一、用甲醇酵母表达经基因优化的HPV 6型L1蛋白（论文文献综述）
丁永桢[1]（2018）在《丹酚酸B防治人乳头瘤病毒感染及其机制研究》文中指出研究背景:宫颈癌（Cervical cancer,CC）是目前最常见的妇科恶性肿瘤之一,其已经成为15至44岁女性癌症死亡的第二大主要病因。流行病学研究表明,99.7%的宫颈癌患者均伴有高危型人乳头瘤病毒（Human papillomavirus,HPV）感染。人乳头瘤病毒是嗜上皮性DNA病毒,在众多的HPV亚型中,约40种能感染生殖道粘膜,其中高危型HPV-16和18型感染导致了 70%以上的宫颈癌的发生,低危型HPV如HPV-6、11等则主要引起感染部位的低度病变、生殖器或皮肤疣和尖锐湿疣。高危型HPV病毒的持续性感染是导致细胞发生癌变的重要条件。通常,病毒感染会导致细胞分泌大量炎症因子,从而导致慢性炎症的发生。而慢性炎症在在肿瘤形成过程中发挥着重要的作用,癌相关炎症因子的高表达能促进肿瘤的侵袭,从而促进肿瘤远处转移和血管生成。随着肿瘤的生长,其内部供氧不充分,该缺氧环境导致肿瘤细胞生成更多新生血管,以补给供氧。同时,癌相关炎症因子通过激活多种信号通路,促进肿瘤血管生成,加快肿瘤生长和转移。中药单体丹酚酸B（Salvianolic acid B,SalB）是丹参主要的水溶性组分之一,在众多丹参的酚酸提取物中含量最为丰富,且具有多种生物学活性,其被报道具有抗炎、抗氧化、调节凋亡、抑制血小板聚集、改善冠状微循环等作用。我们前期研究发现,丹酚酸B能有效抑制三株HPV假病毒株感染靶细胞,本研究深入探讨了丹酚酸B发挥抗HPV病毒的作用机制。另外,由于丹酚酸B本身具有较好的抗炎活性,本研究进一步探讨了丹酚酸B对HPV感染后细胞炎症因子表达和肿瘤细胞血管生成的影响。本文研究的丹酚酸B来源广泛、价格低廉、水溶性高、毒副作用小,且具有高效抗HPV及抗炎活性,因此极有可能被开发成为一类新的安全高效的双功能抗HPV杀微生物剂用于防治HPV感染,减少宫颈癌的发生。研究方法:1.体外假病毒体系评估丹酚酸B抗HPV病毒效果,Time-of-addition、流式细胞术、Temperature shift、表面等离子共振等方法检测丹酚酸B发挥抗病毒作用的可能作用机制和靶点;2.荧光定量PCR、酶联免疫吸附（ELISA）法检测丹酚酸B对HPV感染诱发的炎症因子表达的影响;3.荧光定量PCR、酶联免疫吸附（ELISA）、Western blotting法检测丹酚酸B对氯化钴诱导的宫颈癌细胞HIF-1α、VEGF蛋白及其调节通路的影响;4.MTT法检测丹酚酸B对正常生殖道细胞和子宫颈癌细胞的毒性作用;通过病理切片、ELISA及免疫组化法检测丹酚酸B凝胶对家兔阴道粘膜的刺激性。研究结果:1.丹酚酸B能剂量依赖性地抑制HPV病毒感染靶细胞,其主要抑制病毒进入靶细胞的早期阶段,能与病毒的主要衣壳蛋白L1特异性结合,进而抑制HPV病毒颗粒黏附于靶细胞表面;2.丹酚酸B能剂量依赖性地下调HPV感染HeLa细胞后炎症因子IL-1β、IL-6、IL-8 mRNA的表达,降低IL-6、IL-8蛋白的表达;3.丹酚酸B能剂量依赖性地下调氯化钴诱导的宫颈癌Siha细胞HIF-1α及下游VEGF蛋白的表达,其通过影响PI3K/AKT和ERK1/2通路抑制HIF-1α蛋白的合成;4.丹酚酸B对正常生殖道细胞和子宫颈癌细胞基本无毒,其CC50均大于800μg/ml。家兔阴道刺激性实验结果显示,丹酚酸B凝胶对家兔阴道上皮无损伤,对阴道粘膜炎症因子的释放无明显影响,不会引起的阴道上皮细胞和基质细胞的异常增殖。研究结论:丹酚酸B能抑制HPV病毒感染靶细胞的早期阶段,其直接靶向病毒L1蛋白,阻止病毒黏附入侵靶细胞,进而发挥抗病毒作用。此外,丹酚酸B能够有效抑制HPV感染所诱发的炎症反应和肿瘤细胞血管生成。丹酚酸B对正常生殖道细胞和子宫颈癌细胞基本无毒,不会诱导家兔阴道粘膜炎症反应,安全性较高,因此极有可能被开发成为一类安全高效的多功能抗HPV杀微生物剂用于防治HPV感染。
丁永桢,温嘉泳,赖宝龙,刘叔文,李琳[2]（2018）在《咖啡酸抗人乳头瘤病毒感染的研究》文中提出宫颈癌（Cervical cancer,CC）是妇科最常见的恶性肿瘤之一,而高危型人乳头瘤病毒（Human papillomavirus,HPV）的持续感染是诱导宫颈癌发生的重要危险因素。目前全球抗HPV药物极为匮乏,寻找新的高效、低毒、价廉的广谱抗病毒药物对HPV感染的防治至关重要。本文研究发现,咖啡酸（Caffeic acid,CA）能有效抑制三株不同亚型的HPV感染（HPV-6、HPV-16及HPV-18）,其半数抑制浓度在12.116.5μg/mL之间。Time-of-addition结果证实,咖啡酸对病毒进入靶细胞的早期阶段具有一定抑制作用。Temperature shift实验发现,咖啡酸能一定程度抑制HPV病毒颗粒黏附于靶细胞表面。表面等离子共振分析表明,咖啡酸与HPV-16型病毒的主要衣壳蛋白L1具有极强的结合力。综上,咖啡酸具有较高的抗HPV活性,其作用机制可能是与病毒衣壳蛋白L1结合,从而阻止病毒黏附并进入靶细胞。咖啡酸具有安全、价廉、易得等优势,有望被开发成新型的抗HPV病毒感染的抑制剂,因其尚能同时抵抗多种性传播性病毒的感染,对HPV并发的多种性传播性疾病具有较好的预防作用,应用前景广泛。
金晓媚[3]（2014）在《毕赤酵母不同启动子的作用特点及在HPV16 L1表达中的应用》文中认为研究目的探讨不同毕赤酵母启动子在不同培养条件下控制异源蛋白表达的特点；探讨不同启动子及其组合应用对人乳头瘤病毒16型L1蛋白（HPV16L1）表达的影响；此外,探讨通用质粒载体系统在毕赤酵母和汉逊酵母间的穿梭表达应用。本研究致力于从启动子合理应用角度,优化异源蛋白在酵母中的表达与制备。研究方法以毕赤酵母GS115基因组为模板,经PCR扩增获得PTEF1和PFLD DNA片段,经基因重组分别替换商业化的毕赤酵母载体pPink-LC和pPink-HC中的PAOX1,以绿色荧光蛋白（GFP）为报告基因；在不同碳源（葡萄糖、甘油、甲醇、山梨醇）背景下探讨PTEF1指导异源蛋白表达的水平以及与不同碳源利用及菌体生长状态的相关性,此外,考察PTEF1指导HPV16L1表达的情况；通过不同碳、氮源的组合,探讨PFLD指导GFP及HPV16L1表达的特点；通过构建PAOX1和PTEF1双启动子表达载体,或多次转化整合两个表达单元于同一染色体中,探讨启动子联合应用对提高HPV16L1表达水平的影响；通过构建基于汉逊酵母rDNA序列以及汉逊酵母、毕赤酵母来源的不同启动子的通用表达载体,分别转化毕赤酵母和汉逊酵母,探讨其介导在两个宿主系统中的基因整合及蛋白表达。研究结果组成型的PTEF1在以葡萄糖（Glu）或甲醇（M）作为碳源的培养条件下,24h可获得GFP及HPV16L1的高效表达,之后蛋白表达量急剧下降,而在甘油（Gly）或山梨醇（Sor）培养基中获得了持续高水平表达。以葡萄糖及甘油为碳源的菌获得了更快的生长速率；PFLD在Sor+NH4+、Sor+MA、M+NH4+和M+MA四种组合诱导培养基中,在24h、48h、72h都获得高效表达,在M+NH4+和M+MA中表达量最高,而在Glu+NH4+Glu+MA、Gly+NH4+和Gly+MA中则仅获得较少或无明显蛋白表达；PAOX1和PTEF1启动子控制的表达单元可共表达GFP和/或HPV16L1,但蛋白水平较之单个表达单元有所下降；汉逊酵母的rDNA及自主复制序列（ARS）可介导质粒在毕赤酵母和汉逊酵母中的转化,但转化及整合效率在毕赤酵母中较低,通过无抗性压力多次传代结合抗性筛选,含有汉逊rDNA的质粒能够稳定整合于毕赤酵母染色体基因组中；启动子PMOX以及PAOX1和PTEF1可在两个宿主系统中工作；通用载体介导了GFP及HPV16L1在两个酵母系统中的有效表达。研究结论本研究应用不同启动子在毕赤酵母中成功实现了异源蛋白的表达；显示了不同培养条件对启动子作用及蛋白表达具有显着影响；证实不同启动子控制的多表达单元可实现目的蛋白共表达,但存在相互干扰现象；构建了可介导在毕赤酵母和汉逊酵母中穿梭表达的通用载体系统。研究通过启动子的合理应用,实现了HPV16L1高效表达,有助于低成本、多价HPV疫苗研发；此外,为基于酵母系统的基因重组蛋白的表达与制备提供了一种有效的优化策略。
王丽媛[4]（2010）在《苦瓜map30基因的优化及其转化毕赤酵母的研究》文中研究指明MAP30 （Momordica anti-HIV protein of 30 kD）是1990年,Lee-Huang等人首次从苦瓜果实和种子粗提物中分离得到的分子量为30kD I核糖体失活蛋白。MAP30具有抗病毒、抗肿瘤、抗菌等多种生物活性,能够作用于病毒感染的细胞内的核糖体,干扰蛋白质的合成,同时作用于病毒DNA、RNA抑制病毒的复制和转录,并且MAP30针对底物的保守区发挥作用,不易产生抗药性。此外,MAP30可以特异的诱导肿瘤或肿瘤转化细胞的凋亡。MAP30对HIV、疱疹病毒等有明显的抑制作用,对乙肝、乙脑、流脑、乳房肿瘤、黑色素瘤、流感等也有不同的抑制作用,但对正常的细胞无毒副作用,是一种很有前景的新型抗肿瘤、抗病毒候选药物。本研究利用PCR技术扩增苦瓜总DNA得到未优化map30基因,采用化学合成方法得到经密码子优化的map30基因；将基因片段插入到克隆载体pMD18T-Vector中,酶切鉴定正确后进行序列测定,结果证明得到的优化map30基因序列同未优化map30基因序列与预计的核苷酸序列完全一致；序列鉴定正确之后,构建了携带有map30基因的毕赤酵母新型表达载体质粒map30/pPGAPHa,重组质粒经酶切鉴定正确后进行序列测定,序列鉴定正确之后,用BglⅡ线性化重组质粒,通过电转化的方法转化到宿主菌GS115,通过SDS-PAGE筛选鉴定。证实重组质粒已转入到宿主菌中,并获得了表达。重组酵母表达上清液经SDS-PAGE分析,初步确定重组蛋白分泌表达。Westen-blot显示,重组表达的蛋白在30KD处有一特异条带,而空载体转化菌诱导上清对照未见特异性条带,证实表达产物具有His-tag抗原性,间接说明融合蛋白为重组MAP30。通过SDS-PAGE分析发现,经过密码子优化的基因蛋白的表达量要稍高于未经优化的基因,这与我们预期的一致。
李娜[5]（2010）在《黑曲霉脂肪酶基因优化设计、合成及其在酵母中的表达》文中研究说明脂肪酶（Triacylgycerol acylhydrolase, Lipase, EC3.1.1.3）,是一类水解酶,广泛存在于植物种子,动物组织及微生物体中。能催化长链脂肪酸甘油酯水解为长链脂肪酸和甘油。黑曲霉脂肪酶是重要的工业用酶,在食品、制药及前体化合物的合成和手性化合物的拆分等方面有广泛的用途。获得高效表达黑曲霉脂肪酶的基因工程菌是该酶工业化生产的前提。本文以毕赤酵母分泌表达能提高目的蛋白表达量为研究目标,对黑曲霉脂肪酶基因进行了优化设计、合成并在毕赤酵母中进行了表达,主要工作包括以下内容：1、根据毕赤酵母密码子的偏爱性,对已有的黑曲霉脂肪酶基因lip的带信号肽序列的基因和成熟肽基因5’端的99个氨基酸进行突变,并合成突变引物。以原有的基因为模板PCR扩增得到突变基因的序列,与pPIC9K构建重组表达载体pPIC9K-lipm和pPIC9K-lipm-27,并在毕赤酵母GS115中进行分泌表达,摇瓶水平诱导酶液经SDS-PAGE检测表明有蛋白表达,但检测其酶活性较低。2、从Genbank已登录的黑曲霉脂肪酶基因（GenBank Accession No. DQ647700）出发,对lipA基因进行生物学分析。分析表明该基因全长1044bp,编码一个348氨基酸的多肽,其中编码成熟肽基因序列长894bp,编码298氨基酸成熟肽。其中（G+C）%含量为55.59%,密码子第三位GC碱基含量为66.1%。按P.pastoris密码子偏爱性,密码子分析显示基因中RSCU值<0.3的密码子数量为190个,占整个基因密码子的63.7%。对lipA基因mRNA分析表明,lipA基因mRNA折叠后最小自由能△G=-293.74kcal/mol。确定优化方案设计lipA基因,并人工合成lipAm基因。根据毕赤酵母密码子偏爱性,去除黑曲霉脂肪酶基因中酵母表达低频率密码子,替换为酵母高频密码子,获得能在毕赤酵母中高效表达的黑曲霉脂肪酶基因lipAm,并在合成基因的5’端加入EcoR I酶切位点,3’端加入Not I酶切位点,以便基因转入表达载体pPIC9K中。3、经人工合成及序列测定以后,构建了优化黑曲霉脂肪酶基因酵母表达载体pPIC9K-lipAm及pPIC9K-lipAm。经Sal I线性化后,电击转化巴斯德毕赤酵母GS115,经MD和MM平板筛选、PCR检测获得阳性重组酵母,实现了lipAm基因在酵母中的分泌表达。结果表明,摇瓶水平诱导120h后,其优化后的lipAm基因重组酵母酶活为优化前酶活的5倍。
邹立扣[6]（2007）在《优化设计的植酸酶phyC基因及phyA～m-phyCs基因在毕赤巴斯德酵母中的表达研究》文中进行了进一步梳理植酸酶作为畜禽及水产等动物的一种绿色饲料添加剂，已日益广泛使用于饲料工业中，其使用效果已在世界范围内得到了确证。根据其最适pH值，植酸酶主要分为酸性（EC3．1．3．8，phyA基因编码）及中性植酸酶（EC3．1．3．26，phyC基因编码）。其中来源于真菌的酸性植酸酶，其酶促反应的pH有效作用范围在2.5～5.5之间，目前，以对真菌来源的酸性植酸酶研究最多，并进行了规模化发酵生产。而中性植酸酶其酶促反应的pH有效作用范围在6～9之间，由于研究较少，产酶量较低等原因的尚无商品投入市场。而对于融合植酸酶的研究也未见报道。为提高中性植酸酶的产量，本论文首次优化设计了中性植酸酶phyC基因，获得了优化设计的phyCs基因，并现实了其在毕赤巴斯德酵母的表达；为拓宽植酸酶的pH作用范围，降低生产成本，本研究创造性地将酸性植酸酶phyAm及中性植酸酶phyCs基因融合连接，并首次现实了融合基因phyAm-phyCs在毕赤巴斯德酵母的表达；完成了对重组酵母菌的液体发酵实验；并对重组植酸酶的酶学性质进行了研究。本论文主要开展了以下研究：1．从课题组成功克隆的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）WHNB02中性植酸酶基因phyC（GenBankNo：AFAY220075）出发，对phyC基因进行生物学分析。分析表明该基因全长1152bp，编码一个383个氨基酸的多肽，其中编码成熟肽基因序列长1074bp，编码358氨基酸成熟肽。其中（G+C）％含量为46.2％，密码子第三位（G+C）％碱基含量为56.7％；加上毕赤酵母α因子信号肽后（G+C）％为44.3％，密码子第三位（G+C）％碱基含量为43.6％。按P．pastoris密码子偏爱性，密码子分析显示基因中RSCU值＜0.3的密码子数量为118个，占整个基因密码子的33％。对phyC基因mRNA分析表明，phyC基因mRNA折叠后最小自由能△G=-437.30 kcal／mol，其起始密码子被包裹在mRNA折叠所形成的发夹环中。2．确定优化方案设计phyC基因，并首次人工合成phyCs基因。全方位改造天然phyC基因序列，根据毕赤酵母密码子偏爱性，去除植酸酶基因中酵母表达低频密码子，替换为酵母高频密码子，获得能在毕赤酵母中高效表达的中性植酸酶优化基因长度为1074bp的phyCs，改造后的基因与phyC基因的同源率为73.5％，（G+C）％变为49.1％，密码子第三位GC碱基含量变为60.1％；加上毕赤酵母α因子信号肽后（G+C）％变为46.2％，密码子第三位GC碱基含量变为52％；消除了序列中的AT富含区；自由能△G由提高至-434.90kcal／mol，其起始密码子并为被包裹在mRNA折叠所形成的发夹环中；在合成基因上游5’端加入SnaBI酶切位点，下游3’端加入NotI酶切位点，以便基因转入表达载体pPIC9K。3．经克隆及序列测定后，首次构建了优化中性植酸酶基因酵母表达载体pPIC9K-phyCs。经SacI线性化后，电转化毕赤巴斯德酵母宿主菌GS115，经MD和MM平板筛选、PCR检测和酶活性测定，获得阳性重组酵母，实现了phyCs基因在酵母中的分泌表达。结果表明，经甲醇诱导摇瓶发酵120h后，优化phyCs基因重组酵母酶活达到18.5U／ml（WEBI）为优化前酶活的9倍，经液体分批补料发酵96h后，中性植酸酶酶活达到54U／m1（wBSG），由此可见，中性植酸酶产量得到大幅度提高，SDS-PAGE分析显示，诱导植酸酶的分子量为51kDa，去糖基化后植酸酶大小为42kDa。4．为拓宽植酸酶的pH作用范围，生产出满足单胃动物及水产动物的新型植酸酶，降低生产成本，构建了植酸酶融合phyAm-phyCs基因表达载体pPIC9K-AmCs。从酸性植酸酶基因phyS（GenBank No：AF218813）出发，根据phyAm（经81位、82位Arg密码子进行同义突变）、phyCs基因序列及毕赤巴斯德酵母表达载体pPIC9K多克隆位点序列特点，采用PCR法获得植酸酶phyAm基因表达片段（上游插入SnaBI酶切位点，下游插入AvrⅡ酶切位点），将扩增片段连入pUCm-T获得克隆载体pUCm-phyAm；采用PER法获得植酸酶phyCs基因表达片段并加入接头（G4S）3（上游插入AvrⅡ酶切位点，下游插入NotⅠ酶切位点），将扩增片段连入pUCm-T获得克隆载体pUCm-phyCs。AvrⅡ，NotⅠ双酶切克隆载体pUCm-phyCs及表达载体pPIC9K，成功构建了融合植酸酶基因中间表达载体pPIC9K—phyCs。经酶切及序列测定后，SnaBI，AvrⅡ双酶切pPIC9K-phyCs及pUCm-phyAm，本研究创造性地酸性植酸酶phyAm及中性植酸酶phyCs基因融合连接，并构建了表达载体pPIC9K-phyAmCs。5．BspEI线性化表达载体pPIC9K-phyAmCs后，电转化毕赤巴斯德酵母宿主菌GS115，首次实现了融合基因phyAm-phyCs在毕赤巴斯德酵母的表达。经MD和MM平板筛选、PCR检测和酶活性测定，获得阳性重组酵母，首次实现了phyAm-phyCs融合植酸酶基因在毕赤巴斯德酵母中分泌表达。研究结果表明，经甲醇诱导摇瓶发酵120h后，酶活达到20.5U／ml（wEBI）。发酵结果显示，发酵84h后融合植酸酶的酶活达到176U／ml。SDS-PAGE分析表明，诱导融合植酸酶糖基化较严重，去糖基化后植酸酶大小为94.6kDa，而酸性植酸酶去糖基化后大小为52.6kDa，由此可见融合植酸酶于酵母中表达成功。6．对表达中性植酸酶、融合植酸酶的酶学性质进行了研究。经过硫酸铵沉淀、乙醇丙酮沉淀、透析、浓缩及层析离子交换纯化后，测定了重组中性及融合植酸酶的热稳定性值、最适反应pH值及最适反应温度等酶学性质。结果显示重组中性植酸酶最适反应温度为70℃，最适pH值为7.5，pH6-9时植酸酶保持了较高的酶活性，80℃处理5分钟及10分钟残留酶活分别保持在97％及83％左右。与未优化前相比，pH作用范围从6-8扩大为6-9，最适反应温度提高了5℃，热稳定性相差不大。去糖基化后测定酶学性质显示植酸酶最适反应温度、最适pH值没有发生变化，但热稳定性下降，80℃处理5分钟及10分钟残留酶活分别保持在77％及70％左右，比去糖基化前下降20％及13％。由此可见，优化重组植酸酶与未优化前植酸酶酶学性质相比，最适反应温度提高，pH值作用范围增大，糖基化对中性植酸酶的热稳定性有较大影响。融合植酸酶纯化后，结果显示重组融合植酸酶最适反应温度为55℃，最适pH值出现三个峰值分别为2.5，5.5-6.0及7.0，pH5.5时酶活最高，pH7.0时候酶活为5.5的84％，pH2.5时酶活为5.5的82％。80℃处理5分钟及10分钟残留酶活分别保持在63％左右，85℃、90℃、95℃及100℃处理5分钟及10分钟残留均保留在50％-60％左右。由此可见，融合植酸酶pH作用范围变宽，其在pH2.5-7范围内均能保持较高酶活，与酸性植酸酶相比融合植酸酶的热稳定性也有一定的提高。本文首次实现了优化设计并人工合成的中性植酸酶基因phyCs在毕赤巴斯德酵母中的表达，与未优化相比酶活提高了9倍；创造性地现实了融合植酸酶基因phyAm-phyCs在毕赤巴斯德酵母的表达，表达的融合植酸酶具有较宽的pH作用范围，其在pH2.5-7范围内均能保持较高酶活，且具有较好的热稳定性；首次完成了对重组中性、酸性植酸酶酵母菌的液体发酵实验，中性植酸酶及融合植酸酶液体分批补料发酵后，酶活分别达到58U／ml和176ml。
谢飞[7]（2007）在《人乳头瘤病毒18型基因工程预防性疫苗研究》文中进行了进一步梳理宫颈癌和宫颈癌前病变是全世界妇女健康的一个主要问题。临床学，分子生物学，和流行病学调查已经证明人乳头瘤病毒（human papillomavirus，HPV）是宫颈癌和宫颈非典型增生的主要病因。99％的宫颈癌患者被检测含有高危型HPVs，最常见的类型有16，18，31，和45。每年，全世界约有470，000例宫颈癌患者被诊断出来，有一半的妇女将痛苦地死亡。在美国，每年要进行5千万例巴氏试验，他们发现约有1.2百万例低度宫颈非典型增生（Cervical intraepithelial neoplasia[CIN]1），300，000例高度宫颈非典型增生（CIN2／3）和10，000例宫颈癌。在美国，每年用于宫颈癌的筛选和治疗的医疗费估计在60亿美元。虽然在发达国家通过巴氏试验大幅度降低了这种疾病的发病率，在美国2005年仍然有3，710人死于宫颈癌。在世界其它地方，大多数妇女不能进行常规妇科检测和筛选，宫颈癌在女性肿瘤死亡率中居第2位，继乳腺癌之后。现在治疗宫颈非典型增生仅限于切除或烧蚀方法来移除或破坏宫颈组织。这样治疗的有效率大约达到90％，但可能复发和带来经济负担。外科治疗只是切除宫颈非典型增生组织，那些似乎正常的感染HPV的组织而未处理。因此根除这种感染最理想的方法是用疫苗，就像乙肝预防乙型肝炎一样，在青少年没有遇到HPV之前就注射预防性疫苗。对于那些已经感染的妇女和遭受早期宫颈癌的患者可以用正在研究中的治疗性疫苗。Merck公司用酿酒酵母表达系统研制的HPV6，11，16，18型四价疫苗，商品名Gardasil（嘉德西哥）于2006年6月8日被美国FDA批准上市。葛兰素史克（GSK）公司采用杆状病毒昆虫细胞表达系统研制的HPV16／18型两价疫苗也已接近完成Ⅲ期临床研究，可能在2007年10月获得批准上市。本研究主要是从Genebank中查出所有的较全18L1基因序列，并按照毕赤酵母密码子偏爱性原则，优化设计出HPV18L1基因（1725bp）并合成全长序列，然后利用毕赤酵母表达载体pAO819r表达载体，在体外构建含一个和二个拷贝的L1基因载体pAO819r-L1和pAO819r-L1Ⅱ。线形化后转化到Gs115酵母细胞，经G418抗性筛选获高拷贝工程菌并用甲醇诱导表达。构建了DNA疫苗载体pDRVI1.0-18L1，大提质粒后免疫BalB／C小鼠制备抗体，为研制HPV18型诊断试剂和抗原鉴定提供科学实验依据。表达产物采用化学发光Western blot鉴定，用自制抗HPV18 L1蛋白鼠血清作为一抗，在55KDa处有诱导蛋白免疫印迹出现。证明该表达系统能表达出HPV18L1蛋白。细胞破碎后经过超速梯度离心的纯化方法，得到的样品在电镜下观察到HPV18的病毒样颗粒。筛选出毕赤酵母高表达株后，进行了5L发酵罐的发酵工艺，菌体破碎工艺和纯化工艺摸索。实验中构建的毕赤酵母表达菌株，可经甲醇诱导表达HPV18L1晚期蛋白，表达的L1能在细胞内自主组装成病毒样颗粒，而且能在廉价的培养基上快速生长到高细胞密度，有利于在工业上进行高密度发酵。本研究为HPV18基因工程疫苗的后续研发奠定了坚实的基础。
董金蓉[8]（2007）在《人乳头瘤病毒16型晚期蛋白L1预防性疫苗的研究》文中研究指明人乳头瘤病毒（HPV）感染属于严重的性传播疾病，给人类健康带来很大的影响，临床学、分子生物学和流行病学调查已经证明人乳头瘤病毒是宫颈癌的主要病因，并且随着科学技术的快速发展，分子生物学和基因工程技术的应用不断进步，预防和治疗宫颈癌的疫苗倍受许多科学家的重视。因此，此项疫苗的研究具有非常重要的社会效益和经济效益。目前大多数关于HPV疫苗的研究都是以其晚期蛋白L1或L1+L2所形成的病毒样颗粒（VLPs）为基础进行的，在本实验中，我们应用毕赤酵母表达系统开展了基因工程HPV16L1预防性疫苗的研究工作，取得了一些进展，为该疫苗的进一步发展奠定了基础。实验期间主要得到了以下几个方面的结果：1)搜索Genebank中有关HPV16L1的基因序列，共搜索到30条较完整的序列，用软件AlignX进行序列比对，确定同源性最大的氨基酸序列，再根据毕赤酵母密码子进行优化，送上海生工合成，但三个月后送来两个片段，两片段间有一段重复序列（其中都含有BglⅡ的酶切位点），将两个片段分别酶切后通过BglⅡ进行连接，将连接产物作为模板，进行PCR反应，将其产物进行鉴定，合成了全长为1536bp的HPV16L1基因。2)构建了酵母重组质粒pAO819-16L1，经酶切鉴定正确后通过电击转化到酵母菌株GS115中，经G418抗性筛选获高拷贝工程菌并用甲醇（1％）诱导进行表达，每隔24h补加甲醇1％，在诱导后48h、72h和96h收菌，用Western Blot鉴定发现在55KD处出现特异性的条带，而阴性对照中未出现目的条带，发现诱导后72h表达量最高。3)构建原核重组质粒pET43.1a-16L1，经酶切鉴定正确后转化至BL21 codonplus（DE3）和BL21 codonPlus（DE3）-RILP菌株中进行表达，目的蛋白以包涵体的形式存在，通过8M尿素变性处理后过离子交换树脂，分阶段进行洗脱，0.1MNaCl可洗脱杂蛋白，0.5MNaCl可洗脱目的蛋白，纯度可达80％以上，以便对酵母表达的目的蛋白进行阳性对照。4)构建了真核重组质粒pDRVI1.0-16L1，经酶切和测序鉴定正确后，用试剂盒大提质粒免疫小鼠，共免疫四针，每次免疫后通过电穿孔加强免疫效果，制备了抗HPV16L1的抗血清，通过WB鉴定后发现该抗体能产生特异性的条带，滴度较高，但特异性不强。
牛俊[9]（2007）在《人乳头瘤病毒16亚型L1基因在毕赤酵母GS115中的优化表达》文中进行了进一步梳理优化HPV16L1基因在Pichia Pastoris酵母中的表达。首先用酵母偏爱密码子对HPV16型L1基因进行优化并用引物延伸法合成该基因,将该基因构建到分泌型酵母表达载体pPICZαB形成整合质粒,电击转化GS115酵母细胞,筛选阳性重组子,经SDS-PAGE电泳、Western-Blot检测,选取表达量较高的菌株进行摇瓶表达,并摸索优化表达条件,5L发酵罐表达蛋白,初步建立稳定的发酵工艺。发酵上清经SDS-PAGE电泳检测显示,其中有特异蛋白条带,且在第四天表达量最高,表达产物单体分子量为55,000Da左右。发酵上清液经纯化,可获得纯度为90%以上的HPV16L1蛋白,电镜观察,所得HPV16L1蛋白可自组装成病毒样颗粒（VLPs）,直径约为55nm。结果表明,HPV16L1基因经过密码子优化和发酵条件的摸索,在Pichia Pastoris酵母中能够稳定地表达。
林晓华,吴宁,侯丽辉,吴效科[10]（2006）在《人乳头瘤病毒与宫颈肿瘤关系的研究进展》文中认为宫颈病变是女性最常见的疾患之一,其患病率以每年2%3%的速度上升。近年来,年轻宫颈疾病患者有明显上升趋势。研究发现,人乳头瘤病毒（HPV）与宫颈疾病关系密切,感染了某些类型的HPV很有可能最终导致宫颈癌变,故日益受到众多学者的重视,现对HPV与宫颈疾病的研究进展作一综述。
二、用甲醇酵母表达经基因优化的HPV 6型L1蛋白（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、用甲醇酵母表达经基因优化的HPV 6型L1蛋白（论文提纲范文）
（1）丹酚酸B防治人乳头瘤病毒感染及其机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一章 丹酚酸B抗HPV病毒活性及其机制研究 |
| 一 实验材料与仪器 |
| 二 实验方法 |
| 三 实验结果 |
| 四 小结 |
| 第二章 丹酚酸B抑制HPV诱导的炎症反应 |
| 一 实验材料与仪器 |
| 二 实验方法 |
| 三 实验结果 |
| 四 小结 |
| 第三章 丹酚酸B抑制宫颈癌细胞Siha血管生成 |
| 一 实验材料与仪器 |
| 二 实验方法 |
| 三 实验结果 |
| 四 小结 |
| 第四章 丹酚酸B的安全性评价 |
| 一 实验材料与仪器 |
| 二 实验方法 |
| 三 实验结果 |
| 四 小结 |
| 全文结论 |
| 讨论与展望 |
| 参考文献 |
| 中英文缩写词对照表 |
| 成果 |
| 致谢 |
（2）咖啡酸抗人乳头瘤病毒感染的研究（论文提纲范文）
| 材料与方法 |
| 1细胞、质粒与试剂 |
| 2 HPV假病毒包装 |
| 3 HPV假病毒滴度测定 |
| 4 HPV假病毒抑制实验 |
| 5 Time-of-addition分析 |
| 6 Temperature shift分析 |
| 7 Time-of-removal分析 |
| 8 HPV16L1蛋白的表达和纯化 |
| 9表面等离子共振 (Surface plasmon resonance, SPR) 分析 |
| 10细胞毒性实验 |
| 11统计学方法 |
| 结果 |
| 1咖啡酸能显着抑制三种亚型HPV感染靶细胞 |
| 2咖啡酸对病毒进入靶细胞的早期阶段具有一定作用 |
| 3咖啡酸能抑制HPV病毒黏附靶细胞 |
| 4咖啡酸对宿主细胞相关受体无影响 |
| 5咖啡酸能特异性结合HPV的L1衣壳蛋白 |
| 6咖啡酸对靶细胞的毒性较低 |
| 讨论 |
（3）毕赤酵母不同启动子的作用特点及在HPV16 L1表达中的应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 实现病毒样颗粒的高效制备有助于降低疫苗成本、促进推广应用 |
| 1.1.1 HPV引起的子宫颈癌危害严重 |
| 1.1.2 HPV疫苗研究进展 |
| 1.2 甲醇酵母系统是应用广泛的异源蛋白表达系统，在HPV病毒样颗粒制备中具有诱人前景 |
| 1.2.1 毕赤酵母表达系统 |
| 1.2.2 汉逊酵母表达系统 |
| 1.2.3 HPV L1在酵母中的表达研究 |
| 1.3 毕赤酵母启动子在异源基因表达中应用的研究进展 |
| 1.4 本课题主要研究内容、目的及意义 |
| 1.4.1 研究主要内容 |
| 1.4.2 本研究的目的及意义 |
| 第二章 利用毕赤酵母翻译延伸因子1-a启动子在毕赤酵母中表达异源蛋白 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料与方法 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 PCR扩增TEF1-a启动子、GFP基因和HPV16 L1基因结果 |
| 2.3.2 重组质粒酶切鉴定 |
| 2.3.3 GFP的表达 |
| 2.3.4 毕赤酵母在不同碳源培养基中的生长曲线 |
| 2.3.5 HPV16L1蛋白的表达 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 甲醛脱氢酶(FLD)启动子在毕赤酵母中的应用研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 PCR扩增FLD启动子 |
| 3.3.2 重组质粒酶切鉴定 |
| 3.3.3 GFP表达 |
| 3.3.4 毕赤酵母在不同碳氮源培养基中的生长曲线 |
| 3.3.5 不同碳氮源组合培养基中HPV16 L1表达 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 联合应用AOX1启动子和TEF1-a启动子在毕赤酵母中共表达异源蛋白 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料与方法 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验方法 |
| 4.3 实验结果与讨论 |
| 4.3.1 PCR扩增HPV16 L1(M)基因结果 |
| 4.3.2 重组质粒酶切鉴定 |
| 4.3.3 重组质粒pPinkAOX1-HPV16 L1(M)/TEF1-HPV16 L1在毕赤酵母中的表达 |
| 4.3.4 重组质粒pHanAOX1-GFP在毕赤酵母重组菌pPinkTEF1-HPV16 L1中的表达 |
| 4.3.5 重组质粒pHanAOXl-HPV16 L1在毕赤酵母重组菌pPinkTEFl-HPV16 L1中的表达 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 用于异源蛋白表达的通用载体在毕赤酵母和汉逊酵母中的应用 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 实验材料与方法 |
| 5.2.1 实验材料 |
| 5.2.2 实验方法 |
| 5.3 实验结果与讨论 |
| 5.3.1 重组质粒酶切鉴定 |
| 5.3.2 汉逊酵母rDNA及ARS元件对质粒在毕赤酵母和汉逊酵母细胞中转化效率的作用分析 |
| 5.3.3 重组质粒pHanMOX-GFP转化毕赤酵母及汉逊酵母启动子P_(MOX)指导下的GFP表达 |
| 5.3.4 利用毕赤酵母启动子AOX1、TEF1、FLD以及汉逊酵母启动子MOX分别在毕赤酵母和汉逊酵母中表达GFP蛋白 |
| 5.3.5 重组质粒pHanAOX1-HPV16 L1(M)和pHanMOX-HPV 16L1(M)在毕赤酵母和汉逊酵母中的穿梭表达 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录Ⅰ 缩写词 |
| 附录Ⅱ 主要试剂 |
| 附录Ⅲ 主要溶液的配制 |
| 附录Ⅳ 主要仪器 |
| 附录Ⅴ 基本实验操作 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（4）苦瓜map30基因的优化及其转化毕赤酵母的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 苦瓜蛋白MAP30的研究进展 |
| 1.1.1 MAP30的生物活性 |
| 1.1.2 MAP30的结构 |
| 1.1.3 MAP30的作用机制 |
| 1.2 巴斯特毕赤酵母的研究进展 |
| 1.2.1 巴斯特毕赤酵母表达系统的构成 |
| 1.2.2 巴斯特毕赤酵母的遗传特性 |
| 1.2.3 外源蛋白在巴斯德毕赤酵母中的表达 |
| 1.3 基因的优化 |
| 1.3.1 影响外源基因表达的因数 |
| 1.3.2 优化基因表达的关键因素 |
| 1.3.3 基因优化的实例 |
| 1.4 本研究的目的意义、内容和技术路线 |
| 1.4.1 目的意义 |
| 1.4.2 研究内容 |
| 1.4.3 技术路线 |
| 第2章 map30优化及未优化基因的克隆及鉴定 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株与质粒 |
| 2.1.2 主要材料 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 实验中用到的数据库 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 优化map30基因 |
| 2.2.2 引物设计 |
| 2.2.3 优化map30基因质粒提取 |
| 2.2.4 苦瓜总DNA的提取 |
| 2.2.5 PCR扩增map30基因 |
| 2.2.6 PCR扩增产物回收 |
| 2.2.7 map30基因的克隆与测序 |
| 2.2.8 重组质粒酶切鉴定 |
| 2.2.9 重组质粒序列分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 优化基因质粒提取 |
| 2.3.2 苦瓜总DNA的提取 |
| 2.3.3 PCR扩增map30基因 |
| 2.3.4 重组pMD18-map30基因的鉴定 |
| 2.3.5 重组质粒酶切鉴定 |
| 2.3.6 重组质粒序列鉴定 |
| 2.4 讨论 |
| 第3章 map30酵母重组表达 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 菌株 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 map30基因重组表达载体的构建及鉴定 |
| 3.2.2 工程菌GS115/pPGAPHa/map30的构建 |
| 3.2.3 工程菌GS115/pPGAPHa/map30表达及筛选鉴定 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 map30基因重组表达载体的构建及鉴定 |
| 3.3.2 重组map30/pPGAPHa质粒的序列分析 |
| 3.3.3 重组质粒线性化 |
| 3.3.4 工程菌GS115/pPGAPHa/map30的构建 |
| 3.3.5 SDS-PAGE筛选结果 |
| 3.3.6 优化基因与未优化基因表达的比较 |
| 3.3.7 重组蛋白Western blot鉴定 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 表达系统的选择 |
| 3.4.2 表达载体的选择 |
| 3.4.3 线性化及电转化 |
| 3.4.4 TCA法沉淀蛋白 |
| 3.4.5 蛋白质鉴定方法 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（5）黑曲霉脂肪酶基因优化设计、合成及其在酵母中的表达（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 微生物脂肪酶 |
| 1.1.1 微生物脂肪酶概述 |
| 1.1.2 微生物脂肪酶的应用研究 |
| 1.2 用于生产生物柴油脂肪酶的研究进展 |
| 1.3 毕赤酵母表达系统的研究进展 |
| 1.3.1 P.pastoris表达系统的构成 |
| 1.3.2 P.pastoris表达系统的宿主菌 |
| 1.3.3 P.pastoris的转化方法及整合方式 |
| 1.3.4 外源基因表达质粒在P.pastoris中的表达方式 |
| 1.3.5 外源基因在P.pastoris表达系统中表达的影响因素 |
| 1.4 目的基因优化设计的策略 |
| 1.4.1 目的基因的特性 |
| 1.4.2 mRNA5’端非翻译区 |
| 1.4.3 起始密码子AUG的旁侧序列及mRNA二级结构 |
| 1.4.4 密码子的选择 |
| 1.4.5 基因剂量 |
| 1.5 本文研究的目的和意义 |
| 2 黑曲霉脂肪酶基因突变及其在毕赤酵母中的表达 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 引物设计 |
| 2.2.2 黑曲霉脂肪酶突变基因的扩增、克隆及重组表达载体的构建 |
| 2.2.3 重组黑曲霉脂肪酶在P.pastoris中的表达 |
| 2.3 讨论 |
| 3 黑曲霉脂肪酶基因(lipAm)的优化设计、合成及其表达 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验方法 |
| 3.2 实验结果 |
| 3.2.1 黑曲霉脂肪酶lipA密码子的优化设计及引物合成 |
| 3.2.2 黑曲霉脂肪酶优化基因lipAm的合成、验证及校正 |
| 3.2.3 黑曲霉脂肪酶成熟肽基因lipAm-27的扩增 |
| 3.2.4 重组表达载体pPIC9K-lipAm及pPIC9K-lipAm-27的构建 |
| 3.2.5 重组黑曲霉脂肪酶的转化及在P.pastoris中的表达 |
| 3.3 讨论 |
| 参考文献 |
| 在校期间发表的论文、科研成果等 |
| 致谢 |
（6）优化设计的植酸酶phyC基因及phyA～m-phyCs基因在毕赤巴斯德酵母中的表达研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 1.植酸酶概述 |
| 2.植酸酶研究存在的问题 |
| 3.本研究前期工作基础 |
| 4.本研究目的及意义 |
| 第一章 优化设计中性植酸酶phyC基因和phyA~m-phyCs融合基因的生物学信息分析 |
| 摘要 |
| 1 引言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 选用分析软件并确定分析优化方案 |
| 2.2.2 分析中性植酸酶phyC基因 |
| 2.2.3 优化设计中性植酸酶phyC基因 |
| 3 结果 |
| 3.1 分析优化方案的确定 |
| 3.2 中性植酸酶phyC基因的生物学信息分析 |
| 3.2.1 氨基酸、碱基含量及密码子偏爱性 |
| 3.2.2 phyC基因的mRNA二级结构及自由能 |
| 3.2.3 phyC基因mRNA的起始密码子旁侧序列 |
| 3.3 优化中性植酸酶phyCs基因的生物学信息分析 |
| 3.3.1 碱基含量及密码子偏爱性 |
| 3.3.2 phyCs基因的mRNA二级结构及自由能 |
| 3.3.3 phyCs基因mRNA的起始密码子旁侧序列 |
| 3.4 优化中性植酸酶phyCs基因的合成 |
| 3.4.1 合成phyCs基因序列 |
| 3.4.2 中性植酸酶蛋白的糖基化位点预测 |
| 3.5 酸性植酸酶phyA~m与中性植酸酶phyCs融合基因的生物学信息分析 |
| 3.5.1 融合植酸酶基因phyA~m-phyCsmRNA的起始密码子旁侧序列 |
| 3.5.2 融合植酸酶蛋白的糖基化位点预测 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第二章 优化设计人工合成中性植酸酶phyCs基因在毕赤巴斯德酵母中的表达 |
| 摘要 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 质粒与菌株 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 培养基 |
| 2.1.4 植酸酶活性测定溶液 |
| 2.1.5 SDS-PAGE电泳药品及试剂 |
| 2.1.6 主要仪器及耗材 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 中性植酸酶phyCs基因表达载体的构建 |
| 2.2.1.1 中性植酸酶phyCs基因表达片断的获得 |
| 2.2.1.2 pPIC9K载体质粒DNA的处理 |
| 2.2.1.3 连接反应及转化 |
| 2.2.1.4 阳性克隆的筛选及鉴定 |
| 2.2.2 表达载体pPIC9K-phyCs的电击转化 |
| 2.2.2.1 重组表达载体的线性化处理 |
| 2.2.2.2 酵母感受态细胞的制备 |
| 2.2.2.3 电击转化 |
| 2.2.2.4 重组酵母的筛选 |
| 2.2.3 中性植酸酶phyCs基因在毕赤巴斯德酵母中的表达 |
| 2.2.3.1 重组酵母的诱导培养 |
| 2.2.3.2 重组酵母的诱导培养表达植酸酶产物的活性测定 |
| 2.2.3.3 表达产物的SDS-PAGE检测 |
| 2.2.4 重组酵母基因工程菌的发酵 |
| 2.2.4.1 YPD斜面培养 |
| 2.2.4.2 种子制备 |
| 2.2.4.3 补料分批发酵条件控制 |
| 3 结果 |
| 3.1 表达载体pPIC9K-phyCs的E.coli克隆阳性菌落的PCR筛选 |
| 3.2 中性植酸酶phyCs基因表达载体pPIC9K-phyCs的鉴定 |
| 3.3 重组载体的转化及重组酵母的筛选 |
| 3.4 中性植酸酶phyCs基因在毕赤巴斯德酵母中的诱导表达 |
| 3.5 重组酵母基因工程菌的摇瓶产酶曲线测定 |
| 3.6 表达产物的SDS-PAGE分析 |
| 3.7 中性植酸酶重组酵母基因工程菌的液体发酵 |
| 3.8 表达中性植酸酶蛋白的二级结构预测分析 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三章 优化设计的植酸酶phyCs基因与酸性植酸酶phyA~m基因在毕赤巴斯德酵母中的融合表达 |
| 摘要 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 质粒与菌株 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 培养基 |
| 2.1.4 植酸酶活性测定溶液 |
| 2.1.5 SDS-PAGE电泳药品及试剂 |
| 2.1.6 主要仪器及耗材 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 植酸酶phyA~m及phyCs基因的扩增 |
| 2.2.1.1 引物设计 |
| 2.2.1.2 PCR扩增植酸酶基因 |
| 2.2.1.3 植酸酶phyA~m及phyCs基因表达片断的克隆及鉴定 |
| 2.2.2 植酸酶phyA~m及phyCs基因融合表达中间载体的构建 |
| 2.2.2.1 植酸酶phyCs基因表达片断的获得 |
| 2.2.2.2 pPIC9K载体质粒DNA的处理 |
| 2.2.2.3 连接反应及转化 |
| 2.2.2.4 阳性克隆的筛选及鉴定 |
| 2.2.3 植酸酶phyA~m及phyCs基因融合表达载体pPIC9K-phyA~mCs的构建 |
| 2.2.3.1 植酸酶phyA~m基因表达片断的获得 |
| 2.2.3.2 pPIC9K-phyCs载体质粒DNA的处理 |
| 2.2.3.3 连接反应及转化 |
| 2.2.3.4 阳性克隆的筛选及鉴定 |
| 2.2.4 表达载体pPIC9K-phyA~mCs的电击转化 |
| 2.2.4.1 重组表达载体的线性化处理 |
| 2.2.4.2 酵母感受态细胞的制备 |
| 2.2.4.3 电击转化 |
| 2.2.4.4 重组酵母的筛选 |
| 2.2.5 植酸酶phyA~m及phyCs基因在毕赤巴斯德酵母中的融合表达 |
| 2.2.5.1 重组酵母的诱导培养 |
| 2.2.5.2 重组酵母的诱导培养表达植酸酶产物的活性测定 |
| 2.2.5.3 表达产物的SDS-PAGE检测 |
| 2.2.6 重组酵母基因工程菌的发酵 |
| 2.2.6.1 YPD斜面培养 |
| 2.2.6.2 种子制备 |
| 2.2.6.3 补料分批发酵条件控制 |
| 3 结果 |
| 3.1 植酸酶phyA~m及phyCs基因的扩增 |
| 3.2 植酸酶phyA~m-phyCs基因融合表达载体的构建 |
| 3.3 重组载体的转化及重组酵母的筛选 |
| 3.4 植酸酶phyA~m-phyCs融合基因在毕赤巴斯德酵母中的诱导表达 |
| 3.5 重组酵母基因工程菌摇瓶产酶曲线的测定 |
| 3.6 表达产物的SDS-PAGE |
| 3.7 融合植酸酶重组酵母基因工程菌的液体发酵 |
| 3.8 表达融合植酸酶的结构预测分析 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第四章 重组植酸酶的纯化及最适反应温度、热稳定性、最适反应pH等酶学性质的测定 |
| 摘要 |
| 1 引言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 植酸酶重组基因工程菌株 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 培养基 |
| 2.1.4 植酸酶活性测定溶液 |
| 2.1.5 植酸酶纯化缓冲液 |
| 2.1.6 主要仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 中性植酸酶的纯化 |
| 2.2.2 融合植酸酶的纯化 |
| 2.2.3 纯化植酸酶的SDS-PAGE |
| 2.2.4 植酸酶的热稳定性的测定 |
| 2.2.5 植酸酶的最适pH值的测定 |
| 2.2.6 纯化植酸酶的去糖基化 |
| 2.2.7 植酸酶的最适反应温度测定 |
| 3 结果 |
| 3.1 表达产物的纯化 |
| 3.1.1 重组中性植酸酶的纯化 |
| 3.1.2 重组融合植酸酶的纯化 |
| 3.2 纯化产物的SDS-PAGE |
| 3.2.1 重组中性植酸酶的SDS-PAGE |
| 3.2.2 重组融合植酸酶的SDS-PAGE |
| 3.3 表达产物热稳定性的测定 |
| 3.3.1 表达中性植酸酶的热稳定性 |
| 3.3.2 表达融合植酸酶的热稳定性 |
| 3.4 表达产物最适反应pH的测定 |
| 3.4.1 表达中性植酸酶的最适反应pH |
| 3.4.2 表达融合植酸酶的最适反应pH |
| 3.5 表达产物最适反应温度的测定 |
| 3.5.1 表达中性植酸酶的最适反应温度 |
| 3.5.2 表达融合植酸酶的最适反应温度 |
| 3.6 表达产物的去糖基化 |
| 3.6.1 表达中性植酸酶的去糖基化 |
| 3.6.2 表达酸性植酸酶的去糖基化 |
| 3.6.3 表达融合植酸酶的去糖基化 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 结论 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 博士在读期间发表论文等情况 |
（7）人乳头瘤病毒18型基因工程预防性疫苗研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 宫颈癌与宫颈癌疫苗 |
| 1.1.1 HPV病毒结构与分子病毒学 |
| 1.1.2 疫苗的有效性 |
| 1.1.3 预防性疫苗 |
| 1.1.4 治疗性疫苗 |
| 1.1.5 其它类型HPV疫苗 |
| 1.1.6 结论和未来展望 |
| 1.2 甲醇酵母表达系统简介 |
| 1.2.1 甲醇酵母中的甲醇代谢 |
| 1.2.2 甲醇酵母表达系统 |
| 1.2.3 外源蛋白在甲醇酵母中的表达 |
| 1.2.4 甲醇酵母的发酵 |
| 1.2.5 两种甲醇酵母的区别 |
| 1.3 本实验的研究背景及目的 |
| 2 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 工具酶和主要生化试剂 |
| 2.1.2 试剂盒 |
| 2.1.3 质粒与菌株 |
| 2.1.4 实验动物 |
| 2.1.5 主要仪器 |
| 2.1.6 常用溶液的配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1.常用实验方法 |
| 2.2.2 HPV18晚期蛋白L1在毕赤酵母菌中的表达及鉴定 |
| 2.2.3 人乳头瘤病毒18型L1基因原核表达与纯化 |
| 2.2.4 人乳头瘤病毒18L1抗血清的制备和鉴定 |
| 2.2.5 毕赤酵母工程菌发酵与纯化工艺研究 |
| 3 结果与讨论 |
| 3.1 HPV18晚期蛋白L1在毕赤酵母菌中的表达及鉴定 |
| 3.1.1 毕赤酵母表达载体构建与鉴定 |
| 3.1.2 电击转化GS115,G418筛选 |
| 3.1.3 HPV18L1基因的诱导表达与Western blot检测 |
| 3.1.4 免疫电镜观察 |
| 3.2 人乳头瘤病毒18型L1基因原核表达与纯化 |
| 3.2.1 原核重组质粒的构建和鉴定 |
| 3.2.2 原核表达质粒构建 |
| 3.2.3 表达产物的鉴定与纯化 |
| 3.2.4 化学发光Wester-blot检测与定量纯化的蛋白 |
| 3.3 人乳头瘤病毒18L1抗血清的制备和鉴定 |
| 3.3.1 DNA疫苗重组质粒的构建和鉴定 |
| 3.3.2 免疫小鼠 |
| 3.3.3 抗血清的检测 |
| 3.4 毕赤酵母工程菌发酵与纯化工艺研究 |
| 3.4.1 毕赤酵母工程菌发酵工艺研究 |
| 3.4.2 毕赤酵母工程菌纯化工艺研究 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 硕士期间发表论文 |
| 附录1 HPV18 L1基因经优化序列与氨基酸序列 |
| 附录2 pAO819-HPV18L1 Ⅱ质粒HPV L1基因部分测序结果 |
| 致谢 |
（8）人乳头瘤病毒16型晚期蛋白L1预防性疫苗的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 人乳头瘤病毒简介 |
| 1.1.1 人乳头瘤病毒的病原学 |
| 1.1.2 人乳头瘤病毒的分子结构 |
| 1.1.3 人乳头瘤病毒的免疫学 |
| 1.2 毕赤酵母表达系统简介 |
| 1.2.1 毕赤酵母载体 |
| 1.2.2 毕赤酵母菌株 |
| 1.3 人乳头瘤病毒疫苗的研究进展 |
| 1.3.1 预防性疫苗 |
| 1.3.2 治疗性疫苗 |
| 1.3.3 兼有双重作用的嵌合疫苗 |
| 1.3.4 树突状细胞疫苗在 HPV感染中的应用 |
| 参考文献 |
| 第二章 酵母重组质粒的构建和表达 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 工具酶和主要生化试剂 |
| 2.1.2 试剂盒 |
| 2.1.3 质粒、菌株和抗体 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.1.5 常用溶液的配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 目的基因的合成 |
| 2.2.2 酵母重组质粒的构建和序列测定 |
| 2.2.3 目的蛋白在酵母细胞中的表达和鉴定 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 目的基因的合成 |
| 2.3.2 酵母重组质粒的鉴定 |
| 2.3.3 目的基因的序列测定 |
| 2.3.4 目的蛋白在酵母细胞中的表达和鉴定 |
| 2.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 原核重组质粒的构建和表达 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 工具酶和主要生化试剂 |
| 3.1.2 质粒、菌株和抗体 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.1.4 常用溶液的配制 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 原核重组质粒的构建和鉴定 |
| 3.2.2 原核重组质粒的表达和鉴定 |
| 3.2.3 目的蛋白的纯化 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 原核重组质粒的构建和鉴定 |
| 3.2.2 原核重组质粒的表达和鉴定 |
| 3.2.3 目的蛋白的纯化 |
| 3.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 抗血清的制备 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 工具酶和主要生化试剂 |
| 4.1.2 试剂盒 |
| 4.1.3 质粒与实验动物 |
| 4.1.4 主要仪器 |
| 4.1.5 常用溶液的配制 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 DNA疫苗重组质粒的构建和鉴定 |
| 4.2.2 免疫小鼠 |
| 4.2.3 抗血清的制备 |
| 4.2.4 抗血清的检测 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 DNA疫苗重组质粒的构建和鉴定 |
| 4.3.2 免疫小鼠 |
| 4.3.3 抗血清的检测 |
| 4.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 总结 |
| 附录 |
| 致谢 |
（9）人乳头瘤病毒16亚型L1基因在毕赤酵母GS115中的优化表达（论文提纲范文）
| 内容提要 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 HPV 研究背景 |
| 1.1.1 HPV 的分子生物学 |
| 1.1.2 HPV 的流行病学 |
| 1.1.3 HPV 疫苗的研究现状 |
| 1.1.4 表达载体的选择 |
| 1.2 本论文设计思路 |
| 1.2.1 实验目的 |
| 1.2.2 设计思路 |
| 第二章 实验材料和方法 |
| 2.1 材料、仪器和试剂 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.1.3 常用试剂配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 HPV16L1 基因的优化设计与合成 |
| 2.2.2 将HPV16L1 基因构建至表达载体 |
| 2.2.3 毕赤酵母重组子的制备与筛选 |
| 2.2.4 酵母重组子的5L 发酵罐表达 |
| 2.2.5 蛋白的纯化与鉴定 |
| 第三章 结果与讨论 |
| 3.1 HPV16L1 基因的设计合成 |
| 3.1.1 合成L1 基因第一段 |
| 3.1.2 合成L1 基因第二段 |
| 3.1.3 合成L1 基因第三段 |
| 3.1.4 三段连接得到完整的HPV16L1 基因 |
| 3.2 HPV16L1 基因构建至表达载体 |
| 3.2.1 L1 基因连T-easy 载体 |
| 3.2.2 L1 连pPICZαB 真核表达载体 |
| 3.3 酵母重组子的获得与筛选 |
| 3.3.1 转化子的获得 |
| 3.3.2 PCR 筛选酵母重组子 |
| 3.3.3 摇瓶筛选酵母重组子 |
| 3.4 摇瓶发酵优化HPV16L1 基因表达条件 |
| 3.4.1 优化基础盐培养基 |
| 3.4.2 添加维生素 |
| 3.4.3 添加蛋白胨 |
| 3.5 重组子发酵罐表达 |
| 3.6 VLP 蛋白纯化及电镜观察 |
| 3.6.1 VLP 蛋白纯化 |
| 3.6.2 VLP 电镜结果 |
| 参考文献 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 致谢 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
（10）人乳头瘤病毒与宫颈肿瘤关系的研究进展（论文提纲范文）
| 0 引 言 |
| 1 HPV微观结构 |
| 2 HPV与宫颈疾病 |
| 2.1 HPV与基因 |
| 2.2 HPV与免疫 |
| 3 HPV疫苗 |
四、用甲醇酵母表达经基因优化的HPV 6型L1蛋白（论文参考文献）
- [1]丹酚酸B防治人乳头瘤病毒感染及其机制研究[D]. 丁永桢. 南方医科大学, 2018(01)
- [2]咖啡酸抗人乳头瘤病毒感染的研究[J]. 丁永桢,温嘉泳,赖宝龙,刘叔文,李琳. 病毒学报, 2018(03)
- [3]毕赤酵母不同启动子的作用特点及在HPV16 L1表达中的应用[D]. 金晓媚. 北京协和医学院, 2014(01)
- [4]苦瓜map30基因的优化及其转化毕赤酵母的研究[D]. 王丽媛. 哈尔滨师范大学, 2010(05)
- [5]黑曲霉脂肪酶基因优化设计、合成及其在酵母中的表达[D]. 李娜. 华中师范大学, 2010(04)
- [6]优化设计的植酸酶phyC基因及phyA～m-phyCs基因在毕赤巴斯德酵母中的表达研究[D]. 邹立扣. 四川农业大学, 2007(02)
- [7]人乳头瘤病毒18型基因工程预防性疫苗研究[D]. 谢飞. 华中师范大学, 2007(04)
- [8]人乳头瘤病毒16型晚期蛋白L1预防性疫苗的研究[D]. 董金蓉. 华中师范大学, 2007(04)
- [9]人乳头瘤病毒16亚型L1基因在毕赤酵母GS115中的优化表达[D]. 牛俊. 吉林大学, 2007(03)
- [10]人乳头瘤病毒与宫颈肿瘤关系的研究进展[J]. 林晓华,吴宁,侯丽辉,吴效科. 医学研究生学报, 2006(02)