对IRF3,IRF5,IRF7 的表达和磷酸化水平的影响 |
| 2.2 GAAA ODN A1对H1N1感染CAL-1细胞中IRF5核转位的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三章 不同单链RNA病毒对人pDC样 CAL-1 细胞中IRFs、TLR3/7和RIG-Ⅰ及其下游信号分子表达的影响 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 细胞 |
| 1.2 不同ssRNA病毒 |
| 1.3 实验试剂与器材 |
| 1.4 实验方法 |
| 1.4.1 不同流感病毒感染CAL-1 细胞中TLR3、7和RIG-Ⅰ及其下游信号分子m RNA水平动态变化 |
| 1.4.2 不同ssRNA病毒对IRF家族表达谱的影响 |
| 1.4.3 统计分析 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 不同流感病毒感染CAL-1 细胞中TLR3、7和RIG-Ⅰ及其下游信号分子mRNA水平动态变化 |
| 2.2 TNF-和 IFN-m RNA表达水平有可能是决定流感病毒致病性强弱和炎症强弱的重要指标 |
| 2.3 不同ssRNA病毒对IRF家族表达谱的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
| 附录 |
（6）Wnt5a与SOX2信号对BCG感染肺泡上皮细胞后凋亡和炎性反应的调控作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述及目的意义 |
| 1.1 结核病与结核分枝杆菌 |
| 1.1.1 结核病的流行病学 |
| 1.1.2 结核分枝杆菌 |
| 1.1.3 肺泡上皮细胞(AECS)与结核分枝杆菌相互作用的研究进展 |
| 1.2 Wnt5a信号通路 |
| 1.2.1 概述 |
| 1.2.2 Wnt5a信号在炎症性疾病的作用研究 |
| 1.2.3 Wnt5a信号对细胞凋亡的调节作用 |
| 1.3 SOX2信号通路 |
| 1.3.1 概述 |
| 1.3.2 SOX2信号对炎症反应的调节作用 |
| 1.3.3 SOX2信号对细胞凋亡的调节作用 |
| 1.4 Wnt信号与SOX2的相互作用研究进展 |
| 1.5 科学问题和研究目的意义 |
| 第二章 Wnt5a对BCG感染肺泡上皮细胞TLR信号介导的炎性反应调控作用研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 细胞系与菌株 |
| 2.2.2 试剂及常用耗材 |
| 2.2.3 主要仪器与设备 |
| 2.2.4 PCR引物 |
| 2.2.5 抗体 |
| 2.2.6 常用溶液的配置 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 实验技术路线 |
| 2.3.2 A549细胞培养 |
| 2.3.3 结核分枝杆菌培养 |
| 2.3.4 Wnt5a条件培养基制备 |
| 2.3.5 结核分枝杆菌感染A549细胞模型的建立 |
| 2.3.6 实时荧光定量PCR |
| 2.3.7 Western blotting分析 |
| 2.3.8 ELISA法检测Wnt5a蛋白浓度 |
| 2.3.9 MTT噻唑蓝比色法检测A549细胞存活率 |
| 2.3.10 数据分析 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 结核分枝杆菌感染对A549细胞Wnt5a信号通路的影响 |
| 2.4.2 外源Wnt5a促进BCG感染的A549细胞TLR信号相关蛋白的表达 |
| 2.4.3 外源Wnt5a促进BCG感染的A549细胞SOX2表达 |
| 2.5 讨论 |
| 第三章 Wnt5a信号调控BCG感染肺泡上皮A549细胞凋亡的作用研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 菌株与细胞系 |
| 3.2.2 主要试剂、实验耗材及试剂配制 |
| 3.2.3 主要仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 实验设计及技术路线 |
| 3.3.2 细胞复苏、传代、冻存和计数 |
| 3.3.3 BCG菌株培养 |
| 3.3.4 Wnt5a条件培养基制备 |
| 3.3.5 Wnt5a和BCG作用A549细胞后凋亡小体的检测 |
| 3.3.6 Wnt5a和BCG作用A549细胞后凋亡率的检测 |
| 3.3.7 Wnt5a和BCG作用A549细胞后总活性氧水平的检测 |
| 3.3.8 Wnt5a和BCG作用A549细胞后线粒体膜电位的检测 |
| 3.3.9 Wnt5a和BCG作用A549细胞后凋亡相关蛋白表达的检测 |
| 3.3.10 数据统计分析、软件作图 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 Wnt5a促进BCG诱导的A549细胞凋亡 |
| 3.4.2 Wnt5a增加ROS产生进而促进BCG诱导的A549细胞凋亡 |
| 3.4.3 Wnt5a/JNK信号介导的内源性凋亡途径促进BCG诱导的A549细胞凋亡 |
| 3.5 讨论 |
| 第四章 SOX2调控BCG感染肺脏上皮A549细胞炎性反应及细胞凋亡的作用研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 细胞系、菌株与慢病毒载体 |
| 4.2.2 主要试剂、耗材 |
| 4.2.3 主要仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 实验设计及技术路线 |
| 4.3.2 细胞系的培养 |
| 4.3.3 BCG菌株培养 |
| 4.3.4 SOX2过表达A549稳定转染细胞株的建立与鉴定 |
| 4.3.5 BCG感染A549细胞Wnt5a信号、TLR信号和细胞凋亡相关分子检测 |
| 4.3.6 数据统计分析 |
| 4.4 实验结果与分析 |
| 4.4.1 稳定转染过表达SOX2细胞株的建立与鉴定 |
| 4.4.2 过表达SOX2抑制BCG感染A549细胞Wnt5a/JNK信号转导 |
| 4.4.3 过表达SOX2抑制BCG感染A549细胞TLR信号介导的炎性反应 |
| 4.4.4 过表达SOX2抑制BCG诱导的A549细胞凋亡 |
| 4.5 讨论 |
| 第五章 结论和展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 中英文缩略词表 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（7）小麦阿拉伯木聚寡糖对LPS诱导的猪肺泡巨噬细胞炎症因子分泌的影响及作用机制（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 缩略词 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 文献综述 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 阿拉伯木聚寡糖 |
| 1.2.1 小麦AXOS简介 |
| 1.2.2 小麦AXOS的生物学功能 |
| 1.2.2.1 肠道益生活性 |
| 1.2.2.2 免疫调节活性 |
| 1.2.2.3 其他功能活性 |
| 1.2.3 其他AXOS的免疫作用 |
| 1.3 巨噬细胞的极化和免疫功能 |
| 1.3.1 巨噬细胞的极化 |
| 1.3.2 巨噬细胞的免疫功能 |
| 1.4 本研究的目的意义与主要内容 |
| 1.4.1 目的意义 |
| 1.4.2 主要内容 |
| 2 小麦AXOS对LPS诱导的巨噬细胞炎症因子和NF-κB信号通路的影响 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 试验材料 |
| 2.1.2 试验仪器 |
| 2.1.3 试验设计 |
| 2.1.4 样品分析 |
| 2.1.4.1 细胞培养 |
| 2.1.4.2 小麦AXOS溶液的配制 |
| 2.1.4.3 巨噬细胞活性测定 |
| 2.1.4.4 炎症因子的含量 |
| 2.1.4.5 Western Blot 测定 NF-kB 蛋白 |
| 2.1.4.6 荧光定量PCR检测炎症因子基因表达水平 |
| 2.1.5 数据处理和分析 |
| 2.2 试验结果 |
| 2.2.1 巨噬细胞活性 |
| 2.2.2 炎症因子影响 |
| 2.2.3 NF-κB p65及炎症因子mRNA表达的影响 |
| 2.2.4 AXOS对NF-κB信号通路的影响 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 3 结论与创新点 |
| 3.1 主要结论 |
| 3.2 创新点 |
| 参考文献 |
（8）雌激素受体对玉米赤霉烯酮诱导的肠道炎症反应的影响及其调控机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号及缩略语 |
| 引言 |
| 第一章 文献综述 |
| 1. 霉菌毒素玉米赤霉烯酮的研究进展 |
| 1.1 霉菌毒素的污染现状及毒性作用 |
| 1.2 玉米赤霉烯酮的研究进展 |
| 2. 玉米赤霉烯酮与肠道炎症反应 |
| 2.1 肠道炎症反应的研究进展 |
| 2.2 ZEA对肠道炎症反应影响的研究进展 |
| 3. 雌激素受体与肠道炎症反应 |
| 3.1 雌激素受体的结构、作用机制与分布 |
| 3.2 雌激素受体与肠道炎症的关系 |
| 3.3 雌激素受体影响肠道炎症的机制 |
| 4. NLRP3炎性小体与肠道炎症反应 |
| 4.1 炎性小体激活与疾病 |
| 4.2 NLRP3炎性小体的激活与表达 |
| 4.3 NLRP3炎性小体与肠炎的关系 |
| 4.4 炎性小体的转录调节因子 |
| 参考文献 |
| 第二章 ZEA诱导猪小肠上皮细胞炎症反应 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2. 结果 |
| 2.1 ZEA对IPEC-J2细胞活性的影响 |
| 2.2 ZEA对IPEC-J2氧化应激的影响 |
| 2.3 ZEA对IPEC-J2线粒体损伤的影响 |
| 2.4 ZEA对IPEC-J2细胞内炎性小体激活的影响 |
| 3. 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 ZEA诱导小鼠肠道炎症反应 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2. 结果 |
| 2.1 ZEA对小鼠肠道损伤的影响 |
| 2.2 ZEA对小鼠结肠组织NLRP3炎性小体及细胞因子的影响 |
| 2.3 ZEA对小鼠腹腔巨噬细胞氧化应激及线粒体损伤的影响 |
| 2.4 ZEA通过ROS影响小鼠腹腔巨噬细胞NLRP3炎性小体激活 |
| 3. 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 ZEA对DSS诱导的肠道炎症反应的影响 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2. 结果 |
| 2.1 ZEA对DSS诱导的IPEC-J2细胞炎症反应的影响 |
| 2.2 ZEA对DSS诱导的小鼠结肠炎的影响 |
| 2.3 ZEA对DSS诱导的小鼠结肠炎中NLRP3炎性小体表达的影响 |
| 2.4 不同处理中雌激素受体的表达变化 |
| 3. 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 ER对NLRP3炎性小体信号通路调控研究 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2. 结果 |
| 2.1 ER与NLRP3转录结合位点的预测 |
| 2.2 ER调控NLRP3基因的转录 |
| 2.3 ERα调控NLRP3炎性小体的表达与共定位 |
| 2.4 ERα拮抗剂促进DSS诱导的小鼠结肠炎恢复 |
| 2.5 ERα拮抗剂抑制结肠组织中NLRP3炎性小体表达与共定位 |
| 3. 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 论文创新点 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（9）肺泡巨噬细胞内IL-33/STAT3/MMP-2，9通路在LPS诱导的急性肺损伤中的作用机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一部分: LPS诱导的大鼠急性肺损伤模型构建及其支气管肺泡灌洗液中炎症因子水平研究 |
| 1. 前言 |
| 2. 材料与方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5.结论 |
| 第二部分: IL-33/STAT3信号通路在LPS诱导肺泡巨噬细胞分泌MMP-2和MMP-9 过程中的作用机制研究 |
| 1. 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5. 结论 |
| 第三部分: IL-33中和抗体对LPS诱导的急性肺损伤的保护作用研究 |
| 1. 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 中英文缩略词表 |
| 攻读学位期间公开发表的论文 |
| 致谢 |
（10）METRNL在支气管哮喘中表达上调并促进支气管上皮细胞CCR3的表达（论文提纲范文）
| 主要英文缩略语词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 综述 |
| 参考文献 |
| 在读期间文章发表情况 |
| 致谢 |
四、异氟醚对人肺泡巨噬细胞趋化因子和细胞因子mRNA表达的影响（论文参考文献）
- [1]健脾益肺Ⅱ号治疗慢阻肺临床疗效及减轻香烟暴露联合流感病毒感染小鼠肺炎症作用研究[D]. 蔡甜甜. 广州中医药大学, 2021(02)
- [2]固本止咳中药对COPD模型小鼠呼吸道损伤修复的调控机制研究[D]. 王明哲. 北京中医药大学, 2021(01)
- [3]脂肪间充质干细胞外泌体改善小鼠急性肺损伤的作用机制研究[D]. 夏良君. 南京中医药大学, 2021(02)
- [4]清金化痰汤及黄芩苷通过TLR4/MyD88/NF-κB/NLRP3通路抑制LPS诱导的急性肺损伤的研究[D]. 朱长乐. 北京中医药大学, 2020(04)
- [5]干扰素调节因子家族成员在流感病毒诱导的局部和全身炎症反应中的表达模式[D]. 五且昆·吐尔逊. 吉林大学, 2020(01)
- [6]Wnt5a与SOX2信号对BCG感染肺泡上皮细胞后凋亡和炎性反应的调控作用[D]. 杨易. 宁夏大学, 2020
- [7]小麦阿拉伯木聚寡糖对LPS诱导的猪肺泡巨噬细胞炎症因子分泌的影响及作用机制[D]. 章倩晖. 浙江大学, 2020(01)
- [8]雌激素受体对玉米赤霉烯酮诱导的肠道炎症反应的影响及其调控机制研究[D]. 范文韬. 南京农业大学, 2019(08)
- [9]肺泡巨噬细胞内IL-33/STAT3/MMP-2，9通路在LPS诱导的急性肺损伤中的作用机制研究[D]. 梁亚峰. 苏州大学, 2019(04)
- [10]METRNL在支气管哮喘中表达上调并促进支气管上皮细胞CCR3的表达[D]. 闫小逸. 南京医科大学, 2017(05)