腺相关病毒及其变体DHFR和GFP重组载体的构建及其在NIH3T3细胞中的表达

腺相关病毒及其变体DHFR和GFP重组载体的构建及其在NIH3T3细胞中的表达

一、腺相关病毒与变异体DHFR和GFP重组载体的构建及其在NIH3T3细胞中的表达(论文文献综述)

周超颖[1](2016)在《MTB Ag85B199-207和HIV-1 Env120-128双特异TCR基因修饰CD8+ T细胞及其活性研究》文中研究说明结核病和人类免疫缺陷病毒1型(human immunodeficiency virus type 1,HIV-1)感染是全球最致命的慢性感染疾病。结核是HIV感染者发病率和死亡率升高的主要原因,也更容易在HIV感染人群中进行播散。据WHO统计报告,2013年全球新增结核病人900万,其中110万(13%)共感染HIV;全球结核死亡人数150万,其中1/4为合并感染HIV致死。在宿主中,结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis, MTB)和HIV彼此加强相互作用,加快免疫功能的弱化或丧失。结核潜伏感染者,一旦再感染HIV,会加速破坏机体免疫系统,主要使CD4+T淋巴细胞的功能下降和数量减少,激活原本受抑制的MTB,使之更容易发展成活动性结核。同时,MTB通过刺激单核细胞和巨噬细胞大量分泌单核细胞趋化蛋白1 (monocyte chemoattractant protein-1, MCP-1)促进HIV的转录,加速病毒增殖,促使病情恶化。目前,MTB/HIV双重感染者的治疗主要是异烟肼预防治疗与抗逆转录病毒治疗的结合,其疗程长,多种药物相互作用,药物重叠的毒副作用大,易产生耐药性,病人服药依从性差,对这两种疾病同时有效的药物稀缺,整合异烟肼预防治疗与抗逆转录病毒治疗存在时间和药物选择的巨大挑战,以及出现免疫重建炎症综合症等问题。因此,亟需开发针对MTB/HIV共感染行之有效的治疗方法。抗MTB/HIV共感染的主要免疫机制是以T细胞介导的细胞免疫为主。已有大量实验证据表明,抗原特异性CD8+T细胞在控制MTB和HIV感染中发挥着至关重要的作用。效应CD8+T细胞通过以下两种途径来发挥作用:1)发挥细胞毒作用,通过穿孔素和颗粒酶B (granzyme B, GrB)途径直接杀伤感染靶细胞;2)释放Thl型细胞因子,如干扰素-γ (interferon-γ, IFN-γ)、肿瘤坏死因子-a (tumor necrosis factor-a, TNF-a),抑制病原体复制,促进巨噬细胞清除胞内病原体。然而,在MTB/HIV共感染者体内,其免疫功能明显紊乱,表现为T细胞增殖反应下降,效应CD8+T细胞数量和反应水平均很低,白细胞介素-2(interleukin-2, IL-2)和IFN-γ产生显着减少。因此,通过过继转移大量效应CD8+T细胞至MTB/HIV共感染者体内,可增强其抗MTB/HIV感染的能力。过继细胞免疫治疗已在抗MTB和HIV感染中显示了巨大潜力。Kitsukawa等利用灭活的结核菌体外致敏PBL,将其回输给多药耐药肺结核患者,取得良好疗效。Lieberman等将患者自体HIV特异性CD8+细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL)过继回输治疗6例HIV感染者,最初2周所有患者CD4计数增加,5名患者血浆病毒血症减少。24周后,2名患者的HIV病毒负载继续减少,另1名患者CD4计数增加超过2倍。尽管过继细胞免疫治疗展现出光明的前景,但这种方法的广泛应用却存在许多障碍。首先,我们很难从处于疾病进展期的患者体内分离出效应T细胞,因为此时CTL反应是不断消耗的;接受长期治疗的个体也是如此,因为随着病原体负载减少,针对病原体的CTL反应也减少。另外,从患者体内分离出的T细胞往往是已最终分化的,很难扩增。即使可以扩增,回输患者体内后其存活时间也很短。而通过抗原特异T细胞受体(T cell receptor, TCR)基因修饰初始T细胞,人为赋予普通T细胞识别特异抗原的能力,短期内获得大量效应T细胞,则可有效解决这一问题。我们已经利用结核分枝杆菌38KDa抗原体外刺激正常人外周血CD4+和CD8+T细胞,获得38KDa抗原特异TCR,转导初始T细胞,修饰的T细胞具有显着的体外抗结核抗原活性。HIV-1 gag特异性TCR基因修饰CD8+T细胞的体外和体内活性也有报道。但是,用MTB和HIV-1抗原双特异的TCR对T细胞进行基因修饰尚未见报道。有研究者提出,在人初始T细胞池中,不同特异性的TCR种类<108,而潜在外源肽>1015,因此,TCR的数量与大量潜在的外源肽-MHC复合物相比,是相形见绌的。适应性T细胞免疫要求每个T细胞都能识别大量与细胞异常相关的潜在抗原肽,这种现象可以由T细胞的交叉反应性来解释。最近报道的从I型糖尿病患者分离的1E6 TCR具有非常大的交叉反应性。表达1E6 TCR的T细胞除了识别前胰岛素原来源的HLA-A*0201限制性PPI15-24肽(ALWGPDPAAA)以外,还至少对130万个十肽产生反应,反应强度与PPI15-24一样强烈。在这些大量肽中,活化表达1E6 TCR的T细胞时,RQFGPDFPTI比PPI15-24的活性强100倍以上,尽管它与PPI15-24在组成上有七个氨基酸不一致。因此,我们完全有理由相信可以找到一个单一TCR同时识别两种抗原肽。本文首次提出通过转导一个TCR同时产生针对两种不相似病原体抗原肽的活性反应,为MTB/HIV共感染患者的免疫治疗提供新的思路。利用分别负载MTB肽Ag85B199-207 (KLVANNTRL)和HIV-1肽Env120-128 (KLTPLCVTL)的树突状细胞(dendritic cell, DC)反复刺激HLA-A*0201型健康人外周血CD8+T细胞,通过互补决定区3 (complementarity determining region 3, CDR3)谱型分析,筛选出同时对Ag85B 199-207和Env120-128特异的单一TCR,通过逆转录病毒载体将双特异TCR基因转导至普通CD8+T细胞中使其表达。研究结果显示,双特异TCR基因修饰的CD8+T细胞既可针对Ag85B199-207产生高水平的IFN-γ、 TNF-α和GrB分泌及特异性杀伤,同时也可针对Env120-128产生显着的效应反应。本研究为MTB/HIV共感染过继细胞免疫治疗奠定了基础,同时也为其他共感染疾病的免疫治疗研究提供了模式和平台。方法1.筛选Ag85B199-207和Env120-128双特异TCR1)采用淋巴细胞分离液分离HLA-A*0201型健康志愿者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC);2) PBMC贴壁培养2h后,吸出悬浮细胞,往贴壁细胞中加入100ng/mL重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(recombinant human granulocyte macrophage colony-stimulating factor, rhGM-CSF)和100 ng/mL重组人白细胞介素-4 (recombinant human interleukin-4, rhIL-4)诱导DC;3)MTB肽Ag85B199-207 (50 μg/mL)和HIV-1肽Env120-128 (50μg/mL)分别冲击致敏DC;4)利用分别负载Ag85B199-207和Env120-128抗原肽的DC诱导抗原特异T细胞发生克隆扩增;5)经过两轮刺激后,磁珠分选CD8+T细胞,提取mRNA,逆转录为cDNA;6)CDR3谱型分析检测刺激前后CDR3谱型,找出刺激后均呈单克隆增生的Ag85B199-207和Env120-128双特异的TCRα、β基因家族。2.重组逆转录病毒载体构建与病毒滴度测定1)根据NCBI网站GeneBank报道的人TCR α、β基因家族上游可变区(variable region, V)和下游恒定区(constant region, C)基因序列,设计TCR α和β链全长基因上、下游引物,扩增出Ag85B199-207和Env120-128双特异的α17和p15基因;2)根据文献报道的影响外源TCR基因表达和功能的C区9个关键氨基酸序列,分别设计α和β链C区突变位点上、下游引物,利用重组PCR方法将TCRα、β链C区9个关键氨基酸进行替换;3)利用重组PCR技术,将TCRα和p基因通过自剪切多肽P2A连接,测序鉴定正确后插入逆转录病毒载体pMX-IRES-GFP,酶切鉴定;4)采用脂质体转染法,将重组逆转录病毒表达载体pMX-β 15-P2A-α 17-IRES-GFP与包膜蛋白质粒VSV-G共转染GP2-293包装细胞;5)收集转染后48 h病毒上清,低温超速离心浓缩纯化重组病毒,分装后保存于-80℃;6)重组病毒感染NIH3T3细胞,流式细胞术检测其感染性滴度,计算公式:病毒感染性滴度(GFU/mL)=NIH3T3细胞数×GFP阳性率/病毒浓缩液量(mL)。3.TCR基因修饰CD8+T细胞1)采用Ficoll密度梯度离心法,分离HLA-A*0201型健康人外周血PBMC;2)磁珠分选CD8+T细胞;3)联合使用抗CD3 (1μg/mL)、抗CD28 (1μg/mL)单抗和IL-2 (100U/mL)活化刺激分选出的CD8+T细胞;4)以最佳感染复数(multiplicity of infection, MOI),,即MOI=13将重组逆转录病毒pMX-β15-P2A-α17-IRES-GFP感染CD8+T细胞;5)IL-2刺激感染后的CD8+T细胞;6)流式细胞术检测病毒感染后CD8+T细胞的GFP表达阳性率;7)流式细胞术检测病毒感染后CD8+T细胞的MHC dextramer阳性率;8)实时荧光定量PCR (real-time quantitative PCR, qRT-PCR)检测病毒感染后CD8+T细胞的β15-P2A-α17的基因水平。4.TCR基因修饰CD8+T细胞针对外源性抗原的活性测定按已摸索好的效靶比(effector:target, E:T),将TCR基因修饰CD8+T细胞与负载MTB肽Ag85B199-207或H1V-1肽Env120-128的DC共培养。实验组设置如下:① Vector plus TCR+DC:TCR基因修饰CD8+T细胞+未负载抗原肽的DC; ②NV+DC-MTB:未转染CD8+T细胞+负载MTB肽Ag85B199-207的DC;③NV+DC-HW:未转染CD8+T细胞+负载HIV-1肽Env120-128的DC;④Vector+DC-MTB:空载体转染CD8+T细胞+负载MTB肽Ag85B199-207的DC;⑤ Vector+DC-HIV:空载体转染CD8+T细胞+负载HIV-1肽Envi20-128的DC;⑥ Vector plus TCR+DC-CMV:TCR基因修饰CD8+T细胞+负载CMV肽pp65495-503的DC; ⑦ Vector plus TCR+DC-MTB:TCR基因修饰CD8+T细胞+负载MTB肽Ag85B199-207的DC; ⑧ Vector plus TCR+DC-HIV:TCR基因修饰CD8+T细胞+负载HIV-1肽Env120-128的DC。利用酶联免疫吸附分析法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)检测CD8+T细胞培养上清中IFN-γ、TNF-α、GrB的分泌水平;利用时间分辨荧光免疫分析技术(time-resolved fluoroimmuno assay, TRFIA)检测CD8+T细胞对负载抗原肽DC的杀伤活性;利用ELISA检测TCR基因修饰CD8+T细胞IFN-γ分泌的剂量效应;利用胞内细胞因子染色法(intracellular cytokine staining, ICS)检测TCR基因修饰CD8+T细胞的IFN-γ分泌。5.TCR基因修饰CD8+T细胞针对内源性抗原的活性测定按已摸索好的E:T,将TCR基因修饰CD8+T细胞与转染pV1J.ns-tPA-Ag85B质粒、pCAGGS-Env质粒或pCI-OVA质粒的DC共培养。实验组设置如下:①Vector plus TCR+DC:TCR基因修饰CD8+T细胞+未负载抗原的DC;②NV+DC-MTB:未转染CD8+T细胞+转染pV1J.ns-tPA-Ag85B质粒的DC;③NV+DC-Env:未转染CD8+T细胞+转染pCAGGS-Env质粒的DC;④Vector+DC-MTB:空载体转染CD8+T细胞+转染pV1J.ns-tPA-Ag85B质粒的DC;⑤ Vector+DC-Env:空载体转染CD8+T细胞+转染pCAGGS-Env质粒的DC;⑥ Vector plus TCR+DC-OVA:TCR基因修饰CD8+T细胞+转染pCI-OVA质粒的DC; ⑦ Vector plus TCR+DC-MTB:TCR基因修饰CD8+T细胞+转染pV1J.ns-tPA-Ag85B质粒的DC; ⑧ Vector plus TCR+DC-Env:TCR基因修饰CD8+T细胞+转染pCAGGS-Env质粒的DC。利用ELISA检测CD8+T细胞培养上清中IFN-γ、TNF-α、 GrB的分泌水平;利用TRFIA检测CD8+T细胞对负载抗原DC的杀伤活性。6.TCR基因修饰J.RT3-T3.5细胞的CD69表达水平测定接种不表达TCR的Jurkat T细胞系J.RT3-T3.5细胞,按MOI为0、1、5、10、20、50分别加入重组逆转录病毒浓缩液,测定最适MOI值。按最适MOI值加入病毒感染J.RT3-T3.5细胞,与负载不同浓度(0、0.01、0.1、1、10μg/mL)的MTB肽Ag85B199-207或HIV-1肽Env120-128的T2细胞共培养,标记APC-CD69抗体,流式细胞术检测J.RT3-T3.5细胞的CD69表达。7.统计学分析采用Windows SPSS 17.0统计软件包进行数据分析。所有计量资料用平均值±标准差(x±s)表示;采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)比较CD8+T细胞的细胞因子分泌水平和杀伤水平,方差不齐时采用Welch进行校正;多重比较方差齐时用LSD法,方差不齐时用Dunnett T3法。检验水准a=0.05,双侧检验。结果1.分析抗原肽刺激前后CDR3谱型,筛选出MTB肽Ag85B199-207和HIV-1肽Env120-128双特异TCR通过对CDR3谱型进行分析发现,抗原肽刺激前健康志愿者外周血T细胞各TCR Vα (α chain variable gene)、Vβ (β chain variable gene)基因家族CDR3谱型均呈8个或8个以上峰型的高斯分布,表现为多克隆性。而抗原肽刺激后,部分TCR基因家族的CDR3谱型发生改变,呈偏态分布甚至单峰分布,表明这些家族是因为抗原肽的持续刺激而引起的寡克隆或单克隆增生。通过比较刺激前、后的CDR3谱型,我们在CD8+T细胞中找到了刺激前为多克隆,刺激后呈单克隆扩增,针对MTB肽Ag85B199-207和HIV-1肽Env120-128都特异的Vα17和Vβ15基因家族。2.构建重组逆转录病毒表达载体成功扩增出MTB肽Ag85B199-207和HIV-1肽Env120-128双特异的α17和β15全长基因片段,将其克隆至pGEM-T载体后测序鉴定,其V、C区DNA序列与GeneBank报道的序列完全一致。利用重组PCR技术,将人Cα、Cβ区9个关键位点的氨基酸替换为鼠C区相应位点氨基酸,扩增出hVβ15mCβ-P2A-hVα17mCα融合基因,将其插入pMX-IRES-GFP载体,构建重组逆转录病毒表达质粒pMX-hVβ5mCβ-P2 A-hVα17mCα-IRES-GFP,酶切鉴定证实基因片段插入正确。将上述表达质粒与包膜蛋白质粒VSV-G共转染包装细胞GP2-293,收集48 h病毒上清,经低温超速离心浓缩纯化后感染NIH3T3细胞,流式细胞术检测NIH3T3细胞GFP表达阳性率,经计算,重组病毒滴度为1.08×l08GFU/mL。3.TCR基因修饰CD8+T细胞按MOI=13,将重组逆转录病毒颗粒感染CD8+T细胞,感染5天后,在倒置荧光显微镜下观察GFP的表达,利用流式细胞术检测CD8+T细胞的dextramer阳性率。结果显示,在荧光显微镜下可观察到明显的绿色荧光,TCR基因修饰CD8+T细胞的MTB dextramer和HIV-1 dextramer双阳性率约为10%。收集感染5天后的CD8+T细胞,提取RNA,并逆转录为cDNA, qRT-PCR检测TCR基因修饰CD8+T细胞的β15-P2A-a17的基因表达水平,结果显示,TCR载体转染组β15-P2A-α17的基因水平显着高于未转染组和空载体转染组。4.TCR基因修饰CD8+T细胞针对外源性抗原的活性检测1)TCR基因修饰CD8+T细胞的IFN-y分泌水平按E:T=7,将TCR基因修饰CD8+T细胞和负载MTB肽Ag85B199-207、HIV-1肽Env120-128、CMV肽pp65495-503的DC或未负载抗原肽的DC混合培养18 h,ELISA检测细胞培养上清中IFN-y的分泌水平。结果显示,负载MTB肽组(Vector plus TCR+DC-MTB组)和负载HIV-1肽组(Vector plus TCR+DC-HIV组)的IFN-y分泌水平组间差异均具有统计学意义(F值和P值分别为F=50668.981,P=0.000;F=4097.071,P=0.000)。各组间两两比较结果显示,Vector plus TCR+DC-MTB组(598.530 ± 3.621 pg/mL)和Vector plus TCR+DC-HIV组(323.584 ± 6.870 pg/mL)的IFN-y分泌水平分别显着高于各自的四个对照组(P值均<0.001)。2)TCR基因修饰CD8+T细胞的TNF-α分泌水平按E:T=20,将TCR基因修饰CD8+T细胞和负载MTB肽Ag85B199-207、HIV-1肽CMV肽pp65495-503的DC或未负载抗原肽的DC混合培养24 h,ELISA检测细胞培养上清中TNF-α的分泌水平。结果显示,负载MTB肽组(Vector plus TCR+DC-MTB组)和负载HIV-1肽组(Vector plus TCR+DC-HIV组)的TNF-a分泌水平组间差异均具有统计学意义(F值和P值分别为F=2173.051, P=0.000; F=393.708, P=0.000)。各组间两两比较结果显示,Vector plus TCR+DC-MTB组(566.531±19.548 pg/mL)和Vector plus TCR+DC-HIV组(354.622 ± 28.604 pg/mL)的TNF-a分泌水平分别显着高于各自的四个对照组(P值均<0.01)。3)TCR基因修饰CD8+T细胞的GrB分泌水平按E:T=20,将TCR基因修饰CD8+T细胞和负载MTB肽Ag85B199-207、HIV-1肽Env120-128、CMV肽pp65495-503的DC或未负载抗原肽的DC混合培养24 h,ELISA检测细胞培养上清中GrB的分泌水平。结果显示,负载MTB肽组(Vector plus TCR+DC-MTB组)和负载HIV-1肽组(Vector plus TCR+DC-HIV组)的GrB分泌水平组间差异均具有统计学意义(F值和P值分别为F=2757.830,P=0.000; F=3601.843,P=0.000)。各组间两两比较结果显示,Vector plus TCR+DC-MTB组(413.818 ± 12.507 pg/mL)和Vector plus TCR+DC-HIV组(375.823 ± 9.654 pg/mL)的GrB分泌水平分别显着高于各自的四个对照组(P值均<0.01)。4)TCR基因修饰CD8+T细胞的杀伤效应按E:T=30,将TCR基因修饰CD8+T细胞和负载MTB肽Ag85B199-207、HIV-1肽Env120-128、CMV肽pp65495-503的DC或未负载抗原肽的DC混合培养4 h,TRFIA检测TCR基因修饰CD8+T细胞对负载抗原肽DC的杀伤活性。结果显示,负载MTB肽组(Vector plus TCR+DC-MTB组)和负载HIV-1肽组(Vector plus TCR+DC-HIV组)的杀伤水平组间差异均具有统计学意义(F值和P值分别为F=1708.411, P=0.000; F=114.198,P=0.000)。各组间两两比较结果显示,Vector plus TCR+DC-MTB组(31.107±1.140%)和Vector plus TCR+DC-HIV组(21.280±2.862%)的杀伤水平分别显着高于各自的四个对照组(P值均<0.05)。5)TCR基因修饰CD8+T细胞IFN-y分泌的剂量效应按E:T=7,将TCR基因修饰CD8+T细胞和负载不同浓度的MTB肽Ag85B 199-207或HIV--1肽Env120-128的DC共培养18 h, ELISA检测细胞培养上清中IFN-γ的分泌水平。结果显示,TCR载体转染组的IFN-γ分泌水平在MTB肽或HIV-1肽浓度为0.01 μg/mL时即可检测得到,并且随MTB肽或HIV-1肽浓度的增加而升高,呈现出明显的剂量效应;而未转染组和空载体转染组在每一个肽浓度均没有检测到显着的IFN-γ分泌。6)ICS检测TCR基因修饰CD8+T细胞的IFN-γ分泌将TCR基因修饰CD8+T细胞与负载MTB肽Ag85B199-207、HIV-1肽Env120-128或CMV肽pp65495-503的DC共培养,利用ICS检测CD8+T细胞的胞内IFN-γ分泌。结果显示,在TCR载体转染组中,通过DC递呈MTB肽Ag85B199-207后,超过5%的TCR基因修饰CD8+T细胞为CD8和IFN-γ双阳性;通过DC递呈HIV-1肽Env120-128后,超过2%的TCR基因修饰CD8+T细胞共表达CD8和IFN-γ;通过DC递呈无关肽CMV pp65495-503后,只有很低水平的双阳性CD8+T细胞可检测到;而在未转染组和空载体转染组中,双阳性CD8+T细胞的水平均很低。5.TCR基因修饰CD8+T细胞针对内源性抗原的活性检测1)TCR基因修饰CD8+T细胞针对内源性抗原的IFN-γ分泌按E:T=7,将TCR基因修饰CD8+T细胞和转染pV1J.ns-tPA-Ag85B质粒、pCAGGS-Env质粒或pCI-OVA质粒的DC共培养18 h,ELISA检测细胞培养上清中IFN-γ的分泌水平。结果显示,转染pV1J.ns-tPA-Ag85B质粒组(Vector plus TCR+DC-MTB组)和转染pCAGGS-Env质粒组(Vector plus TCR+DC-Env组)的IFN-γ分泌水平组间差异均具有统计学意义(F值和P值分别为F=1545.061,P=0.000; F=1611.016, P=0.000)。各组间两两比较结果显示,Vector plus TCR+DC-MTB组(338.280 ± 13.919 pg/mL)和Vector plus TCR+DC-Env组(236.875 ± 7.979 pg/mL)的IFN-γ分泌水平分别显着高于各自的四个对照组(P值均<0.001)。2)TCR基因修饰CD8+T细胞针对内源性抗原的TNF-a分泌按E:T=20,将TCR基因修饰CD8+T细胞和转染pV1J.ns-tPA-Ag85B质粒、pCAGGS-Env质粒或pCI-OVA质粒的DC共培养24 h, ELISA检测细胞培养上清中TNF-a的分泌水平。结果显示,转染pViJ.ns-tPA-Ag85B质粒组(Vector plus TCR+DC-MTB组)和转染pCAGGS-Env质粒组(Vector plus TCR+DC-Env组)的TNF-α分泌水平组间差异均具有统计学意义(F值和P值分别为F=1648.189,P=0.000; F=341.302, P=0.000)。各组间两两比较结果显示,Vector plus TCR+DC-MTB组(307.088 ± 6.695 pg/mL)和Vector plus TCR+DC-Env组(187.847±11.278 pg/mL)的TNF-α分泌水平分别显着高于各自的四个对照组(P值均<0.001)。3)TCR基因修饰CD8+T细胞针对内源性抗原的GrB分泌按E:T=20,将TCR基因修饰CD8+T细胞和转染pV1J.ns-tPA-Ag85B质粒、pCAGGS-Env质粒或pCI-OVA质粒的DC共培养24 h, ELISA检测细胞培养上清中GrB的分泌水平。结果显示,转染pV1J.ns-tPA-Ag85B质粒组(Vector plus TCR+DC-MTB组)和转染pCAGGS-Env质粒组(Vector plus TCR+DC-Env组)的GrB分泌水平组间差异均具有统计学意义(F值和P值分别为F=99.449,P=0.000;F=149.589,P=0.000)。各组间两两比较结果显示,Vector plus TCR+DC-MTB组(289.289 ± 53.946 pg/mL)和Vector plus TCR+DC-Env组(263.086 ± 39.756 pg/mL)的GrB分泌水平分别显着高于各自的四个对照组(P值均<0.05)。4)TCR基因修饰CD8+T细胞针对内源性抗原的杀伤效应按E:T=30,将TCR基因修饰CD8+T细胞和转染pV1J.ns-tPA-Ag85B质粒、pCAGGS-Env质粒或pCI-OVA质粒的DC共培养4h, TRFIA检测TCR基因修饰CD8+T细胞对负载抗原的DC的杀伤活性。结果显示,转染pV1J.ns-tPA-Ag85B质粒组(Vector plus TCR+DC-MTB组)和转染pCAGGS-Env质粒组(Vector plus TCR+DC-Env组)的杀伤水平组间差异均具有统计学意义(F值和P值分别为F=803.014, P=0.000; F=235.995, P=0.000)。各组间两两比较结果显示,Vector plus TCR+DC-MTB组 (25.663 ± 0.655%)和Vector plus TCR+DC-Env组(15.054±0.696%)的杀伤水平分别显着高于各自的四个对照组(P值均<0.001)。6.TCR基因修饰J.RT3-T3.5细胞的CD69表达水平测定按不同MOI值,将重组逆转录病毒颗粒感染J.RT3-T3.5细胞,流式细胞术结果显示,MOI=5时,J.RT3-T3.5细胞的GFP阳性率最高,在感染后第3天达52.7%。将TCR基因修饰的J.RT3-T3.5细胞与负载不同浓度的MTB肽Ag85B199-207或HIV-1肽Env120-128的T2细胞共培养,流式细胞术检测J.RT3-T3.5细胞CD69的表达。结果显示,通过对GFP阳性的细胞群进行分析,在TCR载体转染组中,J.RT3-T3.5细胞对MTB肽和HIV-1肽均有反应,其早期活化标志CD69的表达在肽浓度为0.01 μg/mL时即有明显升高,且随着肽浓度的增加而增加,表现出明显的剂量效应;但在空载体转染组中,J.RT3-T3.5细胞对每一个浓度的MTB肽和HIV-1肽均没有明显反应,其CD69表达均没有明显升高。结论本研究利用分别负载MTB肽Ag85B199-207和HIV-1肽Env120-128的DC反复刺激HLA-A*0201型健康志愿者外周血CD8+T细胞,通过CDR3谱型分析,获得针对这两种抗原肽共同特异的单个TCR。通过逆转录病毒载体pMX-IRES-GFP介导,将该双特异TCR转导至初始CD8+T细胞,人为赋予其识别特异性抗原的能力。由于外源性TCRα、β链可能与内源性TCRα、β链发生错配,因此,为了减少错配机率,同时增加外源性TCR的表达和功能,我们对双特异TCR进行最小突变,即将人C区9个关键位点氨基酸替换为鼠C区相应位点氨基酸。我们将最小突变的双特异TCR基因转导自体CD8+T细胞并检测其活性,结果表明该TCR基因修饰的CD8+T细胞具有双特异性,既可针对MTB肽Ag85B199-207产生高水平的IFN-γ、TNF-α、GrB分泌及杀伤活性,又可针对HIV-1肽Env120-128产生显着的效应反应。本研究首次提出通过转导一个TCR同时产生针对两种不相似病原体抗原肽的活性反应,为MTB/HIV共感染过继细胞免疫治疗提供了新的思路,同时也为其他共感染疾病的免疫治疗研究提供了模式和平台。

解珺丹[2](2014)在《白血病新融合基因PAX5-UBE2D4的克隆及功能研究》文中指出目的:1.检测65例初诊急性B淋巴细胞白血病及19例染色体核型分析为9p13异常患者中PAX5基因重排的发生率,并分析其临床特点及实验室特征。2.从一例伴dic(7;9)(p11-13;p13)的混合表型急性白血病的研究入手,定位克隆PAX5的新对手基因及融合基因,并对其新融合基因进行初步功能研究,以深化我们对PAX5相关融合基因致白血病发生、发展机制的认识。3.分析BCR/ABL1阳性急性白血病中BTG1基因缺失的发生情况,阐述伴有BTG1基因缺失的BCR/ABL1阳性急性白血病的临床及实验室特征,初步探讨BTG1缺失与BCR/ABL1阳性急性白血病的发病及复发的相关性。方法:1.通过R显带技术对84例患者骨髓标本进行核型分析,并选用位于9p13PAX5基因两端的RP11-344B23和RP11-652D9克隆,常规抽提DNA,采用缺口平移法标记荧光素,应用荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)对65例B-ALL及19例伴有abn(9p)异常的患者进行PAX5基因重排或缺失筛选,并分析其临床及实验室特征。2.收集7例伴有dic(7;9)的患者骨髓标本,其中4例应用DNA抽提试剂盒(Invitrogen公司生产)抽提基因组DNA,各自送检至少1.5ug DNA于上海伯豪生物技术有限公司,选用安捷伦人类比较基因组芯片(Agligent Technologies,SantaClara,CA,USA,244K)对4例患者进行Array-CGH技术检测,同时应用送检公司所提供的软件(Agilent Genomic Workbench Lite Edition6.5software)进行数据与图像的分析,明确7号和9号染色体的重排情况;利用RT-PCR验证易位中PAX5新对手基因(位于7p13的UBE2D4基因);设计引物并利用KOD高保真酶扩增出PAX5-UBE2D4融合基因全长,根据后续功能研究的需要分别将PAX5-UBE2D4及BCR/ABL两个融合基因全长克隆到慢病毒载体LV5。采用慢病毒包装体系包装PAX5-UBE2D4及BCR/ABL病毒,并用病毒侵染NIH-3T3细胞及小鼠原B细胞BaF3细胞株,成功构建过表达PAX5-UBE2D4、BCR/ABL、PAX5-UBE2D4+BCR/ABL三种稳转细胞株,通过Western Blot验证蛋白表达情况,绘制生长曲线、甲基纤维素集落形成实验、实时定量PCR等情况观察这些对NIH-3T3及BaF3细胞的恶性转化能力。3.收集2001-2013年期间在苏州大学附属第一医院住院诊断和治疗的BCR/ABL1阳性急性白血病44例,选用安捷伦人类比较基因组芯片对22例患者进行Array-CGH技术检测,并对这44例患者的骨髓标本mRNA,利用RT-PCR精确定位BTG1基因缺失位点,并总结BTG1缺失组患者的临床及实验室特征,分析其与发病机制及复发的相关性。结果:1.伴随9p13/PAX5重排患者的临床及实验室特征65例B-ALL及19例9p13异常患者中PAX5基因缺失的有20例(23.8%),PAX5基因易位的有2例(2.4%),PAX5基因扩增1例(1.2%),总的异常率为27.4%(23/84)。伴有t(9;22)的PAX5基因重排阳性率高于不伴有t(9;22)的PAX5基因重排率,PAX5基因重排在不同性别、年龄及不同白细胞、血红蛋白及血小板水平,差异均无统计学差异(P值均>0.05)。2.PAX5-UBE2D4融合基因的克隆及功能研究应用FISH技术、比较基因组杂交芯片、RT-PCR和基因测序技术对其中1例患者白血病细胞dic(7;9)(p11-13;p13)的断裂点进行精确定位,克隆到一个新的累及PAX5和泛素结合酶UBE2D4的融合基因,PAX5-UBE2D4。该融合基因由PAX5的1-7号外显子和UBE2D4的2-7号外显子融合而成,且UBE2D4基因的开放阅读框出现移码后提前终止。通过分子克隆及细胞培养技术,利用携带PAX5-UBE2D4及BCR/ABL慢病毒载体的质粒转染NIH-3T3细胞及BaF3细胞,对其生物学特性进行检测后发现,PAX5-UBE2D4能促进细胞的生长,且能在甲基纤维素半固体培养基形成集落,同时PAX5-UBE2D4可使BaF3细胞减少对IL-3的依赖。Western Blot结果显示,PAX5-UBE2D4融合蛋白主要表达在细胞核,在细胞浆可少量表达,融合蛋白大小约55KDa。通过定量PCR检测PAX5的表达,感染组细胞均表现为PAX5高表达。3.BTG1基因缺失在Ph阳性急性白血病中的发生率及作用在44例初治的BCR/ABL1阳性急性白血病中,共有14例患者出现BTG1缺失(14/39,31.8%),包括10例BCR/ABL1阳性的急性B淋巴细胞白血病(10/32,31.3%),2例混合表型急性白血病(2/6,33.3%),2例慢性粒细胞白血病急变期(2/6,100%)。在此研究中,共精确定位5种BTG1缺失断裂位点,从第284个至第304个碱基,横跨20个碱基对,形成截短型BTG1转录本。在BTG1缺失型及野生型患者相比较,两组在外周血WBC计数、Hb水平、PLT计数、骨髓原始细胞比例、性别、年龄及化疗的总体缓解率方面的差异均无统计学意义。结论:1.本实验通过对急性B淋巴细胞白血病中PAX5基因异常进行FISH筛选,发现PAX5基因异常是急性B淋巴细胞白血病中最常见的一类遗传学异常,还可见于AML-M2,同时常伴随常见的再现性遗传学异常,如t(9;22)(q34;q11),在B细胞的发育分化及增殖过程起协同作用,诱发B-ALL的发生发展。2.发现一种累及PAX5基因的新获得性染色体易位:dic(7;9)(p11-13;p13)。该易位基因组水平的断裂点分别位于PAX5第7内含子及UBE2D4第1内含子之间。与野生型PAX5蛋白一样,PAX5-UBE2D4的融合蛋白位于细胞核内,对PAX5的转录活性可能有一定影响,PAX5-UBE2D4融合蛋白能使BaF3细胞获得增殖优势,协同表达的BCR/ABL蛋白可抑制细胞的粘附和凋亡,促使细胞不依赖于细胞生长因子而过度增殖。3.BTG1基因缺失在BCR/ABL1阳性急性白血病中的发生率可达33.3%,高于国外报道,本研究首次发现在MPAL及CML-BC(B系)中也存在BTG1基因缺失。BTG1基因缺失可能在BCR/ABL1阳性急性白血病的发病及复发过程中扮演一个很重要的角色。

范良生[3](2012)在《靶向VEGFR-3的多肽TMTP2在恶性肿瘤靶向治疗中的应用研究》文中研究指明研究背景与目的近年来,VEGF-C/VEGFR-3信号通路在多项研究中被证实介导实体瘤周及瘤内新生淋巴管生成过程中起重要的作用,该信号通路是肿瘤淋巴管生成的关键环节,同时对肿瘤细胞的移动、浸润以及转移也起到了非常重要的作用。大量的临床病理研究表明肿瘤细胞中VEGF-C或VEGF-D的表达与多种肿瘤的转移直接相关。最近有研究表明,在小鼠黑色素瘤模型中利用重组腺相关病毒的基因治疗方法表达可溶性VEGFR-3可阻断淋巴结的转移。这些研究结果提示,阻断VEGFR-3信号通路能有效抑制淋巴结转移,也有可能降低远处器官转移的发生率。所以,基于该通路在肿瘤转移以及淋巴管生成过程的重要性,阻断该信号途径的相关研究有望成为抗肿瘤淋巴转移治疗新的有效手段。在前期的研究中应用新型细菌鞭毛展示随机肽库技术对重组活性蛋白VEGFR-3的胞外区进行筛选,经体外验证测序获得一段5肽序列,命名为"TMTP2";本研究拟选择肿瘤淋巴管及淋巴管生成为研究靶点,通过建立体内外淋巴管生成及肿瘤相关模型来探讨验证TMTP2与淋巴管内皮细胞的靶向识别效应,以及对淋巴管生成及肿瘤转移的靶向阻遏效应;旨在为多肽载体的应用带来新的理论依据和实践经验,如能进而利用该多肽载体携带化疗药物进行靶向肿瘤淋巴管生成与转移的治疗,则有望提供一个早期诊断转移和控制肿瘤转移和复发的多肽药物,为肿瘤的分子治疗带来新的契机和希望。方法通过体外三维培养的方法建立淋巴管体外成管模型,再通过相关的软件分析体外形成的管样结构进行分析;在C57BL/6小鼠角膜微袋中移植TC-1细胞相应肿瘤,通过HE染色及免疫荧光的方法检测肿瘤及肿瘤淋巴管的新生;在BALB/c小鼠乳腺皮下脂肪垫处注射小鼠来源的乳腺癌4T1细胞,建立自发性肺及其他器官的转移模型,2-3周分别取肺组织于体视显微镜下观察,并且通过HE染色进一步验证;在BALB/c裸鼠的乳腺原位脂肪垫皮下注射人类乳腺癌细胞系MDA-MB-231建立乳腺癌异种移植模型,通过染色观察肿瘤内部淋巴管的生成及转移情况。通过尾静脉注射或者显微注射的方法将带有荧光标记多肽注射到小鼠或者斑马鱼的体内,不同时间点取下组织,利用免疫荧光的方法检测多肽的分布及靶向情况。通过建立乳腺癌原位移植模型、角膜微袋肿瘤生长模型及模式生物-斑马鱼,检测TMTP2在新生淋巴管生成过程中的靶向识别作用,通过尾静脉注射或者显微注射的方法将带有荧光标记多肽注射到小鼠或者斑马鱼的体内,不同时间点取下组织,利用免疫荧光的方法检测多肽的分别及靶向情况。利用上述模型体内验证多肽TMTP2-DKK对上述模型的肿瘤及淋巴管新生的靶向阻遏作用。体外先对4T1细胞进行不同浓度多肽TMTP2-DKK的处理,再通过Transwell试验验证多肽TMTP2-DKK处理后的细胞对迁移侵袭的影响;在构建的乳腺癌转移模型中验证多肽TMTP2-DKK在体内对转移的抑制效应;显微镜观察计算多肽处理后的小鼠肺部的转移灶,HE染色进一步验证其转移灶的组织结构。结果与空白对照组对比,HLEC体外三维培养6h后,VEGF-C融合蛋白组中形成更多的管腔样结构,随着培养时间的增加,最后形成复杂的闭合三维淋巴管网;角膜微袋肿瘤移植的小鼠从第5天出现肉眼可见的血管新生的变化,由7天直至14天血管生长更加明显;在BALB/C小鼠4T1乳腺癌转移模型中,在肿瘤细胞移植4周后所有被种植的小鼠均发生较大的原发肿瘤,同时在肺部可见多个转移结节;小鼠乳腺癌原位异种移植模型也可见皮下瘤不同程度的生长;TMTP2对LEC细胞有很好的亲和效应,在实验组的细胞胞浆内可见很强的绿色荧光,也有部分细胞核内也有较强的荧光,而在对照肽组只有蓝色的核染色之外,没有其他的荧光;在小鼠的乳腺癌及全角膜的切片中均可见较强的多肽表达荧光,而在错序对照肽无相关的荧光表达;同样在斑马鱼的胸导管内也有绿色荧光的分布;在体外成管试验中,未处理组与添加了VEGFC组都有明显的管状结构形成,而TMTP2-DKK及TMTP2-DKK+VEGFC处理组成管均明显减少,错序肽以及TMTP2则对成管没有抑制作用;在乳腺癌的荷瘤小鼠中,TMTP2-DKK处理组的肿瘤体积明显小,瘤体重量明显较对照组轻,且内部淋巴管的数目也较对照组少;在TMTP2-DKK处理组的角膜成瘤整体要比对照组小,且组化结果淋巴管的数目明显少于对照组;在斑马鱼的试验中,与对照组相比,TMTP2-DKK处理后发生明显的心包水肿及胸导管分离,高倍视野下观察到斑马鱼胸导管缺失;在体外Transwell试验中,与对照组相比,TMTP2-DKK处理组的细胞穿过率明显减少;TMTP2-DKK处理组的小鼠肿瘤体积及重量明显小于对照组,肺转移率也较对照组降低;HE染色对可见肺局部有大量的转移灶;结论本研究成功建立了体外三维淋巴管成管模型、体内的角膜微袋肿瘤模型、乳腺癌转移模型及裸鼠原位异种移植瘤模型,为淋巴管新生及肿瘤淋巴管生产及相关信号通路的研究提供了理想的动物模型;多肽TMTP2对表达VEGFR-3的LEC及在体内肿瘤及相应的淋巴管均有很好的靶向识别效应;偶联DKK后,可以抑制淋巴管的发生,且可抑制肿瘤的转移;多肽TMTP2如能与抗肿瘤药物如阿霉素等偶联,将大大提高肿瘤早期治疗的靶向性和高效性,可能成为临床上靶向阻遏肿瘤淋巴管的生成与抑制肿瘤转移的一种全新的诊断和治疗工具;

魏建超[4](2010)在《日本脑炎病毒入胞机制及其靶向抑制分子的研究》文中指出日本脑炎(Japanese encephalitis, JE),又称流行性乙型脑炎(Epidemic Encephalitis B),是由日本脑炎病毒(Japanese Encephalitis Virus, JEV)引起的以中枢神经系统损害为主的急性传染病。该病对猪的致死率不高,但可引起怀孕母猪流产、死胎或木乃伊胎,公猪发生睾丸炎而不育。JEV在鸟与蚊子之间有一个区域性传播循环,猪作为中间扩增宿主,带毒蚊子通过叮咬将感染性病毒传播给人。这不仅严重危害养猪业的健康稳定发展,而且还严重威胁着人类的公共卫生安全。尽管目前对JEV的病原学、分子生物学和免疫学特性的研究已取得了很大的进展,疫苗的应用也使乙脑的发病率有所下降,然而幸存者也往往会留有严重的后遗症,尚无有效的抗病毒治疗药物,而且JEV的致病的分子机制仍不完全清楚,因此,JEV的致病机理和抗病毒研究成为当前研究的重点和难点。病毒与细胞表面相应受体的结合是病毒生命周期中的始动环节,也是影响病毒宿主范围、组织嗜性和致病性的决定因素之一。病毒入胞于是也成为当前抗病毒治疗和抗病毒药物设计一个具有吸引力的靶点。一般认为JEV囊膜糖蛋白E是该病毒的病毒吸附蛋白(virus attachment protein, VAP),介导JEV与宿主细胞受体结合及膜融合。研究发现黄病毒的E蛋白含有3个结构域,即结构域Ⅰ、结构域Ⅱ和结构域Ⅲ。其中,结构域Ⅲ(domainⅢ, DⅢ)被认为是受体的主要结合部位,而且该结构域中保守基序(Arg387-Gly387-Asp389, RGD)的单氨基酸突变可能影响JEV的受体识别和毒力。本研究从病毒黏附蛋白和细胞受体的两个角度探讨了日本脑炎病毒入胞机制并以此为靶点对其靶向抑制分子进行了筛选和抗病毒活性评价。研究内容具体如下:1.日本脑炎病毒E蛋白受体结合域及其突变体的可溶性表达与多克隆抗体制备本试验利用点突变技术和基因重组技术构建了日本脑炎病毒囊膜蛋白结构域Ⅲ(EDⅢ)及其保守的RGD基序单氨基酸突变体(△EDⅢ, RGD突变为RGE)的原核表达载体,通过低温诱导(18℃)的策略获得了其可溶性重组蛋白。并以纯化EDⅢ蛋白免疫小鼠获得了抗EDⅢ的多克隆抗体。Western blot结果表明可溶性EDⅢ和ΔEDⅢ能被猪源JEV阳性血清所识别,制备的血清具有很好的特异性,为后续的研究奠定了基础。2.囊膜蛋白结构域Ⅲ及其保守的RGD基序在日本脑炎病毒入胞过程的作用分析本研究比较了含有保守RGD基序的重组E DⅢ蛋白或RGD多肽及其单氨基酸突变体(RGD突变为RGE)的重组ΔEDⅢ蛋白或RGE多肽结合到BHK-21细胞膜受体的能力。细胞黏附试验和流式细胞术结果显示重组E DⅢ蛋白较之其突变体能更有效地结合到BHK-21细胞膜表面,而且重组E DⅢ蛋白和RGD多肽与BHK-21细胞预孵育后能显着地抑制JEV感染BHK-21细胞,其抑制率分别达到65%和98%,然而RGD基序的突变(RGD突变为RGE)使得其抑制率分别下降到22%和52%。由此可推测,JEV是通过其囊膜蛋白上保守的RGD基序与靶细胞的膜受体相结合来介导其入胞的。这也进一步证实了,JEV囊膜蛋白DⅢ是其细胞膜受体的结合域,且可作为JEV入胞抑制剂的候选分子。3.日本脑炎病毒囊膜蛋白特异性结合肽的筛选与鉴定本试验以纯化的重组囊膜蛋白(Trx-E)作为靶标,Trx作为对照,对噬菌体随机12肽库进行4轮亲和筛选,挑取单克隆ELISA初步鉴定噬菌体克隆特异性,阳性克隆测序后合成多肽,应用表面等离子共振技术(SPR)进一步鉴定多肽的亲和力。ELISA结果显示,在随机挑选的20个单克隆当中,15个克隆靶向结合到重组蛋白Trx-E的囊膜蛋白(E)区域,5个克隆靶向结合到重组蛋白Trx-E的硫氧还原蛋白(Trx)区域。SPR试验进一步证实,5个人工合成多肽在一定程度上均能特异性结合到Trx-E的囊膜蛋白(E)区域,其中,多肽P1与Trx-E的囊膜蛋白(E)区域亲和力最高,其氨基酸序列为:TPDCTRWWCPLT。这为进一步研究JEV的入胞机制和靶向抗病毒治疗奠定了基础。4.日本脑炎病毒囊膜蛋白结合肽体内外抗病毒活性的研究本研究在前一章筛选到5个日本脑炎病毒囊膜蛋白结合肽的基础上,进一步评价了其抑制JEV感染的活性。Q-PCR结果显示5个囊膜蛋白结合肽在一定程度上均能抑制JEV感染BHK-21细胞,其中P1的抑制率最高,达到85%以上。进一步的PRNT结果证实P1在BHK-21、PK15和Vero细胞均呈现剂量依赖的抑制JEV感染的活性。而且,小鼠腹膜内接种试验表明P1预孵育JEV较之对照组能有效地减少(轻)病毒血症和致死率以及中枢神经系统的组织病理损伤。这些结果为JEV的抗病毒治疗和药物设计提供了一个新的思路。5.日本脑炎病毒在PK15细胞上膜受体的鉴定目前,JEV在猪源细胞上受体分子仍不清楚。本研究选择PK15细胞为主要的研究对象,同时选用Vero和BHK-21细胞,应用VOPBA鉴定出多个与JEV结合的蛋白,其中一个共有的约74kDa的JEV结合蛋白被随后的Western blot试验证实为HSC70。抗HSC70抗体能阻断JEV与上述三种细胞的结合,间接免疫荧光试验和激光共聚焦显微镜观察显示HSC70定位在BHK-21、PK15和Vero细胞膜上,提示HSC70可能是BHK-21、PK15和Vero细胞上的一个共有JEV受体候选分子。在BHK-21和Vero细胞上约67kDa、80kDa和105kDaJEV结合蛋白在JEV入胞过程起什么作用,是否是辅助受体,尚待进一步研究。综上所述,这些研究结果将为深入乙脑致病机制的解析及其新型抗病毒药物的设计提供了新的思路和有益的线索。

曹兴[5](2010)在《磁性纳米基因载体介导Mcl-1特异性shRNA治疗肝细胞癌的实验研究》文中提出肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是最常见的一种肝癌。乙肝、丙肝病毒感染或肝硬化引发的慢性炎症最终往往导致肝癌的发生。肝癌是我国癌症中的第2号杀手,每年死亡人数约占全世界死于肝癌人数的53%。凋亡的调节机制非常复杂,人们对凋亡调节基因,特别是其中的B细胞淋巴瘤/白血病基因-2(B cell lymphoma/leukemia-2,Bcl-2)这一基因家族进行了深入的研究。髓样细胞白血病基因-1(myeloid cell leukemia-1, Mcl-1)是Bcl-2基因家族中重要的抗凋亡成员,也是肝细胞癌中目前已知的重要抗凋亡因子,因此研究Mcl-1基因在肝癌组织中的异常表达对了解肝癌发生的可能机制及抗肿瘤治疗的可能途径有重要意义,是未来抗肿瘤治疗策略中的一个新靶点。RNA干扰技术(RNAi)是近年发展起来的新技术,RNAi引发的基因沉默作用是特异的和有效的,具有抑制作用强、稳定性高、细胞摄取相对容易等优点,为肿瘤的基因治疗提供新的、有前途的手段。是当前基因治疗研究最广为应用的基因沉默工具。小干扰RNA(siRNA)选择性抑制基因表达使基因治疗达到最大的特异性,但是弱小的细胞内导入能力、有限的血液稳定性及非特异的免疫原性阻碍了siRNA基因治疗的发展。相比普通的siRNA,具有短发卡结构的shRNA产生的RNAi效应更强,但国内外的研究都没能有效解决将siRNA导入体内细胞的转染效率低下的问题。基因转运需要合适的载体,理想的基因转运系统,应具有较高的基因转染效率、良好的靶向性和生物相容性、较高的稳定性及生物可降解性。目前的病毒载体和非病毒脂质体载体都存在不同程度的缺陷,因而寻找一种理想的基因载体就成为当务之急。纳米基因转运体的研制是目前国际纳米生物和肿瘤基因治疗研究领域重要的前沿性课题。纳米粒与DNA的连接多通过静电吸引作用来完成。DNA的磷酸骨架所带的负电荷只能与表面带正电性的载体结合。因此,需要利用生物活性分子对纳米颗粒的表面进行改性,使其表面携带阳离子物质,以起到防止纳米颗粒团聚,并有利于结合DNA分子的作用。Fe304磁性纳米粒兼具有磁靶向和被动靶向的特点,可以通过在其表面进行氨基功能化修饰,增加其稳定性和转染效率。基于以上背景和已有的研究成果,我们先用免疫化学Envision法测定抗凋亡因子Mcl-1在肝癌组织及癌旁组织中的表达,探讨凋亡机制失衡导致肝癌的发生的关系及临床病理学意义。结果显示,与高分化的肝癌组织相比,在低分化、增殖旺盛的肝癌组织中Mcl-1蛋白表达显着增强,62例肝癌组织中,Mcl-1阳性表达率为64.5%,高于临近癌旁组织,且与肝癌Edmonson grade分级、肿瘤直径、肝内外转移有关(P<0.05),为下一步的肿瘤基因治疗提供了实验基础。我们设计、合成了Mcl-1siRNA,并且与空载体质粒psiRNA-Hhlneo链接构建重组质粒Mcl-1shRNA真核表达载体psiRNA1-3,通过酶切电泳、基因测序证实是否正确构建,通过转染高表达Mcl-1的人肝癌HepG2细胞检测Mcl-1mRNA下降水平,筛选出最佳的shRNA。结果重组质粒psiRNA-Hh 1 neo-shRNA经酶切电泳、基因测序证明寡核苷酸片段成功插入预计位点,且序列与我们设计合成的完全一致,说明我们成功地构建shRNA真核表达载体psiRNA1-3。重组质粒载体转染人肝癌HepG2细胞后,HepG2细胞Mcl-1 mRNA含量较转染前及对照组均有明显的下降(P<0.01),说明我们制备的shRNA能有效抑制Mcl-1基因的表达,其中尤以psiRNA3抑制作用明显,抑制率达到58.3%。故在后续研究中,我们均以psiRNA3作为实验模板,探讨针对Mcl-1基因RNA干扰对肿瘤的治疗作用。通过改进的共沉淀法制备PLL修饰的Fe304磁性纳米粒(DMNP),用透射电镜、激光粒度分析仪考察其形态、粒径、Zeta电位,MTT法观察其细胞毒性,不同的基因/纳米粒材料比制备基因纳米复合物,通过其形态、粒径、Zeta电位、基因保护实验考察磁性基因载体的理化特性,转染pEGFP-Cl绿色荧光蛋白质粒观察基因转染效率。结果制备的葡聚糖包裹的Fe304纳米粒径均一,分散性良好。PLL修饰的氨基功能化Fe304粒径(32±4)nm, Zeta电位为+18.23mV,对基因有较好的保护作用,选此条件下制备的基因纳米复合物进行基因转染,持续作用时间较脂质体和裸基因均要长。故后续研究中以此磁性纳米基因载体进行基因治疗研究。培养人肝癌HepG2细胞后,以DMNP进行转染,并观察外加磁场作用下对基因沉默效果的影响,72h后用RT-PCR和Western Blot检测Mcl-1 mRNA和Mcl-1蛋白的抑制率,用流式细胞仪及荧光显微镜检测细胞周期的改变和细胞凋亡情况,从体外考察基因治疗效果;建立裸鼠肝癌动物模型,以基因纳米复合物作瘤内多次注射,绘制肿瘤生长曲线,24天后切取肿瘤检测瘤重抑制率,从动物在体模型考察基因治疗效果。结果发现RNA干扰治疗组在外加磁场作用下Mcl-1mRNA和蛋白质的抑制率均明显提高,分别达到72.3%和54.2%,较未加磁场作用的治疗组与阴性治疗组抑制率均显着增强(均P<0.05)。移植瘤动物实验表明RNA干扰治疗组的肿瘤生长明显减慢,较假性治疗组明显增强(P<0.01)。说明我们制备的磁性纳米基因载体(DMNP)介导的Mcl-1shRNA对Mcl-1高表达的肝细胞癌有良好的治疗效果。

熊刚[6](2009)在《DcR3在食管鳞状细胞癌组织中的表达及相关机制研究》文中研究指明背景食管癌是人类八种最常见的恶性肿瘤之一。在全世界每年新增的30万病例中,约70 %发生在我国,并且其发病率仍呈上升趋势。食管癌总体预后不佳,总的2年和5年生存率分别为35%~42%和15%~24%。食管癌主要分为食管鳞状细胞癌(ESCC)和食管腺癌,而前者占了90%以上。因此,研究ESCC的发病机制,寻找其新的诊断和治疗靶点,已经成为提高食管癌预防和治疗效果的当务之急。在肿瘤的发生、发展中有一对矛盾贯穿始终,那就是机体的免疫监视和肿瘤的免疫逃逸。而诱导肿瘤特异性的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应和瘤细胞自身生长停滞或凋亡是机体用以清除肿瘤细胞的主要手段。LIGHT及FasL介导的凋亡是体内最常见的凋亡模式,在免疫调节和肿瘤的免疫监视中起着重要作用。DcR3是TNFRSF的一个新成员。研究发现,DcR3通过竞争性结合可以阻断经由其配体FasL、LIGHT以及TL1A所介导的肿瘤细胞的凋亡;同时DcR3还可抑制免疫应答中T细胞的增殖并影响DCs的分化和成熟,并抑制CD4+T细胞在混合淋巴细胞反应(MLR)中的增殖;此外,DcR3还可抑制T细胞的趋化效应,降低T细胞与抗原提呈细胞间的相互作用。研究显示,DcR3 mRNA低表达于正常人体组织中的胃、脊髓、淋巴结、肺、脾、结肠组织及多数造血细胞中,而高表达于胃肠道恶性肿瘤、乳腺癌、结肠癌、肺癌、胶质细胞瘤和淋巴瘤等多种恶性肿瘤中。研究证实,高表达DcR3是肿瘤细胞逃避机体免疫监视和杀伤的一个重要机制,其表达水平同多种肿瘤的进展程度、转移情况、对化疗的抵抗性以及不良预后有明显的相关性。因此,作为一种候选的肿瘤标志物和基因治疗标靶,DcR3目前已经成为了肿瘤诊断和治疗相关研究的热点。研究DcR3 mRNA和蛋白在人ESCC细胞系和ESCC病人组织标本中的表达情况并分析DcR3的表达与疾病的侵袭、转移、复发乃至预后间的关联性,将有助于评价DcR3作为ESCC的临床及预后的分子标志的可能性;而探讨其表达调控的可能机制则将有助于ESCC肿瘤基因治疗靶点的筛选。因此,关于DcR3在ESCC病人中的高表达及其相关机制的研究对于该疾病的防治有相当重要的意义。目的研究DcR3基因在ESCC病人肿瘤组织和相应的远癌组织中的表达情况,分析DcR3基因的表达与病人临床病理特征之间的关系,为评价DcR3作为ESCC的临床及预后的分子标志提供实验依据;检测DcR3基因启动子和编码区的多态性位点在重庆地区汉族ESCC人群中的基因型和等位基因频率,探讨DcR3启动子多态性与ESCC患病风险之间的关联,筛查与ESCC肿瘤组织中DcR3基因高表达相关联的SNP位点,为进一步研究和分析影响其表达调控的分子机制奠定基础;检测DcR3基因启动子区的甲基化状态差异,探讨ESCC肿瘤组织DcR3启动子甲基化状态是否参与其表达调控;考察DcR3 RNAi对ESCC肿瘤细胞的生长能力、侵袭能力和凋亡等方面的影响,初步探讨DcR3在人ESCC细胞发生和发展过程中可能作用和机制。方法1.收集109例ESCC肿瘤组织和对应的远癌组织标本,通过半定量逆转录聚合酶链反应(Semi-quantitative RT-PCR)检测其中DcR3 mRNA表达情况;2.运用免疫组织化学检测52例ESCC病人肿瘤组织中DcR3蛋白表达情况并行半定量分析;3.选取DcR3基因启动子和编码区四个多态性位点(-369G/T、-323A/C、-321C/T、147C/T),通过PCR扩增产物测序的方法了解这些多态位点在重庆地区正常人群中的频率分布,检测上述多态位点在ESCC人群中的基因型和等位基因频率;4.选择4对DcR3 mRNA表达状态有明显差异的癌及相对应的远癌组织标本,利用重亚硫酸盐修饰后测序法(BSP)检测DcR3基因启动子区的甲基化状态;5.构建基于miR-30的、靶向DcR3的慢病毒干扰载体;6.用干扰载体、包装质粒pMD2G及包膜质粒psAX2共同转染293FT细胞进行病毒包装;7.通过流式细胞仪(FACS)感染后的KYSE150细胞,获得DcR3 RNAi的ESCC细胞模型;8.利用Real-time PCR和Western Blotting检测DcR3 RNAi后瘤细胞上DcR3的表达情况;9.绘制体外培养的感染细胞、对照细胞和亲本细胞的生长曲线;10.通过Transwell侵袭小室实验检测DcR3 RNAi与LIGHT-Fc协同作用对瘤细胞体外侵袭能力的影响;11.运用Tunel试剂盒检测DcR3 RNAi与LIGHT-Fc协同作用对瘤细胞凋亡的影响。结果1. ESCC肿瘤标本中DcR3 mRNA表达率为73.4%,而远癌组织为47.7%(p<0.01);分析发现DcR3 mRNA的表达与病人的性别、年龄、部位和组织分化程度没有明显的相关性,而与肿瘤组织的外侵程度(p<0.05)、区域淋巴结转移情况(p<0.05)和临床TNM分期(p<0.05)有较强的相关性;2. ESCC肿瘤组织中DcR3蛋白的表达强弱与mRNA表达基本一致,DcR3的过表达率为28.8%;DcR3的过表达与ESCC病人区域淋巴结转移(p<0.05)和TNM分期(p<0.05)有明显的相关性;3.重庆地区汉族人群中-369G/T、-323A/C、-321C/T三个位点不存在多态性;而147C/T位点等位基因C的频率为43.7%,略高于中国汉族人(39.0%)和日本人(40.0%)。147C/T多态位点是与重庆地区汉族人群ESCC易感性相关联的一个风险位点,而且该多态位点的等位基因型C具有显性遗传效应,携带等位基因C的基因型CC和CT的ESCC发病风险显着增加(p<0.05)。但该多态位点与ESCC肿瘤组织中DcR3蛋白的异常高表达无明显的相关性;4. DcR3阳性的肿瘤组织和DcR3阴性的远癌组织,基因的启动子区的甲基化状态相同,即基因启动子区所有的CpG位点都呈非甲基化状态;5.成功设计并构建了基于miR-30的、靶向DcR3的慢病毒干扰载体;包装获得的病毒上清在体外能有效地感染人KYSE150细胞;6.经FACS分选,Western Blotting检测证实载体pPRIME-DcR3.3i能有效地抑制瘤细胞DcR3的蛋白表达,抑制率为82.6%;7. DcR3 RNAi对KYSE150细胞的体外生长无明显影响;8. DcR3 RNAi与LIGHT-Fc协同能有效地抑制瘤细胞的体外侵袭能力;9. DcR3 RNAi明显促进了LIGHT-Fc对KYSE150细胞的凋亡诱导。结论ESCC肿瘤组织中DcR3在mRNA和蛋白质水平较之对应的远癌组织存在明显的高表达,其高表达与肿瘤的区域淋巴结转移情况和临床TNM分期有较强的相关性。重庆地区汉族人群中147C/T位点是与ESCC易感性相关联的一个风险位点,该位点的等位基因型C具有显性遗传效应;ESCC病人肿瘤组织中DcR3的异常高表达与该基因CpG岛的甲基化状态异常无关; DcR3 RNAi对肿瘤细胞的体外生长没有直接的抑制效应,但能与LIGHT-Fc协同,有效地抑制瘤细胞的体外侵袭能力并促进对瘤细胞的凋亡诱导;DcR3对于ESCC是一个潜在的肿瘤生物标记。

陈小艳[7](2009)在《LMP1+/mCD99L2-A20诱导小鼠A20细胞转化为H/RS样细胞的研究》文中研究说明研究背景霍奇金淋巴瘤(Hodgkin’s lymphoma,HL)是一种好发于儿童和中青年的淋巴造血系统恶性肿瘤,它虽然是恶性淋巴瘤的一部分,但其组织病理学特征与非霍奇金淋巴瘤(non Hodgkin’s lymphoma,NHL)截然不同,其恶性成分--H/RS(Hodgkin/Reed-Sternberg,H/RS)细胞一般只占肿瘤组织的极少部分(<1%),其余是大量以淋巴细胞为主的背景细胞,如此少量的H/RS细胞是如何生存于大量的背景细胞之中的?它与背景细胞究竟存在什么关系?H/RS细胞是如何发生的?这些问题170多年来一直困扰着医学界。要探究这些悬而未决的问题,当务之急是建立类似人HL病理特征的淋巴瘤动物模型,观察H/RS细胞与背景细胞之间的相互作用,以揭示H/RS细胞生存、增殖、免疫逃避、免疫调节的机制,这是本课题组多年来在国家自然科学基金资助下一直致力研究的核心问题。最近十几年来有关H/RS细胞的研究取得了很大的进展,研究结果表明H/RS细胞起源于生发中心凋亡前B细胞(残疾B淋巴细胞)。κ基因结合核因子(NF-κB)是调节B细胞分化和存活的重要转录因子,正常状态下NF-κB仅表现为对不同刺激产生一过性活化,但NF-κB在H/RS细胞中则表现为持续活化。NF-κB的持续活化是H/RS细胞显着的分子特征,它能抑制H/RS细胞凋亡,促进其增殖,故NF-κB被认为是H/RS细胞的存活因子。NF-κB属于一个高度保守的转录因子家族,作为重要的转录调控因子,NF-κB调节很多基因表达,这些基因与细胞增殖、分化、免疫反应、凋亡、转化有着密切关系。现已明确HL的发病机制与EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)感染有关,其潜伏膜蛋白1(latent membrane protein 1,LMP1)通过模拟激活的CD40受体信号而诱导NF-κB的持续活化。LMP1通过活化NF-κB信号传导通路,下调淋巴细胞CD99的表达,可诱导出具有HL病理学特征的H/RS细胞的产生。研究证实,将LMP1基因转染EBV阴性的BJAB细胞和IM9细胞,使CD99蛋白表达减少或缺失的B淋巴细胞显示出了与H/RS细胞类似的表型。本研究组前期将LMP1基因导入小鼠B淋巴瘤细胞株A20细胞后,部分细胞出现了H/RS样细胞的形态特征及免疫表型,初步建立了鼠类人H/RS细胞模型;进一步再利用RNAi技术将A20细胞中的mCD99L2(mouse CD99 antigen-like2)基因沉默,经过在体外反复传代、克隆筛选和鉴定,建立了低表达mCD99L2基因的LV-mCD99L2-A20克隆株,发现其中也出现了类人HL病理学特征的H/RS样细胞。动物体内成瘤实验结果表明,这种低表达mCD99L2基因的LV-mCD99L2-A20克隆株在生物学特性方面与H/RS细胞也具有一定程度的相似性。然而令人遗憾的是,本研究组前期采用传统的脂质体转染法将LMP1基因转染小鼠B淋巴瘤细胞株A20,由于该细胞属于悬浮细胞,转染效率很低,而且所诱导出的H/RS样细胞因在体外培养困难,故未能成功建立长期稳定表达LMP1基因的鼠类人H/RS细胞模型,动物体内成瘤实验也未能成瘤,因而限制了本课题组对HL发病机制研究的开展。目前需要亟待解决的问题是,如何建立长期稳定表达LMP1基因和/或低表达mCD99L2基因的鼠类人H/RS细胞模型?慢病毒载体具有能感染分裂期和非分裂期细胞,使目的基因能在靶细胞内长期稳定表达的优势,而本课题组前期未能成功建立长期稳定表达LMP1基因的鼠类人H/RS细胞模型,本研究拟构建含目的基因LMP1的重组慢病毒表达载体,采用慢病毒转染细胞的技术,将外源基因导入靶细胞A20,在前期课题研究结果的基础之上(LMP1基因导入小鼠B淋巴瘤细胞株A20细胞后,部分细胞出现了H/RS样细胞的形态特征及免疫表型),建立长期稳定表达LMP1基因的鼠类人H/RS细胞模型。鉴于在EBV阴性的HL细胞株L428表达LMP1后能诱导出更多数量的多核RS细胞的实验研究,以及本课题组前期所建立的低表达mCD99L2基因的LV-mCD99L2-A20克隆株也出现了类人HL病理学特征的H/RS样细胞的形态和免疫表型,本研究拟采用所构建的含目的基因LMP1的慢病毒载体再次转染LV-mCD99L2-A20,观察是否能诱导出更多的多核RS细胞,从而建立长期稳定表达LMP1基因同时低表达mCD99L2基因的鼠类人H/RS细胞模型。另外,本课题组前期将初步构建的表达LMP1基因的小鼠H/RS样细胞皮下接种BALB/c小鼠未能成瘤,再将低表达mCD99L2基因的LV-mCD99L2-A20克隆株皮下接种具有健全免疫功能的BALB/c小鼠,因成瘤率极低,仅为3.6%(2/56),显着低于A20细胞在其体内的成瘤率75%(21/28),使我们在构建鼠类人HL病变特征的动物模型方面遇到了另一个挑战。本研究需要解决的第二个关键问题是:如何提高鼠类人HL病理特征的H/RS样细胞在BALB/c鼠体内的成瘤率?淋巴瘤为免疫系统恶性肿瘤,其发生与机体免疫状况有着密切的关系,研究表明几乎所有HL伴有AIDS患者的H/RS细胞均有EBV的感染,提示HL的发生既与EBV感染密切相关,同时也伴有免疫功能缺陷。本研究拟将BALB/c小鼠经X线照射后,在降低其免疫功能的基础上,将所构建的表达LMP1的A20细胞以及表达LMP1同时低表达mCD99L2的LV-mCD99L2-A20克隆株皮下接种放射后的BALB/c小鼠,提高鼠类人H/RS细胞在BALB/c小鼠体内的成瘤率,观测鼠类人H/RS细胞在BALB/c小鼠体内的生物学特性、免疫表型和病理特征,从而建立鼠类人HL病理特征的动物模型。目的1.构建含目的基因LMP1和报告基因copGFP的重组慢病毒表达载体,进行慢病毒包装和滴度测定。2.不同方式转染鼠源性B淋巴瘤细胞株A20,探讨悬浮细胞A20最佳的转染方式,为本研究后续工作奠定基础。3.将LMP1基因导入A20细胞和LV-mCD99L2-A20细胞,诱导其转化为H/RS样细胞,构建长期稳定表达LMP1基因和/或低表达mCD99L2基因的鼠类人H/RS细胞模型--LMP1+A20和LMP1+/mCD99L2-A20细胞。4.构建LMP1+A20和LMP1+/mCD99L2-A20克隆株荷瘤裸鼠模型和BALB/c小鼠模型。方法1.含目的基因LMP1的重组慢病毒表达载体的构建与鉴定以及慢病毒包装和滴度测定根据慢病毒表达载体pCDF1-copGFP的多克隆酶切位点,设计特异性PCR引物,上下游分别引入BglⅡ和EcoRⅠ,以LMP1阳性质粒为模板,扩增目的基因LMP1全长,将之连接到慢病毒表达载体pCDF1-copGFP的多克隆酶切位点,转化大肠杆菌,挑选阳性克隆,经PCR扩增、质粒小量抽提、限制性酶切鉴定和测序鉴定重组载体pCDF1-LMP1-copGFP。在脂质体介导下将慢病毒包装系统的包装结构质粒pFIV、包膜质粒pVSVG和重组质粒pCDF1-LMP1-copGFP导入病毒包装细胞293FT,收集病毒上清,再用病毒上清转染293FT细胞,荧光显微镜观察293FT细胞绿色荧光的分布,高倍镜下对发荧光的细胞进行计数,根据SBI公司使用手册提供的公式计算病毒上清液的滴度(Tu/ml):滴度=(稀释因子)×(绿色荧光细胞数/计数的细胞总数)×(被转染的细胞数)/0.5。2.不同方式转染鼠源性B淋巴瘤细胞株A20的探讨分别用传统的脂质体转染技术、新兴发展的NucleofectorTM核酸转染技术和慢病毒载体介导的转染技术,将重组慢病毒表达载体质粒pCDF1-LMP1-copGFP导入鼠源性B淋巴瘤细胞株A20,荧光显微镜观察A20细胞绿色荧光的分布,高倍镜下对发荧光的细胞进行计数,根据以下公式计算转染效率:转染效率=(绿色荧光细胞数/计数的细胞总数)×100%分析比较这三种技术转染悬浮细胞A20的转染效率,探讨A20细胞最佳的转染方式。3.不同滴度慢病毒转染不同类型细胞转染效率的比较将大容积包装的慢病毒上清液经低温超速离心浓缩,再分别用慢病毒上清液转染293FT、正常鼻咽上皮细胞和A20细胞,以及用浓缩后的慢病毒(107Tu/ml)分别转染293FT、L428和A20细胞,转染5d后,荧光显微镜下观察细胞内绿色荧光的分布,比较分析不同滴度慢病毒转染不同类型细胞的转染效率。4.长期稳定表达LMP1基因和/或低表达mCD99L2基因的鼠类人H/RS细胞模型的构建与鉴定采用经大容量包装和低温超速离心浓缩后的含目的基因LMP1的慢病毒转染A20细胞和LV-mCD99L2-A20细胞,有限稀释法筛选LMP1+A20单克隆和LMP1+/mCD99L2-A20单克隆细胞。光学显微镜和透射电镜下观察LMP1+A20单克隆和LMP1+/mCD99L2-A20单克隆细胞的形态特征;光镜下测试网格计数法动态监测大细胞(直径≥25μm)。RT-PCR和Western blot分别检测细胞内LMP1mRNA和LMP1蛋白的表达;MTT法检测细胞体外增殖能力;Transwell检测细胞的微侵袭能力;流式细胞仪检测细胞周期及细胞的免疫表型(CD19与CD30)。PCR检测LMP1+/mCD99L2-A20细胞内shRNA干扰载体的整合情况;RT-PCR及荧光定量PCR检测LMP1+/mCD99L2-A20细胞内mCD99L2表达水平。5.LMP1+A20和LMP1+/mCD99L2-A20克隆株荷瘤裸鼠和BALB/c小鼠模型构建分别将LMP1+A20和LMP1+/mCD99L2-A20克隆株皮下接种裸鼠成瘤,观察动物成瘤时间、成瘤率、皮下肿瘤生长速度;取裸鼠瘤块行石蜡包埋、制备病理组织切片、HE染色观察瘤细胞形态;免疫组织化学染色检测瘤组织内LMP1蛋白的表达;取瘤组织做原代培养,RT-PCR检测原代细胞内LMP1mRNA的表达;RT-PCR检测mCD99L2的表达水平;流式细胞仪检测原代瘤细胞CD19和CD30的表达。再分别将LMP1+A20和LMP1+/mCD99L2-A20克隆株皮下接种娇档暮途璛线照射(2Gy)后的同源BALB/c小鼠,做上述检测和鉴定;流式细胞仪检测正常BALB/c小鼠、接种瘤细胞成瘤和未成瘤小鼠外周血中淋巴细胞亚群的比例。6.统计学处理采用统计软件SPSS 13.0对实验结果进行统计学处理和分析。计量资料以均数±标准差(x-±s)表示。MTT法检测体外细胞增殖能力采用析因设计方差分析比较各组间差异。A20与各组细胞中H/RS样细胞数目的比较采用两因素方差分析(two-wayANOVA)比较组间差异。流式细胞仪检测细胞周期、肿瘤细胞CD抗原表达、外周血淋巴细胞亚群比例数据采用单因素方差分析(One-wayANOVA)比较组间差异,LSD多重比较各组间差异。Transwell法检测细胞体外微侵袭能力和两组之间成瘤时间的比较采用两独立样本t检验进行比较,两组之间成瘤率的比较采用X2检验。在体肿瘤生长曲线的比较采用重复测量方差分析方法处理,若球形检验P<0.05,拒绝球形检验,用Greenhouse-Geisser进行校正,采用校正后的F值和P值。结果1.含目的基因LMP1的重组慢病毒表达载体的构建与鉴定以及慢病毒包装和滴度测定(1)PCR扩增目的基因LMP1所设计引物位于LMP1全外显子的上下游,包含起始密码子和终止密码子,扩增片段大小为1.2 kb。PCR产物的琼脂糖凝胶电泳见一清晰的特异性扩增条带,其大小与理论预期值相符。(2)LMP1基因重组慢病毒表达载体pCDF1-LMP1-copGFP的构建和鉴定将构建的LMP1基因重组慢病毒表达载体pCDF1-LMP1-copGFP的菌液经PCR扩增,琼脂糖凝胶电泳可见1.2 kb的目的基因LMP1片段,小量抽提重组质粒,经EcoRⅠ和BglⅡ双酶切后,获得与目的基因LMP1 1.2kb一致的清晰条带,而空载体质粒上只有6671 bp的单一片段。(3)DNA测序结果取重组质粒进行DNA测序,结果表明我们所获得的LMP1片段与GenBank所公布的相应序列一致,无碱基缺失及错误。(4)慢病毒包装及滴度测定结果用脂质体将已构建的慢病毒载体系统中3种质粒成分导入病毒包装细胞293FT中,荧光显微镜下见大量绿色荧光,证实已有大量质粒转入293FT细胞,绿色荧光位于细胞的胞膜及胞浆,这与LMP1的表达位置一致。取病毒上清液转染293FT细胞,荧光显微镜下观察细胞内绿色荧光的分布,测定病毒上清液的滴度为1.6×105Tu/ml。2.不同方式转染鼠源性B淋巴瘤细胞株A20(1)脂质体转染通过阳离子脂质体LipofectamineTM 2000介导,将重组质粒pCDF1-LMP1-copGFP导入A20细胞,转染24~48h后,荧光显微镜下观察仅见个别细胞有绿色荧光。(2)NucleofectorTM核酸转染采用Amaxa核酸转染仪,将特定的转染溶液NucleofectorTM和重组质粒pCDF1-LMP1-copGFP导入A20细胞,转染4~48h后,荧光显微镜下观察可见较多细胞有绿色荧光,转染效率在10%左右,表明NucleofectorTM核酸转染技术可明显提高A20细胞的转染效率。但是,转染72h后几乎不见绿色荧光细胞,并且细胞死亡率逐渐提高。(3)慢病毒上清液转染用含目的基因LMP1的慢病毒上清液转染293FT、正常鼻咽上皮和A20细胞,转染5d后,荧光显微镜下观察,293FT和鼻咽上皮细胞可见较多的绿色荧光,转染效率约为80%,而A20细胞则有少许细胞有绿色荧光,转染效率<1%。3.浓缩后的慢病毒转染不同类型细胞转染效率的比较用经过大容积包装和低温超速离心浓缩后的慢病毒(滴度为107Tu/ml)分别转染293FT、L428和A20细胞,其转染效率分别为100%、90%和80%。4.长期稳定表达LMP1基因和/或低表达mCD99L2基因的鼠类人H/RS细胞模型的构建与鉴定(1)采用经低温超速离心浓缩后的含目的基因LMP1的慢病毒分别转染A20细胞和LV-mCD99L2-A20细胞,有限稀释法筛选出LMP1+A20细胞单克隆株和LMP1+/mCD99L2-A20细胞单克隆株。转染25d后,倒置显微镜和普通光学显微镜观察,发现细胞出现明显的形态改变,细胞体积增大,直径≥25μm,胞浆丰富,细胞核及核仁明显增大,出现单核、双核和多核H/RS样细胞。(2)透射电镜观察,转型后的LMP1+A20细胞体积增大,胞浆丰富,细胞器增多,主要表现为线粒体和内质网增多。最明显的是细胞核增大,核仁明显增大,出现多核和双核细胞。(3)细胞计数结果经两因素方差分析显示,不同细胞组之间差异具有显着性(F=529.733,P=0.000),三组细胞经LSD多重比较显示,LMP1+A20和LMP1+/mCD99L2-A20细胞中H/RS样细胞与对照组A20细胞相比,差异具有显着性(P=0.000),LMP1+A20和LMP1+/mCD99L2-A20细胞中H/RS样细胞数目较A20细胞中的H/RS样细胞多;而LMP1+A20与LMP1+/mCD99L2-A20细胞中H/RS样细胞数无统计学差异。(4)RT-PCR检测LMP1+A20细胞和LMP1+/mCD99L2-A20细胞内LMP1mRNA表达阳性,而对照组A20细胞表达阴性。(5)Western blot检测LMP1+A20细胞内LMP1蛋白表达阳性,而空载体组pCDF-A20细胞和对照组A20细胞表达阴性。(6)MTT检测发现LMP1+A20细胞体外增殖能力较空载体组pCDF-A20细胞和对照组A20细胞减慢,差异有显着性(P<0.05)。(7)Transwell法检测细胞体外微侵袭能力,发现LMP1+A20细胞的运动能力比pCDF-A20细胞明显减慢,差异具有显着性(P=0.000)。(8)流式细胞仪检测细胞周期发现LMP1+A20、pCDF-A20与A20细胞G1期和S期比例无显着性差异,LSD多重比较结果显示:LMP1+A20细胞G2期比例高于pCDF-A20组和A20组,差异有显着性(P=0.010)。pCDF-A20组与A20组G2期差异不显着(P=0.966)。(9)流式细胞仪检测细胞的免疫表型,单因素方差分析显示LMP1+A20、pCDF-A20与A20三组细胞CD30阳性细胞比例有显着性差异(F=326.125,P=0.000),CD19阳性细胞比例无显着性差异(F=4.473,P=0.650)。LSD多重比较结果显示LMP1+A20细胞CD30阳性细胞比例(72.600±1.990%)高于对照组A20细胞(41.173±1.620%)和pCDF-A20细胞(41.587±1.543%),差异有显着性(P=0.000,P=0.000)。(10)抽提LMP1+/mCD99L2-A20细胞DNA进行PCR,能检测出ShRNA干扰载体稳定整合至细胞基因组。(11)RT-PCR及荧光定量PCR检测LMP1+/mCD99L2-A20细胞mCD99L2的表达水平低于A20细胞,mCD99L2基因的干扰效率约为50%。5.LMP1+A20和LMP1+/mCD99L2-A20克隆株荷瘤裸鼠模型的构建与鉴定(1)成瘤情况:LMP1+A20和LMP1+/mCD99L2-A20克隆株2×107细胞分别皮下接种裸鼠3只(6个位点),成瘤率100%,成瘤时间分别为9.5±2.9d和10.5±1.4d。(2)病理形态观察:光镜下见瘤细胞弥漫分布,大小不一,细胞核大深染,核圆形、卵圆形或不规则形,病理性核分裂像多见;LMP1+A20克隆株和LMP1+/mCD99L2-A20克隆株均可见散在分布的胞浆丰富的大细胞,呈双核、多核或不规则核,核仁大,微嗜酸性。这些大细胞极其类似人HL的H/RS细胞形态。(3)免疫组织化学染色:瘤组织内LMP1蛋白表达阳性,阳性定位于细胞膜。(4)取瘤组织做原代培养,RT-PCR检测原代瘤细胞内LMP1mRNA的表达,琼脂糖凝胶电泳可见1.2kb片段;(5)RT-PCR检测LMP1+/mCD99L2-A20细胞内mCD99L2的表达水平,低于对照组A20细胞。(6)流式细胞仪检测LMP1+A20和LMP1+/mCD99L2-A20原代瘤细胞CD19和CD30的比例分别为83.6%、52.5%和87.1%、61.2%。6.LMP1+A20和LMP1+/mCD99L2-A20克隆株BALB/c小鼠模型的建立(1)成瘤情况:LMP1+A20和LMP1+/mCD99L2-A20克隆株2×107细胞分别皮下接种BALB/c小鼠,两株细胞未照射组(n=4)均未成瘤;照射后24h组(n=4)接种LMP1+A20细胞成瘤率为100%,接种LMP1+/mCD99L2-A20细胞成瘤率为75%。结果表明将两组瘤细胞接种未经照射的BALB/c小鼠,均未见肿瘤形成,而X线全身照射(2Gy)BALB/c小鼠后24h接种瘤细胞则能显着提高成瘤率。(2)病理形态观察:光镜下见瘤细胞弥漫分布,大小不一,细胞核大深染,核圆形、卵圆形或不规则形,可见散在的胞浆丰富的大细胞,呈双核、多核或不规则核,核仁大,微嗜酸性,其中可见“镜影细胞”,在肿瘤细胞周围可见淋巴细胞呈散在或灶性浸润,另还可见浆细胞和组织细胞等背景细胞。(3)免疫组织化学染色:检测瘤组织内瘤细胞LMP1表达阳性,定位于细胞膜和细胞浆。(4)RT-PCR检测原代瘤细胞内LMP1 mRNA的表达,可见1.2kb片段;(5)RT-PCR检测LMP1+/mCD99L2-A20细胞内mCD99L2的表达水平,低于对照组A20细胞。(6)外周血淋巴细胞亚群:对接种LMP1+A20细胞和LMP1+/mCD99L2-A20细胞成瘤和未成瘤的BALB/c小鼠外周血进行流式细胞检测CD3、CD4、CD8、CD19阳性淋巴细胞亚群的比例,并与正常BALB/c小鼠(n=4)进行比较。方差分析显示五组间各指标均存在显着性差异。LSD多重比较显示:接种LMP1+A20和LMP1+/mCD99L2-A20细胞成瘤鼠和未成瘤鼠间CD3(P=0.000)、CD4(P=0.000)、CD8(P=0.000)、CDl9(P=0.000)阳性细胞比例有显着性差异;成瘤鼠CD3、CD4、CD8低于未成瘤鼠,CD19高于未成瘤鼠,而接种LMP1+A20细胞成瘤鼠和接种LMP1+/mCD99L2-A20细胞成瘤鼠间CD3、CD4、CD8、CD19阳性细胞比例无显着性差异。结论1.高滴度慢病毒表达载体可高效转染小鼠B淋巴瘤细胞A20,较脂质体转染法和NucleofectorTM核酸转染法有明显的优势。2.将LMP1基因导入A20细胞和LV-mCD99L2-A20细胞,能诱导A20细胞转化为H/RS样细胞,建立了长期稳定表达LMP1基因和/或低表达mCD99L2基因的小鼠H/RS样细胞模型。3.将LMP1+A20和LMP1+/mCD99L2-A20克隆株分别皮下接种裸鼠和经X线照射后的BALB/c小鼠,建立了LMP1+A20和LMP1+/mCD99L2-A20克隆株荷瘤裸鼠模型和BALB/c小鼠模型,后者出现了淋巴细胞、浆细胞和组织细胞等背景细胞,类似人cHL的病理特征。创新之处1.探索出了一种高效转染悬浮细胞A20的方法--高滴度慢病毒转染法。2.将LMP1基因导入A20细胞和LV-mCD99L2-A20细胞,建立了长期稳定表达LMP1基因和/或低表达mCD99L2基因的小鼠H/RS样细胞模型。3.将LMP1+A20和LMP1+/mCD99L2-A20克隆株分别皮下接种裸鼠和经放射后的BALB/c小鼠,建立了LMP1+A20和LMP1+/mCD99L2-A20克隆株荷瘤裸鼠模型和BALB/c小鼠模型,后者出现了类似人cHL的病理特征,初步建立了类人HL小鼠模型。4.X线照射BALB/c小鼠(2Gy)降低其免疫功能后,便于建立荷瘤动物模型。

李晓光[8](2008)在《B和C基因型重组乙型肝炎病毒的构建及其相关研究》文中提出研究目的:1.构建B和C基因型重组乙型肝炎病毒及检测其在Huh7细胞内的复制和表达。2.探讨B和C基因型乙型肝炎病毒对Huh7细胞全基因组表达模式的影响是否相似。3.评价针对重组B和C基因型HBV S区目的小发夹RNAs(shRNAs)在存在错配的情况下对HBsAg和HBeAg表达的抑制作用,对HBsAg mRNA水平的抑制作用,及对HBV DNA复制的抑制程度。研究方法:1.根据相关文献设计扩增HBV全基因组的引物,分别从感染B和C基因型的患者血清中提取HBV DNA作为模板,应用高保真热启动Taq DNA聚合酶扩增HBV全基因组;2.SacⅠ酶切扩增的全长HBV和pUC19,应用T4 DNA连接酶使HBV插入pUC19上的SacⅠ酶切位点,命名为pUC19-BHBV和pUC19-CHBV;3.应用SapⅠ酶切pUC19-HBV和pHY106真核表达载体,将获得的全长HBV在与线性的pHY106连接,使全长HBV插入pHY106的SapⅠ酶切位点,命名为pHY106-BHBV和pHY106-CHBV;4.将pHY106-BHBV和pHY106-CHBV分别转染Huh7细胞,以pHY106空载体转染作对照;①分别于转染后24h、48h和72h取细胞培养上清,-20℃冻存,用于ELISA检测HBsAg和HBeAg表达;②转染后72h,裂解细胞,提取细胞内HBV核心颗粒内HBV复制中间体,用于Southern blot检测;③转染后72h,用PBS洗细胞5次,裂解细胞,应用Real-time PCR定量检测Huh7细胞内HBV DNA水平。5.基因芯片技术:B或C基因型重组乙型肝炎病毒(即pHY106-BHBV,pHY106-CHBV)转染Huh7细胞,以pHY106空载体为对照,48h后提取细胞mRNA,逆转录为cDNA,与芯片杂交,用GenePix Pro3.0软件分析Cy3和Cy5两种荧光信号的强度,计算每个基因点在本次实验中的表达差异值Ratio,Ratio=Cy5/Cy3;筛选出Ratio大于2或小于0.5的基因点,这些数据所代表的基因在与两种探针杂交时表现出较大的差异;6.实时定量PCR:pHY106-BHBV,pHY106-CHBV转染Huh7细胞48h,以pHY106空载体为对照,提取细胞总RNA,逆转录为cDNA,应用实时定量PCR对基因芯片差异表达的部分基因进行验证。7.将shRNAs分别和B或C基因型重组HBV,即pHY106-BHBV和pHY106-CHBV共转染HepG2细胞;于转染后24h、48h、72h、96h和120h分别取细胞培养上清,-20℃冻存,留作ELISA检测HBsAg和HBeAg表达水平;8.shRNAs分别和B或C基因型重组HBV转染HepG2细胞72h后,应用Trizol法提总RNA,逆转录为cDNA,进行RT-PCR,对HBsAg mRNA水平进行半定量检测;于转染后72h,裂解细胞,提取HBV核心颗粒内的HBV复制中间体进行Southernblot实验。结果:1.成功构建了pHY106-BHBV和pHY106-CHBV两个表达载体;2.pHY106-BHBV和pHY106-CHBV转到Huh7细胞后,检测到了HBsAg和HBeAg的表达,HBsAg表达于48h达高峰,HBeAg的表达高峰晚于HBsAg约24h;3.应用Southem blot检测到了细胞内HBV核心颗粒内的HBV复制中间体,包括rcDNA,dsDNA和ssDNA;4.应用Real-time PCR定量检测发现转染到Huh7细胞内的pHY106-BHBV和pHY106-CHBV HBV DNA拷贝数高,于72h达高峰,可达8log10;5.pHY106-BHBV转染Huh7细胞48h后,从4097个基因中筛选出差异表达基因共60条,其中1条基因表达明显增强,59条基因表达降低明显;6.pHY106-CHBV转染Huh7细胞48h后,筛选出差异表达基因共122条,其中34条基因表达明显增强,88条基因表达降低明显;7.实时定量PCR验证上述芯片结果,证实pHY106-BHBV转染Huh7细胞48h后,IFNGR2、GPR125、DDEF2和PI3K mRNA表达水平均不同程度下调,相对表达率分别为0.8、0.5、0.3和0.4,与基因芯片结果基本一致;pHY106-CHBV转染Huh7细胞48h后,EEF2、INF592表达下调,相对表达率分别为0.8和0.6,与基因芯片结果符合。8.shRNA·458和shRNA·635对B和C基因型HBV HBsAg和HBeAg表达具有很强抑制作用,转染后48h显现明显的抑制作用,于72h抑制作用达高峰,对HBsAg和HBeAg表达抑制水平分别可达到80%和50%左右;9.shRNA共转染72h,shRNA·458和shRNA·635对B和C基因型HBV HBsAgmRNA具有明显的抑制作用,抑制水平在60%~70%左右;10.Southern blot结果发现shRNA·458和shRNA·635对B和C基因型HBV的复制具有明显的抑制作用。结论:1.本研究构建成的HBV真核重组表达载体pHY106-BHBV和pHY106-CHBV能够在Huh7细胞内复制和表达HBsAg和HBeAg,适合用于B和C基因型HBV的致病机制、病毒与机体的相互作用、新药开发等方面的研究工作。2.B和C基因型乙型肝炎病毒均能对Huh7细胞表达谱产生明显的改变,B和C基因型乙型肝炎病毒对Huh7细胞表达谱的改变明显不同,仅发现DDEF2在两者均下调,这表明B和C基因型乙型肝炎病毒对机体的影响可能存在不同的方式。3.shRNA·458和shRNA·635是良好的抑制B和C基因型HBV的有效工具;一定范围的错配仍然能够发挥shRNA的抑制HBV的作用。

李玉琴[9](2007)在《肝细胞癌相关抗原661和结核分枝杆菌热休克蛋白70表位融合基因疫苗的免疫效果》文中提出基因疫苗是近年来发展起来的新型疫苗,又叫做核酸疫苗或DNA疫苗,与常规的灭活疫苗、减毒活疫苗、亚单位疫苗以及重组疫苗相比,具有安全、有效、制备容易、保存运输方便等优点,因而受到广泛重视。HCA661是2002年利用SEREX法从肝细胞癌患者分离出的一种新的肝细胞癌抗原,也称为TFDP3或CT40,属于CT抗原。该基因编码的蛋白表达于肝细胞癌中,而在除睾丸外正常组织中均不表达。HCA661蛋白具有免疫原性,能够诱导抗体反应,能够引起CTL反应。mtHSP70蛋白是一种载体分子,并具有免疫佐剂的作用。其受体是CD40,在mtHSP70多肽结合区有一个刺激表位,具有7个重要的氨基酸残基Q407、P408、S409、V410、Q411、E420和H424,能显着提高HSP70或CD40L刺激的DCs成熟,增强CD40-HSP70途径中p38MAP激酶的磷酸化。为尽量减少机体产生针对mtHSP70的免疫应答,进一步优化基因佐剂,本研究构建了HCA661和mtHSP70刺激表位的融合基因疫苗pc-HCA661-mtHSP70E[o1],重组的共表达质粒已由双酶切和测序证实。将pc-HCA661-EGFP重组质粒通过体外转染NHI/3T3细胞,建立了稳定表达融合蛋白的细胞系。pCI-HCA661-mtHSP70E和pCI-HCA661-mtHSP70C(羧基端)免疫动物后,采用流式细胞术、MTT法、Western blot、ELISA、免疫组化等实验室技术,证实了pCI-HCA661-mtHSP70E比起pCI-HCA661- mtHSP70C具有更好的免疫疗效。

潘运龙[10](2007)在《纳米金或IL-12抑制血管内皮细胞增殖和H22肝癌血管生成的研究》文中研究指明目的:近年研究表明纳米金能够阻止具有肝素结合位点的VEGF165与其受体VEGFR-2的结合,并抑制VEGF165的信号传导。本实验利用纳米金的这种新特性,研究纳米金能否抑制血管内皮细胞增殖并抑制裸鼠肝癌血管生成。以往研究认为白介素12(IL-12)通过诱导干扰素-γ(IFN-γ)、干扰素-γ诱导蛋白-10(IP-10)和干扰素-γ诱导单核因子(MIG)的生成,进而抑制肿瘤血管生成。然而,VEGF和Ang-2(血管生成素-2)是目前已知血管内皮细胞增殖的主要促进因子,我们推测IL-12是通过抑制肝癌组织中VEGF和Ang-2基因的表达,抑制血管内皮细胞增殖,发挥其抑制肝癌的血管生成和肝癌生长的作用。这种推测需要用实验加以证实。方法:1.用免疫印迹方法检测纳米金是否能特异性的与bFGF肝素结合位点结合;用纳米金与血管内皮细胞作用,检测细胞下游信号PLC—γ1的变化;用缺乏肝素结合位点的VEGF121作为对照,观察纳米金对血管内皮细胞增殖的影响;用AFM表征纳米金与VEGF165、VEGF121作用前后形貌大小变化,以及纳米金与血管内皮细胞作用前后细胞超微结构变化。将H22肝癌接种到Balb/c裸鼠,用或不用纳米金处理作为治疗组和对照组。用免疫组化方法检测肝癌微血管密度。测量肝癌大小、重量。2.构建含小鼠白介素12(mIL-12)双亚基基因的重组腺病毒(AdvmIL-12),检测重组腺病毒对H22肝癌细胞的感染效率。用ELISA法测定H22细胞中mIL-12蛋白的表达量;观察AdvmIL-12对H22细胞生长的影响。将AdvmIL-12转染的肝癌H22细胞作为实验组,以Adv-EGFP/H22为载体对照组和H22为空白对照组。这些细胞被分批接种到裸鼠肾包膜下,右前肢皮下。用RT-PCR法检测肝癌组织中的VEGF和Ang-2基因的表达;免疫组织化学方法测量肿瘤组织中微血管密度。测量肿瘤大小和重量。比较组间差别,P<0.05为有显着性差异。结果:1.体外实验表明,纳米金能够与具有肝素结合位点的bFGF结合;抑制VEGF165的信号传导;明显抑制VEGF165促进血管内皮细胞增殖作用。而纳米金对缺乏肝素结合位点的VEGF121没有抑制作用。2.裸鼠体内实验发现,用纳米金处理的实验组微血管密度为14.27±1.08,对照组微血管密度为23.52±1.36,实验组微血管密度较对照组明显减少(t=21.694,P<0.01)。实验组肿瘤体积较小,重量较轻,与对照组比较有显着性差异,P<0.05。3.在近生理条件下,AFM检测到纳米金与VEGF165、VEGF121作用前后血管内皮细胞超微结构变化。当血管内皮细胞处于增殖状态时,细胞表面出现许多大小约数百纳米的颗粒,细胞膜边缘明显延伸,伪足明显延长。相反地,当血管内皮细胞被纳米金抑制时,细胞表面颗粒大为减少,伪足缩短。4.在AdvmIL-12感染复数为100、感染时间为2小时情况下,重组腺病毒的转染率为96.41%。实验组细胞上清液中检测到IL-12蛋白的表达量为(89.71±22.05)ng.48h-1.106 cells-1。AdvmIL-12对H22细胞的生长无抑制作用。5.裸鼠体内实验表明,实验组肝癌组织中IL-12蛋白的表达量明显高于对照组,而实验组VEGF和Ang-2基因的表达弱于对照组。VEGF基因比值分别为:实验组0.8867±0.1924,载体对照组1.1744±0.1189,空白对照组1.1874±0.1752,P<0.05。Ang-2基因比值分别为:实验组0.7878±0.1471,载体对照组1.0319±0.1574,空白对照组1.0361±0.1536,P<0.05。实验组肿瘤平均重量、肿瘤体积和肿瘤微血管密度明显少于对照组,差异有显着性。结论:1.体外实验表明,纳米金能够抑制VEGF165的信号传导,明显抑制VEGF165促进血管内皮细胞增殖作用。而纳米金对缺乏肝素结合位点的VEGF121没有抑制作用。2.在裸鼠体内,纳米金通过阻止VEGF165与VEGFR-2结合,抑制H22肝癌血管生成和肝癌生长。3.AFM探测结果表明,纳米金抑制了VEGF165促血管内皮细胞增殖的作用。4.AdvmIL-12高效感染H22细胞,对体外培养H22细胞的生长无抑制作用。5.在缺乏T细胞的裸鼠体内,IL-12通过抑制肝癌组织中VEGF和Ang-2基因的表达,并抑制血管内皮细胞增殖,发挥其抑制H22肝癌血管生成和肝癌生长的作用。本实验结果将有助于肝癌及其他实体肿瘤的抗血管生成治疗。

二、腺相关病毒与变异体DHFR和GFP重组载体的构建及其在NIH3T3细胞中的表达(论文开题报告)

(1)论文研究背景及目的

此处内容要求:

首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景,再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题,并提出你的论文准备的观点或解决方法。

写法范例:

本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。

(2)本文研究方法

调查法:该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。

观察法:用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。

实验法:通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。

文献研究法:通过调查文献来获得资料,从而全面的、正确的了解掌握研究方法。

实证研究法:依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。

定性分析法:对研究对象进行“质”的方面的研究,这个方法需要计算的数据较少。

定量分析法:通过具体的数字,使人们对研究对象的认识进一步精确化。

跨学科研究法:运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。

功能分析法:这是社会科学用来分析社会现象的一种方法,从某一功能出发研究多个方面的影响。

模拟法:通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。

三、腺相关病毒与变异体DHFR和GFP重组载体的构建及其在NIH3T3细胞中的表达(论文提纲范文)

(1)MTB Ag85B199-207和HIV-1 Env120-128双特异TCR基因修饰CD8+ T细胞及其活性研究(论文提纲范文)

摘要
ABSTRACT
前言
第一章 筛选MTB肽Ag85B_(199-207)和HIV-1肽Env_(120-128)双特异TCR
    1.1 材料与方法
    1.2 实验结果
    1.3 讨论
    1.4 参考文献
第二章 构建重组逆转录病毒表达载体
    2.1 材料与方法
    2.2 实验结果
    2.3 讨论
    2.4 参考文献
第三章 双特异TCR基因修饰CD8~+T细胞及其活性研究
    3.1 材料与方法
    3.2 实验结果
    3.3 讨论
    3.4 参考文献
全文总结
综述
    参考文献
英文缩略词表
参与的科研项目和发表的相关论文
致谢

(2)白血病新融合基因PAX5-UBE2D4的克隆及功能研究(论文提纲范文)

中文摘要
Abstract
第一部分 双色荧光原位杂交技术检测急性 B 淋巴细胞白血病 PAX5 基因重排
    1.1 引言
    1.2 材料和方法
    1.3 结果
    1.4 讨论
    参考文献
第二部分 白血病新融合基因 PAX5-UBE2D4 的克隆及功能研究
    2.1 引言
    2.2 材料和方法
    2.3 结果
    2.4 讨论
    参考文献
第三部分 BTG1 基因在 BCR/ABL1 阳性急性白血病中的缺失情况
    3.1 引言
    3.2 材料与方法
    3.3 结果
    3.4 讨论
    参考文献
总结
综述
    参考文献
攻读学位期间公开发表的论文
英文缩略词表
致谢

(3)靶向VEGFR-3的多肽TMTP2在恶性肿瘤靶向治疗中的应用研究(论文提纲范文)

缩略语表
中文摘要
Abstract
研究背景
    参考文献
第一部分 淋巴管发生及肿瘤转移相关模型的建立
    中文摘要
    Abstract
    前言
    材料与方法
    结果
    讨论
    参考文献
第二部分 TMTP2在体外对淋巴管内皮细胞LEC的靶向识别效应研究
    中文摘要
    Abstract
    前言
    材料与方法
    结果
    讨论
    参考文献
第三部分 TMTP2在体内对肿瘤及新生淋巴管靶向识别效应研究
    中文摘要
    Abstract
    前言
    材料与方法
    结果
    讨论
    参考文献
第四部分 TMTP2-DDK的肿瘤靶向治疗及淋巴管新生的靶向阻遏作用
    中文摘要
    Abstract
    前言
    材料与方法
    结果
    讨论
    参考文献
第五部分 TMTP2-DKK靶向抑制肿瘤转移的研究
    中文摘要
    Abstract
    前言
    材料与方法
    结果
    讨论
    参考文献
综述 淋巴管生成与肿瘤转移机制及相关信号分子通路的研究进展
    参考文献
已发表文章
在读期间发表的文章目录
致谢

(4)日本脑炎病毒入胞机制及其靶向抑制分子的研究(论文提纲范文)

摘要
ABSTRACT
英文缩略词表
第一部分 文献综述
    第一章 黄病毒囊膜蛋白与受体的研究进展
        1 黄病毒囊膜蛋白的结构与功能
        2 膜融合机制
        3 黄病毒的受体研究现状
        参考文献
    第二章 以病毒入胞为靶点的抗病毒策略
        1 抗病毒的靶点之一--病毒粘附蛋白与受体的结合
        1.1 病毒粘附蛋白
        1.2 受体与辅受体(receptors and co-receptors)
        1.3 病毒受体模拟分子
        2 抗病毒的靶点之二--膜融合
        3 抗病毒的靶点之三--病毒内化
        4 问题与展望
        参考文献
    第三章 病毒受体的研究方法
        1 根据已有知识推测受体
        2 用细胞特异性单抗鉴定受体--单克隆抗体法
        3 用抗独特型抗体模拟病毒鉴定受体--抗独特型抗体法
        4 分子克隆
        5 病毒覆盖蛋白结合试验
        6 亲和层析法
        7 筛选易感细胞CDNA文库鉴别病毒受体
        7.1 利用病毒感染的特性筛选阳性克隆
        7.2 在病毒基因中加入报告基因作为筛选标志
        7.3 利用FACS分离获得易感性细胞
        8 噬菌体表面展示技术
        9 免疫共沉淀技术
        10 GST PULL-DOWN方法
        11 酵母双杂交技术
        12 表面等离子共振技术
        13 蛋白质芯片
        14 荧光共振能量转移技术
        15 二维电泳与质谱技术
        16 多种病毒受体研究方法的联合使用
        参考文献
第二部分 研究内容
    第四章 日本脑炎病毒E蛋白受体结合域及其突变体的可溶性表达与多克隆抗体制备
        摘要
        1 材料与方法
        1.1 质粒、菌株和动物
        1.2 主要试剂
        1.3 主要仪器
        1.4 EDⅢ及其突变体ΔEDⅢ原核表达载体的构建
        1.5 重组表达载体pET-EDⅢ或pET-/ΔEDⅢ的诱导表达
        1.6 重组蛋白的His-Bind螯合层析柱纯化
        1.7 纯化的重组蛋白EDⅢ或ΔEDⅢ的SDS-PAGE分析
        1.8 纯化重组蛋白EDⅢ或ΔEDⅢ的Western Blotting分析
        1.9 纯化重组蛋白EDⅢ或ΔEDⅢ的透析和定量
        1.10 鼠抗重组蛋白EDⅢ血清的制备与鉴定
        2 结果
        2.1 重组表达载体pET-EDⅢ或pET-ΔEDⅢ的酶切鉴定
        2.2 测序结果
        2.3 表达产物的可溶性分析及纯化效果的分析
        2.4 纯化的重组蛋白EDⅢ或ΔEDⅢ的Westem Blotting分析
        2.5 纯化重组蛋白EDⅢ或ΔEDⅢ的定量
        2.6 鼠抗重组蛋白EDⅢ血清的Western Blotting分析
        3 讨论
        参考文献
        Abstract
    第五章 囊膜蛋白结构域Ⅲ及其保守的RGD基序在日本脑炎病毒入胞过程的作用分析
        摘要
        1 材料与方法
        1.1 病毒和细胞
        1.2 主要仪器与试剂
        1.3 细胞毒性试验
        1.4 细胞膜受体结合试验
        1.5 黏附试验
        1.6 阻断试验
        1.7 噬斑减少试验
        1.8 荧光定量PCR检测
        1.9 数据分析
        2 结果
        2.1 细胞毒性评价
        2.2 细胞膜受体结合试验
        2.3 黏附试验
        2.4 EDⅢ、AEDⅢ或RGD和RGE阻断JEV结合BHK-21到细胞表面的差异分析
        3 讨论
        参考文献
        Abstract
    第六章 日本脑炎病毒囊膜蛋白特异性结合肽的筛选与鉴定
        摘要
        1 材料与方法
        1.1 材料
        1.2 方法
        2 结果
        2.1 噬菌体的富集效应
        2.2 噬菌体克隆与JEV囊膜蛋白(E)结合特异性测定
        2.3 阳性噬菌体DNA序列分析
        2.4 表面等离子体共振(SPR)技术测定噬菌体展示短肽对靶分子亲和力的结果
        3 讨论
        参考文献
        Abstract
    第七章 日本脑炎病毒囊膜蛋白结合肽体内外抗病毒活性的研究
        摘要
        1 材料与方法
        1.1 病毒、细胞和实验动物
        1.2 主要仪器与试剂
        1.3 细胞毒性试验
        1.4 体外抑制试验
        1.5 噬斑减少试验
        1.6 荧光定量PCR检测
        1.7 体内试验
        1.8 病理组织切片制作及HE染色
        1.9 数据分析
        2 结果
        2.1 细胞毒性评价
        2.2 六种囊膜蛋白结合肽体外抑制JEV感染BHK-21细胞
        2.3 囊膜蛋白结合肽P1在BHK-21、PK15和Vero细胞上抑制JEV感染
        2.4 体内试验
        3 讨论
        参考文献
        Abstraet
    第八章 日本脑炎病毒在PK15细胞上膜受体的鉴定
        摘要
        1 材料与方法
        1.1 病毒、细胞和抗体
        1.2 主要试剂
        1.3 病毒纯化
        1.4 细胞膜蛋白制备
        1.5 VOPBA
        1.6 western blot分析膜蛋白与抗HSC70的结合
        1.7 抗体阻断试验
        1.8 间接免疫荧光试验(IFA)和激光扫描共聚焦显微镜((Laser Scanning Confocal Microscope,LSCM)观察
        1.9 数据分析
        2 结果
        2.1 制备细胞膜蛋白的SDS-PAGE分析
        2.2 VOPBA鉴定在PK15、Vero和BHK-21细胞上的JEV结合蛋白
        2.3 western blot分析膜蛋白与抗HSC70的结合
        2.4 抗HSC 70抗体阻断JEV与PK15、Vero和BHK-21细胞的结合
        2.5 激光扫描共聚焦显微镜((Laser Scanning Confocal Microscope,LSCM)观察
        3 讨论
        参考文献
        Abstract
全文总结
致谢
攻读学位期间发表的学术论文

(5)磁性纳米基因载体介导Mcl-1特异性shRNA治疗肝细胞癌的实验研究(论文提纲范文)

摘要
ABSTRACT
缩略词表
第一部分 肝癌组织中Mcl-1抗凋亡蛋白的表达及意义
    一、前言
    二、材料与方法
        2.1 研究对象
        2.2 仪器与试剂
        2.3 免疫组织化学
        2.4 结果判定
        2.5 统计学分析
    三、结果
        3.1 光镜下观察
        3.2 免疫组织化学结果
    四、讨论
第二部分 靶向MCl-1的shRNA重组质粒载体的构建及评价
    一、前言
    二、材料与方法
        2.1 材料
        2.2 实验方法
    三、结果
        3.1 psiRNA-hH1neo重组质粒酶切电泳鉴定
        3.2 psiRNA质粒的浓度和纯度测定
        3.3 不同的shRNA对Mcl-1 mRNA的抑制率
    四、讨论
第三部分 生物磁性纳米基因载体的制备和及其与质粒DNA的连接
    一、前言
    二、材料与方法
        2.1 试剂及仪器
        2.2 实验方法
    三、实验结果
        3.1 制备产物Fe_3O_4纳米粒子形貌表征
        3.2 PLL修饰Fe_3O_4纳米粒子与DNA的结合效率测定结果
        3.3 PLL修饰Fe_3O_4纳米粒子对DNA的保护实验结果
        3.4 PLL修饰Fe_3O_4纳米粒基因转运体系的细胞毒性实验(MTT)
        3.5 普鲁士蓝染色结果
    四 讨论
第四部分 磁性纳米介导的Mcl-1 shRNA体内外治疗肝细胞癌的实验研究
    一、前言
    二、材料与方法
        2.1 实验材料
        2.2 实验方法
    三、结果
        3.1 RT-PCR检测Mcl-1 mRNA抑制情况
        3.2 Western blot检测Mcl-1蛋白
        3.3 不同组细胞生长曲线的绘制
        3.4 流式细胞仪检测各组HepG2细胞周期
        3.5 裸鼠肝癌移植瘤动物模型
    四、讨论
参考文献
综述·一
    参考文献
综述·二
    参考文献
致谢
研究成果

(6)DcR3在食管鳞状细胞癌组织中的表达及相关机制研究(论文提纲范文)

英文缩写词
英文摘要
中文摘要
论文正文 DcR3 在食管鳞状细胞癌组织中的表达及相关机制研究
    前言
    第一部分:ESCC 肿瘤组织中DcR3 表达情况与临床病理特征间的关系研究
        材料与方法
        结果
        讨论
        小结
    第二部分:ESCC 肿瘤组织中DcR3 高表达与启动子SNP 及CpG 岛甲基化状态关系的初步研究
        材料与方法
        结果
        讨论
        小结
    第三部分:基于miR-30 的DcR3 慢病毒干扰载体的构建及其体外抑瘤作用的初步研究
        材料与方法
        结果
        讨论
        小结
    全文总结
    致谢
    参考文献
文献综述 DcR3 及临床相关研究进展
    参考文献
攻读学位期间发表及待发表的文章
英文论着

(7)LMP1+/mCD99L2-A20诱导小鼠A20细胞转化为H/RS样细胞的研究(论文提纲范文)

摘要
ABSTRACT
前言
技术路线
第一章 LMP1基因重组慢病毒表达载体的构建
    一、材料和方法
    二、结果
    三、讨论
    参考文献
第二章 不同方式转染小鼠B淋巴瘤细胞A20的探讨
    一、材料和方法
    二、结果
    三、讨论
    参考文献
第三章 LMP1~+/mCD99L2~-基因的小鼠H/RS样细胞模型的建立
    一、材料与方法
    二、结果
    三、讨论
    参考文献
第四章 LMP1~+A20和LMP1~+/mCD99L2~-A20克隆株荷瘤裸鼠及BALB/c小鼠模型的构建
    一、材料与方法
    二、结果
    三、讨论
    参考文献
全文总结
英文缩写与注解
攻读学位期间研究成果
致谢
统计学审稿证明

(8)B和C基因型重组乙型肝炎病毒的构建及其相关研究(论文提纲范文)

英文缩略词表
中文摘要
英文摘要
第一部分 B和C基因型重组全长乙型肝炎病毒的构建及其在Huh7细胞内的复制和表达
    前言
    材料与方法
    结果
    讨论
    参考文献
    小结
第二部分 B和C基因型乙型肝炎病毒对Huh7细胞全基因组表达模式的不同影响
    前言
    材料和方法
    结果
    讨论
    参考文献
    小结
第三部分 2~4个碱基错配的短发夹RNAs对B和C基因型HBV抑制作用的研究
    前言
    材料和方法
    结果
    讨论
    参考文献
    小结
综述一
综述二
在读期间发表的文章
致谢
简历

(9)肝细胞癌相关抗原661和结核分枝杆菌热休克蛋白70表位融合基因疫苗的免疫效果(论文提纲范文)

提要
英文缩略词
第一章 绪论
    第一节 肝癌基因治疗的进展
        参考文献
    第二节 睾丸肿瘤抗原的研究进展
        参考文献
第二章 重组真核表达质粒pc-HCA661-mtHSP 刺激表位的构建
    前言
    材料与方法
    结果
    讨论
    结论
    参考文献
第三章 稳定表达HCA661-EGFP 融合基因的小鼠细胞株的建立
    前言
    材料与方法
    结果
    讨论
    结论
    参考文献
第四章 共表达质粒pc-HCA661-mtHSP 刺激表位p、c-HCA661-mtHS85P羧基端的生物功能的体内验证
    前言
    材料与方法
    结果
    讨论
    结论
    参考文献
创新性总结
攻博期间发表的学术论文
中文摘要
英文摘要
致谢

(10)纳米金或IL-12抑制血管内皮细胞增殖和H22肝癌血管生成的研究(论文提纲范文)

中文摘要
英文摘要
前言
第一章 纳米金或IL-12抑制血管内皮细胞增殖、血管生成的研究现状
    第一节 血管内皮细胞增殖与肿瘤血管生成、肿瘤生长的关系
        1.1.1 血管内皮细胞增殖的促进因子及其受体与血管生成
        1.1.2 肿瘤血管生成与肿瘤生长和转移
        1.1.3 抑制血管内皮细胞增殖与肿瘤血管生成的方法与途径
    第二节 纳米金及其在生物医学的应用
        1.2.1 纳米金的特性
        1.2.2 纳米金的制备
        1.2.3 纳米金在生物医学的应用
    第三节 纳米金与血管内皮生长因子的作用
        1.3.1 纳米金在抑制血管内皮细胞增殖方面的研究
        1.3.2 肝素、硫酸乙酰肝素和VEGF的肝素结合位点与血管生成
        1.3.3 纳米金与血管内皮生长因子的可能作用机制
    第四节 IL-12抑制血管内皮细胞增殖、血管生成及肿瘤生长的研究
        1.4.1 IL-12研究概况
        1.4.2 IL-12抑制血管内皮细胞增殖和血管生成,抑制肿瘤生长
        1.4.3 IL-12基因治疗
    第五节 抗肿瘤血管生成研究的方向
    第六节 本研究目的、内容和意义
        1.6.1 纳米金能否阻断VEGF165的信号传导,并抑制肝癌血管生成及肝癌生长
        1.6.2 IL-12能否抑制VEGF、Ang-2的表达,并抑制肝癌血管生成及肝癌生长
    参考文献
第二章 纳米金抑制血管内皮细胞增殖的研究
    第一节 纳米金的制备及表征
        2.1.1 实验材料及试剂
        2.1.2 纳米金的制备方法
        2.1.3 纳米金的表征
        2.1.4 结果
        2.1.5 讨论
        2.1.6 小结
    第二节 纳米金与VEGF、bFGF分子作用
        2.2.1 纳米金与bFGF肝素结合位点作用的实验
        2.2.2 血管内皮细胞受体-2下游信号磷脂酶C-γ1磷酸化活性检测
        2.2.3 讨论
        2.2.4 小结
    第三节 纳米金抑制血管内皮细胞增殖的实验研究
        2.3.1 材料
        2.3.2 实验方法
        2.3.3 实验结果
        2.3.4 讨论
        2.3.5 小结
    第四节 纳米金与VEGF、血管内皮细胞作用的AFM、TEM研究
        2.4.1 实验材料
        2.4.2 实验方法
        2.4.3 实验结果与讨论
        2.4.4 本节小结
        2.5 本章结论
    参考文献
第三章 纳米金抑制裸鼠体内血管生成及H22肝癌生长的实验研究
    3.1 实验材料
    3.2 实验方法
    3.3 结果
    3.4 讨论
    3.5 本章结论
    参考文献
第四章 IL-12基因转染肝癌H22细胞及对H22细胞生长的影响
    4.1 材料和试剂
    4.2 实验方法
    4.3 结果
    4.4 讨论
    4.5 本章结论
    参考文献
第五章 IL-12抑制H22肝癌VEGF和Ang-2基因的表达并抑制肝癌血管生成
    5.1 材料和试剂
    5.2 实验方法
    5.3 结果
    5.4 讨论
    5.5 本章结论
    参考文献
第六章 全文总结与展望
    6.1 纳米金能够阻断VEGF165的信号传导,并抑制肝癌血管生成及肝癌生长
    6.2 IL-12能够抑制VEGF、Ang-2基因的表达,并抑制肝癌血管生成及肝癌生长
    6.3 全文结论
    6.4 本研究创新点
    6.5 存在问题和展望
部分插图
附录一 缩略词语表
附录二 发表论文、参加科研课题及学术会议情
致谢

四、腺相关病毒与变异体DHFR和GFP重组载体的构建及其在NIH3T3细胞中的表达(论文参考文献)

  • [1]MTB Ag85B199-207和HIV-1 Env120-128双特异TCR基因修饰CD8+ T细胞及其活性研究[D]. 周超颖. 南方医科大学, 2016(02)
  • [2]白血病新融合基因PAX5-UBE2D4的克隆及功能研究[D]. 解珺丹. 苏州大学, 2014(01)
  • [3]靶向VEGFR-3的多肽TMTP2在恶性肿瘤靶向治疗中的应用研究[D]. 范良生. 华中科技大学, 2012(09)
  • [4]日本脑炎病毒入胞机制及其靶向抑制分子的研究[D]. 魏建超. 南京农业大学, 2010(05)
  • [5]磁性纳米基因载体介导Mcl-1特异性shRNA治疗肝细胞癌的实验研究[D]. 曹兴. 中南大学, 2010(02)
  • [6]DcR3在食管鳞状细胞癌组织中的表达及相关机制研究[D]. 熊刚. 第三军医大学, 2009(06)
  • [7]LMP1+/mCD99L2-A20诱导小鼠A20细胞转化为H/RS样细胞的研究[D]. 陈小艳. 南方医科大学, 2009(01)
  • [8]B和C基因型重组乙型肝炎病毒的构建及其相关研究[D]. 李晓光. 中国人民解放军军医进修学院, 2008(08)
  • [9]肝细胞癌相关抗原661和结核分枝杆菌热休克蛋白70表位融合基因疫苗的免疫效果[D]. 李玉琴. 吉林大学, 2007(03)
  • [10]纳米金或IL-12抑制血管内皮细胞增殖和H22肝癌血管生成的研究[D]. 潘运龙. 暨南大学, 2007(02)

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腺相关病毒及其变体DHFR和GFP重组载体的构建及其在NIH3T3细胞中的表达
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