一、关于基因文库的一般介绍（论文文献综述）
曹堃[1]（2020）在《TTC9C在胶质瘤放射敏感性中的作用及机制研究》文中研究表明一、课题背景胶质瘤是发生于神经外胚层的肿瘤,其侵袭性及增殖能力较强,具有高发病率、高术后复发率、高病死率及低治愈率的特点,是威胁人类健康的主要恶性肿瘤之一。并且,恶性胶质瘤难以通过手术根治且对放化疗普遍不敏感,同时,现有的恶性胶质瘤放射增敏剂普遍存在着增敏效果差、毒副作用大等缺陷,且其放射增敏效果仍然存在争议,难以满足临床上胶质瘤放射增敏的需求。因此,寻找恶性胶质瘤放射增敏的新靶点,进一步提高恶性胶质瘤的放疗效果,具有十分重要的临床意义。在肿瘤放疗领域的研究中,放疗抵抗的产生机制尚未完全清楚,高效的放射增敏新基因的研究亟待加强。近年来,随着肿瘤生物学和放射肿瘤学的发展,针对肿瘤放射敏感性相关基因的靶向治疗成为研究热点,而全基因组筛选文库有望从人类全基因组的角度筛选出更高效的肿瘤放射增敏靶点。CRISPR Cas9技术是近年来发展迅速的一项基因编辑技术,在此基础上构建的CRISPR Cas9人类全基因组文库为筛选肿瘤放射增敏新靶点提供了新的方法。本研究中,我们使用CRISPR Cas9人类全基因组文库感染了恶性人脑胶质瘤细胞,并通过高通量测序阴性筛选的方法,发现了放射增敏新靶点TTC9C,并进一步在细胞学、动物学、临床层面验证了其放射增敏效果,并对其影响放射敏感性的分子机制进行了深入探究。二、研究内容及方法1、CRISPR Cas9全基因组文库筛选肿瘤放射增敏新靶点本研究首先使用文库感染U87MG细胞后,给予γ射线照射处理,之后使用阴性筛选策略,通过高通量测序获得差异基因作为候选。接下来,使用不同组织来源的肿瘤细胞系构建候选基因的敲低细胞系,进一步通过克隆形成率、细胞凋亡、DNA损伤修复通路检测等手段验证候选靶基因的放射增敏效果,并从中选出了放射增敏效果最佳的靶基因TTC9C。2、TTC9C对胶质瘤细胞放射敏感性的调控作用研究选取不同来源背景的胶质瘤细胞系,构建其TTC9C敲除、过表达稳转细胞,通过肿瘤细胞的增殖、迁移、克隆形成率、凋亡、周期、免疫荧光、DNA损伤修复通路检测等方式,进一步明确其放射增敏效果,并初步探索TTC9C对DNA损伤修复的影响。3、TTC9C对颅内胶质瘤放射敏感性的影响及临床研究构建裸鼠颅内胶质瘤放疗模型,通过生存率观察、脑组织解剖、病理切片、免疫组化等方式,进一步明确了TTC9C敲除在颅内胶质瘤中的放射增敏效果,并验证其对HR修复通路的抑制作用。接下来,通过生物信息学分析等手段,进一步探究了TTC9C在胶质瘤等肿瘤中的表达特征、与HR修复蛋白的共表达关系等,进一步明确TTC9C的生物学作用与功能。4、TTC9C对胶质瘤放射敏感性的调控机制研究本研究使用DSBs foci的方法,检测TTC9C照后于DSBs断端的募集情况,判断其是否直接募集于DNA断端直接发挥作用。接下来,通过免疫共沉淀与Western Blot,检测照后TTC9C是否发生了相应的蛋白分子修饰。进一步通过IP质谱明确TTC9C的互作蛋白与DNA损伤修复的关系,进而通过Co-IP与Western Blot的方法明确其直接作用的分子为ATR。接下来,通过构建ATR的不同截断体,明确TTC9C与ATR结合的具体功能域。三、研究结果:本研究主要结果如下:1、在人类全基因组范围内,成功筛选出了胶质瘤放射增敏新靶点TTC9C:（1）使用CRISPR Cas9人类全基因组文库成功感染了人脑胶质瘤细胞U87MG;（2）通过高通量二代测序及文献调研等方法选取了TTC9C等5个候选基因;（3）验证了5个候选基因的放射增敏效果,确定TTC9C为目标靶基因。2、体外实验中,TTC9C敲除在胶质瘤细胞中发挥了显着的放射增敏效应:（1）TTC9C敲除显着抑制胶质瘤细胞的增殖能力;（2）TTC9C敲除显着减弱胶质瘤细胞的迁移能力;（3）TTC9C敲除显着降低胶质瘤细胞的照后活力;（4）TTC9C敲除显着减少胶质瘤细胞的照后存活率;（5）TTC9C敲除显着促进胶质瘤细胞的照后凋亡;（6）TTC9C敲除显着抑制胶质瘤细胞的照后DNA损伤修复;（7）TTC9C敲除显着抑制照后DNA损伤修复通路的激活。3、体内实验中,TTC9C敲低在颅内胶质瘤放疗中发挥了显着的放射增敏作用,进一步研究显示,TTC9C在包括胶质瘤在内的多种肿瘤的发生发展中发挥了重要作用:（1）TTC9C敲除在颅内胶质瘤中发挥了显着的放射增敏效果,显着延长荷瘤裸鼠的照后生存时间、减小颅内胶质瘤的照后体积、抑制颅内胶质瘤的照后增殖能力、促进颅内胶质瘤的照后凋亡、抑制颅内胶质瘤的照后HR修复;（2）TTC9C与胶质瘤患者预后和HR修复信号通路密切相关,TTC9C表达量显着影响胶质瘤等癌症患者的预后、TTC9C与HR相关蛋白的表达具有显着的相关性。4、TTC9C与ATR结合,直接参与了照后DNA损伤的HR修复:（1）电离辐射可导致TTC9C核内募集;（2）TTC9C在照后发生磷酸化修饰;（3）TTC9C与ATR等HR修复通路相关蛋白结合发挥作用;（5）TTC9C与ATR的N端结合。五、结论:本研究通过CRISPR Cas9全基因组文库筛选发现了胶质瘤放射增敏新靶点TTC9C,并在细胞和动物模型中明确了其放射增敏作用。机制研究发现,TTC9C通过与ATR结合,参与电离辐射导致的DNA损伤的HR修复,从而影响人脑胶质瘤的放射敏感性。我们的结果提示,TTC9C在人脑胶质瘤细胞放疗中具有巨大的潜在应用价值。
訾玉玲[2]（2020）在《2019年全国Ⅰ卷理综生物38题试题分析》文中进行了进一步梳理一、原题呈现[生物—选修3:现代生物科技专题]基因工程中可以通过PCR技术扩增目的基因。回答下列问题。（1）基因工程中所用的目的基因可以人工合成,也可以从基因文库中获得。基因文库
陈玲玲[3]（2019）在《乳氟禾草灵降解菌株Bacillus sp. YS-1的分离、鉴定及其降解机制的研究》文中研究说明乳氟禾草灵（lactofen）,是一种典型的二苯醚类除草剂,被广泛用于防治大豆、棉花、花生、番茄等多种作物的田间阔叶杂草。由于乳氟禾草灵的水溶性低,与土壤颗粒结合紧密,易于在土壤中残留,由乳氟禾草灵残留造成的环境污染问题,引起人们的广泛关注。微生物在乳氟禾草灵残留的降解过程中起着重要作用。目前国内外的学者已经分离得到一些乳氟禾草灵的降解菌株,但目前仅报道了两个乳氟禾草灵降解基因。本论文分离得到一株乳氟禾草灵降解菌株YS-1,研究了其对乳氟禾草灵的降解特性、代谢途径,并克隆表达了参与降解的酯酶基因,研究了其酶学特性及对不同底物的立体异构选择性。主要研究内容和结果归纳如下。1、乳氟禾草灵降解菌株的分离、降解特性及代谢途径本研究从长期受除草剂污染的农田土壤中分离筛选得到一株乳氟禾草灵降解菌株YS-1。通过菌株的生理生化特征及16S rRNA基因序列分析,将其鉴定为Bacillus sp.YS-1。菌株YS-1在15 h内对50 mg/L乳氟禾草灵的降解率达到97.6%,最适降解温度为 40℃,最适 pH 为 8.0,Co2+、Fe3+、Mg2+、A13+、Zn2+和 Mn2+（0.1 mM）能促进菌株对乳氟禾草灵的降解,其中A13+的促进效果最为显着,其相对降解率为119.5%。Cu2+（0.1 mM）对降解有明显的抑制作用,其相对降解率为18.9%。通过HPLC-MS/MS鉴定菌株YS-1降解乳氟禾草灵的代谢产物并推测其降解途径:菌株YS-1首先水解乳氟禾草灵侧链上的酯键,生成三氟羧草醚,再将苯环上的硝基还原成氨基,生成氨基三氟羧草醚,最后氨基发生乙酰化,生成乙酰氨基三氟羧草醚。水培试验的结果表明,乳氟禾草灵对黄瓜和高粱幼苗的生长均有明显的抑制作用,而菌株YS-1降解乳氟禾草灵的终产物乙酰氨基三氟羧草醚对黄瓜和高粱幼苗的生长无明显的影响。2、乳氟禾草灵降解菌株YS-1中酯酶基因rhoE和rapE的克隆通过构建基因文库,从菌株YS-1中克隆得到两个酯酶基因rhoE和rapE,将其编码的氨基酸序列在NCBI的UniProtKB/Swiss-Prot（Swissprot）数据库中进行比对,最高相似性分别为28%和88%。酯酶RhoE和RapE无信号肽,属于胞内酶。RhoE和RapE都具有酯酶典型的特征序列标签GXSXG和三联体催化活性位点Ser-His-Asp/Glu,其中RhoE属于酯酶第Ⅳ家族,RapE为酯酶第Ⅴ家族的成员。rhoE编码的氨基酸序列同源性较低,是一个新的酯酶基因。3、RhoE和RapE的表达、纯化及酶学特性对酯酶基因rhoE和rapE进行异源表达与纯化得到可溶性蛋白RhoE和RapE。HPLC-MS/MS结果表明,酯酶RhoE和RapE对乳氟禾草灵侧链上的两个酯键均有活性,最终将乳氟禾草灵水解为三氟羧草醚。另外,酯酶RhoE和RapE也能水解除草剂禾草灵及喹禾灵苯环侧链上的酯键。RhoE酶促反应的最适温度为35℃,最适pH为8.0,Zn2+和Cd2+（0.1 mM）能强烈抑制RhoE的酶活力。RapE酶促反应的最适温度为25℃,最适pH为8.0,Ni2+,Cu2+和Cd2+（0.1 mM）能强烈抑制RapE的酶活力。RhoE在70℃下孵育30 min,仍能保持29.9%的相对活力,而RapE则已经完全失活。pH=10.0时,RhoE和RapE均能保持70.0%以上的酶活力。酯酶RhoE和RapE均对碳链长度小于10个碳原子的短链对硝基苯基酯的亲和力和催化效率较高,对碳链长度大于10的长链对硝基苯基酯的亲和力和催化效率较低,表明RhoE和RapE均偏好于降解短链对硝基苯基酯,属于酯酶而非脂肪酶。RhoE对所测定的几种对硝基苯基酯的催化效率均显着高于RapE,但RapE对乳氟禾草灵的亲和力更高。4、RhoE和RapE对乳氟禾草灵、禾草灵以及喹禾灵的手性选择性分析酯酶RhoE和RapE在降解乳氟禾草灵的过程中,EF值逐渐减小,存在明显的异构体选择性,偏好于降解S型乳氟禾草灵。RhoE和RapE降解禾草灵以及喹禾灵的过程中,EF值逐渐升高,存在异构体选择性且S型异构体的降解速率较快。
张?[4]（2018）在《硫醚单加氧酶的发现表征及其结构与功能关系研究》文中研究表明光学活性亚砜是一类重要的手性中间体,也是一些含硫药物结构的重要组成部分,例如用于治疗胃食管反流性疾病的质子泵抑制剂,也称为拉唑类药物。光学活性亚砜一般通过对其前体硫醚的不对称单加氧反应获得,除了化学氧化法之外,近年来生物催化的硫醚不对称单加氧反应的发展也很迅速。能催化硫醚不对称单加氧反应的生物催化剂主要有两大类,包括 Baeyer-Villiger 单加氧酶（Baeyer-Villiger monooxygenases,BVMOs）和细胞色素 P450 单加氧酶（Cytochrome P450 monooxygenases,CYPs）。本论文对这两类单加氧酶催化的硫醚不对称单加氧反应进行了系统研究,主要包括三部分内容:1)新型BVMOs的发现和纯化表征;2)醋酸钙不动杆菌环己酮单加氧酶（AcCHMO）的分子改造和结构功能关系分析;3)细胞色素型硫醚单加氧酶P450SMO催化过程的电子传递机理分析。第一部分:BVMOs作为一种能催化硫醚不对称氧化反应的生物催化剂,近年来受到了众多研究者的青睐。虽然BVMOs的底物谱很宽,但是目前尚未报道能够催化拉唑硫醚氧化的天然酶。因此我们选择能够催化大位阻硫醚底物的EtaA和能够催化苯甲硫醚（Methy1 phenyl sulfide,MPS）的CHMONCIMB9871为模板,进行了基因组数据库挖掘并测定了候选酶对MPS和奥美拉唑硫醚（Omeprazole sulfide,OPS）的催化能力。其中来源于Bradyrhizobium oligotrophicum和Aeromicrobium marinum的BoBVMO和AmBVMO对OPS具有相对较高的催化活性,而来源于Acinetobacter calcoaceticus的AcCHMO对MPS具有较高的催化活性。因此,我们选择这三个重组酶为研究对象,对其进行了纯化和催化性能研究。进化树及序列分析表明,这三个酶属于典型的I类BVMOs。底物谱考察表明,它们对MPS的催化活力最高,分别达到117、25和839U/gprotein。BoBVMO和AmBVMO对OPS的催化活力分别为18和24U/gprotein,但是这两个酶在大肠杆菌中基本上为包涵体表达且热稳定性较差。而AcCHMO虽然不能催化大位阻硫醚底物的不对称氧化反应,但是其可溶性和稳定性要优于BoBVMO和AmBVMO,在30℃的半衰期达到20 h,是BoBVMO和AmBVMO的4.5和3.7倍。第二部分:我们选择AcCHMO作为进一步研究对象,对其底物特异性进行了改造。通过对底物通道瓶颈周围氨基酸的活性位点组合饱和突变,成功获得了突变体AcCHMOM1（K326C/F432L）,实现了对OPS氧化活性从无到有的突破。在此突变体的基础上,对酶的底物口袋、底物通道、FAD和NADPH结合位点等核心区域进行了迭代饱和突变库的构建,以及对全长蛋白进行了易错PCR突变库的构建。利用底物硫醚和产物亚砜溶解度的差异,创新设计了一种基于平板透明圈的高通量筛选方法,对AcCHMOM1催化OPS的活性进行了定向进化,使其活力提高至30.3 U/gprotein。纯酶的反应结果表明,最优突变体AcCHMOM6在22 h内催化3 g L-1 OPS生成（S）-奥美拉唑的转化率达到96%。同时,AcCHMO及其突变体对4种结构从小到大底物（环己酮,MPS,5-甲氧基-2-甲基硫-1H-苯并咪唑和OPS）的活力变化规律,揭示了其底物特异性的转变历程。另外,我们对AcCHMO及其突变体进行了结构解析,成功得到了突变体AcCHMOM2的晶体结构,并初步阐释了其底物特异性改变的结构基础:底物通道的形状和大小是决定其底物特异性的关键。第三部分:本实验室前期从红球菌（Rhodococcus sp.）ECU0066中克隆得到一个硫醚单加氧酶P450SMO,它对一系列小分子硫醚底物具有良好的催化活力及立体选择性。P450SMO虽然也能催化OpS的不对称氧化,但其催化效率极低（<10-4U/gprotein）。P450SMO属于细胞色素CYPs的Class Ⅳ家族,该家族的CYPs具有“自给自足”的电子传递系统,但是电子传递效率低下仍是其应用的主要限制性因素,因此揭示其电子传递的机制对于进一步改善酶的催化性能至关重要。前期在本实验室和上海有机所周佳海组的共同努力下,已经成功解析了 P450sMO的晶体结构。在此基础上,本论文对其电子传递过程中蛋白的构象动态变化进行了系统研究。我们通过对参与催化过程的蛋白各结构域进行波谱学分析,分别测定了电子传递过程各步骤的动力学。结果显示,Fe2S2结构域将电子从FMN传递给heme这一过程是限速步骤。结合晶体结构的分析,我们推测Fe2S2结构域在电子传递过程中可能发生较大的构象变化,以便实现电子的顺利转移。利用蛋白质交联质谱和单分子荧光共振能量转移技术,对上述假设进行了验证,发现P450SMO的Fe2S2结构域存在着两种典型构象,一种是靠近FMN的“F-构象”,另一种是靠近heme的“H-构象”,这两种构象的动态变化受到不同还原剂如DTT、NADPH或Na2S2O3的调控。最终,我们提出了 P450SMO催化循环中由构象变化控制的两步电子传递机制:第一步,当FMN获得NADPH的电子后传递给氧化态的Fe2S2中心,这时Fe2S2中心处于“F-构象”;第二步,当Fe2S2中心得到电子后将发生构象变化,使其转变为“H-构象”,从而将电子顺利转移给heme,开始催化循环。
王芸[5]（2018）在《反硝化喹啉降解微生物群落结构与功能关系的研究》文中认为喹啉及其衍生物是一类典型的含氮杂环化合物,常存在于焦化、印染、农药等工业废水中,对人类有严重的致畸、致突变性。目前对喹啉的好氧降解认识比较清楚,但在环境中,尤其是受污染的土壤和水体中,缺乏氧气是一种更普遍的状态,因此进行喹啉厌氧降解机制的研究有重要的应用价值。但目前人们对喹啉厌氧条件下的降解知识还是很匮乏,关键的降解途径并不清楚,对参与降解的微生物也所知甚少。本实验室建立了一个反硝化喹啉降解反应器,连续运行多年,功能稳定,但始终没能从中分离得到能够反硝化厌氧降解喹啉的纯培养菌株。本研究通过体外批式实验,研究喹啉的反硝化降解过程。发现COD/N对喹啉去除率有影响,在比值为5.1时,喹啉去除率达到最高,同时硝酸盐也完全被还原,为喹啉降解最优碳氮比。如果COD/N大于5.1,由于电子受体不足,喹啉去除率降低;反之,COD/N小于5.1,硝酸盐还原产物亚硝酸盐会产生累积。通过自动反硝化培养物实时气体检测系统（ROBOT系统）,对最优COD/N=5.1的喹啉降解过程进行了更深入研究,结果表明,喹啉降解经历了反硝化降解和产甲烷降解2个阶段。在反硝化阶段,硝酸盐作为电子受体程序性还原成亚硝酸盐、NO、N2O和N2,最终累积的氮气量表明初始加入的硝酸盐已经完全还原成为氮气;当所有氮氧化物利用完以后,转入产甲烷降解阶段,最终喹啉去除率达到95.1%。菌群数据分析结果表明,Thauera属在喹啉降解过程中,在DNA和RNA文库中都是富集程度最高的类群,相对丰度最高分别达到30%和50%。此外,Rhodococcus和Desulfobacterium属细菌在RNA水平也表现活跃。总共鉴定出76个与喹啉降解相关的OTUs,被分成13个共丰度变化群（CAGs,Co-abundance groups）。基于理化参数和这些喹啉降解相关细菌的丰度变化数据分析结果,我们推测,在这个菌群中,Thauera菌起到核心作用,在喹啉分子降解的初始步骤中发挥作用,其它功能菌如Rhodococcus、Desulfobacterium、Rhodocyclaceae和Syntrophobacteraceae等协助Thauera菌对喹啉分子进行后续的降解过程,直至Methanosaeta等参与的产甲烷过程完成了喹啉的完全矿化。本论文同时比较了高碳氮比（12.2）和低碳氮比（2.4）对喹啉降解过程及核心降解菌群的影响。结果表明,在高碳氮比情况下,由于电子受体不足,喹啉去除率降低,但降解过程中的代谢产物变化趋势与最优条件下相同;在低碳氮比情况下,有着较高喹啉去除率,但反应后期会有大量的亚硝酸盐及气态产物NO和N2O的累积。菌群分析结果表明,碳氮比的改变并没有显着改变喹啉降解微生物群落结构;与最优组76个核心喹啉降解OTUs相比,低碳氮比组有55个OTUs与之相同,高碳氮比组有58个OTUs与之相同,不同的类群是一些低丰度的OTUs。在COD/N（5.1）条件下,本研究也比较了硝酸盐和亚硝酸盐分别作为电子受体对喹啉降解的影响。结果表明,由于亚硝酸盐接受电子能力减弱,喹啉去除效率降低并且降解速度减慢,但喹啉降解同样经历了反硝化和产甲烷两个阶段,并且所有的亚硝酸盐都被还原成氮气。菌群结果表明,亚硝酸盐对菌群结构的影响明显大于不同碳氮比造成的影响。与最优组76个核心喹啉降解OTUs相比,亚硝酸盐组有49个OTUs与之相同,更多属于Chloroflexi,Deltaproteobacteria门的菌被鉴定出与喹啉降解相关。本论文还构建了4个反硝化功能基因克隆文库（nos Z、nar G、nir S和nir K）来研究喹啉降解反应器中反硝化菌组成多样性。氧化亚氮还原酶基因（nos Z）和硝酸盐还原酶基因（nar G）文库分析结果显示,反硝化菌主要属于Betaproteobacteria门,分布于Rhizobium、Thiobacillus、Acidovorax和Alicycliphilus属,这些属的菌也被鉴定为与喹啉降解过程相关。4个功能基因文库中,除了nir K文库外,其它3个文库中都发现了与Thauera属相似性较高的克隆子类型,但都不是占优势的克隆子。通过反硝化功能基因克隆文库加深了我们对反应器内反硝化菌多样性的认识,对一些属的菌的功能有了更深入的了解。综上所述,本论文通过体外批式培养系统,对喹啉反硝化降解过程进行了深入细致的研究。发现喹啉的降解依赖于不同功能微生物的相互作用,它们各自发挥不同的功能,协作完成了喹啉的完全降解。对比高碳氮比和低碳氮比对喹啉降解过程的影响,发现不同碳氮比对菌群结构影响较弱,但对反硝化中间代谢产物影响显着,尤其N2O的累积与碳氮比密切相关。亚硝酸盐作为一种有毒的电子受体,减慢了喹啉降解速率,同时对喹啉降解菌群的影响大于不同碳氮比造成的影响。本研究对喹啉降解微生物菌群系统全面的分析,为解析喹啉的反硝化降解微生物机制奠定了重要基础。
时伟[6]（2017）在《沁水盆地柿庄南区块煤储层C-N-S微生物地球化学循环与产气潜力研究》文中认为针对沁水盆地南部煤层气井产出水的16Sr RNA测序检测出产甲烷菌、硫酸盐还原菌、硝酸盐还原菌及反硝化细菌,指示沁水盆地南部存在次生生物气成分,与高煤阶热成因煤层气的认识存在矛盾。本文通过系统采集沁水盆地南部柿庄南区块煤层气井产出的水样,进行水离子、氢氧同位素、REE、溶解无机碳同位素、微生物多样性等方面的分析测试,开展与微生物代谢活动密切相关的C-N-S生物地球化学特征研究。研究表明柿庄南区块为近SN向的单斜构造,由东向西煤层的海拔高度逐渐降低,西部寺头断层具有阻水作用,大气降水由东向西径流,西部逐渐过渡为滞流区。研究区煤层水质类型以Na-HCO3-Cl或Na-HCO3为主,由氧化径流环境向深部过渡到还原滞流环境,受控于矿物溶解作用,Na+、K+、Cl-、Ca2+、Mg2+、HCO3-等离子浓度与TDS（矿化度）均呈现增加的趋势,指示了煤层水氧化还原条件的变化特征。通过对采集水样中微生物的16Sr DNA测序分析,检测出产甲烷菌、硫酸盐还原菌、硝酸盐还原菌及反硝化细菌,产甲烷菌类型为甲烷杆菌目,甲烷微菌目,甲烷八叠球菌目;硫酸盐还原菌包括Desulfarculales、Desulfovibrionales、Desulfuromonadales等类型,硝化细菌检测出Nitrososphaerales。本文建立了研究区的C-N-S微生物地球化学作用模型,划分了C-N-S微生物区带:产甲烷带、硫酸根-甲烷厌氧氧化带（SMTZ）与反硝化带。产甲烷带中产甲烷菌的作用使得甲烷浓度增加,为研究区的高含气区。该过渡带之上的SMTZ带中,由于硫酸盐浓度高,绝大多数甲烷都在该过渡带被厌氧氧化消耗掉,SMTZ带对甲烷厌氧氧化作用为次生生物气的重要消耗机制。SMTZ带之上为反硝化作用区带,对应了N2的增加以及硝酸根离子含量的大量减少。产甲烷带产气潜力最高,SMTZ带次之,反硝化带最低。
蒋云露[7]（2016）在《菌剂发酵蔬菜在腐败过程中的微生物群落变化》文中指出目前对发酵蔬菜及其腐败的研究主要集中在发酵过程的微生物区系变化和已腐败发酵蔬菜中微生物的分离鉴定,缺乏对发酵蔬菜在腐败过程中微生物动态变化及其规律的研究。已报道的发酵蔬菜腐败微生物主要为以酵母为主的真菌,因发酵池/坛密封不严氧气渗入而生长并造成腐败。鉴于此,本论文以植物乳杆菌菌剂发酵蔬菜为研究对象,模拟在发酵和储藏过程中有氧渗入发酵系统和无氧两种情况,监测腐败过程发酵体系中的微生物区系变化。利用选择培养基培养的方法对发酵蔬菜的腐败过程中不同种类的微生物进行计数,通过构建16S rDNA文库进行微生物区系分析。为了保证微生物区系分析的高保真性,本研究分别采用了5种方法来提取发酵蔬菜盐卤样品中微生物的基因组,并对提取得到的DNA纯度、浓度以及16S rDNA PCR扩增产物进行了评估。结果表明,成都福际生物公司的土壤DNA提取试剂盒所得的基因组DNA质量最高,并用于后续研究。在无氧发酵蔬菜体系中,在pH值由5.7±0.1下降至3.4±0.1的发酵阶段,乳酸菌（3.73×107 cfu/mL）为总细菌（4.68×107 cfu/mL）中的主要菌群。在贮藏过程中（pH值3.3～3.5）,乳酸菌占到了总细菌数的53.7%。当进入到腐败阶段后,总细菌的数量迅速增加近4个数量级并伴随乳酸菌下降至无法检测,同时真菌开始复苏,腐败后期达到6.03×105 cfu/mL。在发酵过程中,Lactobacillus plantarum为最主要的乳酸菌,而在样品的储藏阶段,L.brevis数量逐渐增加,36天时L.brevis（4.57×104 cfu/mL）取代L.plantarum（7.76×103cfu/mL）成为了主要乳酸菌菌群。在未腐败样品的整个储藏阶段,L.brevis一直都是主要的乳酸菌菌种,并基本维持在104cfu/m L左右。而在腐败样品中,随着腐败的开始（pH值3.4±0.1～4.0±0.1）,检测到的L.plantarum逐渐增多至2.00×105cfu/mL,重新成为优势乳酸菌;当pH值上升超过4.5时,L.plantarum的数量慢慢减少直至无法检测到,但其他腐败微生物如肠杆菌属（Enterobacter）、梭菌属（Clostridium）等迅速生长,在总细菌中所占比例分别超过了23%和18%。在有氧渗入发酵系统的条件下,菌剂发酵蔬菜在第8天是出现了盐卤表面形成膜醭的典型腐败现象。在前15天的发酵过程中,样品的pH值由5.5±0.2迅速下降并稳定在3.6±0.1。盐卤中的总细菌数在第8天为1.50×107cfu/mL（S8）,第15天下降至7.00×105cfu/mL（S15）。之后随着pH值从4.5±0.3上升至6.3±0.3,细菌总数逐渐回升,从3.02×106 cfu/mL（S29）增加至4.61×108 cfu/mL（S57）,并且膜醭中细菌总数的变化情况与盐卤中类似。然而,乳酸菌在盐卤及膜醭中所占比例的变化情况则有所不同。乳酸菌在盐卤中所占的初始比例为71.11%（S1）,随着发酵、贮藏及腐败的进行,盐卤中乳酸菌所占的比例逐渐降低,从63.33%（S8）到无法检测（S57）,从第15天开始,膜醭中乳酸菌所占比例就逐渐高于盐卤中的比例。在第29天和43天时,膜醭中乳酸菌所占比例61.29%（M29）和30.00%（M43）显着高于了盐卤中36.67%（S29）和1.7%（S43）。微生物区系在储藏及腐败过程中有较大差异。储藏及腐败前期盐卤及膜醭样品中以L.plantarum,Cit.freundii为主。腐败中期样品中的优势菌为Ec.Malodoratus和Prop.acidipropionici。从第22天开始,样品中出现了Leu.mesenteroides,而在36天样品中就没有检测到了。在腐败后期时,Providencia rettgeri、Morganella morganii、Shewanella algae、Corynebacterium nuruki开始出现,并逐渐开始成为优势菌群。比较发现,在无氧渗入及有氧渗入的两种条件下,菌剂发酵蔬菜均会发生不同程度的腐败现象。在腐败初期,出现L.plantarum生长,随着腐败的进行,L.plantarum减少,直至无法检测到,同时伴随着腐败菌群的生长。但是这两种条件下的腐败过程中微生物组成差异较大,有氧渗入的情况下细菌种类（23个种）远远高于无氧渗入时的细菌种类（9个种）,并且在无氧渗入的样品中,细菌种类以梭菌属（Clostridium）的细菌为主。本论文结果为进一步解析菌剂发酵蔬菜的腐败规律和腐败防控措施的制定提供了理论基础。
程海卫[8]（2015）在《桔青霉素单克隆抗体和单链抗体的筛选及鉴定研究》文中研究说明桔青霉素（citrinin, CIT）是由青霉属和曲霉属等真菌产生的一种次级代谢产物,广泛存在于多种农产品和食品中。早年间,桔青霉素因为具有较好的抑菌效果,曾被作为抗生素进行使用,但后来经研究发现它也具有强烈的肾毒性和致癌性,严重危害人类和动物的健康。因此,建立一套针对桔青霉素残留的检测方法显得非常必要,而制备抗桔青霉素的特异性抗体对于临床检测方法的建立则具有重要的现实意义。本研究利用化学偶联方法分别制备了桔青霉素人工完全抗原CIT-BSA和CIT-OVA;采用细胞融合技术获得了抗桔青霉素的杂交瘤细胞株3B11及其单克隆抗体；根据基因工程原理构建了大容量、天然鼠源核糖体展示（Ribosome display, RD）单链抗体（Single-Chain Fragment Variant, scFv）文库；运用核糖体展示技术筛选到了抗桔青霉素的单链抗体基因。研究成果为桔青霉素的残留检测奠定了基础。1.桔青霉素完全抗原的合成与鉴定桔青霉素属于小分子半抗原,不具有免疫原性,无法直接用来对机体进行免疫制备抗体,所以,必须首先通过与蛋白载体进行偶联制成人工完全抗原。本研究采用碳二亚胺法,利用1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺（EDC）和N-羟基琥珀亚胺（NHS）作为偶联剂,牛血清白蛋白（BSA）和鸡卵清白蛋白（OVA）作为蛋白载体,分别制备了CIT-BSA和CIT-OVA人工完全抗原,并使用紫外光谱分析、SDS-PAGE以及MALDI-TOF质谱法分别对偶联反应前后物质进行鉴定。鉴定结果显示人工完全抗原CIT-BSA成功偶联,C1T与BSA的偶联比例约为5：1,可以用来对动物机体进行免疫制备相应的抗体。2.桔青霉素单克隆抗体的制备及鉴定为制备抗桔青霉素的单克隆抗体,本研究利用所制备的偶联抗原CIT-BSA对Balb/C小鼠进行免疫,取免疫后的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合,采用间接ELISA和竞争ELISA检测方法进行筛选,经3次亚克隆后筛选到5株稳定分泌抗桔青霉素抗体的杂交瘤细胞株,分别为2A9、3B5、3B11、3C5、 6C1.所筛选到的单克隆抗体经过初步鉴定,抗体亚类分别有IgM、IgG1、IgG2a;经间接竞争ELISA检测方法鉴定,单克隆抗体3B11对桔青霉素的IC50值为150.9 ng/mL,最低检测限ICl0为5.42 ng/mL;与展青霉毒素（PAT）、黄曲霉毒素（AFB1）、伏马毒素（FB1）和赭曲霉毒素（OTA）的交叉反应率均低于0.01%；抗体亲和力常数为7.75×107L/moL,属于高亲和力抗体。本实验所制备的单抗具有较好的抑制效果、灵敏性和特异性,为快速检测桔青霉素的酶联免疫检测方法的建立和检测试剂盒的研制提供了技术依据。3.大容量天然鼠源核糖体展示单链抗体文库的构建与初步鉴定为构建大容量天然鼠源核糖体展示（Ribosome display, RD）单链抗体（Single-Chain Fragment Variant, scFv）基因文库,本研究通过提取SPF级小鼠脾脏总RNA,反转录为cDNA,分别利用引物扩增鼠抗体的VH、VL和C1c基因,采用重叠延伸PCR （SOE-PCR）方法,通过Linker （（Gly4Ser）3）相互拼接,构建了单链抗体scFv基因文库和核糖体展示基因文库：经连接转化,对所构建基因文库进行菌落PCR鉴定、序列测定和比对分析。所构建核糖体展示基因文库库容量约为5.6×1013,基因片段全长大小约为1100 bp,基因文库序列具有较好的完整性和多样性。本试验成功构建了一个大容量天然鼠源核糖体展示单链抗体文库,为进一步筛选单链抗体奠定了基础。4.核糖体展示技术筛选抗桔青霉素的特异性单链抗体为获得桔青霉素特异性单链抗体,本研究在所构建的鼠源天然核糖体展示基因文库的基础上,采用核糖体展示技术进行体外转录和翻译,分别以人工完全抗原CIT-BSA、CIT-OVA和蛋白载体BSA、OVA为包被抗原,采用间接ELISA方法对其进行筛选,亲和筛选所获得的mRNA运用真核原位RT-PCR方法进行回收,所获得的cDNA利用表达载体pTIG-TRX在大肠杆菌内进行可溶性表达,并利用间接ELISA方法对表达产物进行鉴定。经过六轮亲和筛选和间接ELISA方法鉴定,共获得13个单链抗体基因,其中3个单链抗体（编号分别为23、68、109）与CIT具有较高的结合能力；间接竞争ELISA检测结果显示,68号单链抗体对CIT的IC5o值为1242.2 ng/mL,最低检测限LOD:ICio为3.1 ng/mL;并且与展青霉毒素（PAT）、黄曲霉毒素（AFB1）、伏马毒素（FB1）和赭曲霉毒素（OTA）的交叉反应率均低于0.01%；本实验运用核糖体展示技术获得抗CIT的单链抗体,对于建立CIT的快速检测方法具有重要的现实意义,同时也对与筛选其他小分子半抗原的特异性单链抗体以及建立新型检测技术奠定了基础。综上所述,本研究在人工完全抗原的基础上制备了抗桔青霉素的单克隆抗体与单链抗体,为建立桔青霉素残留检测方法奠定了基础,同时也为其他小分子半抗原单链抗体的制备提供了技术依据。
李海云[9]（2015）在《河西走廊盐碱土壤中未培养放线菌多样性研究》文中提出为更加准确了解河西走廊地区盐碱土壤中放线菌种群结构及其多样性信息。提取盐碱土样微生物总DNA,用放线菌特异性引物扩增16S rRNA基因片段,构建土壤放线菌16S rRNA基因克隆文库,用HaeⅢ和HhaⅠ两种限制性内切酶进行酶切分析,对酶切带型不同的菌液进行测序,并进行多样性和系统发育分析。研究结果表明:通过4种方法对盐碱土微生物总DNA进行提取比较,CaCl2-SDS-酶解法是一种最适于河西走廊盐碱土壤微生物总DNA的提取方法。对河西走廊盐碱土中放线菌多样性指数进行分析,疏勒河流域土样中放线菌多样性为原生>次生>农田;黑河流域土样中放线菌多样性为次生>原生;石羊河流域土样中放线菌多样性为次生>原生>农田。通过对河西走廊地区土样中放线菌的16S rRNA基因序列进行系统发育分析,结果表明:疏勒河流域原生盐碱土（S1）中放线菌分属于微球菌亚目、丙酸杆菌亚目、棒状杆菌亚目、弗兰克氏菌亚目、假诺卡氏菌亚目共5个亚目和放线菌未知类群;次生盐碱土（S2）中放线菌分属于微球菌亚目和丙酸杆菌亚目共2个亚目和放线菌未知类群;农田土（S3）中放线菌分属于微球菌亚目和棒状杆菌亚目共2个亚目。黑河流域原生盐碱土（S4）中放线菌分属于微球菌亚目、丙酸杆菌亚目、棒状杆菌亚目、链霉菌亚目共4个亚目和未知放线菌类群;次生盐碱土壤（S5）中放线菌分属于微球菌亚目、丙酸杆菌亚目、链霉菌亚目、微单孢菌亚目、棒状杆菌亚目、假诺卡氏菌亚目共6个亚目和放线菌未知类群。石羊河流域原生盐碱土（S6）中放线菌分属于微球菌亚目、弗兰克氏菌亚目、丙酸杆菌亚目、链霉菌亚目、棒杆菌亚目共5个亚目和放线菌未知类群;次生盐碱土（S7）中放线菌分属于微球菌亚目、弗兰克氏菌亚目、丙酸杆菌亚目、微单孢菌亚目、假诺卡氏亚目、链霉菌亚目、链孢囊菌亚目共7个亚目和放线菌未知类群;在农田土（S8）中放线菌分属于微球菌亚目、弗兰克氏菌亚目、丙酸杆菌亚目共3个亚目和放线菌未知类群。按土样类型不同对放线菌的16S rRNA基因序列进行系统发育分析,原生盐碱土中放线菌分属于微球菌亚目、丙酸杆菌亚目、棒状杆菌亚目、弗兰克氏菌亚目、假诺卡氏菌亚目、链霉菌亚目、链孢囊菌亚目共7个亚目和放线菌未知类群;次生盐碱土中放线菌分属于微球菌亚目、丙酸杆菌亚目、棒状杆菌亚目、弗兰克氏菌亚目、假诺卡氏菌亚目、链霉菌亚目、链孢囊菌亚目、微单孢菌亚目共8个亚目和放线菌未知类群;农田土中放线菌分属于微球菌亚目、弗兰克氏菌亚目、棒状杆菌亚目、丙酸杆菌亚目共4个亚目和放线菌未知类群。
井洪珍[10]（2014）在《珠江水体中氨氧化古菌亚硝酸盐还原酶和氨单加氧酶基因多样性研究》文中研究表明近年来，随着农业、工业和城市污水的排放和城镇化的加剧，排放到珠江中的可溶性无机氮含量愈来愈高，导致与氮循环有关的问题，如温室效应、水体富营养化和酸雨等问题的发生。而氨氧化过程是氮素循环的关键步骤，氨氧化古菌（Ammonia-oxidizingarchaea，AOA）发挥着重要作用， AOA-amoA基因编码的氨单加氧酶是氨氧化作用的关键酶，存在于所有类型的AOA中， AOA-nirK基因编码的亚硝酸盐还原酶是反硝化作用的关键酶，主要负责一氧化二氮气体的排放，研究表明海洋环境中AOA-nirK基因有较高的多样性，可能是该生态中一氧化二氮产生的主体，但是关于淡水环境中AOA-nirK的研究目前还很少。本文以珠江水体为研究对象，以亚硝酸还原酶基因（nirK）和氨单加氧酶基因（amoA）为分子标记，分别构建细菌nirK、AOA-nirK、AOA-amoA和AOB-amoA基因克隆文库，比较分析氨氧化微生物的多样性，并运用实时定量PCR（RT-PCR）对AOA-nirK、AOA-amoA和AOB-amoA基因的丰度进行了比较分析，得到以下主要结论：1.以珠江下游穗石、海心沙、白岘壳、和南沙段水样为研究对象，构建氨氧化古菌nirK基因克隆文库，通过限制性片段长度多样性（RFLP）和BLASTx比对分析得到：穗石、白蚬壳、海心沙、南沙四点水样的nirK基因文库总共可以划分为17个OTUs，其中海心沙水样nirK基因文库中OTU4和OTU5为优势克隆子，占总克隆子的14.06%，OTU10在穗石水样的nirK基因文库中的百分比为13.29，为优势克隆子，而南沙水样的nirK基因文库中的优势克隆子为OTU16，占总克隆子数的17.35%，白蚬壳水样的nirK基因文库优势克隆子为OTU16，占总克隆子数的13.08%。但是测得的氨基酸序列在NCBI数据库中与已有氨氧化古菌的相似度较低，在62%-76%之间。2.以珠江下游穗石、海心沙、白蚬壳、和南沙段水样为研究对象，构建氨氧化古菌AOA-amoA基因克隆文库，通过限制性片段长度多样性（RFLP）和BLASTx比对分析得到：穗石、白蚬壳、海心沙、南沙四点水样的AOA-amoA基因文库总共可以划分为16个OTUs，其中海心沙水样AOA-amoA基因文库中OTU2为优势克隆子，占总克隆子的17.27%，OTU2在穗石水样的AOA-amoA基因文库中的百分比为24.24%，为优势克隆子，而南沙水样的AOA-amoA基因文库中OTU2，仅占总克隆子数的11.11%，与其他三点相差较远。白蚬壳水样的AOA-amoA基因文库优势克隆子也为OTU2，且占总克隆子数的52.69%，远远超过了其他三点，含量比较丰富。南沙水样的AOA-amoA基因文库优势克隆子为OTU1，占总克隆子数的17.95%。测得的氨基酸序列在NCBI数据库中与已有按氧化古菌的相似度在99%-100%之间。3.比较分析珠江水体四点的AOA-nirK和AOA-amoA基因克隆文库的多样性和丰度，可以得到：AOA-amoA基因文库与海洋、热泉和土壤中的氨氧化古菌有着较高的相似度，在93%-100%之间，但是，根据nirK基因得到的基因克隆文库中，所有的序列与NCBI数据库中的已知氨氧化古菌和未培养的古菌都有着很低的相似度，在62%-76%之间，并且单独聚集在一起。且AOA-nirK基因文库17个OUT中有11个与CandidatusNitrosopumilus相似度最高，珠江水体中AOA-nirK有较高的多样性但可能其它的AOA-nirK基因未检测出，研究还有待进一步的完善。定量分析表明，珠江水体中的AOA-nirK基因丰度与AOA-amoA基因丰度相差10-20倍，同时水样中的氨氧化细菌16SrRNA基因丰度高于氨氧化古菌，并且南沙段水样的各基因丰度明显高于其他几个取样点。4.以穗石不同深度水样和泥样为研究对象，结合PCR-DGGE和RT-PCR技术，分析比较得到：DGGE图谱分析结果表明，穗石不同深度水样与泥样的nirK基因PCR产物电泳条带，水泥交界处的条带数目最多，为8条，水深1.5m左右条带数目为7条，其他点为4-5条，由条带亮度可以看出，水泥交界处（S0）和水表（W0）的得到的电泳条带相对较亮。RT-PCR结果表明，穗石不同深度水样与泥样中AOA-nirK基因拷贝数与AOA-amoA基因拷贝数和AOB-amoA基因拷贝数均相差10-20倍左右，除了S8位点，即深层底泥样品。其中AOA-amoA基因拷贝数由水表到深层底泥逐渐减少，但在S0，即水泥交界处达到最大值。而AOA-nirK基因拷贝数，在表层水体和水泥交界处的基因拷贝数较高，而深层底泥中AOA-nirK基因拷贝数最低。
二、关于基因文库的一般介绍（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、关于基因文库的一般介绍（论文提纲范文）
（1）TTC9C在胶质瘤放射敏感性中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 CRISPR Cas9 全基因组文库筛选肿瘤放射增敏新靶点 |
| 一、材料与方法 |
| (一)实验材料 |
| 1、实验细胞 |
| 2、CRISPR Cas9 人类全基因组文库 |
| 3、主要实验试剂 |
| 4、主要实验仪器及耗材 |
| 5、质粒信息 |
| 6、抗体信息 |
| (二)实验方法 |
| 1、60Co-γ射线照射 |
| 2、细胞培养与处理 |
| 3、CRISPR Cas9 人类全基因组文库感染与样品处理 |
| 4、高通量二代测序 |
| 5、慢病毒质粒构建 |
| 6、慢病毒包装及稳转细胞株构建 |
| 7、细胞蛋白提取 |
| 8、BCA法测定蛋白浓度 |
| 9、蛋白凝胶电泳 |
| 10、细胞凋亡检测 |
| 11、克隆形成率实验 |
| 12、细胞活力检测 |
| 13、统计方法 |
| 二、实验结果 |
| (一)CRISPR Cas9 人类全基因组文库(Ge CKO v2)病毒包装及感染 |
| (二)阴性筛选及高通量二代测序 |
| 1、sgRNA测序质量分析 |
| 2、sgRNA序列回帖分析 |
| 3、样本聚类分析 |
| 4、Ribosome基因通路富集分析 |
| 5、差异基因筛选 |
| (三)目的基因的筛选与验证 |
| 1、TTC9C等目标基因的sh RNA构建、感染与敲低效果验证 |
| 2、TTC9C等基因敲低对肿瘤细胞的放射增敏作用 |
| 3、目标基因敲低对肿瘤细胞DNA损伤应答(DNA Damage Response,DDR)通路与凋亡相关蛋白的影响 |
| 三、讨论 |
| 第二部分 TTC9C在胶质瘤细胞放射敏感性中的作用 |
| 一、材料与方法 |
| (一)实验材料 |
| 1、实验细胞 |
| 2、主要实验试剂 |
| 3、主要实验仪器及耗材 |
| 4、质粒信息 |
| 5、抗体信息 |
| (二)实验方法 |
| 1、慢病毒质粒构建 |
| 2、细胞增殖检测 |
| 3、划痕实验 |
| 4、细胞周期检测 |
| 5、免疫荧光染色 |
| 6、其他方法 |
| 二、实验结果 |
| (一)TTC9C质粒过表达和敲低效果验证 |
| (二)TTC9C敲除单克隆细胞系筛选 |
| (三)TTC9C敲除显着抑制胶质瘤细胞的增殖能力 |
| (四)TTC9C敲除显着减弱胶质瘤细胞的迁移能力 |
| (五)TTC9C敲除显着降低胶质瘤细胞的照后活力 |
| (六)TTC9C敲除显着减少胶质瘤细胞的照后存活率 |
| (七)TTC9C敲除显着促进胶质瘤细胞的照后凋亡 |
| (八)TTC9C敲除或过表达对胶质瘤的照后细胞周期变化没有显着影响 |
| (九)TTC9C敲除显着抑制胶质瘤细胞的照后DNA损伤修复 |
| (十)TTC9C敲除显着抑制照后DNA损伤修复通路的激活 |
| 三、讨论 |
| 第三部分 TTC9C对胶质瘤荷瘤模型放射敏感性的影响及临床分析 |
| 一、材料与方法 |
| (一)实验材料 |
| 1、实验动物 |
| 2、主要实验试剂 |
| 3、主要实验仪器及耗材 |
| 4、抗体信息 |
| (二)实验方法 |
| 1、裸鼠颅内原位荷瘤 |
| 2、荷瘤裸鼠放射处理 |
| 3、荷瘤裸鼠生存率观察 |
| 4、石蜡组织切片制作 |
| 5、苏木精-伊红染色 |
| 6、免疫组化染色 |
| 7、TUNEL染色 |
| 8、生物信息学分析 |
| 9、其他方法: |
| 二、实验结果 |
| (一)TTC9C敲除在颅内胶质瘤中发挥了显着的放射增敏效果 |
| 1、裸鼠胶质瘤颅内原位荷瘤模型构建成功 |
| 2、TTC9C敲除显着延长荷瘤裸鼠的照后生存时间 |
| 3、TTC9C敲除显着减小颅内胶质瘤的照后体积 |
| 4、TTC9C敲除显着抑制颅内胶质瘤的照后增殖能力 |
| 5、TTC9C敲除显着促进颅内胶质瘤的照后凋亡 |
| 6、TTC9C敲除显着抑制颅内胶质瘤的照后HR修复 |
| (二)TTC9C在胶质瘤预后和HR修复信号通路的生物信息学分析 |
| 1、TTC9C表达量显着影响胶质瘤等癌症患者的预后 |
| 2、TTC9C与 HR相关蛋白的表达具有显着的相关性 |
| 3、现有研究并未揭示TTC9C与 HR修复的相关关系 |
| 4、TTC9C相关基因功能的挖掘 |
| 三、讨论 |
| 第四部分 TTC9C在胶质瘤放射敏感性及DNA损伤修复中的机制研究 |
| 一、材料与方法 |
| (一)实验材料 |
| 1、实验细胞 |
| 2、主要实验试剂 |
| 3、主要实验仪器及耗材 |
| 4、质粒信息 |
| 5、抗体信息 |
| (二)实验方法 |
| 1、慢病毒质粒构建 |
| 2、免疫共沉淀 |
| 3、蛋白质谱分析 |
| 4、其他方法 |
| 二、实验结果 |
| (一)电离辐射可导致TTC9C核内募集 |
| (二)TTC9C在照后发生磷酸化修饰 |
| (三)蛋白质谱筛选TTC9C结合蛋白 |
| (四)TTC9C与 ATR等 HR修复通路相关蛋白结合发挥作用 |
| (五)TTC9C与 ATR结合位点的筛选 |
| 三、讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附表一 阴性选择差异基因列表(前200位) |
| 附表二 TTC9C结合蛋白列表(前200位) |
| 附表三 TTC9C正相关基因列表(前200位) |
| 附表四 胶质瘤中与TTC9C负相关基因列表 |
| 文献综述 CRISPR Cas9 全基因组文库应用与展望 |
| References |
| 在读期间发表论文 |
| 致谢 |
（2）2019年全国Ⅰ卷理综生物38题试题分析（论文提纲范文）
| 一、原题呈现 |
| 二、参考答案 |
| 三、试题对比与评价 |
| 四、易错解析 |
| 1. 概念混淆 |
| 2.“酶”和“键”不清 |
| 3. 答案不全 |
| 五、教材相关知识再梳理 |
| 1. 基因文库、基因组文库和部分基因文库中的cDNA文库 |
| 2. DNA复制和PCR技术 |
| 3. 相关酶的辨析 |
| 六、备考建议 |
| 1. 抓大不放小，避免知识遗漏 |
| 2. 挖不同主线，构建多级网络 |
（3）乳氟禾草灵降解菌株Bacillus sp. YS-1的分离、鉴定及其降解机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号与缩略语说明 |
| 绪论 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 二苯醚类除草剂概况 |
| 1.1 二苯醚类除草剂的发展概况及其应用 |
| 1.2 二苯醚类除草剂的除草机制 |
| 1.3 二苯醚类除草剂的残留及环境危害 |
| 1.4 微生物降解二苯醚类除草剂的研究进展 |
| 2 酯酶简介及其分类 |
| 2.1 酯酶简介 |
| 2.2 酯酶的分类 |
| 3 手性除草剂的微生物降解 |
| 4 本研究的目的和意义 |
| 第二章 乳氟禾草灵降解菌株YS-1的分离、降解特性及代谢途径研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试剂和培养基 |
| 1.2 乳氟禾草灵降解菌株的分离 |
| 1.3 菌株YS-1的16S rRNA序列分析 |
| 1.4 菌株YS-1的降解特性 |
| 1.5 菌株YS-1降解乳氟禾草灵的代谢途径 |
| 1.6 乙酰氨基三氟羧草醚对黄瓜和高粱幼苗生长的影响 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 乳氟禾草灵降解菌株的分离 |
| 2.2 菌株YS-1的菌落形态 |
| 2.3 菌株YS-1的16S rRNA序列分析 |
| 2.4 菌株YS-1降解乳氟禾草灵的降解特性 |
| 2.5 菌株YS-1降解乳氟禾草灵代谢途径 |
| 2.6 乙酰氨基三氟羧草醚对黄瓜和高粱幼苗的影响 |
| 3 本章讨论 |
| 4 本章小结 |
| 第三章 乳氟禾草灵降解菌株YS-1中酯酶基因rhoE和rapE的克隆 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 培养基与试剂 |
| 1.2 菌株和质粒 |
| 1.3 鸟枪法构建基因文库路线图 |
| 1.4 菌株YS-1总DNA的酶切及酶切片段的回收 |
| 1.5 酶连与转化 |
| 1.6 阳性克隆子对乳氟禾草灵降解效果测定 |
| 1.7 阳性克隆序列的测定与分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 菌株YS-1总DNA的提取及总DNA的酶切 |
| 2.2 阳性克隆子的筛选 |
| 2.3 阳性克隆子的测序及ORF分析 |
| 2.4 酯酶RhoE和RapE在酯酶家族中的分类地位 |
| 2.5 酯酶RhoE和RapE的信号肽分析 |
| 3 本章讨论 |
| 4 本章小结 |
| 第四章 RhoE和RapE的表达、纯化及酶学特性研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试剂与培养基 |
| 1.2 质粒、菌株与引物 |
| 1.3 酯酶RhoE和RapE表达载体的构建 |
| 1.4 酯酶RhoE和RapE的表达 |
| 1.5 酯酶RhoE和RapE的纯化 |
| 1.6 SDS-PAGE凝胶电泳 |
| 1.7 酯酶RhoE和RapE的功能验证及底物谱分析 |
| 1.8 酯酶RhoE和RapE的酶学特性 |
| 1.9 酯酶RhoE和RapE的立体异构选择性分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 酯酶基因rhoE和rapE的PCR扩增 |
| 2.2 酯酶RhoE和RapE表达载体的构建 |
| 2.3 酯酶RhoE和RapE表达和纯化 |
| 2.4 酯酶RhoE和RapE的功能验证及底物谱分析 |
| 2.5 酯酶RhoE和RapE的酶学特性 |
| 2.6 酯酶RhoE和RapE的立体异构选择性分析 |
| 3 本章讨论 |
| 4 本章小结 |
| 全文总结 |
| 研究展望 |
| 论文创新 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读硕士期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（4）硫醚单加氧酶的发现表征及其结构与功能关系研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 手性亚砜化合物的简介 |
| 1.2 质子泵抑制剂 |
| 1.2.1 质子泵抑制剂概述 |
| 1.2.2 质子泵抑制剂作用机制 |
| 1.2.3 埃索美拉唑-(S)-奥美拉唑 |
| 1.3 手性亚砜化合物的合成方法 |
| 1.3.1 化学不对称氧化法 |
| 1.3.2 手性拆分法 |
| 1.3.3 生物法合成 |
| 1.4 Baeyer-Villiger单加氧酶 |
| 1.4.1 Baeyer-Villiger单加氧酶的分类 |
| 1.4.2 Baeyer-Villiger单加氧酶的三维结构 |
| 1.4.3 Baeyer-Villiger单加氧酶的催化机理 |
| 1.4.4 Baeyer-Villiger单加氧酶的分子改造及应用 |
| 1.4.4.1 蛋白质工程简介和常用方法 |
| 1.4.4.2 Baeyer-Villiger单加氧酶突变库的高通量筛选 |
| 1.4.4.3 Baeyer-Villiger单加氧酶的分子改造 |
| 1.4.4.4 Baeyer-Villiger单加氧酶的应用 |
| 1.5 亚铁血红素依赖的单加氧酶 |
| 1.5.1 P450单加氧酶的分类 |
| 1.5.2 关于P450单加氧酶的催化机理 |
| 1.5.3 P450单加氧酶催化的反应类型 |
| 1.5.4 P450单加氧酶的结构与电子传递机制 |
| 1.6 本课题思路目的及意义 |
| 1.7 本课题的思路与主要研究内容 |
| 第2章 硫醚单加氧酶的基因挖掘及酶学性质表征 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 主要实验试剂和仪器设备 |
| 2.2.2 Baeyer-Villiger单加氧酶的基因挖掘 |
| 2.2.2.1 以EtaA和CHMO_(NCIMB9871)为模板的基因检索 |
| 2.2.2.2 Baeyer-Villiger单加氧酶的克隆 |
| 2.2.2.3 Baeyer-Villiger单加氧酶的异源表达 |
| 2.2.3 Baeyer-Villiger单加氧酶的活力测定 |
| 2.2.3.1 分析方法的建立 |
| 2.2.3.2 Baeyer-Villiger单加氧酶粗酶活力测定 |
| 2.2.4 进化树的构建及序列比对分析 |
| 2.2.5 蛋白质纯化 |
| 2.2.6 最适温度测定 |
| 2.2.7 最适pH测定 |
| 2.2.8 热稳定性测定 |
| 2.2.9 底物谱测定 |
| 2.2.10 BoBVMO催化奥美拉唑硫醚的反应优化及性能表征 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 产物埃索美拉唑标准曲线的测定 |
| 2.3.2 Baeyer-Villiger单加氧酶EtaA同源酶的挖掘 |
| 2.3.3 环己酮单加氧酶CHMO_(NCIMB9871)同源酶的基因挖掘 |
| 2.3.4 系统进化树的构建和序列比对分析 |
| 2.3.5 蛋白质纯化 |
| 2.3.6 最适温度 |
| 2.3.7 最适pH |
| 2.3.8 热稳定性 |
| 2.3.9 底物谱扩展 |
| 2.3.10 BoBVMO催化奥美拉唑硫醚的反应优化及性能表征 |
| 2.4 本章小结 |
| 第3章 AcCHMO的分子改造、结构解析及构效关系探究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 主要实验试剂和仪器设备 |
| 3.2.2 突变体的构建和表达 |
| 3.2.3 AcCHMO同源建模、分子对接和底物通道的预测 |
| 3.2.4 CASTing库的构建 |
| 3.2.5 易错PCR库的构建 |
| 3.2.6 DNA shuffling随机重组突变位点 |
| 3.2.7 高通量筛选方法的建立 |
| 3.2.8 突变文库的筛选 |
| 3.2.9 AcCHMO及其突变体的纯化 |
| 3.2.10 AcCHMO突变体对OPS比活力和选择性的测定 |
| 3.2.11 晶体初筛与条件优化 |
| 3.2.12 晶体的X-ray衍射数据采集和处理 |
| 3.2.13 AcCHMO及其突变体对不同底物活力的测定 |
| 3.2.14 AcCHMO突变体催化反应分析 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 平板透明圈筛选法的构建 |
| 3.3.2 AcCHMO同源建模、分子对接和底物通道的预测 |
| 3.3.3 CASTing库的构建 |
| 3.3.4 CASTing库的筛选结果 |
| 3.3.5 易错PCR库的构建 |
| 3.3.6 AcCHMO_(M6)中双突变点分析 |
| 3.3.7 DNA shuffling随机重组突变位点 |
| 3.3.8 AcCHMO_(WT)及其突变体结晶用蛋白质的纯化 |
| 3.3.9 AcCHMO_(WT)及其突变体晶体初筛和条件优化 |
| 3.3.10 AcCHMO_(M2)衍射数据的收集与处理 |
| 3.3.11 AcCHMO_(M2)的晶体结构分析 |
| 3.3.12 AcCHMO_(M2)与OPS的分子对接 |
| 3.3.13 AcCHMO_(M5)突变位点分析 |
| 3.3.14 易错PCR突变位点分析 |
| 3.3.15 AcCHMO底物特异性迁移的研究 |
| 3.3.16 AcCHMO突变体的纯酶反应比较结果 |
| 3.4 本章小结 |
| 第4章 硫醚单加氧酶P450_(SMO)电子传递机制的研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 主要实验试剂和仪器设备 |
| 4.2.2 突变体的构建 |
| 4.2.3 P450_(SMO)及其突变体的表达纯化 |
| 4.2.4 P450_(SMO)的光谱学研究 |
| 4.2.4.1 P450_(SMO)各组分特征峰测定 |
| 4.2.4.2 辅酶及三种底物动力学参数的测定 |
| 4.2.5 P450_(SMO)的单分子荧光标记实验 |
| 4.2.5.1 半胱氨酸突变体构建 |
| 4.2.5.2 非天然氨基酸pAzF突变体的构建 |
| 4.2.6 蛋白质化学交联结合质谱鉴定技术 |
| 4.2.7 P450_(SMO)及其突变体的活力测定 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 P450_(SMO)的光谱学研究 |
| 4.3.1.1 P450_(SMO)各组分特征峰测定 |
| 4.3.1.2 辅酶及底物动力学的测定 |
| 4.3.2 P450_(SMO)的单分子荧光标记实验 |
| 4.3.2.1 半胱氨酸突变体构建纯化及活力测定 |
| 4.3.2.2 半胱氨酸单分子荧光标记 |
| 4.3.2.3 非天然氨基酸pAzF突变体的构建 |
| 4.3.2.4 CXMS和smFRET实验结果分析 |
| 4.3.3 P450_(SMO)中关键氨基酸的突变分析 |
| 4.4 本章小结 |
| 第5章 全文总结和展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 创新点 |
| 5.3 展望 |
| 参考文献 |
| 博士期间撰写的论文和专利 |
| 致谢 |
| 附录 |
（5）反硝化喹啉降解微生物群落结构与功能关系的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 引言 |
| 1.1 微生物生物降解研究进展 |
| 1.1.1 有氧条件下污染物降解研究 |
| 1.1.2 厌氧条件下污染物降解研究 |
| 1.2 有机物厌氧降解相关的微生物功能群 |
| 1.2.1 反硝化微生物研究 |
| 1.2.2 硫酸盐还原菌研究 |
| 1.2.3 产甲烷条件下微生物 |
| 1.3 微生物互营(SYNTROPHY)研究进展 |
| 1.4 喹啉生物降解研究进展 |
| 1.4.1 喹啉概述 |
| 1.4.2 喹啉好氧生物降解研究进展 |
| 1.4.3 喹啉厌氧生物降解研究进展 |
| 1.5 本章小结 |
| 第二章 喹啉反硝化降解菌群的研究 |
| 引言 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 反硝化喹啉降解反应器的运行状况 |
| 2.1.2 生物膜样品采集与处理 |
| 2.1.3 寻找喹啉降解最适碳氮比的体外批式培养实验 |
| 2.1.4 最适碳氮比条件下(COD:NO_3~--N=5.1)的喹啉降解研究 |
| 2.1.5 化学成分分析 |
| 2.1.6 自动化反硝化培养物实时气体检测系统(ROBOT系统) |
| 2.1.7 喹啉降解动力学模型分析 |
| 2.1.8 批式培养菌群样品的基因组DNA提取 |
| 2.1.9 批式培养菌群样品的Total RNA提取与反转录c DNA合成 |
| 2.1.10 喹啉降解菌群的变性梯度凝胶电泳分析(DGGE) |
| 2.1.11 细菌16S rRNA基因V1-V3 区的454 焦磷酸测序及分析 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.2.1 寻找喹啉降解的最适碳氮比 |
| 2.2.2 最优碳氮比条件下(COD/NO_3~--N=5.1)的喹啉降解动态过程研究 |
| 2.2.3 喹啉降解过程中微生物群落研究 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 两种不同碳氮比对喹啉降解的影响 |
| 引言 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 实验结果 |
| 3.2.1 两种不同碳氮比条件下的喹啉降解生理参数动态变化 |
| 3.2.2 两种不同碳氮比处理对喹啉降解菌群的影响 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 亚硝酸盐对喹啉降解的影响 |
| 引言 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 实验结果 |
| 4.2.1 亚硝酸盐作为电子受体条件下的喹啉降解过程 |
| 4.2.2 亚硝酸盐作为电子受体条件下的喹啉去除率 |
| 4.2.3 亚硝酸盐作为电子受体对喹啉降解菌群的影响 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 喹啉降解反应器中反硝化基因的系统发育分析 |
| 引言 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 生物膜样品采集 |
| 5.1.2 生物膜样品DNA提取 |
| 5.1.3 反硝化功能基因nosZ、narG、nirS和 nirK文库构建与分析 |
| 5.2 实验结果 |
| 5.2.1 反硝化功能基因nosZ基因克隆文库分析 |
| 5.2.2 反硝化功能基因narG基因克隆文库分析 |
| 5.2.3 反硝化功能基因nirS基因克隆文库的分析 |
| 5.2.4 反硝化功能基因nirK基因克隆文库的分析 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 本章小结 |
| 参考文献 |
| 论文的创新点 |
| 附录1 缩写及全称 |
| 附录2 溶液及培养基配方 |
| 附录3 仪器设备 |
| 致谢 |
| 博士期间已发表的学术文章及参加的科研课题 |
（6）沁水盆地柿庄南区块煤储层C-N-S微生物地球化学循环与产气潜力研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 1前言 |
| 1.1 选题意义及项目来源 |
| 1.2 国内外研究现状 |
| 1.2.1 微生物的碳循环研究进展 |
| 1.2.2 微生物的硫循环研究进展 |
| 1.2.3 微生物的氮循环研究进展 |
| 1.2.4 C-N-S微生物地球化学作用的协同作用与微生物区带研究进展 |
| 1.2.5 微生物的C-N-S循环对煤层气富集与产能的影响 |
| 1.3 项目的研究内容与思路 |
| 1.3.1 研究内容 |
| 1.3.2 研究目标 |
| 1.3.3 总体思路 |
| 1.3.4 技术流程和实验手段 |
| 1.4 本论文的特色与创新之处 |
| 1.4.1 主要创新点 |
| 1.4.2 主要工作量与成果 |
| 2 柿庄南区块煤层气地质特征 |
| 2.1 柿庄南区块构造特征 |
| 2.1.1 沁水盆地构造特征 |
| 2.1.2 柿庄南区块构造特征 |
| 2.2 柿庄南区块沉积特征 |
| 2.3 柿庄南区块煤层分布特征 |
| 2.4 柿庄南区块煤储层储层物性 |
| 2.4.1 柿庄南区块煤岩、煤质特征 |
| 2.4.2 柿庄南区块煤储层储层压力 |
| 2.4.3 柿庄南区块临界解吸压力 |
| 2.4.4 柿庄南区块煤的孔裂隙特征 |
| 2.4.5 柿庄南区块煤储层吸附性 |
| 2.4.6 柿庄南区块渗透率 |
| 2.5 柿庄南区块煤储层含气性 |
| 2.6 柿庄南区块15号煤顶板灰岩物性特征 |
| 2.7 柿庄南区块地质因素综合分析 |
| 3 柿庄南区块水文与水化学特征 |
| 3.1 柿庄南区块水文特征 |
| 3.1.1 柿庄南区块含水层与隔水层 |
| 3.1.2 柿庄南区块水文地质单元及周界特征 |
| 3.1.3 柿庄南区块水动力特征 |
| 3.2 柿庄南区块水化学场特征 |
| 3.2.1 柿庄南区块煤层产出水离子浓度动态变化特征 |
| 3.2.2 柿庄南区块煤层产出水氢氧同位素特征 |
| 3.2.3 柿庄南区块煤层产出水离子特征 |
| 4 柿庄南区块微生物16S rDNA基因文库 |
| 4.1 柿庄南区块煤储层产出水16SRDNA测序流程 |
| 4.1.1 总体工作流程概述 |
| 4.1.2 信息分析流程 |
| 4.1.3 数据统计 |
| 4.1.4 序列拼接 |
| 4.2 柿庄南区块煤储层产出水微生物OTU及其丰度分析 |
| 4.2.1 OTU统计 |
| 4.2.2 OTU Venn图分析 |
| 4.2.3 OTU PCA分析 |
| 4.2.4 OTU Rank曲线 |
| 4.2.5 C-N-S细菌简介 |
| 4.3 柿庄南区块煤储层产出水微生物物种及其丰度分析 |
| 4.3.1 物种注释分析 |
| 4.3.2 物种热图分析 |
| 4.3.3 物种系统进化分析 |
| 4.4 柿庄南区块煤储层产出水微生物多样性分析 |
| 4.5 柿庄南区块煤储层产出水样品间多样性比较分析 |
| 4.6 柿庄南区块煤储层产出水样品间物种组成聚类分析 |
| 5 柿庄南区块煤储层微生物C-N-S地球化学作用机理 |
| 5.1 柿庄南区块微生物C循环作用 |
| 5.2 柿庄南区块微生物S循环作用 |
| 5.2.1 硫酸盐还原作用机理 |
| 5.2.2 柿庄南区块产甲烷菌所产甲烷的消耗作用 |
| 5.2.3 柿庄南区块S循环作用对煤层水微量元素分布的影响 |
| 5.3 柿庄南区块微生物N循环作用 |
| 5.3.1 微生物N循环作用机理 |
| 5.3.2 柿庄南区块的微生物N循环作用 |
| 5.4 柿庄南区块微生物C-N-S循环微生物区带划分 |
| 6 柿庄南区块C-N-S微生物地球化学对产能的影响 |
| 6.1 柿庄南区块产能概况 |
| 6.2 柿庄南区块微生物作用区带产能数值模拟与储层动态变化 |
| 6.2.1 宏观裂隙系统基本微分方程 |
| 6.2.2 压裂裂缝系统基本方程 |
| 6.2.3 排采过程中煤储层天然裂隙渗透率的变化数学模型 |
| 6.3 柿庄南区块各微生物区带典型单井与井组产能数值模拟 |
| 6.3.1 柿庄南区块产甲烷带典型单井与井组产能数值模拟 |
| 6.3.2 柿庄南区块SMTZ典型单井与井组产能数值模拟 |
| 6.3.3 柿庄南区块反硝化带典型单井与井组产能数值模拟 |
| 7 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录1 |
| 附录2 在学期间发表论文情况 |
（7）菌剂发酵蔬菜在腐败过程中的微生物群落变化（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 发酵蔬菜的概述 |
| 1.2 乳酸菌的介绍 |
| 1.3 总DNA提取方法的介绍 |
| 1.4 基因文库的概述 |
| 1.5 发酵蔬菜中膜醭的概述 |
| 1.6 发酵蔬菜中微生物动态变化的研究意义 |
| 2 盐卤总DNA提取方法比较 |
| 2.1 材料试剂与设备 |
| 2.1.1 材料与试剂 |
| 2.1.2 仪器设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 取样 |
| 2.2.2 总DNA的提取 |
| 2.2.3 总DNA质量检测 |
| 2.2.4 16S rDNA PCR体外扩增 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 凝胶电泳检测基因组DNA |
| 2.3.2 DNA的纯度与浓度 |
| 2.3.3 PCR扩增检测各基因组的质量 |
| 2.4 本章小结 |
| 3 无氧条件下发酵青菜腐败过程中的微生物群落变化 |
| 3.1 材料试剂与设备 |
| 3.1.1 材料与试剂 |
| 3.1.2 仪器设备 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 pH值的测定 |
| 3.2.2 发酵、贮藏及腐败时期微生物区系变化 |
| 3.2.3 LAB的分离鉴定 |
| 3.2.4 腐败泡菜中细菌的16SrDNA基因文库的建立 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 发酵及储藏过程中的pH值及微生物区系变化 |
| 3.3.2 菌剂发酵蔬菜腐败程中的pH值及微生物区系变化 |
| 3.3.3 菌剂发酵蔬菜各个阶段的乳酸菌 |
| 3.3.4 腐败泡菜中腐败细菌总基因组及PCR产物的电泳检测 |
| 3.3.5 腐败泡菜盐卤中的细菌多样性 |
| 3.3.6 腐败泡菜中腐败微生物的分布 |
| 3.4 本章小结 |
| 4 有氧渗入发酵蔬菜腐败过程中的微生物群落变化 |
| 4.1 材料试剂与设备 |
| 4.1.1 材料与试剂 |
| 4.1.2 仪器设备 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 各时期pH值的测定 |
| 4.2.2 发酵及腐败时期微生物曲系变化 |
| 4.2.3 有氧渗入发酵泡菜盐卤及膜醭细菌的16SrDNA基因文库的建立 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 膜醭及盐卤中的pH值及微生物区系变化 |
| 4.3.2 腐败膜醭及盐卤样品的总基因组及PCR产物的电泳检测 |
| 4.3.3 贮藏及腐败过程中膜醭及盐卤中的细菌多样性 |
| 4.3.5 细菌分布及系统发育树的建立 |
| 4.4 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表学术论文情况 |
| 致谢 |
（8）桔青霉素单克隆抗体和单链抗体的筛选及鉴定研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 桔青霉素及其检测方法 |
| 1 桔青霉素概述 |
| 1.1 桔青霉素的理化性质 |
| 1.2 桔青霉素的毒性和抑菌性 |
| 1.3 桔青霉素的限量标准 |
| 2 桔青霉素的检测方法 |
| 2.1 薄层层析法 |
| 2.2 高效液相色谱法 |
| 2.3 酶联免疫吸附测定法 |
| 3 小结 |
| 第二章 抗体制备研究进展 |
| 1 抗体制备概述 |
| 1.1 多克隆抗体的制备 |
| 1.2 单克隆抗体的制备 |
| 1.3 基因工程重组抗体的制备 |
| 2 抗体库技术 |
| 2.1 噬菌体展示技术 |
| 2.2 核糖体展示技术 |
| 3 小结 |
| 第二部分 研究内容 |
| 第三章 桔青霉素完全抗原的合成与鉴定 |
| 摘要 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 主要试剂 |
| 1.1.2 主要仪器 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 桔青霉素人工完全抗原的合成 |
| 1.2.2 桔青霉素人工完全抗原的紫外光谱分析鉴定 |
| 1.2.3 桔青霉素人工完全抗原的SDS-PAGE鉴定 |
| 1.2.4 桔青霉素人工完全抗原的MALDI-TOF鉴定以及偶联比的测定 |
| 2 结果 |
| 2.1 桔青霉素及人工抗原的紫外光谱分析鉴定结果 |
| 2.2 人工完全抗原的SDS-PAGE鉴定结果 |
| 2.3 人工完全抗原的质谱鉴定结果 |
| 3 讨论 |
| 第四章 桔青霉素单克隆抗体的制备及鉴定 |
| 摘要 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 主要试剂和耗材 |
| 1.1.2 实验动物 |
| 1.1.3 细胞系 |
| 1.1.4 主要仪器 |
| 1.1.5 主要试剂的配制 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 Bradford法测蛋白质浓度 |
| 1.2.2 动物免疫 |
| 1.2.3 免疫小鼠血清效价测定 |
| 1.2.4 单克隆抗体的制备与鉴定 |
| 2 结果 |
| 2.1 蛋白浓度的测定 |
| 2.2 免疫小鼠血清效价的测定 |
| 2.3 间接ELISA检测方法的建立 |
| 2.4 间接竞争ELISA检测多抗血清的抑制性 |
| 2.5 单克隆抗体细胞株的筛选与建立 |
| 3 讨论 |
| 第五章 大容量天然鼠源核糖体展示单链抗体文库的构建与初步鉴定 |
| 摘要 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 主要试剂 |
| 1.1.2 主要仪器 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 小鼠脾脏总RNA的提取 |
| 1.2.2 cDNA的合成 |
| 1.2.3 VH、Linker、VL和Cκ基因的扩增 |
| 1.2.4 单链抗体scFv基因文库的组装和序列多样性分析 |
| 1.2.5 核糖体展示基因文库的组装和序列分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 VH、Linker、VL和Cκ基因的扩增与鉴定 |
| 2.2 单链抗体scFv基因文库的扩增和序列多样性分析鉴定 |
| 2.3 核糖体展示基因文库的扩增和序列分析鉴定 |
| 3 讨论 |
| 第六章 核糖体展示技术筛选抗桔青霉素的特异性单链抗体 |
| 摘要 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 主要试剂 |
| 1.1.2 主要仪器 |
| 1.1.3 主要试剂的配制 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 核糖体展示基因文库的体外转录翻译 |
| 1.2.2 固相亲和筛选 |
| 1.2.3 原位反转录回收 |
| 1.2.4 PCR扩增及新一轮展示模板的构建 |
| 1.2.5 筛选后单链抗体基因克隆的筛选 |
| 1.2.6 单链抗体基因的原核表达与鉴定 |
| 1.2.7 抗桔青霉素单链抗体的筛选与鉴定 |
| 1.2.8 抗桔青霉素单链抗体基因序列比对分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 体外转录翻译与亲和筛选 |
| 2.2 单链抗体基因克隆的筛选 |
| 2.3 单链抗体基因的原核表达与Western blot鉴定 |
| 2.4 抗桔青霉素单链抗体结合活性的鉴定 |
| 2.5 抗桔青霉素单链抗体竞争抑制效果与特异性的鉴定 |
| 2.6 抗桔青霉素单链抗体基因序列的比对分析 |
| 3 讨论 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 展望 |
| 附录Ⅰ 溶液配制 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间的主要成果 |
| 致谢 |
（9）河西走廊盐碱土壤中未培养放线菌多样性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 放线菌 |
| 1.1.1 放线菌概述 |
| 1.1.2 盐碱环境放线菌研究现状及意义 |
| 1.2 盐碱土壤微生物多样性研究方法 |
| 1.2.1 盐碱土壤微生物多样性含义 |
| 1.2.1.1 物种多样性 |
| 1.2.1.2 遗传多样性 |
| 1.2.1.3 功能多样性 |
| 1.2.2 盐碱土壤微生物多样性的研究方法 |
| 1.2.2.1 传统的微生物平板纯培养法 |
| 1.2.2.2 生物化学方法 |
| 1.2.2.3 分子生物学方法 |
| 1.3 放线菌分类学研究 |
| 1.3.1 国外分类学进展 |
| 1.3.2 国内分类学进展 |
| 1.3.3 多相分类研究 |
| 1.4 展望 |
| 1.5 本研究目的与意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 土壤样品采集及处理 |
| 2.1.2 主要试剂与器材 |
| 2.1.2.1 主要试剂 |
| 2.1.2.2 主要仪器 |
| 2.1.2.3 引物 |
| 2.1.2.4 培养基 |
| 2.2 研究方法 |
| 2.2.1 土壤微生物总DNA提取方法优化 |
| 2.2.1.1 方法一(Omega试剂盒法) |
| 2.2.1.2 方法二(MoBio试剂盒法) |
| 2.2.1.3 方法三(CTAB-SDS法) |
| 2.2.1.4 方法四(CaCl2-SDS-酶解法) |
| 2.2.1.5 土壤DNA纯度及浓度的检测 |
| 2.2.2 放线菌 16S rRNA基因的PCR扩增及纯化 |
| 2.2.2.1 第一轮PCR扩增 |
| 2.2.2.2 第二轮PCR扩增 |
| 2.2.2.3 Reconditioning PCR扩增 |
| 2.2.3 PCR产物纯化 |
| 2.2.4 目的基因与载体连接 |
| 2.2.5 转化 |
| 2.2.6 阳性克隆筛选 |
| 2.2.7 16S rRNA基因扩增片段限制性内切酶分析(ARDRA)及测序 |
| 2.2.8 系统发育分析及序列登录号 |
| 2.2.9 数据处理 |
| 第三章 结果与分析 |
| 3.1 土壤总DNA提取方法优化及 16S rRNA基因PCR扩增 |
| 3.2 ARDRA分析 |
| 3.3 多样性指数分析 |
| 3.3.1 河西走廊各地区土壤放线菌多样性指数分析 |
| 3.3.2 河西走廊盐碱土壤中放线菌多样性指数分析 |
| 3.4 系统发育分析 |
| 3.4.1 疏勒河流域地区盐碱土壤中放线菌系统发育分析 |
| 3.4.2 黑河流域地区盐碱土壤中放线菌系统发育分析 |
| 3.4.3 石羊河流域地区盐碱土壤中放线菌系统发育分析 |
| 3.4.4 河西走廊地区盐碱土壤中放线菌系统发育分析 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 5.1 DNA提取方法优化 |
| 5.2 放线菌多样性指数分析 |
| 5.3 放线菌系统发育分析 |
| 5.3.1 疏勒河流域放线菌系统发育分析 |
| 5.3.2 黑河流域放线菌系统发育分析 |
| 5.3.3 石羊河流域放线菌系统发育分析 |
| 5.3.4 河西走廊地区不同类型土壤中放线菌系统发育分析 |
| 参考文献 |
| 参与项目与科研成果 |
| 致谢 |
（10）珠江水体中氨氧化古菌亚硝酸盐还原酶和氨单加氧酶基因多样性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 珠江水体污染现状 |
| 1.2 氮循环及其参与微生物研究进展 |
| 1.2.1 氮循环及其关键酶 |
| 1.2.2 氨氧化微生物和反硝化微生物的研究 |
| 1.3 克隆文库构建、PCR-DGGE 及 Q-PCR |
| 1.3.1 克隆文库构建及其应用 |
| 1.3.2 PCR-DGGE 技术 |
| 1.3.3 Q-PCR 技术 |
| 1.4 本文研究内容及目的、意义 |
| 1.4.1 研究内容 |
| 1.4.2 研究目的及意义 |
| 第二章 nirK 基因克隆文库群落结构及丰度分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 试剂及仪器 |
| 2.2.2 水样的采集及预处理 |
| 2.2.3 CTAB 法提取水样总 DNA |
| 2.2.4 nirK 功能基因克隆文库的构建 |
| 2.2.5 阳性克隆子的筛选 |
| 2.2.6 克隆文库的 RFLP 分析 |
| 2.2.7 nirK 基因文库克隆子测序及系统发育树的构建 |
| 2.2.8 nirK 基因文库覆盖率及多样性指数的计算 |
| 2.2.9 nirK、Arch-amoA、amoA 基因实时定量 PCR |
| 2.3 结果及讨论 |
| 2.3.1 珠江水体四点样品基因组提取结果 |
| 2.3.2 nirK 基因扩增及其纯化结果 |
| 2.3.3 nirK 基因阳性克隆子的筛选 |
| 2.3.4 nirK 基因双酶切结果 |
| 2.3.5 nirK 基因阳性克隆子的分类 |
| 2.3.6 nirK 基因文库覆盖率及多样性指数分析 |
| 2.3.7 nirK 基因文库系统发育树分析 |
| 2.3.8 古菌 nirK 基因文库与细菌 nirK 基因文库比较 |
| 2.3.9 nirK 基因丰度分析 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 Arch-amoA 基因克隆文库的构建及群落结构和丰度分析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 试剂及仪器 |
| 3.2.2 水样的采集及预处理 |
| 3.2.3 CTAB 法提取水样总 DNA |
| 3.2.4 Arch-amoA 基因克隆文库的构建 |
| 3.2.5 阳性克隆子的筛选 |
| 3.2.6 克隆文库的 RFLP 分析 |
| 3.2.7 Arch-amoA 基因文库克隆子测序及系统发育树的构建 |
| 3.2.8 Arch-amoA 基因文库覆盖率及多样性指数的计算 |
| 3.3 结果及讨论 |
| 3.3.1 珠江水体四点样品基因组提取结果 |
| 3.3.2 Arch-amoA 基因扩增及其纯化结果 |
| 3.3.3 Arch-amoA 基因阳性克隆子的筛选 |
| 3.3.4 Arch-amoA 基因菌落 PCR 产物双酶切结果 |
| 3.3.5 Arch-amoA 基因阳性克隆子的分类 |
| 3.3.6 Arch-amoA 基因文库覆盖率及多样性指数比较 |
| 3.3.7 Arch-amoA 基因文库与 amoA 基因文库比较 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 穗石不同深度样品中氨氧化古菌群落结构及丰度分析 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 样品采集及预处理 |
| 4.2.2 基因组的提取 |
| 4.2.3 nirK 基因的 PCR 产物扩增 |
| 4.2.4 穗石不同深度水样与泥样中 nirK 基因的 DGGE 群落结构分析 |
| 4.2.5 穗石不同深度水样与泥样中 nirK、Arch-amoA、amoA 基因丰度分析 |
| 4.3 结果及讨论 |
| 4.3.1 穗石不同深度水样与泥样基因组提取结果 |
| 4.3.2 穗石不同深度样品 nirK 基因扩增结果 |
| 4.3.3 穗石不同深度水样与泥样 nirK 基因 PCR 产物 DGGE 结果 |
| 4.3.4 DGGE 图谱分析 |
| 4.3.5 穗石不同深度水样与泥样中 nirK 基因的群落结构分析 |
| 4.3.6 穗石不同深度水样与泥样中 nirK 基因丰度 |
| 4.4 本章小结 |
| 结论与展望 |
| 创新点 |
| 结论 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 附件 |
四、关于基因文库的一般介绍（论文参考文献）
- [1]TTC9C在胶质瘤放射敏感性中的作用及机制研究[D]. 曹堃. 中国人民解放军海军军医大学, 2020(02)
- [2]2019年全国Ⅰ卷理综生物38题试题分析[J]. 訾玉玲. 考试与招生, 2020(02)
- [3]乳氟禾草灵降解菌株Bacillus sp. YS-1的分离、鉴定及其降解机制的研究[D]. 陈玲玲. 南京农业大学, 2019(08)
- [4]硫醚单加氧酶的发现表征及其结构与功能关系研究[D]. 张?. 华东理工大学, 2018(01)
- [5]反硝化喹啉降解微生物群落结构与功能关系的研究[D]. 王芸. 上海交通大学, 2018(01)
- [6]沁水盆地柿庄南区块煤储层C-N-S微生物地球化学循环与产气潜力研究[D]. 时伟. 中国地质大学(北京), 2017(06)
- [7]菌剂发酵蔬菜在腐败过程中的微生物群落变化[D]. 蒋云露. 西华大学, 2016(12)
- [8]桔青霉素单克隆抗体和单链抗体的筛选及鉴定研究[D]. 程海卫. 浙江大学, 2015(01)
- [9]河西走廊盐碱土壤中未培养放线菌多样性研究[D]. 李海云. 西北师范大学, 2015(06)
- [10]珠江水体中氨氧化古菌亚硝酸盐还原酶和氨单加氧酶基因多样性研究[D]. 井洪珍. 华南理工大学, 2014(01)