一、脂质及其代谢调节物在骨重构中的作用(论文文献综述)
冷雨飞[1](2021)在《艾灸治疗类风湿关节炎的网状Meta分析及其疗效机制的脂质组学实验研究》文中认为目的(1)利用网状Meta分析,比较不同艾灸疗法治疗类风湿关节炎(Rheumatoid Arthritis,RA)的疗效差异,旨在明确治疗RA的最佳艾灸疗法,为中医护理技术艾灸的应用提供指导。(2)采用脂质组学高效液相色谱-质谱联用技术,探究RA潜在的脂质生物标志物,以及艾灸治疗RA的潜在作用靶点和网络通路,以期明确艾灸治疗RA的作用机制,为中医护理技术艾灸的应用提供依据。方法(1)网状 Meta 分析:全面系统地检索 PubMed,Web of science,EMBASE,Cochrane 图书馆,EBSCO以及四个中文数据库(万方、知网、中国生物医学文献服务系统和维普)。检索时间为从建库起至2020年10月30日。语言限定为中英文。根据纳排标准,由两名研究员独自进行文献筛选与资料提取。两名评价者独立使用Cochrane偏倚风险评估工具对纳入的随机对照试验进行质量评价。Stata 15.0中的“mvmeta”和“network”软件包用于网状Meta分析。(2)脂质组学机制实验研究:将32只SD大鼠作为研究对象,采用牛Ⅱ型胶原对随机选取的16只大鼠诱导建立RA模型,造模成功后随机分为4组,分别为对照组,模型组,艾灸对照组,艾灸模型组,每组各8只。其中,对照组和模型组不予治疗,艾灸模型组和艾灸对照组进行3周的艾灸治疗。比较4组大鼠的一般情况、体重、足趾容积、关节炎评分、血清细胞因子和踝关节组织病理学,通过以上指标评价大鼠的发病情况及艾灸治疗RA的疗效。采集干预后3周的血浆标本,基于液相脂质组学技术分析各组大鼠的脂质代谢谱,探究与RA相关的潜在生物标志物以及艾灸治疗RA的作用机制。结果(1)网状Meta分析:①临床有效率:间接灸+西药、悬灸+西药、温灸器灸+西药、间接灸与悬灸在有效率方面优于西药。间接灸+西药、悬灸+西药、温灸器灸+西药、间接灸与悬灸在有效率方面优于中药。其余配对比较显示组间差异无统计学意义。基于以上所有干预措施的网状Meta分析结果,在临床有效率方面排名前3的艾灸疗法依次为:温灸器灸+西药(83.9%),悬灸+西药(79.1%)和间接灸+西药(74.3%)。②红细胞沉降率(Erythrocyte sedimentation rate,ESR):悬灸+西药降低ESR的疗效优于间接灸+西药、温灸器灸+西药、悬灸、间接灸、中药、直接灸+西药和西药;与西药相比,间接灸+西药降低ESR的效果更显着。其余配对比较显示组间差异无统计学意义。基于以上所有干预措施的网状Meta分析结果,在ESR方面排名前3的艾灸疗法依次为:悬灸+西药(98.8%),间接灸+西药(74.7%)和温灸器灸+西药(62.2%)。③C-反应蛋白(C-reactiveprotein,CRP):悬灸+西药降低CRP的疗效优于雷火灸+中药、间接灸+西药、间接灸、温灸器灸+西药、中药、悬灸、直接灸+西药和西药;雷火灸+中药降低CRP的疗效优于中药和西药;与西药相比,间接灸+西药和温灸器灸+西药降低CRP的效果更显着。其余配对比较显示组间差异无统计学意义。基于以上所有干预措施的网状Meta分析结果,在CRP方面排名前3的艾灸疗法依次为:悬灸+西药(100.0%),雷火灸+中药(77.9%)和间接灸+西药(61.7%)。④疼痛视觉模拟评分(Visual analog scal,VAS):温灸器灸+中药降低VAS的疗效优于直接灸+西药、间接灸+西药、间接灸、温灸器灸+西药、西药和中药;与西药相比,直接灸+西药更能有效地降低VAS。其余配对比较显示组间差异无统计学意义。基于以上所有干预措施的网状Meta分析结果,在VAS方面排名前3的艾灸疗法依次为:温灸器灸+中药(100.0%),直接灸+西药(69.1%)和间接灸+西药(68.9%)。(2)脂质组学机制实验研究:①造模前,各组大鼠在体重、足趾容积和关节炎指数方面无统计学差异(P>0.05)。经过艾灸治疗后,艾灸模型组大鼠的一般情况有所改善,其体重与模型组相比明显增加,两组差异具有统计学意义(P<0.05);该组大鼠的足趾容积与模型组相比明显下降,两组差异具有统计学意义(P<0.05);且该组大鼠的关节炎指数逐渐下降,与模型组的组间差异具有明显的统计学意义(P<0.01)。与模型组相比,艾灸模型组大鼠IL-18、IL-6和TNF-α水平明显降低,两组差异具有统计学意义(P<0.05),并且该组大鼠的踝关节软骨、滑膜以及炎性细胞浸润的组织病理情况较模型组有所缓解。②差异代谢物:通过统计分析,在模型组和对照组之间筛选鉴定出33个差异代谢物,主要为脂肪酸(FA)和甘油三酯(TG)。其中,31个差异代谢物在艾灸模型组中相对含量和模型组相比具有统计学差异(P<0.05)。艾灸通过上调RA大鼠的DG、FA和碳链长度大于54的TG类物质,下调PC、LPC、PE和碳链长度小于54的TG类物质,使以上差异代谢物水平在干预后趋近于正常水平。此外,21个差异代谢物在艾灸对照组中相对含量和对照组相比具有统计学差异(P<0.05),艾灸可以下调PC、LPC和多数碳链长度小于54的TG类物质的相对含量,上调多数碳链长度大于54的TG类物质的相对含量。③代谢通路分析.:艾灸可能对于大鼠不同机体状态下的脂代谢均有调节作用。脂质代谢与RA密切相关,在病理状态下,艾灸治疗RA调控的潜在重要代谢通路为α-亚麻酸代谢和甘油磷脂代谢。在生理状态下,艾灸调控的潜在重要代谢通路为甘油磷脂代谢。结论(1)艾灸联合药物的综合疗法优于单一药物治疗,临床上联合西药较中药更为普遍。悬灸+西药、间接灸+西药、温灸器灸+西药或中药的综合疗法可能是治疗RA潜在的最佳方法,这为临床治疗RA提供了新的证据和见解。但受纳入研究质量和数量的局限性,本次网状Meta分析的阳性结果在解释时需要非常小心。今后仍需更多高质量的随机对照试验进一步证实确切的结论。(2)艾灸能改善RA大鼠的一般情况和体重,降低足肿胀度和关节炎指数,还可以减轻细胞因子水平,改善踝关节组织的病理情况,表明艾灸能有效治疗RA。(3)RA大鼠存在明显的脂质代谢紊乱,其中33种差异性脂质代谢物可能是RA的潜在生物标志物。综合差异性代谢物在艾灸模型组与模型组、艾灸对照组与对照组的组间变化,无论大鼠处于生理或病理状态,艾灸均可以下调PC、LPC和多数碳链长度小于54的TG类物质的相对含量,上调多数碳链长度大于54的TG类物质的相对含量,而在病理状态下,艾灸还可以上调DG、FA类,下调PE类从而调节RA大鼠的脂代谢紊乱。(4)艾灸可能对大鼠生理和病理状态下的脂代谢均有调控作用,共同涉及的潜在重要代谢通路为甘油磷脂代谢。
保吉燕[2](2021)在《血清ANGPTL8水平和初治2型糖尿病患者动脉粥样硬化的相关性研究》文中进行了进一步梳理目的:探讨初治2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)患者与健康人群血清血管生成素样蛋白8(angiopoietin like protein 8,ANGPTL8)水平之间的差异及不同颈动脉内膜-中层厚度(carotid intima-media thickness,CIMT)分组与健康人群之间ANGPTL8的水平差异,并进一步检测ANGPTL8是否对T2DM个体具有动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)效应。方法:本研究共纳入161例受试者,其中初治T2DM患者83例,健康对照组78例,测量所有受检者的身高、体重、血糖、胰岛素、C肽、糖化血红蛋白(Glycosylated hemoglobin,Hb A1c)、血脂和血清ANGPTL8水平,超声下测量颈动脉内膜-中层厚度(carotid intima-media thickness,CIMT),分析血清ANGPTL8与T2DM、CIMT厚度之间的相关性及在T2DM人群中影响CIMT增厚的危险因素。结果:1.与健康对照组受检者相比,T2DM组受检者的血清ANGPTL8水平显着增高;在健康对照组,T2DM+CIMT正常组,T2DM+CIMT增厚三组人群中,血清ANGPTL8有逐渐升高趋势。2.相关性分析显示,T2DM患者血清ANGPTL8水平与年龄(r=0.235,p=0.033),FCP(r=0.25,P=0.023),Ty G(r=0.456,P<0.01),CIMT(r=0.393,p<0.01),TG(r=0.538,P<0.01)呈正相关,与HDL(r=-0.198,P=0.048)呈负相关。TG是血清ANGPTL8升高的独立危险因素(OR=3.175,P=0.027)。3.T2DM患者CIMT与ANGPTL8(r=0.393,p<0.01)和TG(r=0.24,p<0.05)呈正相关。经年龄和病程调整后,ANGPTL8水平仍与CIMT独立相关(r=0.336,P=0.002),其余指标与CIMT的相关性不显着。4.二元logistic回归分析显示在调整了年龄、病史、FCP、TG、HDL等因素的影响后,血清ANGPTL8水平与CIMT增厚相关,血清ANGPTL8是CIMT增厚的危险因素。结论:1.血清ANGPTL8水平在初治T2DM患者中显着升高;2.在健康对照组、T2DM不伴有CIMT增厚和T2DM伴CIMT增厚三组中,血清ANGPTL8水平呈逐渐升高趋势;3.血清ANGPTL8参与了T2DM患者AS的发生发展,是T2DM患者心血管疾病的危险因素;4.ANGPTL8与TG代谢关系密切,猜测TG在ANGPTL8和AS的相关关系中具有介导作用。
秦敏[3](2020)在《冠心病临床预后的脂质组学研究及脂质代谢紊乱的全基因组关联性研究》文中提出冠心病是目前世界范围内导致死亡的主要疾病之一。尽管相关的药物和手术治疗已经取得显着性的突破,冠心病患者的临床预后仍然较差,准确评估和管理患者的预后风险仍是当今医疗系统面临的一个挑战。此外,冠心病病程中常出现以左室功能障碍(LVD)为特征的病理性左室重构并严重影响患者的生存预后。血脂异常与冠心病死亡和主要不良心血管事件(MACE)以及左室重构的发生发展密切相关。但传统的血脂由于其结构的复杂性以及混合性导致其不足以反映与冠心病临床预后和左室重构相关的脂质代谢改变的丰富性和特异性。因此,本研究先在单中心冠心病患者随访队列中,基于广泛靶向脂质组学检测的脂质代谢物,评估这些脂质分子对临床终点事件和左室重构的影响并识别与其相关的紊乱的脂质代谢通路,进一步基于识别的独立脂质代谢物建立临床终点事件和左室功能障碍的风险预测模型。接下来,通过全基因组关联性研究(GWAS)识别对与临床预后和左室重构相关的脂质代谢物血浆浓度有影响的单核苷酸多态性(SNP)位点。最后,上述结果将在另外一个独立的多中心随访队列中做进一步的验证。主要研究结果如下:(1)本研究首先在包含1011名单中心冠心病患者的内部训练集中评估了广泛靶向脂质组学检测的血浆脂质代谢物对死亡和MACE风险的影响,并分别基于死亡和MACE的独立预测脂质代谢物来建立相关的风险预测模型。结果显示,我们在内部训练集中分别发现了10个(Cer(d18:1/20:1)、Cer(d18:1/24:1)、PE(30:2)、PE(32:0)和PE(32:2)、LPC(18:2/0:0)、LPE(0:0/24:6)、PC(16:1/22:2)、PC(O-36:4)和PC(O-38:2))和2个(Cer(d18:1/20:1)和LPC(20:0/0:0))死亡和MACE的独立预测标志物。此外,基于死亡的10个独立脂质预测标志物和2个传统危险因素(age和AST)建立的预测模型与仅由传统危险因素构成的预测模型相比,其预测效能显着升高(曲线下面积[AUC]:83.65%vs.76.56%),而结合2个独立脂质代谢物和6个传统危险因素的MACE风险预测模型的预测效能较传统模型仅有微弱的提高(AUC:60.73%vs 60.70%)。接下来,我们建立的预测模型在包含558名多中心患者的队列中成功将具有高、中和低死亡或MACE风险的冠心病患者区分开(P<0.05)。最后,我们还发现并验证了磷脂酰胆碱的双键数和磷脂酰乙醇胺的碳原子数与冠心病死亡风险呈负相关。(2)在包含800名单中心冠心病患者的发现队列中,考察基于广泛靶向脂质组学检测的脂质代谢物水平对左室射血分数(LVEF)、左室收缩末期内径(LVESD)、左室舒张末期内径(LVEDD)和左室功能障碍(LVD)的影响,并分别识别与其相关的脂质代谢紊乱通路。随后,再基于识别的LVD的独立标志物建立LVD的风险预测模型,这些结果进一步在464例多中心冠心病患者组成的验证队列中得到了进一步确证。首先,我们发现并验证了7个脂质代谢物(Cer P(d18:1/18:1)、PC(18:1/18:1)、PC(14:0/22:6)、PC(16:0/22:6)、PC(18:0/22:6)、PC(18:2/22:6)和PC(20:1/20:5))与LVEF显着相关,4个脂质代谢物(PC(14:0/22:6)、PC(16:1/22:6)、PC(18:2/22:6)和TG(16:1/16:1/22:5))和LVESD显着相关,以及2个脂质代谢物(PC(14:0/22:6)和PC(18:2/22:6))和LVD显着相关。其次,验证了甘油磷脂代谢通路、亚油酸代谢通路和α-亚麻酸代谢通路紊乱与更高的左室重构风险相关。最后,基于传统危险因素和3个脂质代谢物(PE(34:1)、Hex Cer(d18:1/18:1)和TG(14:0/18:0/18:4))建立的LVD预测模型的预测效能与仅由传统危险因素构成的模型相比取得了显着的提高(AUC:75.2%vs 72.3%)。(3)通过GWAS研究分别在由953名单中心冠心病患者组成的发现队列和524名多中心冠心病患者组成的验证队列中发现并验证了对与死亡和LVD相关的脂类的血浆水平有影响的SNP变异。最后,再分析这些确证的独立SNP位点对冠心病死亡风险的影响。结果发现并确证了位于FADS2基因上的rs174601、rs174602和rs2524299、MYRF基因上的rs198476和rs2071213以及位于DAGLA基因上的rs9735635位点与LPC(20:4/0:0)血浆浓度显着相关(P<1.7E-07),而位于FADS2基因上的rs174570和血浆LPE(0:0/18:2)浓度显着相关(P<1.7E-07)。最后Cox回归分析发现这7个独立的SNP位点不直接影响冠心病患者的死亡风险(P>0.05)。综上,我们发现并验证了特异性好的冠心病死亡和左室重构风险的生物标志物,并且基于独立的脂质代谢物构建的死亡和LVD风险预测模型的预测效能与传统危险因素构成的模型相比均有显着的提高,这些发现结果对评估和管理冠心病患者死亡和左室重构风险有显着改善作用。FADS2、MYRF和DAGLA基因多态性能显着影响冠心病患者血浆LPC(20:4/0:0)和LPE(0:0/18:2)浓度,从遗传学角度阐明了SNP变异与冠心病患者血脂异常的关联性。
陈瑶[4](2020)在《SAK-HV诱导免疫反应的种属差异对降脂功效的影响及其分子机制研究》文中提出心血管疾病是导致全球范围人类死亡的第一疾病,而高脂血症是心血管疾病的主要危险因素之一。目前,治疗药物靶向LDL、Lp[a]和富含TG的VLDL以降低动脉粥样硬化性心血管疾病的风险。但仍存在现有药物难以治愈的严重的血脂异常,以及对现有药物的不良反应,因此对具有新降脂机制的药物研发具有迫切需求。SAK-HV是我们室前期研制的具有溶栓和抗凝功能的重组蛋白,在药效学研究中能够降低高脂Apoe-/-动物模型的血脂水平,改善肝脏脂质沉积,并在给药期内优于他汀药物的降脂效果。它在高脂鹌鹑模型、高脂大鼠模型中均产生类似的降脂效果,提示SAK-HV在高脂血症及非酒精性脂肪肝治疗中具有巨大应用潜力。药理学机制研究发现,SAK-HV诱发的特异性抗体介导了补体系统活化,进而调节肝脏脂代谢通路STAT3-C/EBPβ-PGC-1α的激活,表明SAK-HV诱发的免疫反应在降脂药效中十分关键。不同种属的动物各有其特点,对同一药物的反应也有所不同,而SAK-HV作为治疗性蛋白,仅在小鼠体内评估其免疫反应和降脂作用是不足的。恒河猴在种属划分上属于灵长类,脂代谢调节系统和免疫系统更加精细且与人体更为接近,高脂恒河猴模型更趋近于模拟人体内高血脂状态。为了进一步评价SAK-HV的降脂药效,我们通过饲喂高脂饮食成功构建了高脂恒河猴模型。模型组静脉注射生理盐水,给药组静脉注射相同体积0.04mg/kg的SAK-HV隔天给药7次后,检测血清中总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白等指标,发现在该给药剂量下SAK-HV并不能在恒河猴体内明显降低血清中的脂质水平。肝功能检测结果表明,SAK-HV并未对恒河猴的肝功能产生影响,这与前期的毒理学研究相一致,表明SAK-HV在该剂量下在恒河猴中具有良好的安全性。肝脏病理学提示,SAK-HV对肝脏脂质沉积有一定的改善,但由于动物只数有限,动物个体间存在较大差异,组间无显着差异,因此该作用尚需通过实验进一步探究。在恒河猴中,SAK-HV尽管诱导了血清中特异性抗体的产生,但补体系统并未活化,肝脏降脂通路STAT3-C/EBPβ-PGC-1α也并未检测到显着的活化。实验结果提示,SAK-HV诱导的不同种属间的免疫反应差异可能是造成降脂功效差异的原因。前期实验已经证实SAK-HV能够在高脂小鼠、大鼠及鹌鹑模型中实现降脂。与小鼠、大鼠相比,豚鼠对于致敏物质的反应更敏感,是免疫学研究的理想动物,而恒河猴从进化的角度来看其免疫系统及代谢系统更接近人体。因此,我们进一步研究SAK-HV处理在上述四种动物体内诱发的免疫反应差异与降脂差异的关联。在前期Apoe-/-小鼠研究确定的给药剂量和给药方式的基础上,本研究首先给予小鼠、豚鼠、大鼠、恒河猴等效剂量的SAK-HV,并对比血清中SAK-HV特异性抗体水平以及补体C3a水平,结果表明豚鼠体内SAK-HV特异性抗体水平显着高于恒河猴体内的抗体水平,并且高于小鼠和大鼠的水平,而恒河猴体内的抗体水平则低于小鼠及大鼠的水平。此外,尽管SAK-HV能够激活豚鼠、小鼠和大鼠体内的补体系统,但其并不能在恒河猴体内激活补体。豚鼠在SAK-HV给药后出现强烈的过敏反应而死亡。上述结果证明SAK-HV在豚鼠体内诱发最强的免疫反应,并存在免疫毒性,而在恒河猴体内触发的免疫反应程度低于其在小鼠及大鼠体内的免疫水平。结合SAK-HV在不同种属动物体内降脂药效的差异,我们提出SAK-HV诱发的适度免疫反应在降脂药效中具有关键作用,其在恒河猴体内没有降脂功效可能与恒河猴体内较低水平的免疫反应有关,即可能与其作为灵长类动物具备更高的免疫稳态有关。基于上述结果和分析,我们希望能通过改变药物递送途径实现免疫增效从而改善降脂功效。PLGA-PEG-PLGA(Gel)三嵌段共聚物水凝胶,具有生物相容性高、生物可降解性好以及热敏的特点,在低温(例如4℃)下是低粘度液体,可以将药物混合到聚合物溶液中以方便注射,而当温度达到生理温度时,胶束自动转变为粘性凝胶,形成原位储库,使其成为安全且可控的药物输送载体。本研究中将其用于SAK-HV重组蛋白递送,利用其以可持续的方式在体内释放抗原的特点,通过促进抗原特异性Ig G免疫应答实现免疫增效。同时,温敏和可皮下注射的PLGA-PEG-PLGA水凝胶具有更安全、应用方便和依从性好的优势。药效学实验表明,在Apoe-/-小鼠体内用同样剂量的SAK-HV/PLGA-PEG-PLGA(SAK-HV/Gel)处理产生了较SAK-HV更显着的降脂效果,诱发了更高水平的免疫激活,提示适度的免疫增效确实能够改善降脂,同时也进一步验证了SAK-HV诱导的免疫反应在降脂中的重要作用。另外,我们结合转录组学、lnc RNA测序和代谢组学等多组学技术,对SAK-HV/Gel降脂机制进行了探究,结果提示有尚未报道的通路参与其降脂。差异表达基因功能分析表明SAK-HV/Gel通过促进游离脂肪酸向HDL的转化、促进脂肪酸氧化代谢、抑制脂质合成而降脂。并且,SAK-HV/Gel对免疫反应的调节在其中发挥重要角色。基于lnc RNA测序及m RNA转录组分析,我们提出lnc RNA Gm20649-Onecut1-Cyp7a1通路可能作为重要降脂路径之一,这将作为我们后续工作的重点,从非编码RNA转录的新视角揭示SAK-HV/Gel的降脂机制。同时,代谢组学和m RNA转录组分析结果共同提示脂肪酸氧化分解改变是其降脂过程中的重要环节。SAK-HV/Gel处理后肝脏差异代谢物显着富集在亚油酸代谢、酮体的合成与降解途径,为进一步阐明其降脂机制提供了线索。这些仍需要后续实验的进一步验证与探究。巨噬细胞在免疫反应中发挥重要作用,是先天免疫系统的重要组成部分,其细胞迁移是发挥免疫功能如吞噬、分泌和杀伤的前提条件。不同微环境下,巨噬细胞活化为不同状态参与免疫稳态的调节,并且在高脂血症、动脉粥样硬化等代谢类疾病的进展中发挥调节作用。我们前期研究发现,巨噬细胞是SAK-HV的靶细胞之一,SAK-HV可以选择性地触发其增殖,但目前SAK-HV对巨噬细胞迁移和极化的影响尚不完全清楚。在这部分工作中,我们进一步研究了SAK-HV对巨噬细胞迁移的影响,并基于RAW264.7细胞探讨了SAK-HV诱导迁移的分子机制。利用细胞划痕和transwell实验,证实SAK-HV能够通过其SAK突变域显着促进巨噬细胞迁移。机制研究中,通过筛选迁移相关通路的活化并利用抑制剂实验,发现JNK和NF-κB通路在SAK-HV诱导的细胞迁移中发挥重要作用。进一步,我们筛选了迁移相关效应分子,发现SAK-HV诱导了MCP-1的表达上调,并且MCP-1的表达受到JNK和NF-κB通路的调控。抑制MCP-1表达或干扰其特异性受体CCR2均部分抑制了SAK-HV诱导的细胞迁移。综上,我们发现SAK-HV通过激活JNK和NF-κB通路上调MCP-1的表达,从而以自分泌的方式促进巨噬细胞的迁移。此外,本研究还证实SAK-HV能够促进巨噬细胞M1转化。SAK-HV对巨噬细胞的作用加深了我们对SAK-HV调节免疫反应的认识,同时提示SAK-HV对巨噬细胞功能的调节可能参与其通过调节免疫应答实现降脂的机制。
杨光[5](2020)在《S-烯丙基巯基半胱氨酸(SAMC)在骨关节炎中的保护作用及机制研究》文中研究指明背景骨关节炎(Osteoarthritis,OA)是一种慢性退行性关节疾病,影响到全球数千万人,其流行病学特点为女性的发病率高于男性。骨关节炎会导致病人严重的慢性疼痛、活动受限和残疾;其发病特征是一个或多个关节的结构损伤,主要侵犯手指关节、膝关节、髋关节和脊柱等。骨关节炎的病因常常与年龄相关,其他因素如创伤、代谢、遗传或环境因素,也在骨关节炎的发生中起作用。骨关节炎的治疗包括改变生活方式、减轻体重、药物干预(皮质类固醇和NSAIDs)和外科手术干预(截骨术或人工关节置换术)。这些治疗方法可以减轻病人的痛苦,但目前治疗效果有限。为此,探索更有效的治疗骨关节炎的药物非常必要。大蒜素及其衍生物目前广泛应用于多种疾病的治疗,例如肝功能损伤、肾功能损伤、心脏保护、肿瘤治疗和骨关节炎治疗。大蒜素的主要活性物质是有机硫化合物(Organosulfur compounds,OSCs),包括脂溶性化合物:烯丙基硫化物(Diallyl sulfide,DAS)、二烯丙基二硫化物(Diallyl disulfide,DADS)和二烯丙基三硫化物(Diallyl trisulfide,DATS);以及水溶性化合物:S-烯丙基半胱氨酸(S-allylcysteine,SAC)和 S-烯丙基巯基半胱氨酸(S-allylmercaptocysteine,SAMC)。越来越多的证据表明,大蒜素在临床上骨关节炎的治疗中发挥着关键作用。例如,有机硫化合物OSCs通过抑制NF-κB活化,起到保护受损软骨细胞的作用。另外,DAS可以抑制由尿酸盐结晶和IL-1β诱导的关节炎症中COX-2和PGE2表达,暗示了其在骨关节炎治疗中潜在的保护作用。SAMC是大蒜的主要水溶性成分,在抗氧化、抗炎、抗肿瘤等方面具有潜在的作用。然而,目前尚未有研究探索SAMC在骨关节炎中的治疗作用。由于骨关节炎中炎症和氧化应激的持续存在,造成软骨细胞外基质降解,软骨受损;因此,减轻关节炎症和氧化应激成为治疗的主要目的和手段。转录因子核因子 E2 相关因子 2(Nuclear factor erythroid 2 related factor 2,Nrf2),在对抗一系列病理损伤(包括活性氧和毒性物质)方面起着关键作用。Nrf2是碱性亮氨酸拉链(Basic leucine zipper,bZip)转录因子亚家族的成员。Nrf2通常与胞浆肌动蛋白结合蛋白(Kelch-like ECH-associated protein 1,Keap1)联合存在于胞浆中,使Nrf2持续泛素化并被蛋白酶体降解。因此,Nrf2在基础条件下持续降解保持较低水平;当细胞应激反应时,如暴露于轻度氧化、亲电应激或化学诱导物,Nrf2与Keap1分离,转移到细胞核中。在细胞核内,Nrf2与抗氧化反应元件(Antioxidant response element,ARE)相互作用,使多种抗氧化和其他细胞保护基因的转录增加,如抗氧化酶谷胱甘肽转移酶(GST)和NAD(P)H:醌氧化还原酶-1(NQO1)等。近年来,Nrf2作为一种新的靶向治疗人类疾病,特别是那些具有氧化和炎症应激因素的疾病,显示出良好的前景。本研究旨在探讨SAMC对骨关节炎的治疗作用,通过X线检测结构改变,组织染色检测病理学改变,检测基质金属蛋白酶(Matrix metalloprotease,MMPs)在细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)合成和降解,炎症,和氧化应激的变化,以评价SAMC在骨关节炎体内/体外模型中的作用。并通过基因编辑技术,探讨SAMC对骨关节炎作用的具体靶点和机制,为临床靶向药物的开发提供线索与依据。目的1.探讨S-烯丙基巯基半胱氨酸(SAMC)对骨关节炎的保护作用。2.发现SAMC对骨关节炎的保护作用主要是通过抑制炎症(IL-1β、TNF-α和IL-6)及氧化应激(iNOS、NOX4及4HNE等)发生作用的。3.证明Nrf2是SAMC保护骨关节炎的关键作用靶点,其通路可能是通过调控Nox4/NF-κB信号通路。这些结果将为骨关节炎的治疗提供新的药物靶点。方法1.骨关节炎(OA)体内手术模型的建立。2.原代软骨细胞提取及培养。3.MTT测定软骨细胞增殖。4.IL-1 β诱导体外OA模型。5.X线检测大鼠膝关节的结构改变。6.组织染色检测病理学改变。7.制备Nrf2敲除腺病毒,以及病毒感染细胞。8.ELISA检测炎性细胞因子及胶原蛋白降解产物的表达。9.氧化及抗氧化因子的测定。10.Western B lot检测蛋白表达。11.实时荧光定量PCR(Q-PCR)检测基因表达。12.应用SPSS统计软件进行单因素方差分析。结果1.SAMC改善骨关节炎的进展骨关节炎术后4周,膝关节间隙较对照组明显变窄,有骨赘形成;而SAMC关节内注射则减轻这种形态学改变。骨关节炎最重要的病理表现是关节软骨退变,H&E和番红-固绿(Safranin o-fast green,SO)染色显示SAMC治疗后软骨表面较关节炎组完整,减少了骨关节炎收受造成的软骨损伤形成。SAMC治疗组的软骨组织中II型胶原蛋白(Collagen Ⅱ,Col Ⅱ)的表达较关节炎组增加。相应的是,SAMC下调骨关节炎大鼠中Col Ⅱ降解产物C2C表位、CTX-Ⅱ和COMP的表达。Col Ⅱ的蛋白水解酶分解涉及多种蛋白酶,主要受基质金属蛋白酶(MMPs)及其内源性抑制剂金属蛋白酶组织抑制因子(Tissue inhibitor of metalloproteinase,TIMPs)的平衡调节。骨关节炎大鼠 MMP-2、MMP-9 和 MMP13的表达升高,TIMP-1的表达降低。但SAMC通过降低MMPs活性,抑制Ⅱ型胶原降解,从而稳定ECM来改善OA。2.SAMC减轻骨关节炎中的炎症反应多种炎性细胞因子参与骨关节炎的发病机制。SAMC治疗降低了骨关节炎大鼠及软骨细胞中促炎性细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6的表达,从而保护膝关节软骨免受炎症侵蚀。COX-2和iNOS参与诱导骨关节炎症和组织损伤,而关节炎软骨中COX-2和iNOS的升高能被SAMC下调。SAMC对炎症介质的调节与抑制NF-κB信号通路有关,骨关节炎大鼠关节软骨和软骨细胞中NF-κB p65细胞核转位上调,胞浆蛋白IκBα降解增加,NF-κB通路被激活;而SAMC可逆转NF-κB的活化。3.SAMC调节骨关节炎的氧化还原稳态在氧化应激过程中,软骨细胞脂质过氧化导致胶原降解,软骨受损,引发骨关节基质和软骨破坏。ROS作为氧化应激的启动子,受NOX4、NAD(P)H氧化酶(NOXs)家族成员的调控。与假手术组比较,骨关节炎模型NOX4表达增强。因此,脂质过氧化反应的共同副产物4-羟基肾上腺素(4HNE)在骨关节炎大鼠关节软骨中表现出相同的变化。然而,这两种变化都因SAMC治疗而减弱。骨关节炎大鼠血清中T-AOC、SOD、CA-T、GSH-Px和GSH均下调,但SAMC治疗可逆转这些变化。在GSSG水平,氧化型GSH和丙二醛(MDA)、脂质过氧化副产物在骨关节炎大鼠中上调,SAMC处理呈剂量依赖性缓解氧化应激状态。4.SAMC通过调控Nrf2参与骨关节炎软骨细胞的氧化反应与炎症氧化应激已经被证明参与OA条件下的炎症通路,我们在SAMC治疗的OA大鼠中评价维持氧化还原稳态的关键调节因子Nrf2。Nrf2是一种抗氧化应激转录因子,能抑制活性氧(ROS)引起的软骨胶原降解。SAMC能促进Nrf2在骨关节炎模型软骨中的表达,以应对炎症变化。说明SAMC激活Nrf2相关信号通路,从而参与骨关节炎的保护作用。为了阐明Nrf2在SAMC调节骨关节炎保护中的关键作用,我们进一步采用基因编辑技术。在原代大鼠软骨细胞中,使用腺病毒敲低Nrf2的基因表达,在IL-1β模拟的骨关节炎模型中,我们发现Nrf2功能的缺失导致氧化状态加重,NOX4表达上调,并增加脂质过氧化副产物4HNE的进一步产生。骨关节炎引起的MMP/TIMP-1比值失衡导致胶原降解,在Nrf2缺失细胞中,SAMC不能逆转软骨细胞基质的破坏,甚至在Nrf2缺乏时加重。说明Nrf2基因敲除减弱了 SAMC在IL-1β诱导的骨关节炎软骨细胞中的作用。为了确定SAMC调控的信号通路,我们还检测了 IL-1β诱导的软骨细胞的炎症反应。IL-1β刺激后COX2和iNOS表达上调,但SAMC治疗后减弱;但Nrf2缺失型骨关节炎软骨细胞对SAMC的反应作用消失。此外,Nrf2可抑制NF-κB的激活,该信号通路参与炎症性疾病的发生和炎症介质的表达,说明SAMC可能靶向Nrf2调控的NF-κB信号通路参与对骨关节炎软骨细胞的保护作用。结论1.证实了天然产物SAMC在体内和体外骨关节炎模型中的保护作用:抑制炎症反应,维持氧化还原稳态,防止骨关节炎过程中软骨的破坏。2.SAMC对OA的保护作用可能是通过减少炎性细胞因子(TNF-α、IL-1β和IL-6)和脂质过氧化产物(4HNE)的产生,来减少金属基质蛋白酶(MMPs)的产生,从而调节MMPs/TIMP-1比值失衡而导致的Ⅱ型胶原破坏,改善OA诱导的胶原破坏。3.SAMC其作用的具体机制可能靶向Nrf2调控的NF-κB信号通路而实现的。4.SAMC可作为一种新型的治疗骨关节炎的天然药物,为其治疗方案提供新的线索;其机制的阐明也将为临床骨关节炎的治疗靶点提供新的理论依据。
王辉波[6](2020)在《MFAP4在心肌重构中的作用及其机制研究》文中认为背景心力衰竭是各种类型心血管疾病的最终归宿,是严重威胁人类健康和生活质量的常见疾病。心肌重构是指心脏为适应各种类型心血管疾病引起的心脏前后负荷增加、多种细胞因子及神经体液的作用下,其结构和功能上发生的适应性代偿作用,这些负荷和神经体液因子长期持续最终失代偿引起心力衰竭。心肌重构主要表现为心肌肥厚(心脏体积、重量、心室壁厚度、心肌细胞横截面积的增加,几何形状的改变)、心肌间质和血管周围纤维化(细胞外基质的增加、心脏顺应性改变)、常常伴有心脏收缩功能改变(射血分数、左室短轴缩短率的降低)、心脏电重构(各种类型的房性和室性心律失常的发生率增加)。细胞外基质(extracellular matrix,ECM)是一种存在于所有组织中的三维非细胞结构,其不仅发挥维持组织完整性的机械支持作用,而且还作为信号中枢和生长调控因子的储存库,传递对各种细胞功能调控发挥重要作用的级联信号,以调节细胞活动和修复程序。心肌纤维化的主要病理特征是ECM成分在心肌血管周围和间质中过度积聚,ECM的形态和生化变化可能与HF发病机制和预后密切相关。微纤维相关蛋白4(microfibrillar-associated protein 4,MFAP4),是纤维蛋白原相关蛋白超家族一种36 k Da的ECM糖蛋白,其有一个短的N-末端区域,该区域含有一个与整合素相结合的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(arginine-glycine-aspartic acid,RGD)序列。MFAP4在富含弹性蛋白的组织中高度表达,在心脏相对表达量较高,MFAP4的具体生物学功能尚未完全阐明,但其通过整合素介导血管SMCs激活和增殖,导致动脉狭窄和促炎作用已在体内得到证实。MFAP4与重构相关疾病密切相关,包括肝纤维化、动脉粥样硬化、动脉损伤刺激重构、哮喘等。然而,到目前未有相关文献报道MFAP4在心肌重构中发挥何种生物学作用。本课题旨在通过生物信息学技术,筛选心肌重构中的差异表达基因,预测MFAP4在心肌重构过程中表达升高,结合MFAP4在肝脏纤维化、血管重构、气管重构等疾病的作用及机制,提示MFAP4可能参与了心肌重构发生与发展过程。本实验采用压力超负荷和异丙肾上腺素构建小鼠心肌重构模型,观察MFAP4在重构的心肌组织中的表达改变情况;并且构建MFAP4基因敲除小鼠,研究MFAP4在心脏结构性重构和电重构中的作用及其机制,为心力衰竭过程中心脏病理性重构的防治提供一定的理论基础。方法实验一:通过GEO数据库搜索并下载关于小鼠心肌重构的芯片数据集,使用R软件Limma包进行数据处理,包括背景校正、归一化处理、对数转换和差异表达基因(DEGs)的筛选。在本研究中,将有统计学意义的DEGs定义为log2FC>1或者log2FC<?1(FC=fold change),且调节后的P值<0.05;使用R软件分别绘制这些筛选出的DEGs的火山图和热图;使用Venny网站对多组芯片数据集取交集,得到共同的DEGs;我们通过DAVID 6.8网站对筛选出来的DEGs进行GO功能和KEGG通路富集分析;利用STRING网站分析蛋白质-蛋白质相互作用;建立压力超负荷心肌重构模型,运用RT-PCR对筛选的DEGs进行初步验证;通过Western blot和免疫组化对确定的MFAP4进行进一步实验验证。实验二:构建MFAP4基因敲除小鼠,选8-10周龄MFAP4基因敲除小鼠(KO)和相应的同窝对照野生型小鼠(WT),将其随机分为异丙肾上腺组(ISO)和对照组(Control),分别注射50 mg/kg ISO或等体积生理盐水,连续注射2周后用心脏超声评估小鼠的心功能;根据实验要求收集心脏组织(分生或病理),记录心重(HW)、体重(BW)和胫骨长度(TL)的数值并计算HW/BW和HW/TL比值;通过病理染色来评估各组小鼠的心肌细胞横截面积(CSA)(HE染色、WGA染色)和心肌间质区内的胶原含量(PSR染色);通过RT-PCR和Western blot检测心肌肥厚和纤维化的分子标记物的m RNA和蛋白表达水平。实验三:选8-10周龄MFAP4基因敲除小鼠(KO)和相应的同窝对照野生型小鼠(WT),将其随机分为主动脉缩窄组(AB)和假手术组(Sham),AB术后8周采用心脏超声和血流动力学评估小鼠的心功能;根据实验要求收集心脏组织(分生或病理),记录HW、BW和TL的数值并计算HW/BW和HW/TL比值;通过病理染色来评估各组小鼠的CSA(HE染色、WGA染色)和心肌间质区内的胶原含量(PSR染色);通过RT-PCR和Western blot检测心肌肥厚和纤维化的分子标记物的m RNA和蛋白表达水平;Western blot检测各组小鼠心肌组织中FAK及下游信号通路分子磷酸化水平;体表心电图记录各组小鼠RR间期、PR间期、QRS波和QT持续时间;制备各组小鼠Langendorff离体心脏模型,记录离体心脏左室前游离壁的单相动作电位(MAP),用S1-S1起搏刺激确定APD90和APD交替阀值(ALT);用Burst刺激诱导室性心动过速(ventricular tachycardia,VT),计算VT的诱发率;Western blot检测各组小鼠缝隙连接蛋白(connexin,Cx43)的表达。实验四:提取大鼠乳鼠原代心肌细胞(CMs)和原代成纤维细胞(CFs),RT-PCR比较CMs和CFs的MFAP4基础表达水平;分别用Ang II、PE、TGFβ刺激CMs和CFs,RT-PCR检测纤维化或肥厚标志物,以及MFAP4的表达水平;通过腺病毒介导CFs的MFAP4基因沉默(Ad-sh MFAP4),并使用TGFβ刺激,RT-PCR比较各组细胞的肌成纤维细胞标志物(α-SMA、Col1α、Col3和FN)表达水平;Western blot检测各组细胞中FAK及下游信号通路分子磷酸化水平;通过腺病毒介导CFs的MFAP4基因过表达(Ad-MFAP4),通过加入FAK信号通路的抑制剂(PND-1186)和TGFβ刺激,比较各组细胞的肌成纤维细胞标志物表达水平,判断MFAP4发挥其生物学作用是否依赖于FAK及下游信号通路。结果实验一:从GEO搜索并下载到4组芯片数据集(GSE5500、GSE18224、GSE36074和GSE56348);利用R软件从GSE5500、GSE18224、GSE36074和GSE56348中分别筛选出188、293、253和67个DEGs;利用Venny网站选出在这4个不同的实验中共同差异表达的基因,有23个基因表达升高(Ltbp2、Postn、Cilp、Mfap4、Thbs4、Col8a1、Timp1、Nppa、Gdf15、Pamr1、Lox、Acta1、Itgbl1、Ctgf、Cnksr1、Frzb、Mfap5、Meox1、Tgfb2、Aqp8、Fstl1、Aspn、Srpx2),1个基因表达降低(Retnla);通过DAVID 6.8网站对24个DEGs进行GO功能富集分析,发现它们显着富集于细胞外纤维组织、细胞粘附、伤口愈合、胞外区、胞外基质、生长因子活性等生物学功能;我们建立TAC介导的心肌重构模型,对未被证实的15个DEGs基因进行RT-PCR验证,发现显着升高了Itgbl1、Aspn、Fstl1、Mfap5、Col8a1、Ltbp2、Mfap4、Pamr1、Cnksr1、Aqp8、Meox1、Gdf15、Srpx基因的表达,降低了Retnla(P<0.05);对确定的MFAP4进行进一步实验验证,MFAP4水平在AB后1周略有升高,在AB后2、4、6和8周显着上调(P<0.05);同时免疫组织化学染色显示,AB后8周MFAP4在左心室的表达均明显高于假手术组。实验二:腹腔注射ISO较对照组显着增加了MFAP4基因在心肌中的表达,注射ISO 2周后较注射生理盐水组相比,小鼠心功能明显恶化(P<0.05),而MFAP4缺乏可显着改善ISO诱导的心功能降低(P<0.05);WT-ISO组小鼠的HW/BW、HW/TL比值显着高于WT-Con组小鼠(P<0.05),然而KO-ISO组和WT-ISO组之间没有显着差异(P>0.05);对比CSA,KO-ISO组和WT-ISO组之间也没有显着差异(P>0.05);此外,心肌肥厚的标志物的表达在KO-ISO组和WT-ISO组之间也没有差异(P>0.05);WT-ISO心脏与WT-Con相比,血管周围和间质胶原容积显着增加(P<0.05),MFAP4基因缺失小鼠会使得ISO刺激后胶原容积显着减少(P<0.05);RT-PCR和Western blot检测心肌纤维化标志物在野生型小鼠ISO组中明显上调(P<0.05),MFAP4基因敲除能够降低上述基因的上调的程度(P<0.05)。实验三:AB术后8周的WT小鼠的心功能和血流动力学出现了显着恶化(P<0.05),MFAP4基因敲除后心功能得到相应的缓解(P<0.05);压力超负荷WT小鼠的HW/BW、HW/TL、心肌细胞CSA、心肌肥厚标志物显着增加(P<0.05),然而MFAP4基因敲除的小鼠在AB术后与WT-AB组相比,这些指标均没有显着差异(P>0.05);AB 8周后,血管周围和间质胶原容积、心肌组织纤维化标志物显着增加(P<0.05),而MFAP4基因敲除的小鼠在AB术后与WT-AB组相比,这些指标均显着下降(P<0.05);AB 8周后,FAK及下游的PI3K-AKT和MEK1/2-ERK1/2的磷酸化激活,而其磷酸化水平在MFAP4-KO小鼠中被强烈下调(P<0.05);AB 8周后,4组小鼠之间PR间期和RR间期均没有显着改变(P>0.05);WT-AB组小鼠较WT-Sham组相比显着增加了QRS波时间和QTc间期(P<0.05),而MFAP4缺失后会显着降低AB手术介导的QRS波时间和QTc间期的延长(P<0.05);AB诱导的野生型小鼠组与野生型Sham组的离体心脏灌流实验相比,APD90和ALT显着延长、VA诱导率显着增高、Cx43的表达降低(P<0.05),而MFAP4-KO组在AB后与WT-AB组相比APD90和ALT显着缩短、VA诱导率显着降低、Cx43的表达升高(P<0.05)。实验四:CFs的MFAP4 m RNA表达水平较CMs相比高43.90倍(P<0.001);Ang II、PE和TGFβ刺激CFs后,MFAP4的m RNA表达水平分别升高1.743倍(P<0.001)、1.397倍(P<0.05)、2.895倍(P<0.001);Ang II、PE和TGFβ刺激CMs后,MFAP4的m RNA表达水平分别升高1.253倍(P<0.05)、1.26倍(P>0.05)、1.485倍(P<0.001);TGFβ刺激显着增加了CFs纤维化标志物α-SMA、Col1α、Col3和FN的m RNA表达水平(P<0.05),而加入sh MFAP4的TGFβ刺激组明显降低了纤维化标志物表达水平;免疫荧光显示,TGFβ刺激增加了纤维化标志物α-SMA的荧光强度,而加入sh MFAP4的TGFβ刺激组降低了α-SMA的荧光强度;TGFβ刺激增加FAK及下游的PI3K-AKT和MEK1/2-ERK1/2的磷酸化激活,而加入sh MFAP4的TGFβ刺激组降低了这些蛋白的磷酸化活化(P<0.05);而Ad-MFAP4进一步增加了TGFβ刺激CFs的纤维化标志物α-SMA、Col1α、Col3和FN的m RNA表达水平,而使用了FAK抑制剂(PND-1186)则弱化了Ad-MFAP4对TGFβ刺激CFs的纤维化标志物的增加作用(P<0.05)。结论1.MFAP4在发生重构的心肌组织中明显升高,且在心脏成纤维细胞表达显着高于心肌细胞表达;2.MFAP4基因缺失在异丙肾上腺素诱导的心肌重构中发挥了改善心功能、抑制纤维化的作用,对肥厚无显着影响;3.MFAP4基因缺失在压力负荷诱导的心肌重构中发挥了改善心功能和血流动力学、抑制纤维化、降低室性心律失常发生率的作用,对肥厚无显着影响;4.MFAP4基因缺失发挥抑制心肌重构是通过抑制FAK及下游的PI3K-AKT和MEK1/2-ERK1/2的磷酸化激活发挥作用;
陈庆真[7](2020)在《补肾中药调控ERα-AMPK-Wnt/β-catenin信号通路促进成骨细胞增殖、分化的研究》文中研究表明目的:1.亚硫酸氢盐处理后测序(BSP)技术检测绝经后骨质疏松患者血液中ER α甲基化情况,探索基因甲基化对成骨细胞增殖和分化影响及其分子机制;2.探索ER α-AMPK-Wnt/β-catenin信号通路对成骨细胞增殖和分化影响;3.探索补肾中药有效成分牛膝甾酮对ER α-AMPK-Wnt/β-catenin信号通路影响及其对成骨细胞作用机制。方法:1.ER α基因甲基化对骨质疏松的影响收集2017年6月份~2018年12月份研究对象血液样本43例,包括14例女性健康人群血液样本,14例绝经后骨质疏松人群和15例绝经后非骨质疏松人群血液样本,BSP测序检测患者ESR1(雌激素受体alpha,ER alpha)甲基化频率,RT-qPCR技术验证ESR1 mRNA表达水平。ELISA检测患者血清中雌二醇和ESR1含量变化。2.体外验证ER α DNA甲基化对成骨分化影响体外培养小鼠成骨细胞MC3T3E1-colon24(MC3T3E1-24),设计合成特异性DNMT1 siRNA干预成骨细胞DNMT1表达和DNA甲基化,RT-qPCR和Western blot技术检测目标基因ER α,p-ER α,成骨分化指标OPG和RANKL,验证ESR1基因甲基化对成骨细胞分化影响,茜素红染色和ALP活性检测进一步验证ESR1基因甲基化对成骨细胞成熟影响,MTT技术检测成骨细胞活性情况,验证ESR1基因甲基化对成骨细胞增殖影响。3.ER α调节AMPK α和Wnt/β-catenin信号通路影响成骨细胞活性为验证ER α对AMPK α的调节作用,运用在线网站PROMO和GPMiner预测ER α作为转录因子在AMPK α基因的结合位点。进一步验证ER α对成骨细胞活性的调节作用和分子机制,构建合成ESR1 shRNA和过表达慢病毒载体,无处理的和阴性慢病毒载体干预的MC3T3E1-24细胞作为对照组,RT-qPCR 和 Western blot 技术检测ER α,AMPK α 1/2,p-AMPK α 1/2,检测Wnt/β-catenin 通路重要分子 frizzled,GSK3 β,LRP5,β-catenin,phspho-β-catenin表达变化,检测成骨分化指标OPG,以及ALP表达变化,ALP活性检测进一步验证ESR1基因表达对成骨细胞成熟影响,MTT技术检测成骨细胞活性情况。4.AMPK α介导Wnt/β-catenin信号通路影响成骨细胞活性上一步验证了 ER α调节AMPK α表达和活化影响成骨细胞活性,为进一步验证AMPK α对成骨细胞调节作用和机制,本研究用AMPK激动剂AICAR处理体外小鼠成骨细胞,无药物处理的MC3T3E1-24细胞作为对照组,RT-qPCR和Western blot技术检测 AMPK α,p-AMPK α,检测 Wnt/β-catenin 通路重要分子 frizzled,GSK3 β,LRP5,β-catenin,phspho-β-catenin表达变化,检测成骨分化指标OPG以及ALP表达变化,茜素红染色和ALP活性检测进一步验证ESR1基因表达对成骨细胞成熟影响,MTT技术检测成骨细胞活性情况。5.牛膝甾酮介导ER α-AMPK-Wnt/β-catenin信号通路影响成骨细胞活性牛膝甾酮(10 ng/μL)干预 MC3T3E1-24 细胞 48h,RT-qPCR 技术检测 ER α、AMPKα,frizzled,GSK3 β,LRP5,β-catenin转录水平变化,探索牛膝甾酮对ER-AMPK-Wnt/β-catenin信号通路影响;RT-qPCR检测成骨分化指标OPG以及ALP表达变化,茜素红染色和ALP活性检测观察成骨细胞钙化情况,验证牛膝甾酮对成骨细胞分化的促进作用,MTT技术检测成骨细胞活性情况,流式细胞仪检测成骨细胞凋亡情况,验证牛膝甾酮对成骨细胞增殖影响。结果:1.ERα DNA甲基化诱导骨质疏松临床血液样本进行BSP测序,结果发现绝经后骨质疏松患者血液中ER α甲基化频率较健康人(P<0.01)和绝经后非骨质疏松人群(P<0.01)高,差异有统计学意义。另外,RT-qPCR检测发现与健康人(P<0.05)和绝经后非骨质疏松人群(P<0.01)相比较,绝经后骨质疏松患者血液样本中ERα转录水平显着增高,然而ELISA检测血清样本中雌二醇(E2)(P<0.01)和ER α(P<0.05)表达降低,差异有统计学意义。2.抑制体外成骨细胞DNA甲基化水平可促进成骨分化绝经后骨质疏松与ERα DNA高甲基化水平相关,其可能通过抑制ER α蛋白表达导致患者骨量减少。体外培养MC3T3E1-24细胞,并通过DNMT1 siRNA干预细胞DNA甲基化水平,结果发现抑制DNA甲基化水平,可促进OPG和ALP的mRNA和蛋白表达,抑制RANKL表达。茜素红染色结果表明,与对照组相比较,DNMT1 siRNA干预组细胞钙化水平显着较高(P<0.05)。MTT结果显示,与空白对照组和阴性siRNA干预组相比较,DNMT1 siRNA干预组细胞活性较强(P<0.05)。3.ER α磷酸化介导AMPK和Wnt/β-catenin信号通路的激活,促进成骨细胞分化和增殖1)ER α与AMPK转录结合位点预测ER α作为转录因子,可调控靶基因转录激活和转录表达水平。PROMO和GPMiner在线网站预测结果发现,ER α在编码AMPK α的基因PRKAA2的启动区域有结合位点。2)ER α磷酸化对AMPK和Wnt/β-catenin信号通路影响和成骨细胞影响。ERα shRNA慢病毒载体抑制MC3T3E1-24细胞中ER α转录水平和蛋白表达。另外,RT-qPCR和WB技术检测结果表明,与空白对照组和阴性慢病毒载体组比较,AMPK α和p-AMPK α水平降低,差异有统计学意义;Wnt/β-catenin信号通路中,frizzled,GSK 3β,LRP5,β-catenin表达降低;与此同时,骨形成指标OPG和ALP表达降低;ALP活性检测结果进一步显示与对照组比较,ERα低表达组的成骨细胞钙化水平降低,差异有统计学意义,MTT结果展示成骨细胞活性也显着降低。3)ERα过表达慢病毒载体促进MC3T3E1-24细胞中ER α蛋白表达和磷酸化,RT-q PCR和WB技术检测结果表明,与空白对照组和阴性慢病毒载体组比较,AMPK α 1/2水平提高,差异有统计学意义;frizzled,GSK3 β,LRP5,β-catenin转录表达显着增多,Wnt/β-catenin信号通路被激活;检测成骨指标发现,OPG和ALP表达与对照组比较显着增多,差异有统计学意义,ALP活性检测和MTT检测结果进一步表明,ER α高表达组的成骨细胞钙化和增殖水平显着增高。4)AMPK对Wnt/β-catenin信号通路影响和成骨细胞影响。AICAR激活AMPK通路后,MC3T3E1细胞中AMPK转录表达提高,蛋白活化水平也增多,RT-qPCR和WB结果也表明,Wnt/β-catenin信号通路中frizzled,GSK3 β,LRP5,β-catenin表达显着增多,phspho-β-catenin表达降低;OPG和ALP表达也显着增多;ALP活性检测和MTT检测结果表明,与对照组比较,AMPK过表达组成骨细胞钙化和增殖水平增多,差异有统计学意义。4.牛膝甾酮发挥促进ER α磷酸化作用,激活AMPK和Wnt/β-catenin信号通路,从而促进成骨细胞分化和增殖牛膝甾酮孵育48h后,RT-qPCR和WB检测MC3T3E1-24细胞中ER α-AMPK-Wnt/β-cat enin信号通路相关基因表达,结果发现,ER α,p-ER α,AMPK α,p-AMPK α,frizzl ed,GSK3 β,LRP5,β-catenin表达与无药物处理组比较均显着增多,表明ER α-AMP K-Wnt/β-catenin信号通路被激活,OPG和ALP表达也显着增多,组间差异有意义,表明成骨细胞分化能力增强,茜素红染色和ALP活性检测结果表明,牛膝甾酮促进骨细胞钙化水平,TUNEL检测细胞凋亡情况和MTT检测细胞增殖,结果发现与对照组比较,牛膝甾酮组细胞凋亡和增殖率均无显着差异。结论:1.ER α基因高甲基化促进骨质疏松的发生;2.ERα低表达抑制OPG和ALP表达,促进RANKL表达,成骨分化受到抑制,成骨细胞活性降低;3.ER α激活后促进AMPK α活化,上调Wnt/β-catenin信号通路相关基因表达,从而促进成骨细胞分化和增殖;4.牛膝甾酮通过激活ER α-AMPK-Wnt/β-catenin信号通路促进成骨细胞分化发挥促进骨形成作用。
朱庭辰[8](2020)在《基于阴/阳虚证的原发性骨质疏松症临床代谢组学研究》文中研究表明目的:利用代谢组学技术,探索原发性骨质疏松症肾阳虚证及肝肾阴虚证的生物学标志物特征,为原发性骨质疏松症肾阳虚证及肝肾阴虚证的微观辨证及其证效评价提供研究证据。同时研究代谢标志物与临床指标的相关性,以指导临床。方法:1.根据骨质疏松症肾阳虚证及肝肾阴虚证证候标准及原发性骨质疏松症诊断标准筛选患者,从课题组中征集30例肾阳虚证证候最典型的女性患者并符合原发性骨质疏松症诊断标准,以及30例肝肾阴虚证证候最典型女性患者,同时对照60例患者基线征集30例健康绝经后女性受试者。2.收集受试者的一般情况项目(包括年龄、体重、身高、血压、脉搏等)。记录受试者双能X线腰椎骨密度(BMD)数据。抽取受试者空腹血液,测定骨代谢生化指标。3.抽取受试者的空腹血液,采用LC-MS检测。使用UNIFI1.8.1.软件进行原始数据的采集。原始数据经代谢组学处理软件Progenesis QI(v2.3)软件进行基线过滤、峰识别、积分、保留时间校正、峰对齐和归一化,使用The Human Metabolome Database(HMDB)和Lipidmaps(v2.3)以及METLIN数据库进行定性,再将数据导入代谢组学数据分析软件SIMCA-P进行分析。运用单变量分析与多变量分析结合的方法进行统计分析,进而筛选原发性骨质疏松症肾阳虚证及肝肾阴虚证的潜在代谢标志物。4.结合代谢标志物数据,将代谢标志物、受试者基本信息、各项临床指标进行统计学相关性分析。结果:1.所有数据均经Kolmogorov-Smirnov检验符合正态分布(P>0.05)。2.一般资料结果:经F检验,肾阳虚组、肝肾阴虚组、健康对照组三组间年龄差异存在统计学意义(p<0.05)。经T检验,肾阳虚组、肝肾阴虚组间年龄差异不存在统计学意义(p>0.05)。经F检验,肾阳虚组、肝肾阴虚组、健康对照组三组间BMI差异不存在统计学意义(p>0.05)。3.临床指标结果:经F检验,肾阳虚组、肝肾阴虚组、健康对照组三组在BMD方面比较存在差异,组间差异有统计学意义(P<0.05)。经T检验,肾阳虚组、肝肾阴虚组两组对照组间差异无统计学意义(P>0.05)。经F检验,肾阳虚组、肝肾阴虚组、健康对照组三组25OHD、TP1NP、PTH指标组间差异无统计学意义(P>0.05)。经F检验,肾阳虚组、肝肾阴虚组、健康对照组三组OC、β-CTX指标组间差异存在统计学意义(P<0.05)。经T检验,肾阳虚组、肝肾阴虚组OC指标组间差异无统计学意义(P>0.05),β-CTX指标组间差异存在统计学意义(P>0.05)。4.代谢组学结果:血清全谱代谢组学检测发现,与原发性骨质疏松症相关的9种代谢标志物为4-三甲铵基-丁酸-2烯醇、肌苷、DG(15:0/18:3(9Z,12Z,15Z)/0:0)、DG(15:0/18:4(6Z,9Z,12Z,15Z)/0:0)、PS(18:0/18:1(9Z))、苯丙氨酸-异亮氨酸、1,2-脱水白色向日葵素、TG(8:0/10:0/a-13:0)[rac]、10-甲基-棕榈酸。这些分子中4-三甲铵基-丁酸-2烯醇、DG(15:0/18:3(9Z,12Z,15Z)/0:0)、DG(15:0/18:4(6Z,9Z,12Z,15Z)/0:0)、苯丙氨酸-异亮氨酸、TG(8:0/10:0/a-13:0)[rac]在原发性骨质疏松者体内呈下调趋势,差异倍数均在0.5倍以下,与健康对照组比较有统计学意义(P<0.05)。肌苷、PS(18:0/18:1(9Z))、1,2-脱水白色向日葵素、10-甲基-棕榈酸呈上调趋势,差异倍数均在2倍以上,与健康对照组比较有统计学意义(P<0.05)。血清代谢组学检测发现,与原发性骨质疏松症肾阳虚证及肝肾阴虚证相关的2种代谢标志物为L-苯丙氨酸、s-乳糖谷胱甘肽。L-苯丙氨酸在原发性骨质疏松症患者(肾阳虚证及肝肾阴虚证)体内呈上调趋势;与健康对照组比较,差异倍数在2倍以上,差异有统计学意义(P<0.05)。与肝肾阴虚证组比较,L-苯丙氨酸在肾阳虚证患者体内呈上调趋势,差异倍数在2倍以上,差异有统计学意义(P<0.05)。s-乳糖谷胱甘肽在原发性骨质疏松症肾阳虚证患者体内呈上调趋势;与健康对照组比较,差异倍数在2倍以上,差异有统计学意义(P<0.05)。其在原发性骨质疏松症肝肾阴虚证患者体内呈下调趋势;与健康对照组比较,差异倍数在0.5倍以下,差异有统计学意义(P<0.05)。与肝肾阴虚证组比较,s-乳糖谷胱甘肽在肾阳虚证患者体内呈上调趋势,差异倍数在2倍以上,差异有统计学意义(P<0.05)。5.相关性结果:经Pearson分析,受试者BMD与年龄、TP1NP、OC、β-CTX有负相关性。(r=-0.49、-0.21、-0.40、-0.36);与 BMI、250HD、PTH 不存在相关性(r=0.19、-0.10、-0.01)。经Pearson分析,受试者BMD与4-三甲铵基-丁酸-2烯醇、DG(15:0/18:3(9Z,12Z,15Z)/0:0)、DG(15:0/18:4(6Z,9Z,12Z,15Z)/0:0)、苯丙氨酸-异亮氨酸、TG(8:0/10:0/a-13:0)[rac]有正相关性(r=0.35、0.34、0.29、0.5、0.26);与肌苷、PS(18:0/18:1(9Z))、1,2-脱水白色向日葵素、10-甲基-棕榈酸、L-苯丙氨酸、s-乳糖谷胱甘肽有负相关性(r=-0.25、-0.37、-0.32、-0.39、-0.44、-0.26)。经 Pearson 分析,受试者年龄与 4-三甲铵基-丁酸-2 烯醇、DG(15:0/18:3(9Z,12Z,15Z)/0:0)、DG(15:0/18:4(6Z,9Z,12Z,15Z)/0:0)、苯丙氨酸-异亮氨酸、TG(8:0/10:0/a-13:0)[rac]有负相关性(r=-0.3、-0.39、-0.31、-0.42、-0.32);与肌苷、PS(18:0/18:1(9Z))、1,2-脱水白色向日葵素、10-甲基-棕榈酸、L-苯丙氨酸、s-乳糖谷胱甘肽有正相关性(r=0.28、0.34、0.25、0.36、0.39、0.25)。经 Pearson 分析,受试者 TP1NP与肌苷有正相关性(r=0.26)。经Pearson分析,受试者PTH 与 DG(15:0/18:3(9Z,12Z,15Z)/0:0)、TG(8:0/10:0/a-13:0)[rac]存在正相关性(r=0.21、0.26)。经 Pearson 分析,受试者 OC 与 1,2-脱水白色向日葵素有正相关性(r=0.22)。经Pearson分析,受试者β-CTX与L-苯丙氨酸、s-乳糖谷胱甘肽有正相关性(r=0.39、0.25)。结论:1.随着年龄的增长骨量逐渐减少,原发性骨质疏松症的患病几率增加。2.在骨代谢生化指标中,TP1NP、OC、β-CTX这三种骨转换标志物对评估骨质疏松症均有较好效果,同时β-CTX可能与原发性骨质疏松症肾阳虚证及肝肾阴虚证分型有关。3.发现原发性骨质疏松症的潜在血清代谢标志物为4-三甲铵基-丁酸-2烯醇、肌苷、DG(15:0/18:3(9Z,12Z,15Z)/0:0)、DG(15:0/18:4(6Z,9Z,12Z,15Z)/0:0)、PS(18:0/18:1(9Z))、苯丙氨酸-异亮氨酸、1,2-脱水白色向日葵素、TG(8:0/10:0/a-13:0)[rac]、10-甲基-棕榈酸。4.发现原发性骨质疏松症肾阳虚组、肝肾阴虚组的潜在血清代谢标志物主要为氨基酸及其类似物,包括L-苯丙氨酸、s-乳糖谷胱甘肽。5.猜测 4-三甲铵基-丁酸-2 烯醇、DG(15:0/18:3(9Z,12Z,15Z)/0:0)、DG(15:0/18:4(6Z,9Z,12Z,15Z)/0:0)、苯丙氨酸-异亮氨酸、TG(8:0/10:0/a-13:0)[rac]可能与骨代谢正性相关;肌苷、PS(18:0/18:1(9Z))、1,2-脱水白色向日葵素、10-甲基-棕榈酸、L-苯丙氨酸、s-乳糖谷胱甘肽可能与骨代谢负性相关。6.猜测 TP1NP 与肌苷;PTH 与 DG(15:0/18:3(9Z,12Z,15Z)/0:0)、TG(8:0/10:0/a-13:0)[rac];OC与1,2-脱水白色向日葵素;β-CTX与L-苯丙氨酸、s-乳糖谷胱甘肽可能存在代谢通路相关性。
黄晓[9](2019)在《钙补充拮抗膳食镉暴露致骨毒作用的研究》文中提出镉(cadmium,Cd)污染涉及全人群,对肾脏、骨骼、肺、生殖系统等均有损害作用。膳食是一般人群(非污染区、非职业、非吸烟人群)镉暴露的主要途径。有研究预测,一般人群镉暴露量在未来几十年呈增加趋势。相关领域专家指出,中国重金属污染健康危害防控与风险评估的研究重点,应该集中于镉的健康风险。镉接触最关键有害效应的认定,是风险评估的首要关键步骤。目前食品中镉限量标准,是以肾损伤作为镉接触最关键有害效应制定的。最近越来越多的流行病学研究和动物研究表明,在引起肾损伤水平以下的低剂量镉暴露,能增加骨质疏松症和骨折的风险。有学者认为应以骨损伤,作为镉接触的最关键有害效应,修改并降低食品中镉限量标准。钙(calcium,Ca)摄入不足也是骨质疏松症的危险因素,一般人群中膳食镉暴露和低钙摄入往往同时存在,人群研究中可能因钙摄入不足,造成对镉致骨毒作用高估。在现有关于肾损伤水平以下的低镉暴露增加低骨密度、骨质疏松症和骨折风险的人群研究中,仅2篇报告了钙的摄入量,且钙的摄入量在902-1081mg间,低于美国医学科学院对50岁以上女性人群钙摄入量的建议值(1000-1200mg)。因此,由于膳食钙摄入不足的混杂,人群研究中肾损伤水平以下低镉暴露与骨骼损伤的关系仍不确定。高钙摄入是人体骨密度的保护因素,生命早期足够钙摄入能获得最佳骨峰值,并降低生命后期骨折的风险。但过量摄入钙也可能产生不良作用,如增加肾结石的相对危险性,影响钙及其它金属元素吸收。因此,在增加钙摄入拮抗镉毒作用时,需注意钙摄入过高可能的健康风险。此外,一般人群中存在少部分个体钙摄入量,接近或超过钙的可耐受最高摄入量(tolerable upper intake level,UL)。而膳食是镉暴露和钙摄入的主要途径,且肾也是镉、钙毒作用的主要靶器官,两者进入机体后可能毒作用相加,但目前尚无整体动物水平相关毒理学资料。一般人群因饮食习惯、膳食结构等原因,膳食镉暴露水平不一。目前在一般人群膳食镉暴露剂量下,钙补充是否对镉致骨损伤有保护效应,以及对哪个水平镉暴露人群有保护效应和效应大小尚无研究报道。此外,以往大多数研究表明钙补充能拮抗镉吸收,但膳食钙摄入与镉吸收之间存在复杂的交互作用,在不同镉暴露剂量下,随钙摄入量的不同可能减少、不影响甚至增加镉吸收。目前在一般人群膳食镉暴露剂量下,能否在安全的钙补充范围内通过增加钙摄入减少镉吸收也不明确。鉴于以上研究的不足、人群研究中技术及伦理学等方面的限制,和上述问题亟待研究的现实意义,本论文通过动物模型,模拟一般人群膳食镉暴露和钙摄入水平,以明确钙补充是否对一般人群膳食镉致骨损伤有保护效应,更准确地估计肾损伤水平以下膳食低镉暴露与骨骼损伤的关系,及了解钙补充对镉骨毒作用的保护效应。主要研究内容如下:参考《食品安全性毒理学评价程序和方法》,采用大鼠饲料添加镉建立动物模型,模拟一般人群膳食镉暴露,进行90天经口毒性试验,除观察一般毒理学指标外,还观察了不同剂量钙补充对钙、铁、锌、铜吸收的影响,获得大鼠一般人群膳食镉暴露剂量下钙补充的最小观察到有害作用剂量(the lowest observed adverse effect level,LOAEL)。然后通过检测大鼠镉吸收相关指标(镉表观吸收率,肝肾镉浓度),探讨在一般人群膳食镉暴露剂量下,能否通过钙补充减少镉吸收;并对小肠和肾脏钙转运关键蛋白基因表达进行检测,以解释钙补充对镉吸收影响的可能机制。研究结果将为人群钙补充的风险-收益评估提供相关资料。随后进一步通过建立一般人群和污染区人群不同水平膳食镉暴露动物模型,观察钙补充后不同水平膳食镉暴露的骨效应指标变化,以了解钙补充对哪个水平镉暴露人群有保护效应及效应大小。镉暴露动物模型大鼠钙摄入量正常,可以排除因钙摄入不足而高估镉暴露致骨损伤的可能性,再给予钙补充干预,可以排除高钙摄入可能的保护作用,更准确地估计低镉暴露与镉致骨骼损伤的定量关系。随后进一步从FGF23/Klotho轴出发,探讨钙补充对镉致骨毒作用的潜在保护机制。研究结果不仅为镉的风险评估提供相关毒理学资料,也为理解钙对镉骨毒作用的保护效应及机制提供重要的理论依据。第一章一般人群膳食镉剂量下不同剂量钙补充的大鼠亚慢性毒性研究本研究参考《食品安全性毒理学评价程序和方法》,选用清洁级健康断乳雌性Sprague–Dawley大鼠50只,按体重随机分为5组,分别将氯化镉和碳酸钙掺入钙含量适宜饲料(AIN-93G,含0.5%Ca,为大鼠钙适宜摄入量),连续喂饲90天。既往研究已经证实,以饲料添加1mg/kg镉的方式,给大鼠染毒可以模拟一般人群膳食镉暴露。各组每公斤饲料中加入量(以镉钙计)分别为:0+0(对照组);1mg Cd/kg+0(镉暴露组);1mg Cd/kg+0.15%Ca(低钙补充组);1mg Cd/kg+0.4%Ca(中钙补充组);1mg Cd/kg+0.6%Ca(高钙补充组)。通过对钙毒作用的靶器官肾进行病理学检查,和氮素氮等生化、血液指标检查,以了解不同水平钙补充的钙毒作用;通过对血清钙、铁、锌、铜,钙、铁、锌、铜表观吸收率,肝肾铁、锌、铜浓度和骨钙含量的检测,以观察不同剂量钙补充对钙、铁、锌、铜吸收的影响,从而确定一般人群膳食镉暴露剂量下,大鼠钙补充的LOAEL。与对照组比较,(1)钙补充各组动物活动、生长正常,实验末体重、总进食量、总食物利用率,以及脏器绝对重量、脏体比差异均无统计学意义(p>0.05)。(2)中、高剂量钙补充组尿素氮升高,差异有统计学意义(p<0.05),低剂量钙补充组尿素氮差异无统计学意义(p>0.05),且低、中、高剂量钙补充组间呈剂量-效应关系;(3)低剂量钙补充组病理结果未见明显异常,但在中、高剂量钙补充组肾小管上皮细胞钙化等级和发生率升高,钙补充各组间呈剂量-效应关系,结果与血尿素氮结果一致。(4)低、中剂量钙补充组血常规各指标差异无统计学意义(p>0.05),高剂量钙补充组白细胞计数,单核细胞计数和淋巴细胞计数的增加,且差异有统计学意义(p<0.05)。(5)低、中剂量钙补充组肝、肾组织铁浓度差异无统计学意义(p>0.05),高剂量钙补充组肝、肾铁浓度降低,差异有统计学意义(p<0.05)。(6)镉暴露组与对照组比较各项指标均无统计学意义(p>0.05)。根据中钙补充组的肾病理改变和血清尿素氮高于正常组,且各钙补充剂量组之间呈剂量-效应关系,本研究确定对暴露于1mg Cd/kg饲料,雌性大鼠钙补充的LOAEL,低于中钙补充组钙含量(即每公斤饲料+0.4%Ca),低于文献报道钙单独摄入时的LOAEL值(即每公斤饲料+0.6%Ca)。第二章一般人群膳食镉暴露剂量下不同剂量钙补充对大鼠镉吸收的影响通过对上述动物模型镉吸收相关指标(镉表观吸收率,肝肾组织镉浓度)的检测,及对小肠和肾脏钙结合蛋白基因表达量检测,以明确在一般人群膳食镉暴露剂量下,能否在安全的钙补充范围内,通过钙补充减少镉吸收及可能机制。各钙补充组与镉暴露组比较,低剂量钙补充组肾镉浓度升高,且差异有统计学意义(p<0.05);但中、高剂量钙补充组肾镉浓度与镉暴露组相比较,差异无统计学意义(p>0.05)。大鼠小肠钙结合蛋白基因表达量与肾镉浓度的变化趋势一致。低钙补充组钙结合蛋白基因表达高于镉暴露组(p<0.05),中、高钙补充组小肠钙结合蛋白基因表达与镉暴露组相比差异无统计学意义(p>0.05)。一般人群膳食镉暴露剂量下,中、高剂量钙补充并不减少大鼠的镉吸收;且低剂量钙补充能增加镉吸收,小肠钙结合蛋白可能参与了其过程。第三章钙补充对大鼠镉致骨毒作用的干预效应研究建立一般人群和污染区人群膳食镉暴露动物模型,以第一部分实验获得的大鼠钙补充LOAEL(+0.4%Ca含量)为钙干预剂量,进行干预实验,以了解钙补充对哪个水平镉暴露人群骨损伤有保护作用及效应大小。选用雌性断乳后SD大鼠70只,按体重随机分为7组,分别将氯化镉和碳酸钙掺入AIN-93G饲料连续喂饲90天。各组每公斤饲料中加入量(以镉钙计)分别为:0+0(对照组);1mg Cd/kg+0(低镉暴露组);1mg Cd/kg+0.4%Ca(低镉暴露钙干预组);5mg Cd/kg+0(中镉暴露组);5mg Cd/kg+0.4%Ca(中镉暴露钙干预组);50mg Cd/kg+0(高镉暴露组);50mg Cd/kg+0.4%Ca(高镉暴露钙干预组)。在镉暴露指标上,除大鼠平均每日膳食镉摄入量外,还通过原子吸收法检测肾脏,肝脏和股骨中镉含量,以准确估计大鼠镉体内暴露量。在骨效应指标上,除骨量指标外,还从宏观敏感指标骨生物力学,病理学骨微结构、血清骨代谢生物标志物及骨代谢OPG/RANKL通路进行观察,以评估钙补充干预的保护效应。对中、高镉暴露组大鼠,钙补充干预后,股骨弹性模量和抗弯最大应力分别增加25.32%32.8%,9.9%11.2%,血清PINP(骨形成标志物)增加、骨微结构(骨小梁数量和皮质厚度)增加,骨代谢OPG/RANKL通路中OPG基因(成骨相关)和蛋白表达增加(p<0.05)。但对低镉暴露组大鼠,钙补充除增加骨代谢OPG/RANKL通路中成骨相关基因和蛋白表达外,对上述指标没有影响。钙补充对大鼠镉致骨骼损伤有保护效应,特别是对中、高剂量膳食镉暴露大鼠效应显着。但对低剂量镉暴露组大鼠,钙补充除增加骨代谢OPG/RANKL通路中OPG基因和蛋白表达外,对宏观敏感指标骨生物力学没有影响。第四章钙补充对镉致骨毒作用的干预机制研究通过酶联免疫吸附试验,检测上述动物模型血清1,25-二羟基维生素D3,血清Klotho蛋白和FGF23蛋白,实时定量PCR、免疫组织化学染色检测肾组织Klotho基因和蛋白表达;实时定量PCR,免疫组织化学染色和检测Western blot法检测股骨FGF23基因和蛋白表达,及Wnt/β-catenin通路,成骨细胞的增殖分化相关基因和蛋白,从FGF23/Klotho轴,探讨钙补充对镉致骨毒作用的潜在保护机制。钙补充干预后血清Klotho蛋白、肾Klotho基因和蛋白表达降低(p<0.05);肾钠依赖性磷酸盐协同转运蛋白(Napi2a)基因表达低于干预前(p<0.05);肾1,25-(OH)2D3合成的线粒体Cyp27b1酶基因表达干预后高于干预前(p<0.05)。钙补充干预后,大鼠股骨FGF23基因和蛋白表达升高(p<0.05)。干预后高镉暴露组骨Wnt/β-catenin通路Wnt靶基因Tcf1和Axin2基因表达增加(p<0.05);Wnt通路下游与增殖相关的C-myc蛋白表达增加(p<0.05)。干预后骨促进成骨细胞分化的Runx2蛋白上调,反映成骨细胞终末分化水平的Ⅰ型胶原(Col1a1)基因和蛋白表达上调。在血清蛋白、肾基因和蛋白表达层面,钙补充干预后Klotho表达均下调,骨FGF23基因和蛋白上调,推测钙补充可能通过FGF23/Klotho轴发挥其对镉骨毒作用的保护效应。基于肾组织基因和蛋白表达结果,推测这一生物学效应可能与Klotho和FGF23形成特异性受体复合物,间接影响肾脏中的影响维生素D合成、钙的重吸收和肾磷酸盐转运有关;基于骨组织基因和蛋白表达结果,推测其与FGF23/Klotho轴调控成骨细胞中Wnt/β-catenin通路影响成骨细胞的增殖分化有关。综上所述,对暴露于1mg Cd/kg饲料雌性大鼠,钙补充的LOAEL值低于文献报道钙单独摄入时的LOAEL值,结果提示人群中少部分钙摄入量接近或超过UL者,不能忽视膳食镉暴露的毒作用。一般人群膳食镉暴露剂量下,中剂量钙补充,并不减少低镉暴露大鼠的镉吸收,提示减少镉吸收可能不是钙拮抗镉骨毒作用的机制;且低剂量钙补充能增加镉吸收,提示在人群钙补充的风险-收益评估时,需关注钙补充增加镉吸收的潜在不良作用。钙补充对大鼠镉致骨骼损伤有保护效应,提示在镉的风险评估中,需考虑高钙摄入对镉致骨毒作用的保护效应;而对低剂量组大鼠,钙补充除增加骨代谢OPG/RANKL通路中OPG基因和蛋白表达外,对宏观敏感指标骨生物力学没有影响,提示钙补充对镉骨毒作用的保护效应具有一定的范围和剂量选择性。钙补充对镉致骨毒作用的保护机制涉及FGF23/Klotho轴,还直接影响骨代谢OPG/RANKL信号通路。
叶孟亮[10](2019)在《牦牛骨胶原蛋白肽抗骨质疏松作用机制研究》文中研究说明牦牛(Bos grunniens)是我国珍贵的畜种资源,牦牛骨中含有丰富的胶原蛋白(约占21.5%),补充胶原蛋白肽可以增加骨胶原纤维网架的规则性和牢固性。深入开展对牦牛骨精深加工技术的研究探讨,充分利用牦牛骨中丰富的骨胶原蛋白开发功能性食品,对提高牦牛附加值、增加藏区牧民收益、促进牧区社会经济发展和稳固边疆具有重要意义。本研究以牦牛骨为研究对象,利用酸溶酶提技术制备得到较高纯度牦牛骨胶原蛋白,并对其结构进行了鉴定。基于靶向酶解技术考查了复合蛋白酶(Protamex)、风味蛋白酶(Flavourzyme)、胰蛋白酶(Trypsin)、中性蛋白酶(Neutrase)、碱性蛋白酶(Alcalase)、木瓜蛋白酶(Papain)等6种常用商业蛋白酶对牦牛骨胶原蛋白酶解效果差异,并以水解度、促成骨细胞增殖活性为指标优选了最适用酶;采用响应面法优化了中性蛋白酶酶解牦牛骨胶原蛋白制备促成骨细胞增殖活性肽的最佳工艺参数。利用超滤、体积排阻色谱、反向液相色谱串联质谱技术对牦牛骨胶原蛋白肽进行了进一步分离、纯化和鉴定。通过模拟胃肠道消化、Caco-2细胞单层膜转运模型考查了牦牛骨胶原蛋白肽的消化、吸收、转运机制。基于Real-time qPCR、Western blot和分子对接技术探究了牦牛骨胶原蛋白肽促成骨细胞增殖潜在作用机制。利用骨转换生化标志物、骨生物力学指标、骨形态力学指标考查了牦牛骨胶原蛋白肽抗骨质疏松活性效应;首次基于非靶向代谢组学技术系统探究了牦牛骨胶原蛋白肽抗骨质疏松活性作用机制。取得主要研究成果如下:(1)通过比较分析6种蛋白酶酶解牦牛骨胶原蛋白水解液促成骨细胞增殖率差异,筛选出中性蛋白酶为酶解牦牛骨胶原蛋白制备促成骨细胞增殖活性肽最适用酶,并优化得到最佳酶解工艺组合为:酶解液温度54℃、酶解时间3.6 h、酶底比(E/S)5637 U/g、初始pH 6.12。(2)利用超滤、体积排阻色谱、反向高效液相色谱等方法对酶解牦牛骨胶原蛋白制备得到的促成骨细胞增殖活性肽进行了分离纯化。其中,经超滤后收集得到的组分UF-IV(Mw<3 kDa)表现出较高的促成骨细胞增殖活性;经SuperdexTM peptide 10/300 GL色谱柱(体积排阻色谱法)分离后,组分SP-III表现出较高的促成骨细胞增殖活性,在0.5 mg/mL作用浓度下,促成骨细胞增殖率高达160.6%;经RP-HPLC分离纯化,组分SP-III经Innoval C18色谱柱进一步分离后的组分F8表现出较强的促成骨细胞增殖活性(190.6%)。利用反向液相色谱串联质谱法联合Mascot2.4 search engine对其氨基酸序列进行测定,共鉴定得到35条肽段。基于相对丰度、分子量、比对标准得分等指标筛选出9条具有较高潜在促成骨细胞增殖活性肽进行化学合成验证其体外生物活性,结果表明,GPAGPPGPIGNV(GP-12)肽相较其他8条肽段具有更高的促成骨细胞增殖活性(142.7%)。(3)模拟胃肠道消化试验结果表明,GP-12肽对胃-肠道消化具有一定的抗性,虽部分GP-12肽经肠道内肽酶水解为GPAGPPGPIGN(GP-11)和GPAGPPGPI(GP-9),经消化后仍可发挥促成骨细胞增殖活性。构建的Caco-2细胞单层膜试验结果表明,GP-12肽会被上皮细胞膜肽酶进一步水解为GPPGPIGNV(GV-9)、AGPPGPIGNV(AV-11)肽,仍有部分GP-12肽可以完整通过Caco-2细胞单层膜而转运,但吸收率较低,其吸收机制为细胞旁路途径吸收。(4)牦牛骨胶原蛋白肽GP-12通过激活Wnt/β-catenin信号通路和EGFR信号通路之间交互作用从而诱导成骨细胞的增殖和分化。体外模拟分子对接结果显示,GP-12肽和表皮生长因子受体EGFR的氨基酸残基结合位点为Asn12、Lys13、Leu14、Thr15、Gln16、Leu17、Gly18、Tyr45、Leu325和Phe357,结合力主要为氢键作用和范德华力。牦牛骨胶原蛋白肽GP-12潜在促成骨细胞增殖作用机制可能为:GP-12肽首先将表皮生长因子受体EGFR激活,活化后的EGFR进一步将GSK-3β因子磷酸化,从而阻止β-catenin蛋白降解,造成β-catenin蛋白在成骨细胞内的积累,从而激活Wnt/β-catenin信号通路诱导成骨细胞增殖过程。(5)牦牛骨胶原蛋白肽(<3kDa)具有较好的促成骨增殖活性,且呈现良好的剂量-效应关系。所提取的牦牛骨胶原蛋白肽(<3kDa)中分子量在1 kDa以下的多肽所占比例高达96.8%。牦牛骨胶原蛋白肽(<3kDa)的促成骨细胞增殖活性可能归因于GPSGPAGKDGRIGQPG(GP-16)、GDRGETGPAGPAGPIGPV(GD-18)或者含有类似氨基酸序列的多肽与表皮生长因子受体EGFR相互作用。(6)牦牛骨胶原蛋白肽(<3kDa)可显着提高机体骨形成相关转换生化标志物(BGP、BALP)的表达和降低机体骨吸收相关生化标志物(TRACP、S-CTX、DPD)表达。大鼠股骨骨生物力学指标方面,相较模型组,牦牛骨胶原蛋白肽(<3kDa)和雌二醇处理组大鼠骨弹性载荷和断裂载荷均呈显着上升趋势(P>0.05)。此外,牦牛骨胶原蛋白肽(<3kDa)和雌二醇可显着提高大鼠骨小梁数目(Tb.N)、骨小梁密度(Tb.BMD)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨体积分数(BV/TV),降低骨小梁间距(Tb.Sp)的作用(P<0.05)。综上,牦牛骨胶原蛋白肽(<3kDa)能够明显改善去卵巢大鼠骨质疏松症状,且呈现一定的剂量-效应作用关系。(7)共筛选出8种脂类和类脂分子(牛磺酸、花生四烯酸、1-棕榈酰-2-羟基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯酸、1-硬脂酰-2-羟基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、牛磺酸脱氧胆酸、Taurochenodeoxycholate、牛磺胆),2种有机酸及其衍生物(D-erythro-鞘氨醇-1-磷酸、L-瓜氨酸),以及1种神经递质类物质(血清素)等11种代谢物为潜在生物标志物。去卵巢大鼠骨质疏松发病机制与机体磷脂代谢、氨基酸代谢和脂肪酸代谢紊乱密切相关。牦牛骨胶原蛋白肽干预去卵巢大鼠骨质疏松过程与Membrane transport(ABC transports)、消化系统(Protein digestion and absorption、Mineral absorption)、翻译(Aminoacyl-tRNA biosynthesis)、氨基酸代谢(Arginine and proline metabolism、Valine,leucine and isoleucine degradation)和脂质代谢(Bile secretion、Primary bile acid biosynthesis、Taurine and hypo taurine metabolism)密切相关,且与细胞免疫、神经系统、碳代谢及内分泌系统等多种代谢通路交互作用,多信号通路、多环节、多靶点和多维度干预大鼠骨质疏松症预防、改善与治疗。
二、脂质及其代谢调节物在骨重构中的作用(论文开题报告)
(1)论文研究背景及目的
此处内容要求:
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景,再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题,并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例:
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
(2)本文研究方法
调查法:该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法:用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法:通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法:通过调查文献来获得资料,从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法:依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法:对研究对象进行“质”的方面的研究,这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法:通过具体的数字,使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法:运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法:这是社会科学用来分析社会现象的一种方法,从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法:通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、脂质及其代谢调节物在骨重构中的作用(论文提纲范文)
(1)艾灸治疗类风湿关节炎的网状Meta分析及其疗效机制的脂质组学实验研究(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
前言 |
第一章 理论研究 |
1 现代医学对类风湿关节炎的认识 |
1.1 类风湿关节炎的概念 |
1.2 病因与发病机制研究 |
1.3 诊断与鉴别诊断 |
1.4 西医对于RA的治疗 |
1.5 其他治疗手段 |
2 中医对类风湿关节炎的认识 |
2.1 病因病机 |
2.2 中医对于RA的治疗 |
3 艾灸治疗RA的理论研究 |
3.1 艾灸治疗RA的中医理论依据 |
3.2 艾灸治疗RA的临床应用 |
3.3 艾灸治疗RA的规范化研究 |
3.4 艾灸治疗RA的机制研究 |
4 脂质组学概述 |
4.1 脂质组学的概念 |
4.2 脂质组学的常用技术 |
4.3 RA与脂质分子密切相关 |
4.4 RA代谢组学中关于脂质的发现 |
4.5 RA的脂质组学研究 |
4.6 中医药领域的脂质组学研究现状 |
第二章 艾灸治疗类风湿关节炎的网状Meta分析 |
1 方法 |
1.1 检索策略 |
1.2 纳入标准 |
1.3 排除标准 |
1.4 文献筛选与资料提取 |
1.5 文献质量评估 |
1.6 数据综合和统计分析 |
2 结果 |
2.1 文献检索结果 |
2.2 纳入研究的基本特征 |
2.3 不良事件、脱落与随访 |
2.4 方法学质量评估 |
2.5 传统Meta分析结果 |
2.6 网状Meta分析结果 |
3 讨论 |
3.1 研究的临床意义 |
3.2 局限性和启示 |
3.3 结论 |
第三章 艾灸治疗类风湿关节炎的血浆脂质组学实验研究 |
1 方法 |
1.1 材料与仪器 |
1.2 实验方法 |
1.3 统计学分析 |
1.4 血浆样本预处理 |
1.5 分析条件 |
1.6 数据处理 |
2 结果 |
2.1 艾灸类风湿关节炎大鼠疗效观察 |
2.2 数据质量控制 |
2.3 脂质组学代谢轮廓分析 |
2.4 RA模型血浆代谢轮廓分析 |
2.5 RA模型血浆差异代谢物鉴定 |
2.6 代谢通路分析 |
3 讨论 |
3.1 造模动物和方法的选择 |
3.2 艾灸对RA大鼠的疗效观察 |
3.3 脂质组学结果分析 |
4 小结 |
论文总结与展望 |
1 总结 |
2 创新点 |
3 不足与展望 |
参考文献 |
附录 |
攻读硕士学位期间取得成果 |
致谢 |
(2)血清ANGPTL8水平和初治2型糖尿病患者动脉粥样硬化的相关性研究(论文提纲范文)
中文摘要 |
Abstract |
第一章 前言 |
1.1 研究背景 |
1.2 ANGPTL8及研究现状 |
1.2.1 ANGPTL8概述 |
1.2.2 ANGPTL8与β细胞功能 |
1.2.3 ANGPTL8与脂质代谢 |
1.2.4 ANGPTL8通过调节脂肪组织炎症反应改善IR |
1.2.5 ANGPTL8改善胰岛素信号通路损伤 |
1.2.6 ANGPTL8与AS |
第二章 研究对象及方法 |
2.1 研究对象 |
2.1.1 排除标准 |
2.2 实验方法 |
2.2.1 主要实验仪器和设备 |
2.2.2 基本资料的收集 |
2.2.3 临床指标的测定 |
2.2.4 颈动脉内膜中层厚度的测定 |
2.3 血清ANGPTL8的测定 |
2.3.1 主要试剂 |
2.3.2 试剂盒性能 |
2.3.3 试剂盒组成成分 |
2.3.4 操作步骤 |
2.3.5 实验结果计算 |
2.4 统计学方法 |
第三章 结果 |
3.1 T2DM患者的血清ANGPTL8水平增加 |
3.2 血清ANGPTL8与各临床资料之间的关系 |
3.3 影响血清ANGPTL8水平的危险因素 |
3.4 不同分组间血清ANGPTL8水平的比较 |
3.4.1 CIMT不同分组和健康对照组各临床指标的比较 |
3.4.2 血清ANGPTL8是CIMT增厚的独立危险因素 |
3.4.3 不同血脂水平ANGPTL8的差异 |
第四章 讨论 |
4.1 血清ANGPTL8水平在T2DM患者中显着升高 |
4.2 血清ANGPTL8水平与年龄呈正相关 |
4.3 ANGPTL8与TG代谢密切相关 |
4.4 ANGPTL8与IR之间的关系 |
4.5 ANGPTL8具有AS效应 |
4.6 优势与不足 |
4.7 总结及展望 |
第五章 结论 |
参考文献 |
中英文缩略词表 |
附录 |
综述 ANGPTL8在2型糖尿病中的作用及其表达调控机制研究进展 |
参考文献 |
在学期间研究成果 |
致谢 |
(3)冠心病临床预后的脂质组学研究及脂质代谢紊乱的全基因组关联性研究(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
绪论 |
1.冠心病的临床预后及其研究现状 |
2.冠心病的左室重构及其研究现状 |
3.脂质组学的定义及其研究现状 |
4.冠心病临床终点事件的脂质组学研究现状 |
5.冠心病左室重构的脂质组学研究现状 |
6.遗传变异对冠心病脂质代谢物水平的影响 |
7.研究目的和意义 |
第一章 冠心病患者临床终点事件的广泛靶向脂质组学研究 |
1.材料和仪器 |
1.1 主要试剂 |
1.2 主要仪器 |
2.方法 |
2.1 研究对象及其入选方法 |
2.2 研究对象临床基线资料 |
2.3 研究对象的临床终点事件及随访流程 |
2.4 冠状动脉造影术评估疾病严重程度 |
2.5 入选患者血浆样本的采集 |
2.6 广泛靶向脂质组学检测 |
2.7 数据处理与统计学分析 |
3.结果 |
3.1 冠心病患者的临床基线资料及其对终点事件的影响 |
3.2 脂质代谢物结构特征与死亡风险的相关性 |
3.3 血浆中脂质代谢物对临床终点事件的影响 |
3.4 .基于脂质代谢物面板构建临床终点事件风险预测模型 |
3.5 基于独立标志物的临床终点事件发生风险的生存分析 |
4.讨论 |
5.结论 |
第二章 冠心病患者左室重构的广泛靶向脂质组学研究 |
1.材料与仪器 |
1.1 主要试剂 |
1.2 主要仪器 |
2.方法 |
2.1 冠心病患者入选 |
2.2 研究对象临床基线资料 |
2.3 冠状动脉造影术评估疾病严重程度 |
2.4 彩色多普勒超声诊断系统评价左心室功能 |
2.5 入选患者的血浆样本的采集 |
2.6 广泛靶向脂质组学检测 |
2.7 数据处理与统计学分析 |
3.结果 |
3.1 临床基线资料对左室重构的影响 |
3.2 发现队列揭示与冠心病患者左室重构相关的血浆脂质代谢物 |
3.3 与冠心病患者左室重构相关的脂质代谢通路分析 |
3.4 发现队列建立基于脂质代谢物的左室功能障碍风险预测模型 |
3.5 多中心验证队列重复识别与冠心病患者左室重构相关的脂质代谢物 |
3.6 多中心验证队列重复识别与冠心病患者左室重构相关的脂质代谢通路 |
4.讨论 |
5.结论 |
第三章 冠心病患者脂质代谢紊乱的全基因组关联性分析 |
1.材料与仪器 |
1.1 主要试剂 |
1.2 主要仪器 |
2.方法 |
2.1 研究对象及其入选方法 |
2.2 研究对象的临床基线资料 |
2.3 入选患者血浆样本的采集 |
2.4 血细胞样本基因组DNA提取 |
2.5 基因组DNA浓度及纯度的测定 |
2.6 全基因组基因分型及质控 |
2.7 广泛靶向脂质组学检测 |
2.8 数据处理与统计学分析 |
3.结果 |
3.1 发现队列与死亡相关的脂质代谢物的全基因组关联性分析 |
3.2 发现队列与左室功能障碍相关的脂质代谢物的全基因组关联性分析 |
3.3 多中心队列验证 |
3.4 独立SNP位点对死亡的影响 |
4.讨论 |
5.结论 |
全文总结 |
局限性与展望 |
参考文献 |
附录 |
攻读硕士学位期间的成果 |
致谢 |
附件 |
(4)SAK-HV诱导免疫反应的种属差异对降脂功效的影响及其分子机制研究(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
前言 |
第一部分 SAK-HV在高脂恒河猴中的药效学评估及降脂作用的种属差异 |
1.1 前言 |
1.2 SAK-HV在高脂恒河猴中的降脂作用 |
1.2.1 材料方法 |
1.2.2 实验结果 |
1.3 SAK-HV触发不同种属动物中的免疫差异 |
1.3.1 材料方法 |
1.3.2 实验结果 |
1.4 讨论 |
1.5 小结 |
第二部分 SAK-HV/Gel的免疫效果及其降脂作用评价 |
2.1 前言 |
2.2 SAK-HV/Gel的免疫效果及降脂功效 |
2.2.1 材料方法 |
2.2.2 实验结果 |
2.3 基于转录组学的SAK-HV/Gel降脂机制探究 |
2.3.1 材料方法 |
2.3.2 实验结果 |
2.4 基于代谢组学分析的机制探究 |
2.4.1 材料方法 |
2.4.2 实验结果 |
2.5 讨论 |
2.6 小结 |
第三部分 SAK-HV对巨噬细胞迁移的作用及机制 |
3.1 前言 |
3.2 材料方法 |
3.3 实验结果 |
3.3.1 SAK-HV触发巨噬细胞迁移 |
3.3.2 SAK-HV通过其SAK突变体结构域促进了细胞迁移 |
3.3.3 SAK-HV对巨噬细胞迁移相关通路的影响 |
3.3.4 SAK-HV通过JNK和 NF-κB通路促进迁移 |
3.3.5 SAK-HV处理对迁移相关效应蛋白的影响 |
3.3.6 SAK-HV通过JNK/NF-κB途径促进MCP-1 表达 |
3.3.7 MCP-1 对于SAK-HV诱导的巨噬细胞迁移至关重要 |
3.3.8 SAK-HV促进巨噬细胞M1 型极化 |
3.4 讨论 |
3.5 小结 |
结论与展望 |
参考文献 |
附录 |
作者在学期间取得的学术成果 |
主要简历 |
致谢 |
(5)S-烯丙基巯基半胱氨酸(SAMC)在骨关节炎中的保护作用及机制研究(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
符号说明 |
绪论 |
第一部分 SAMC对骨关节炎的体内作用研究 |
引言 |
1.1 材料和方法 |
1.1.1 SAMC制备 |
1.1.2 实验试剂及抗体 |
1.1.3 实验仪器及耗材 |
1.1.4 实验动物 |
1.1.5 手术建立骨关节炎模型 |
1.1.6 动物实验分组及标本留取 |
1.1.7 X线拍照 |
1.1.8 病理检查 |
1.1.9 免疫组织化学 |
1.1.10 酶联免疫吸附试验(ELISA) |
1.1.11 Western Blot分析 |
1.1.12 逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和定量实时(Q-PCR) |
1.1.13 氧化-抗氧化生物标志物的测定 |
1.1.14 统计分析 |
1.2 结果 |
1.2.1 SAMC改善骨关节炎大鼠模型的进展 |
1.2.2 SAMC对骨关节炎大鼠软骨病理损伤的保护作用 |
1.2.3 SAMC对骨关节炎大鼠胶原降解及MMP/TIMP1比值的影响 |
1.2.4 SAMC减轻骨关节炎大鼠炎症反应 |
1.2.5 SAMC调节骨关节炎的氧化还原平衡 |
1.3 讨论 |
1.3.1 骨关节炎动物模型建立及X线评价 |
1.3.2 大鼠OA膝关节软骨形态学改变 |
1.3.3 SAMC对OA大鼠中软骨基质改变的影响 |
1.3.4 SAMC对OA大鼠中基质金属蛋白酶和基质金属蛋白酶抑制因子的调控 |
1.3.5 SAMC改善OA大鼠的关节炎症反应 |
1.3.6 SAMC减轻了骨关节炎大鼠的氧化应激损伤 |
1.4 小结 |
第二部分 SAMC对骨关节炎的体外作用研究 |
引言 |
2.1 材料和方法 |
2.1.1 实验试剂及抗体 |
2.1.2 实验仪器及耗材 |
2.1.3 大鼠软骨细胞分离培养 |
2.1.4 体外骨关节炎模型和SAMC处理 |
2.1.5 软骨细胞增殖检测 |
2.1.6 DAPI荧光染色 |
2.1.7 Western blot分析 |
2.1.8 酶联免疫吸附试验(ELISA) |
2.1.9 定量RT-PCR (qRT-PCR)分析 |
2.1.10 统计分析 |
2.2 结果 |
2.2.1 SAMC对IL-1β刺激的软骨细胞活力及凋亡的作用 |
2.2.2 SAMC对Ⅱ型胶原产物及C2C抗原表位表达的影响 |
2.2.3 SAMC对IL-1β诱导的MMPs和TIMP-1改变的影响 |
2.2.4 SAMC抑制IL-1β导致的TNF-α增高 |
2.2.5 SAMC抑制IL-1β引起的NF-κB活化 |
2.3 讨论 |
2.4 小结 |
第三部分 SAMC靶向Nrf2参与对骨关节炎的作用机制 |
引言 |
3.1 材料和方法 |
3.1.1 实验试剂及抗体 |
3.1.2 实验仪器与耗材 |
3.1.3 病毒构建及制备 |
3.1.4 大鼠软骨细胞分离培养与腺病毒感染 |
3.1.5 Western blot分析 |
3.1.6 统计分析 |
3.2 结果 |
3.2.1 SAMC对OA大鼠关节炎症通路的作用 |
3.2.2 Nrf2是SAMC调节骨关节炎氧化还原平衡的关键因子 |
3.2.3 SAMC不能调节IL-1β诱导的Nrf2缺失软骨细胞中的氧化应激反应 |
3.2.4 SAMC不能防止IL-1β诱导的Nrf2缺失软骨细胞中的细胞基质破坏 |
3.2.5 SAMC通过NF-κB调节的炎症途径对骨关节炎软骨细胞起保护作用 |
3.3 讨论 |
3.4 小结 |
总结与展望 |
附图表 |
参考文献 |
文献综述 |
参考文献 |
致谢 |
攻读博士学位期间发表的学术论文 |
学位论文评阅及答辩情况表 |
英文论着 |
(6)MFAP4在心肌重构中的作用及其机制研究(论文提纲范文)
中文摘要 |
Abstract |
主要英文缩略词汇表 |
引言 |
第一部分 基于生物信息学分析MFAP4在心肌重构中的表达 |
前言 |
材料与方法 |
结果 |
讨论 |
结论 |
附图 |
第二部分 MFAP4在异丙肾上腺素诱导心肌重构中的作用 |
前言 |
材料与方法 |
结果 |
讨论 |
结论 |
附图 |
第三部分 MFAP4在压力超负荷诱导心肌重构中的作用 |
前言 |
材料与方法 |
结果 |
讨论 |
结论 |
附图 |
第四部分 MFAP4在心肌重构中的作用机制研究 |
前言 |
材料与方法 |
结果 |
讨论 |
结论 |
附图 |
参考文献 |
综述 胞外囊泡与心肌重构的研究进展 |
参考文献 |
攻博期间科研成果目录 |
致谢 |
(7)补肾中药调控ERα-AMPK-Wnt/β-catenin信号通路促进成骨细胞增殖、分化的研究(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
引言 |
第一章 文献研究 |
1 中医学关于骨质疏松症病因病机的认识 |
1.1 中医学对骨质疏松症的认识 |
1.2 骨质疏松的病因病机 |
2 中医药治疗骨质疏松症的现状 |
2.1 常用的补肾类方剂 |
2.2 单味补肾中药及其活性成分与骨质疏松研究进展 |
2.3 补肾中药牛膝及牛膝单体与PMOP研究进展 |
3 现代医学对OP、PMOP的认识 |
3.1 OP和PMOP流行病学研究进展 |
3.2 雌激素和雌激素受体与PMOP研究进展 |
3.3 AMPK信号通路与PMOP的研究进展 |
3.4 Wnt/β-catenin信号通路与PMOP的研究进展 |
第二章 临床与实验研究部分 |
1 血清中ER α甲基化检测对PMOP临床研究意义 |
1.1 实验材料 |
1.2 实验方法 |
1.3 实验结果 |
1.4 讨论 |
2 DNA甲基化对体外成骨细胞增殖和成熟影响 |
2.1 实验材料 |
2.2 实验方法 |
2.3 实验结果 |
2.4 讨论 |
3 ERα调控AMPK α活化对成骨细胞分化影响 |
3.1 实验材料 |
3.2 实验方法 |
3.3 实验结果 |
3.4 讨论 |
4 ERα调控Wnt-β-catenin信号通路对成骨细胞分化影响 |
4.1 实验材料 |
4.2 实验方法 |
4.3 结果 |
4.4 讨论 |
5 牛膝甾酮调控ERα -AMPKα-Wnt/β-catenin信号通路对成骨细胞分化的影响 |
5.1 实验材料 |
5.2 方法 |
5.3 实验结果 |
5.4 讨论 |
第三章 结语 |
1 总结 |
2 创新点 |
3 不足 |
4 展望 |
参考文献 |
附录 |
在校期间发表论文 |
致谢 |
统计学审核证明 |
详细摘要 |
(8)基于阴/阳虚证的原发性骨质疏松症临床代谢组学研究(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
前言 |
第一章 文献研究 |
1. 骨质疏松症的现代医学研究进展 |
1.1 骨质疏松症的现代医学概述 |
1.2 骨质疏松症的发病机制研究 |
2. 骨质疏松症中医方向研究进展 |
2.1 中医对骨质疏松症的认识 |
2.2 骨质疏松症的病因病机 |
2.3 骨质疏松症的中医辨证 |
2.4 中医临床研究存在的问题及应对策略 |
3. 代谢组学研究现状 |
3.1 代谢组学的概念 |
3.2 代谢组学研究进程 |
3.3 代谢组学中的统计分析 |
3.4 代谢组学和中医证型的联系 |
4. 代谢组学在骨质疏松症中的应用进展 |
4.1 代谢组学在诊断骨质疏松症方向的研究进展 |
4.2 代谢组学技术在骨质疏松症中医证型判别方面的研究进展 |
第二章 代谢组学实验研究 |
1. 研究对象 |
1.1 研究对象来源 |
1.2 骨质疏松症研究标准 |
1.3 健康受试者筛选标准 |
2. 研究方法 |
2.1 伦理审查 |
2.2 实验分组及样本量 |
2.3 随机方法 |
2.4 盲法 |
2.5 观察指标 |
2.6 质量控制 |
2.7 代谢组学检测 |
2.8 数据的处理 |
2.9 代谢组学差异代谢物筛选 |
2.10 研究流程 |
3 研究结果 |
3.1 代谢组学研究结果 |
3.2 临床研究结果 |
第三章 讨论 |
1 代谢组学部分 |
1.1 原发性骨质疏松症的潜在代谢标志物 |
1.2 原发性骨质疏松症肾阳虚证、肝肾阴虚证的潜在代谢标志物 |
2 临床部分 |
2.1 血清骨代谢生化指标水平对原发性骨质疏松症的影响 |
2.2 人体一般情况及骨代谢生化指标对BMD的影响 |
2.3 代谢组学代谢标志物与各临床指标的联系 |
结论 |
不足与展望 |
参考文献 |
中英文缩略词表 |
攻读硕士期间取得的学术成果 |
附件 |
致谢 |
(9)钙补充拮抗膳食镉暴露致骨毒作用的研究(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
中英文缩略词表 |
前言 |
第一章 一般人群膳食镉暴露剂量下大鼠钙补充的最小观察到有害作用剂量研究 |
1.1 引言 |
1.2 材料与方法 |
1.2.1 试剂与仪器 |
1.2.2 实验动物及分组 |
1.2.3 钙补充剂量选择及给予方式 |
1.2.4 一般临床观察,体重和食物消耗 |
1.2.5 钙吸收代谢实验 |
1.2.6 血液学检查 |
1.2.7 血生化检查 |
1.2.8 脏器重量、脏体比 |
1.2.9 肾病理学检查 |
1.2.10 生物样品中钙、铁、锌、铜检测 |
1.2.11 统计分析 |
1.3 结果 |
1.3.1 大鼠一般状况、体重和进食量 |
1.3.2 大鼠食物利用率和膳食镉暴露量 |
1.3.3 血液学结果 |
1.3.4 血生化结果 |
1.3.5 脏器重量和脏器指数 |
1.3.6 肾病理学结果 |
1.3.7 钙补充对血清钙、磷、铁、锌、铜的影响 |
1.3.8 钙补充对钙、铁、锌、铜表观吸收率的影响 |
1.3.9 钙补充对大鼠肝、肾组织中铁、锌、铜含量的影响 |
1.3.10 钙补充对大鼠股骨干重和骨钙含量的影响 |
1.4 讨论 |
第二章 一般人群膳食镉暴露剂量下不同剂量钙补充对大鼠镉吸收的影响 |
2.1 引言 |
2.2 材料与方法 |
2.2.1 试剂与仪器 |
2.2.2 实验动物、分组及染毒 |
2.2.3 镉吸收代谢实验 |
2.2.4 饲料钙、镉含量测定和肝、肾组织镉含量测定 |
2.2.5 CaBP、CaT1和DMT1 基因实时荧光定量PCR检测 |
2.2.6 统计分析 |
2.3 结果 |
2.3.1 大鼠饲料镉钙含量 |
2.3.2 大鼠膳食每日镉摄入情况 |
2.3.3 钙补充对大鼠镉表观吸收率的影响 |
2.3.4 钙补充对大鼠肝、肾组织镉浓度的影响 |
2.3.6 钙补充对大鼠小肠CaBP基因表达的影响 |
2.3.7 钙补充对大鼠肾脏CaBP、CaT1、DMT1基因表达的影响 |
2.4 讨论 |
第三章 钙补充对不同剂量膳食镉暴露致大鼠骨毒作用的干预效应研究 |
3.1 引言 |
3.2 材料与方法 |
3.2.1 仪器与试剂 |
3.2.2 实验动物及分组 |
3.2.3 剂量选择及给予方式 |
3.2.4 体重、摄食量及一般情况观察 |
3.2.5 三点弯曲试验测试大鼠股骨生物力学特性 |
3.2.6 原子吸收法测定大鼠骨钙含量和肝、肾、骨组织镉含量 |
3.2.7 大鼠胫骨组织病理学检查 |
3.2.8 大鼠血清骨代谢标志物PINP、β-CTX酶联免疫吸附检测 |
3.2.9 大鼠股骨骨代谢通路OPG和 RANKL实时荧光定量PCR检测 |
3.2.10 大鼠股骨骨代谢通路OPG和 RANKL蛋白酶联免疫吸附检测 |
3.2.11 大鼠胫骨骨代谢通路OPG和 RANKL免疫组织化学检测 |
3.2.12 统计分析 |
3.3 结果 |
3.3.1 大鼠体重情况 |
3.3.2 大鼠膳食镉摄入情况 |
3.3.3 钙补充干预对大鼠肾皮质,肝脏和股骨镉浓度的影响 |
3.3.4 钙补充干预对大鼠股骨重量和骨钙含量的影响 |
3.3.5 钙补充干预对大鼠血清骨代谢生物标志物的影响 |
3.3.6 钙补充干预对大鼠股骨生物力学指标的影响 |
3.3.7 钙补充干预对大鼠胫骨病理学的影响 |
3.3.8 钙补充干预对大鼠血清骨代谢OPG/RANKL通路蛋白酶联免疫吸附检测结果的影响 |
3.3.9 钙补充干预对大鼠股骨OPG/RANKL通路基因表达实时荧光定量PCR检测结果的影响. |
3.3.10 钙补充干预对大鼠股骨OPG/RANKL通路蛋白酶联免疫吸附检测结果的影响 |
3.3.11 钙补充干预对大鼠胫骨OPG/RANKL通路蛋白免疫组化检测结果的影响 |
3.4 讨论 |
第四章 基于FGF23/Klotho轴探讨钙对镉致骨毒作用的保护机制研究 |
4.1 引言 |
4.2 材料与方法 |
4.2.1 试剂与仪器 |
4.2.2 实验动物及分组 |
4.2.3 实验方法及样本收集 |
4.2.4 血清1,25-(OH)2D3,Klotho蛋白,全段FGF23,C端 FCF23 蛋白酶联免疫吸附检测 |
4.2.5 肾组织Klotho基因、FGF受体基因、VD代谢基因及磷转运基因实时荧光定量PCR |
4.2.6 骨FGF23、Wnt/β-catenin信号通路、成骨细胞分化相关基因实时荧光定量PCR |
4.2.7 肾Klotho蛋白和胫骨FGF23、Wnt/β-catenin、成骨细胞增殖分化相关蛋白免疫组化检测 |
4.2.8 骨组织蛋白提取和骨组织Col1a1蛋白酶联免疫吸附检测 |
4.2.9 骨组织FGF23 蛋白免疫印迹法检测(Western blotting) |
4.2.10 统计分析 |
4.3 结果 |
4.3.1 钙补充干预对大鼠血清1,25-(OH)2D3的影响 |
4.3.2 钙补充干预对大鼠血清Klotho蛋白、全段FGF23 蛋白和C端 FGF23 蛋白的影响 |
4.3.3 钙补充干预对大鼠肾Klotho、FGF受体基因、VD代谢基因及磷转运基因表达的影响 |
4.3.4 钙补充干预对大鼠肾组织中Klotho蛋白表达酶联免疫吸附检测结果的影响 |
4.3.5 钙补充干预对大鼠肾组织中Klotho蛋白免疫组化检测结果的影响 |
4.3.6 钙补充干预对大鼠股骨FGF23基因与蛋白的影响 |
4.3.7 钙补充干预对大鼠股骨Wnt/β-catenin信号通路相关基因和蛋白的影响 |
4.3.8 钙补充干预对大鼠成骨细胞分化相关基因表达的影响 |
4.3.9 钙补充干预对大鼠成骨细胞分化相关蛋白的影响 |
4.4 讨论 |
第五章 全文总结 |
5.1 主要研究结论 |
5.2 主要创新点 |
5.3 研究不足 |
5.4 展望 |
参考文献 |
综述 镉毒性损害的营养干预研究进展 |
参考文献 |
作者简介 |
致谢 |
(10)牦牛骨胶原蛋白肽抗骨质疏松作用机制研究(论文提纲范文)
摘要 |
abstract |
第一章 引言 |
1.1 牦牛骨研究现状 |
1.1.1 牦牛骨结构及营养特性 |
1.1.2 牦牛骨利用现状 |
1.2 骨胶原蛋白研究现状 |
1.2.1 骨胶原蛋白提取 |
1.2.2 骨胶原蛋白肽制备 |
1.2.3 骨胶原蛋白肽生物活性 |
1.3 骨质疏松症研究进展 |
1.3.1 骨质疏松症分类 |
1.3.2 骨质疏松症治疗 |
1.3.3 骨质疏松症动物模型构建 |
1.3.4 骨代谢信号通路研究进展 |
1.3.5 代谢组学在骨质疏松症研究中的应用 |
1.4 本课题研究背景及内容 |
1.4.1 研究背景 |
1.4.2 研究目的和意义 |
1.4.3 研究内容 |
1.4.4 技术路线 |
第二章 牦牛骨胶原蛋白提取及结构鉴定 |
2.1 前言 |
2.2 材料与方法 |
2.2.1 试验材料与试剂 |
2.2.2 主要仪器设备 |
2.2.3 试验方法 |
2.2.4 数据分析方法 |
2.3 结果与讨论 |
2.3.1 牦牛骨基本成分分析 |
2.3.2 牦牛骨胶原蛋白紫外扫描分析 |
2.3.3 牦牛骨胶原蛋白热变性温度分析 |
2.3.4 牦牛骨胶原蛋白傅里叶变换红外光谱分析 |
2.3.5 牦牛骨胶原蛋白SDS-PAGE电泳分析 |
2.3.6 牦牛骨胶原蛋白微观结构分析 |
2.4 本章小结 |
第三章 牦牛骨胶原蛋白肽酶解工艺优化 |
3.1 前言 |
3.2 材料与方法 |
3.2.1 试验材料与试剂 |
3.2.2 主要仪器设备 |
3.2.3 试验方法 |
3.2.4 数据分析方法 |
3.3 结果与讨论 |
3.3.1 牦牛骨胶原蛋白酶解液水解度分析 |
3.3.2 牦牛骨胶原蛋白酶解液分子量分布分析 |
3.3.3 不同蛋白酶解液促成骨细胞增殖活性比较分析 |
3.3.4 牦牛骨胶原蛋白酶解工艺单因素试验分析 |
3.3.5 牦牛骨胶原蛋白酶解工艺响应面试验分析 |
3.4 本章小结 |
第四章 牦牛骨胶原蛋白肽分离纯化及生物活性研究 |
4.1 前言 |
4.2 材料与方法 |
4.2.1 试验材料与试剂 |
4.2.2 主要仪器设备 |
4.2.3 试验方法 |
4.2.4 数据分析方法 |
4.3 结果与讨论 |
4.3.1 牦牛骨胶原蛋白肽超滤及其组分的促成骨细胞增殖活性分析 |
4.3.2 牦牛骨胶原蛋白肽体积排阻分离及其组分的促成骨细胞增殖活性分析 |
4.3.3 牦牛骨胶原蛋白肽RP-HPLC分离及其组分的促成骨细胞增殖活性分析 |
4.3.4 牦牛骨胶原蛋白肽氨基酸测序及其促成骨细胞增殖活性分析 |
4.3.5 牦牛骨胶原蛋白肽潜在毒性和致敏性分析 |
4.4 本章小结 |
第五章 模拟胃肠道消化及CACO-2转运机制研究 |
5.1 前言 |
5.2 材料与方法 |
5.2.1 试验材料与试剂 |
5.2.2 主要仪器设备 |
5.2.3 试验方法 |
5.2.4 数据分析方法 |
5.3 结果与讨论 |
5.3.1 GP-12肽模拟胃肠道消化后组分鉴定及促成骨细胞增殖活性分析 |
5.3.2 Caco-2 细胞单层模型评价及GP-12 肽转运分析 |
5.3.3 GP-12肽吸收转运机制分析 |
5.4 本章小结 |
第六章 牦牛骨胶原蛋白肽促成骨细胞增殖分子机制研究 |
6.1 前言 |
6.2 材料与方法 |
6.2.1 试验材料与试剂 |
6.2.2 主要仪器设备 |
6.2.3 试验方法 |
6.2.4 数据分析方法 |
6.3 结果与讨论 |
6.3.1 成骨细胞形态学观察结果分析 |
6.3.2 细胞周期结果分析 |
6.3.3 荧光Quantitative real-time PCR结果分析 |
6.3.4 蛋白质免疫印迹Western blot结果分析 |
6.3.5 GP-12肽的分子对接结果研究 |
6.4 本章小结 |
7.1 前言 |
7.2 材料与方法 |
7.2.1 试验材料与试剂 |
7.2.2 主要仪器设备 |
7.2.3 试验方法 |
7.2.4 数据分析方法 |
7.3 结果与讨论 |
7.4 本章小结 |
第八章 牦牛骨胶原蛋白肽抗骨质疏松活性研究 |
8.1 前言 |
8.2 材料与方法 |
8.2.1 试验材料与试剂 |
8.2.2 主要仪器设备 |
8.2.3 试验方法 |
8.2.4 数据分析方法 |
8.3 结果与讨论 |
8.3.1 大鼠体重变化测定 |
8.3.2 大鼠骨转换生化标志物分析 |
8.3.3 大鼠骨生物力学指标分析 |
8.3.4 大鼠骨形态力学指标分析 |
8.4 本章小结 |
第九章 牦牛骨胶原蛋白肽抗骨质疏松活性代谢组学研究 |
9.1 前言 |
9.2 材料与方法 |
9.2.1 试验材料与试剂 |
9.2.2 主要仪器设备 |
9.2.3 试验方法 |
9.2.4 数据分析方法 |
9.3 结果与讨论 |
9.3.1 实验质控数据分析 |
9.3.2 牦牛骨胶原蛋白肽处理组大鼠血清代谢指纹图谱分析 |
9.3.3 PCA和 OPLS-DA数据分析 |
9.3.4 单变量统计分析 |
9.3.5 潜在生物标志物鉴定分析 |
9.3.6 潜在生物标志物生物信息学分析 |
9.4 本章小结 |
第十章 全文结论 |
10.1 结论 |
10.2 论文创新点 |
10.3 展望 |
参考文献 |
附录 |
致谢 |
作者简历 |
四、脂质及其代谢调节物在骨重构中的作用(论文参考文献)
- [1]艾灸治疗类风湿关节炎的网状Meta分析及其疗效机制的脂质组学实验研究[D]. 冷雨飞. 南京中医药大学, 2021(01)
- [2]血清ANGPTL8水平和初治2型糖尿病患者动脉粥样硬化的相关性研究[D]. 保吉燕. 兰州大学, 2021(12)
- [3]冠心病临床预后的脂质组学研究及脂质代谢紊乱的全基因组关联性研究[D]. 秦敏. 华南理工大学, 2020
- [4]SAK-HV诱导免疫反应的种属差异对降脂功效的影响及其分子机制研究[D]. 陈瑶. 军事科学院, 2020(02)
- [5]S-烯丙基巯基半胱氨酸(SAMC)在骨关节炎中的保护作用及机制研究[D]. 杨光. 山东大学, 2020(12)
- [6]MFAP4在心肌重构中的作用及其机制研究[D]. 王辉波. 武汉大学, 2020(03)
- [7]补肾中药调控ERα-AMPK-Wnt/β-catenin信号通路促进成骨细胞增殖、分化的研究[D]. 陈庆真. 广州中医药大学, 2020(06)
- [8]基于阴/阳虚证的原发性骨质疏松症临床代谢组学研究[D]. 朱庭辰. 南京中医药大学, 2020(08)
- [9]钙补充拮抗膳食镉暴露致骨毒作用的研究[D]. 黄晓. 东南大学, 2019(01)
- [10]牦牛骨胶原蛋白肽抗骨质疏松作用机制研究[D]. 叶孟亮. 中国农业科学院, 2019