IFN-α对人宫颈癌裸鼠皮下移植生长的影响

IFN-α对人宫颈癌裸鼠皮下移植生长的影响

一、IFN-α对人宫颈癌裸鼠皮下移植瘤生长的影响(论文文献综述)

杜华珊[1](2021)在《STING对宫颈癌增殖、迁移和侵袭能力的作用及机制的研究》文中指出研究背景:宫颈癌是最常见的妇科癌症之一。每年全球大约有57万新发病例,31万死亡病例。大约95%的宫颈癌病例是由高危人类乳头瘤病毒(HPV)的持续感染引起的。尽管已有预防高危型HPV的疫苗,宫颈癌对妇女来说仍然是一场健康危机。因此,有必要为宫颈癌的预防和治疗提供新的视角。干扰素基因刺激因子(STING)是一种跨膜蛋白,是细胞质DNA传感通路的重要分子。越来越多的证据表明,STING通路除了能保护宿主免受多种致病性攻击外,在癌症中也起着至关重要的作用。在结直肠癌、卵巢癌、黑色素瘤中,与抗肿瘤T细胞启动和I型干扰素相关的STING信号被严重抑制以逃避免疫监视。STING在胃癌组织中低表达,与肿瘤大小、肿瘤浸润深度、淋巴转移、临床病理分期和生存率有关。敲除STING可促进胃癌细胞的增殖、克隆形成、迁移和侵袭。此外,多项研究表明,STING激动剂可以作为单药或联合手术治疗、放化疗、免疫治疗发挥抗肿瘤作用,弥补传统疗法的不足。研究目的:目前,尚不清楚STING在宫颈癌发生发展过程中的具体作用。本研究检测了人角质形成细胞、宫颈上皮永生化细胞以及四种宫颈癌细胞系中STING的表达情况。通过构建沉默STING和过表达STING的稳定转染宫颈癌细胞系,进行细胞生物学行为实验探讨STING对于宫颈癌细胞增殖、迁移、侵袭能力的影响和相关调控机制。此外,通过构建裸鼠皮下移植瘤模型进行体内实验对体外实验的结果进行验证,为宫颈癌预防和宫颈癌复发或转移的治疗提供新的思路。研究方法:第1部分:STING对宫颈癌增殖、迁移、侵袭能力影响的体外实验1、通过qRT-PCR及蛋白质免疫印迹实验检测体外培养的人角质形成细胞Ha Ca T、宫颈上皮永生化细胞H8、四种宫颈癌细胞系(He La、Si Ha、C33A、Ca Ski)的STING m RNA和蛋白表达情况;2、构建沉默STING的sh RNA慢病毒载体。选择He La、Si Ha细胞系作为沉默STING的转染细胞系。设计构建STING基因的过表达慢病毒载体,转染C33A细胞系。鉴定稳定转染细胞系中STING的表达情况;3、通过CCK8实验、平板克隆实验、细胞划痕实验和Transwell小室实验探究STING对于宫颈癌细胞的增殖、迁移、侵袭能力的影响。第2部分:STING调控宫颈癌细胞生物学行为信号通路的探索1、下调STING表达后,采用蛋白质免疫印迹实验检测β-catenin的总蛋白、活化蛋白以及核蛋白中的含量,检测Wnt通路下游靶基因(cyclin D1,c-Myc,MMP9)表达水平;2、上调STING表达后,采用蛋白质免疫印迹实验检测β-catenin的总蛋白、活化蛋白以及核蛋白中的含量,检测Wnt通路下游靶基因(cyclin D1,c-Myc,MMP9)表达水平;3、应用免疫共沉淀实验检测STING是否与β-catenin结合;4、下调STING表达的同时联用β-catenin通路抑制剂,采用蛋白质免疫印迹实验检测β-catenin的总蛋白、活化蛋白以及核蛋白中的含量,检测Wnt通路下游靶基因(cyclin D1,c-Myc,MMP9)表达水平;5、下调STING表达的同时联用β-catenin通路抑制剂,通过CCK8实验、平板克隆实验和Transwell小室实验探究下调STING表达对宫颈癌生物学行为的影响能否被β-catenin通路抑制剂所逆转。第3部分:沉默STING对宫颈癌细胞增殖能力影响的体内实验1、使用vector He La、sh STING-He La细胞系构建裸鼠皮下移植瘤模型,探究移植瘤沉默STING对裸鼠体重影响;2、通过测量裸鼠移植瘤体积和绘制肿瘤生长曲线验证下调STING表达对于宫颈癌细胞体内增殖能力的影响;3、肿瘤组织进行HE染色,探究下调STING表达是否影响肿瘤组织病理形态;4、肿瘤组织进行免疫组化染色,验证沉默STING的He La细胞在体内成瘤后是否仍保持沉默STING的特征;5、通过免疫组化染色Ki67探究沉默STING对于移植瘤增殖能力的影响。研究结果:第1部分:1、qRT-PCR及蛋白质免疫印迹实验显示在人角质形成细胞、宫颈上皮永生化细胞、4种宫颈癌细胞系中STING表达水平有差异。与正常细胞相比,HPV阴性宫颈癌细胞系C33A中的STING表达降低,其余三种HPV阳性宫颈癌细胞系(He La、Si Ha、Ca Ski)STING表达升高;2、成功合成了靶向STING的sh RNA并筛选出干扰效率最高的sh RNA片段。成功构建并验证沉默STING基因的He La和Si Ha稳转细胞系的STING蛋白、m RNA水平与对照组相比均存在显着统计学差异。STING过表达慢病毒载体构建成功,成功构建并验证过表达STING基因的C33A稳转细胞系的STING蛋白、m RNA水平与对照组相比均存在显着统计学差异;3、STING表达下调后,He La及Si Ha细胞增殖、克隆形成、迁移和侵袭能力增强。过表达STING基因后,C33A细胞体外增殖、克隆形成、迁移和侵袭的能力明显下降。第2部分:1、沉默STING后,Western blot显示β-catenin蛋白总表达量及活化的β-catenin蛋白表达量、细胞核β-catenin蛋白含量明显增加,Wnt通路下游靶基因(cyclin D1,c-Myc,MMP9)表达水平也随之升高;2、STING过表达后,Western blot显示β-catenin蛋白总表达量及活化的β-catenin蛋白表达量、细胞核β-catenin蛋白含量明显减少,Wnt通路下游靶基因(cyclin D1,c-Myc,MMP9)表达水平也随之明显降低;3、免疫共沉淀实验显示内源性STING可与β-catenin结合;4、沉默STING的同时联用β-catenin通路抑制剂,显示β-catenin蛋白总表达量及活化的β-catenin蛋白表达量、Wnt通路下游靶基因(cyclin D1,c-Myc,MMP9)表达水平与单纯沉默STING组比较明显降低;5、沉默STING的同时联用β-catenin通路抑制剂显示细胞体外增殖速度、克隆形成能力、迁移和侵袭的能力明显低于单纯沉默STING组。第3部分:1、裸鼠接种移植瘤后,sh STING-He La组裸鼠体重呈低于vector-He La组趋势,但趋势无统计学意义;2、sh STING-He La组肿瘤体积和生长速度明显大于对照组;3、HE染色显示vector-He La组形成的肿瘤病灶中细胞排列紧密、胞核深染、细胞形态呈卵圆形;sh STING-He La组形成的肿瘤病灶中细胞排列紊乱、血管组织较丰富;4、免疫组化染色显示体外构建的sh STING-He La细胞系成瘤后,STING低水平表达特征保留;5、免疫组化染色显示sh STING-He La组Ki67表达水平高于vector He La组Ki67表达水平。研究结论:1、不同类型的宫颈癌细胞STING表达水平不同,但STING的细胞生物学作用相同。STING可抑制宫颈癌细胞增殖、迁移、侵袭,在宫颈癌的发生发展中起抑癌基因作用;2、STING下调宫颈癌Wnt/β-catenin信号通路中总β-catenin蛋白、活化β-catenin蛋白、核β-catenin蛋白以及Wnt通路下游靶基因(cyclin D1,c-Myc,MMP9)蛋白表达水平;3、Wnt/β-catenin通路抑制剂ICG001可显着逆转沉默STING导致的宫颈癌细胞中Wnt/β-catenin通路相关蛋白质的表达上调。4、Wnt/β-catenin通路抑制剂ICG001可显着逆转沉默STING导致的宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的上调。5、STING通过抑制Wnt/β-catenin信号通路抑制宫颈癌的发生发展。6、沉默STING对宫颈癌细胞体内增殖能力有促进作用。

贺屏雅[2](2021)在《药用真菌桑黄通过内质网应激—线粒体损伤诱导人宫颈癌细胞凋亡》文中研究表明桑黄是一类大型药用真菌的统称,桑黄孔菌属(Sanghuangporus)目前共包括14个物种,其中,中国有9个物种,主要用于缓解妇科肿瘤症状如阴道出血、白带、腹痛、腹部肿块等。Sanghuangprous vaninii是桑黄孔菌属最常见的一个种。桑黄又称桑耳,中国最早的中药学着作《神农本草经》对其药用价值进行了记载。桑黄这一名称首次出现在唐朝甄权所着的《药性论》中。对其植物化学研究表明,桑黄的主要次级代谢产物主要为多糖、黄酮、萜类、吡咯烷酮等。现代药理学证明其具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎等多种生物学活性。因此,桑黄有可能用于妇科肿瘤的治疗。然而,目前仍缺乏其对最常见的妇科肿瘤—宫颈癌的抗肿瘤活性及其作用机制的研究。目的:研究桑黄提取物对人宫颈癌Si Ha细胞的抗肿瘤作用及相关的分子作用机制,为桑黄的临床应用提供科学依据。方法:采用紫外分光光度法检测桑黄包括多糖、黄酮、酚类、三萜在内的主要活性成分含量。分别采用硫酸-蒽酮、福林-酚、亚硝酸-硝酸铝和香草醛-冰醋酸法对4种主要成分进行含量测定。选用人大细胞肺癌细胞(H460)、人宫颈癌细胞(Si Ha)、人乳腺癌细胞(MDA-MB-231)、人肝癌细胞(SMMC-7721)、人肝癌细胞(BEL-7402)和人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)为待检细胞株,采用CCK-8检测细胞活力。应用透射电镜确定Si Ha细胞的超微结构变化。通过流式细胞仪测定细胞周期分布,细胞凋亡,线粒体膜电位,细胞内活性氧及钙离子。使用PI染料检测不同浓度桑黄提取物对Si Ha细胞周期分布的影响。使用Annexin V-FITC/PI检测定量检测桑黄提取物诱导的凋亡细胞的比例。使用JC-1探针检测桑黄提取物处理Si Ha细胞48小时后其线粒体膜电位的变化。使用DCFH-DA检测Si Ha细胞内活性氧水平的变化。使用Fluo-3 AM检测Si Ha细胞内钙离子水平的变化来评价桑黄提取物是否引起细胞内钙离子超载。Western blot分析用于探讨内质网应激和凋亡相关蛋白表达水平的变化。通过裸鼠皮下异种移植模型评估了其体内抗肿瘤作用。结果:桑黄抑制肿瘤细胞增殖的物质基础可能是以三萜、黄酮和酚类物质为主,桑黄提取物在体内和体外显着抑制Si Ha细胞的增殖。阻滞细胞周期并引起细胞凋亡导致了桑黄提取物诱导的细胞死亡。桑黄提取物可以将Si Ha细胞周期阻滞在G0/G1期,增加Si Ha细胞凋亡的比例,尤其是早期凋亡的比例。桑黄提取物诱导了内质网应激,其表现为GRP78和CHOP的表达升高,并伴有钙(Ca2+)的释放。Ca2+过载和氧化应激促进线粒体膜电位的下降,并随后激活caspase-3和-9,最终导致细胞凋亡。结论:桑黄提取物在体内外对人宫颈癌细胞Si Ha细胞有显着地抑制作用。其作用机制可能与阻滞细胞周期并诱导细胞发生内质网应激-线粒体途径凋亡有关。

陈伟妍[3](2021)在《基于PI3K/AKT/mTOR信号通路探讨熊果酸诱导胃癌细胞凋亡及自噬性死亡的机制研究》文中提出目的:本实验运用细胞学、细胞生物学、分子生物学、裸鼠移植瘤实验等技术手段,通过熊果酸对裸鼠体内胃癌移植瘤的干预实验及体外胃癌细胞MGC-803干预实验,从细胞水平及分子水平探讨熊果酸对体内、外胃癌细胞凋亡及自噬性死亡的影响,分析凋亡及自噬性死亡的发生机制,为熊果酸抗胃癌的治疗提供丰富的实验依据,为胃癌的中医药治疗提供理论支持。材料与方法:1.熊果酸干预PI3K/AKT/mTOR信号通路诱导胃癌移植瘤细胞凋亡及自噬性死亡第一部分实验选取雄性BALB/c裸鼠为研究动物,建立人胃癌MGC-803细胞皮下移植瘤动物模型。实验动物分两组:模型组及熊果酸干预组。首先通过观察肿瘤,探明熊果酸具有抑制胃癌细胞增殖的作用。进一步通过免疫组织化学染色法及免疫印迹法检测凋亡相关蛋白Caspase 3、Caspase 9、Bax、Bcl-2表达情况,探明熊果酸具有诱导胃癌细胞凋亡的作用。检测自噬性死亡相关蛋白LC3、Beclin-1、P62表达情况,探明熊果酸具有诱导胃癌细胞自噬性死亡的作用。最后利用免疫组织化学法及免疫印迹法,阐明熊果酸通过干预PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制胃癌组织生长,抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡及自噬性死亡。2.熊果酸干预PI3K/AKT/mTOR信号通路诱导胃癌细胞凋亡第二部分实验选取人胃癌细胞MGC-803进行培养,建立人胃癌细胞模型。首先通过倒置相差显微镜观察细胞数量变化与形态学改变明确细胞的生长状态,探明熊果酸具有抑制胃癌细胞生长的作用。利用CCK8法探明不同浓度熊果酸对胃癌细胞MGC-803生长的抑制作用。筛选组实验浓度分别为0、20、40、60、80(μmol/L),时间分别为0、12、24、36、48、72(h)。筛选出熊果酸最佳药物作用浓度40μmol/L与时间48h。实验分为三组:对照组、40μmol/LUA干预组、40μmol/LUA+Z-VAD-FMK组。时间设定为48h。利用流式细胞术法检测各组细胞凋亡水平,探明熊果酸具有诱导胃癌细胞凋亡的作用。通过免疫印迹法检测凋亡相关蛋白Caspase 3、Caspase 9、Bax、Bcl-2表达情况,探明熊果酸具有诱导胃癌细胞凋亡的作用。通过免疫印迹法检测PI3K/AKT/mTOR信号通路相关蛋白PI3K、p-AKT、p-mTOR表达情况,阐明熊果酸干预PI3K/AKT/mTOR信号通路诱导胃癌细胞MGC-803凋亡。3.熊果酸干预PI3K/AKT/mTOR信号通路诱导胃癌细胞自噬性死亡第三部分实验选取人胃癌细胞MGC-803进行培养,建立人胃癌细胞模型。实验细胞分组:对照组,40μmol/LUA干预组、40μmol/LUA+3-MA组。时间设定为48h。首先通过MDC法制成玻片倒置荧光显微镜下观察细胞内绿色点状荧光信号表达的数量及强度变化情况,及利用双荧光m RFP-e GFP-LC3质粒转染细胞法,荧光显微镜下观察细胞内红色和绿色点状荧光的数量变化,探明熊果酸具有诱导胃癌细胞发生自噬性死亡的作用。利用免疫印迹法,观察各组细胞自噬性死亡相关蛋白LC3、Beclin-1、P62表达情况,探明熊果酸具有抑制胃癌细胞自噬性死亡的作用。最后利用免疫印迹法及免疫荧光细胞化学染色法检测PI3K、p-AKT、p-mTOR及ULK1蛋白表达情况,阐明熊果酸干预PI3K/AKT/mTOR信号通路诱导胃癌细胞MGC-803自噬性死亡。结果:1.熊果酸干预PI3K/AKT/mTOR信号通路诱导胃癌移植瘤细胞凋亡及自噬性死亡第一部分实验构建胃癌细胞MGC-803裸鼠皮下移植瘤模型成功。熊果酸对裸鼠胃癌移植瘤的生长具有明显抑制作用。与模型组相比,熊果酸干预组移植瘤体积明显减小,差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组相比,熊果酸干预组移植瘤质量明显减小,差异有统计学意义(P<0.05)。免疫组织化学染色法检测细胞增殖指数结果:与模型组相比,熊果酸干预组中PCNA蛋白表达减少。与模型组相比,熊果酸干预组中Ki67蛋白表达减少。免疫组织化学染色法检测凋亡相关蛋白表达结果:与模型组相比,熊果酸干预组中Cleaved-caspase 3、Cleaved-caspase 9蛋白表达增加,Bax蛋白表达增加,Bcl-2蛋白表达减少。免疫印迹法检测凋亡相关蛋白结果:与模型组相比,熊果酸干预组中Cleaved-caspase 3、Cleaved-caspase 9蛋白表达水平显着增加,Bax蛋白表达水平也显着增加,Bcl-2蛋白表达水平显着减少,差异有统计学意义(P<0.05)。免疫组织化学染色法检测自噬相关蛋白结果:与模型组相比,熊果酸干预组中LC3Ⅱ蛋白表达增加,Beclin-1蛋白表达增加,P62蛋白表达减少。免疫印迹法检测自噬相关蛋白表达结果:与模型组相比,熊果酸干预组中LC3Ⅱ蛋白表达水平显着增加,Beclin-1蛋白表达水平也显着增加,P62蛋白表达水平显着减少,差异有统计学意义(P<0.05)。免疫组织化学染色法检测PI3K/AKT/mTOR信号通路相关蛋白表达结果:与模型组相比,熊果酸干预组中PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表达减少,ULK1蛋白表达增加。免疫印迹法检测PI3K/AKT/mTOR信号通路相关蛋白表达结果:与模型组相比,熊果酸干预组中PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表达水平显着减少,ULK1蛋白表达水平显着增加,差异有统计学意义(P<0.05)。2.熊果酸干预PI3K/AKT/mTOR信号通路诱导胃癌细胞凋亡倒置相差显微镜观察细胞生长状态结果:对照组胃癌细胞生长旺盛,呈上皮细胞样型,细胞大小不等,多角形或细长形,细胞轮廓清晰,细胞核较大,细胞间连接比较紧密。随着浓度增加,胃癌细胞数量减少。CCK8法检测结果:0-80μmol/L的熊果酸对胃癌细胞生长的抑制作用,随着熊果酸浓度的增加而增加。熊果酸具有抑制胃癌细胞生长的作用,并呈浓度和时间依赖性。熊果酸的最佳药物作用浓度是40μmol/L,最佳药物作用时间是48h。流式细胞术法检测细胞凋亡结果:与对照组比,40μmol/LUA干预组中细胞凋亡率显着增加,差异有统计学意义(P<0.05)。与40μmol/LUA干预组相比,40μmol/LUA+Z-VAD-FMK组中细胞凋亡率显着降低,差异有统计学意义(P<0.05)。流式细胞术法检测显示,凋亡抑制剂仅抑制熊果酸诱导部分胃癌细胞发生死亡,提示除凋亡外胃癌细胞仍存在其它死亡形式。免疫印迹法检测凋亡相关蛋白表达结果:与对照组相比,40μmol/LUA干预组中Cleaved-caspase 3、Cleaved-caspase 9蛋白表达水平显着增加,Bax蛋白表达水平也显着增加,Bcl-2蛋白表达水平显着减少,差异有统计学意义(P<0.05)。与40μmol/LUA干预组相比,40μmol/LUA+Z-VAD-FMK组中Cleaved-caspase 3、Cleaved-caspase 9蛋白表达水平显着减少,Bax蛋白表达水平也显着减少,Bcl-2蛋白表达水平显着增加,差异有统计学意义(P<0.05)。免疫印迹法检测PI3K/AKT/mTOR信号通路相关蛋白表达结果:与对照组相比,40μmol/LUA干预组中PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表达水平显着减少,差异有统计学意义(P<0.05)。与40μmol/LUA干预组相比,40μmol/LUA+Z-VAD-FMK组中PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表达水平显着增多,差异有统计学意义(P<0.05)。3.熊果酸干预PI3K/AKT/mTOR信号通路诱导胃癌细胞MGC-803自噬性死亡采用MDC法检测细胞自噬性死亡结果:与对照组相比,40μmol/LUA干预组细胞内绿色点状荧光数量增多、强度增加。与40μmol/LUA干预组相比,40μmol/LUA+3-MA组细胞内绿色点状荧光数量减少、强度减弱。采用双荧光m RFP-e GFP-LC3质粒转染细胞法检测细胞自噬性死亡结果:与对照组相比,40μmol/LUA干预组中黄色和红色点状荧光数量均显着增加,差异有统计学意义(P<0.05)。与40μmol/LUA干预组相比,40μmol/LUA+3-MA组中黄色和红色点状荧光数量均显着减少,差异有统计学意义(P<0.05)。采用免疫印迹法检测自噬相关蛋白表达结果:与对照组相比,40μmol/LUA干预组中LC3Ⅱ蛋白表达水平显着增加,Beclin-1蛋白表达水平也显着增加,P62蛋白表达水平显着减少,差异有统计学意义(P<0.05)。与40μmol/LUA干预组相比,40μmol/LUA+3-MA组中LC3Ⅱ蛋白表达水平显着减少,Beclin-1蛋白表达水平也显着减少,P62蛋白表达水平显着增加,差异有统计学意义(P<0.05)。免疫印迹法检测PI3K/AKT/mTOR信号通路相关蛋白表达结果:与对照组相比,40μmol/LUA干预组中PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表达水平显着减少,其下游ULK1蛋白表达水平显着增加,差异有统计学意义(P<0.05)。与40μmol/LUA干预组相比,40μmol/LUA+3-MA组中PI3K、p-AKT、p-mTOR、ULK1蛋白表达水平无显着差异,差异无统计学意义(P>0.05)。免疫荧光细胞化学染色方法检测各组细胞PI3K/AKT/mTOR信号通路相关蛋白表达结果:与对照组相比,40μmol/LUA干预组中ULK1蛋白表达增加,PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表达减少。与40μmol/LUA干预组相比,40μmol/LUA+3-MA组中PI3K、p-AKT、p-mTOR、ULK1蛋白表达情况无显着变化。结论:1.熊果酸具有抑制体内、外胃癌细胞生长的作用。2.熊果酸通过诱导胃癌细胞凋亡及自噬性死亡,从而抑制胃癌细胞生长。3.熊果酸诱导胃癌细胞凋亡及自噬性死亡,从而抑制胃癌细胞生长是通过干预PI3K/AKT/mTOR信号通路实现的。

徐中华[4](2021)在《重组人血管内皮抑素对宫颈癌放疗敏感性的调控作用和机制研究》文中研究指明研究背景宫颈癌是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤,在我国女性恶性肿瘤中发病率仅次于乳腺癌。目前,其治疗方式主要采用手术、化疗和放疗的综合治疗。然而,辐射抵抗常常导致局部复发和远处转移进而造成治疗失败。因此,研究宫颈癌放疗抵抗分子机制,筛选潜在的分子靶点和有效的辐射增敏药物,对提高宫颈癌的放射敏感性至关重要。重组人血管内皮抑素是一种抑制血管内皮细胞迁移及新生血管生成的生物抑制剂。有研究表明其联合放疗对口腔鳞状细胞癌和食管癌治疗中表现协同效果,但该联合疗法治疗宫颈癌的效果及具体机制尚不清楚。研究目的探究重组人血管内皮抑素对宫颈癌放疗敏感性的影响及其可能的分子机制,以期为宫颈癌患者提供一种安全有效的治疗方案。研究方法采用CCK-8法探究梯度浓度的重组人血管内皮抑素及其联合放疗对Hela,Siha和HUVEC细胞活力的抑制效果。应用平板克隆实验探究重组人血管内皮抑素联合放疗对Hela,Siha细胞克隆形成能力的影响。此外,采用流式细胞术检测重组人血管内皮抑素联合放疗对Hela,Siha细胞和HUVEC细胞凋亡和周期分布的影响。通过小管形成实验探究其联合放疗对HUVEC细胞小管结构形成的影响。此外,细胞免疫荧光检测联合处理后HUVEC细胞中γ-H2AX的表达情况。为进一步明确重组人血管内皮抑制素对HUVEC细胞放疗增敏机制,通过Western blot检测VEGFR及其下游信号通路激活情况。建立宫颈癌裸鼠皮下移植瘤模型,探究重组人血管内皮抑制素联合放疗对肿瘤生长的抑制作用。采用免疫组化实验探究各组肿瘤组织中微血管密度(MVD)和周细胞覆盖率(αSMA)的变化并通过ELISA检测各组裸鼠血清中VEGF-A表达情况。研究结果梯度浓度的重组人血管内皮抑素在处理24 h后表现出对HUVEC细胞抑制效果,并在200μg/m L出现统计学差异,对宫颈癌Hela和Siha细胞均未表现抑制效果;此外,重组人血管内皮抑素促进放疗对HUVEC细胞抑制效果(P<0.05)。平板克隆实验表明重组人血管内皮抑素对宫颈癌细胞未表现出辐射增敏的协同作用。流式细胞术结果表明重组人血管内皮抑素促进放疗对HUVEC细胞凋亡和G2/M期阻滞(P<0.05),对Hela和Siha细胞未表现出明显促进效果。小管形成实验结果显示重组人血管内皮抑素联合放疗可以显着抑制HUVEC细胞小管结构形成(P<0.05)。细胞免疫荧光结果表明放疗可以明显促进细胞内γH2AX焦点形成(P<0.05);此外,重组人血管内皮抑素联合放疗处理6 h后HUVEC细胞中γH2AX焦点形成受到抑制(P<0.05)。Western blot结果表明重组人血管内皮抑素可以抑制HUVEC细胞中VEGFR2/PI3K/AKT/DNA-PKcs的磷酸化,而对细胞中HIF-1α表达无明显影响。宫颈癌裸鼠移植瘤模型表明,与对照组相比,重组人血管内皮抑素处理组裸鼠的体积和重量均未发生明显改变,而放疗和重组人血管内皮抑素联合放疗处理组裸鼠的体积和重量明显减小(P<0.05);此外,与单独放疗处理组相比,重组人血管内皮抑素联合放疗处理组裸鼠的体积和重量稍减小,未见明显统计学差异(P>0.05)。免疫组化结果表明,与对照组相比,重组人血管内皮抑素和放疗及重组人血管内皮抑素联合放疗处理均可以抑制肿瘤组织中微血管密度和周细胞覆盖率(P<0.05);与单独放疗处理组相比,重组人血管内皮抑素联合放疗处理组肿瘤组织中微血管密度进一步降低(P<0.05),而周细胞覆盖率表达没有明显变化。ELISA实验结果表明,与对照组相比,重组人血管内皮抑素和放疗单独处理组血清中的VEGF-A表达没有明显变化,而重组人血管内皮抑素联合放疗可以显着抑制血清中的VEGF-A表达(P<0.05)。研究结论重组人血管内皮抑素及其联合放疗可以抑制HUVEC细胞增殖,促进放疗诱导HUVEC细胞凋亡和G2/M期阻滞,而对Hela和Siha细胞没有促进效果。此外,进一步抑制HUVEC细胞小管结构形成和放疗诱导DNA损伤修复。在宫颈癌裸鼠移植瘤模型中,重组人血管内皮抑素对放疗抗肿瘤促进效果不明显,联合处理可以显着抑制肿瘤组织中微血管密度和血清中VEGF-A的表达,而重组人血管内皮抑素对放疗抑制周细胞覆盖率没有促进效果。体内外实验结果说明重组人血管内皮抑素联合放疗通过VEGF/VEGFR途径抑制HUVEC细胞DNA损伤修复促进其凋亡,进而降低肿瘤组织中微血管密度。

郭秋芬[5](2020)在《阿帕替尼联合放化疗对宫颈癌抗肿瘤作用的临床研究及机制研究》文中研究说明第一章阿帕替尼联合放化疗治疗复发、晚期宫颈癌的疗效及安全性的临床研究目的:阿帕替尼(Apatinib),是一种酪氨酸激酶活性的抑制剂(TKI),它可以高度选择性的抑制血管内皮生长因子受体2(vascular endothelial growth factor receptor 2,VEGFR2),在多种实体肿瘤治疗中均表现出良好的安全性和积极的治疗效果。这部分的临床研究目的是评价阿帕替尼(Apatinib)联合同步放化疗治疗复发、晚期宫颈癌的临床疗效和安全性。方法:对2016年7月至2018年5月就诊于山东省肿瘤防治研究院妇瘤科的 59 例IVB期(International Federation of Gynecology and Obstetrics Staging,FIGO分期)初次治疗及治疗后首次复发的宫颈癌患者开展此项随机对照试验。所有符合入选标准的患者(n=59)按1:1被随机分成了两个组,即阿帕替尼组(n=30)和对照组(n=29)。阿帕替尼组首次复发宫颈癌患者采用阿帕替尼联合卡铂-紫杉醇一线化疗方案。阿帕替尼组IVB期初治宫颈癌患者接受阿帕替尼联合卡铂(Carboplatin)-紫杉醇(Paclitaxel)化疗同步后装放疗(concurrent chemo-brachytherapy,CCBT)。对照组内首次复发的患者,给予卡铂(Carboplatin)-紫杉醇(Paclitaxel)静脉联合化疗,对照组内的IVB期初治患者,给予卡铂-紫杉醇化疗同步后装放疗。结果:59例入组患者中,7例因多种因素于疗效评价前即终止临床试验。最终纳入分析的共52例(阿帕替尼组28例,对照组24例),两组患者的年龄、ECOG评分、体重指数、转移部位、转移数目、分化程度、肿瘤病理类型、手术史和治疗方式等基本特征相似。此临床试验中,受试者的中位随访的时间(PFS)是14.0个月,截止到随访截止日(2019-4-30),已有27例受试者死亡,占总人数的51.9%。疗效评价显示,阿帕替尼组内,中位总无进展生存期(progression-free-survival,PFS)较对照组明显延长(10.1 月 vs 6.4 月,P<0.01;HR,0.44,P<0.01)。分层分析显示,首次复发宫颈癌患者,阿帕替尼联合化疗组患者的中位PFS,相比于单纯化疗组明显升高(10.1月vs 6.4月,P<0.01)。IVB期初治宫颈癌患者,阿帕替尼联合同步放化疗(CCBT)的患者比对照组只是接受了 CCBT的患者,她们的的中位PFS显着增加(10.3月vs 6.1月,P<0.01)。Apatinib组受试者的客观缓解率(ORR,objective response rate),明显的比对照组要高(64.3%vs 33.3%,P<0.05),差异有显着性。多因素分析结果可以看出,骨转移(P<0.001)、腺癌(P<0.05)和阿帕替尼联合治疗(P<0.01)是疾病独立的预后因素,骨转移和病理类型为腺癌预后较差,可导致PFS缩短,而阿帕替尼联合治疗作为保护因素,延长了患者的PFS。安全性评估分析显示,阿帕替尼组的蛋白尿、粘膜炎、手足综合征和高血压等并发症,各级别的发生率均要明显高于对照组(P<0.05),当阿帕替尼减量或给予受试者对症治疗时,严重的副反应可得到充分缓解。阿帕替尼未明显加重放化疗的其他副作用。结论:阿帕替尼联合同步放化疗或联合单纯化疗对复发、晚期宫颈癌患者具有良好的疗效,可延长PFS,提高ORR,且毒副作用可控。阿帕替尼与放化疗具有协同抗肿瘤作用。第二章阿帕替尼联合放疗对人宫颈癌SiHa及HeLa细胞裸鼠移植瘤抑制作用的实验研究研究目的:放射治疗在宫颈癌的治疗过程中,有其非常重要的地位,部分患者放疗不敏感导致放疗效果较差。阿帕替尼(Apatinib)作为高度选择性VEGFR2抑制剂,因其抗血管生成机制使其成为潜在的放疗增敏剂。但是阿帕替尼联合放疗在宫颈癌治疗领域的实验研究少见报道,且机制不清。在本章节中,我们通过建立人宫颈癌SiHa及HeLa细胞裸鼠移植瘤模型,进一步验证阿帕替尼在体内实验,即宫颈癌裸鼠移植瘤模型中的抗肿瘤作用及其对肿瘤细胞放疗敏感性的影响,并对其可能的分子机制进行初步探索。研究方法:这部分实验选取的人宫颈癌细胞系是SiHa及HeLa细胞系,以其为研究对象,建立人宫颈癌细胞裸鼠皮下移植瘤模型,并分组观察疗效。每种模型具体分为4组:①对照组;②Apatinib组;③放疗组;④Apatinib+放疗组。通过绘制肿瘤生长曲线观察对比各组的疗效差异。通过对荷瘤裸鼠进行血细胞分析及心、肝、肾组织的HE染色观察药物的安全性及毒副作用。通过免疫组化法检测CD31蛋白的表达情况,测算微血管密度(MVD)的改变验证Apatinib在裸鼠移植瘤模型中的抗血管生成作用,通过检测PCNA、Ki-67表达检测其对肿瘤细胞增殖的影响,通过检测BCL-2表达检测其对肿瘤细胞凋亡的影响。Western blotting 检测 VEGFR2 通路和 JAK2/STAT3 通路关键分子 VEGFR2/p-VEGFR2,JAK2/p-JAK2,STAT3/p-STAT3及下游缺氧诱导因子HIF-1α表达,初步探索阿帕替尼对宫颈癌细胞VEGFR2通路及JAK2/STAT3通路活化状态的影响及其下游靶基因HIF-1α分子表达的影响。研究结果:①荷瘤裸鼠血细胞分析显示:荷瘤裸鼠的Apatinib组和Apatinib+放疗组,与对照相比,可见白细胞计数轻度下降,并可见轻度的贫血,但是差异不显着(P>0.05)。血细胞分析结果未见其他血液学毒性反应。②各实验组荷瘤裸鼠的心、肝、肾组织经HE染色证实均未见明显损害,与对照组无明显差异。③宫颈癌裸鼠皮下异位移植瘤的生长曲线(Growth curve)的结果可以看出:Experimental组肿瘤生长较Control组均减慢,Apatinib+放疗组肿瘤最小。SiHa细胞移植瘤生长速度及最终重量依次为:对照组(1.80g±0.60g)>Apatinib组(0.97g±0.17g)>放疗组(0.33g±0.23g)>Apatinib+放疗组(0.32g±0.08g),有统计学差异(P<0.05)。HeLa细胞移植瘤依次为:对照组(1.01g±0.30g)>放疗组(0.74g±0.32g)>Apatinib 组(0.57g±0.20g)>Apatinib+放疗组(0.48g±0.26g),有统计学差异(P<0.05)。SiHa和HeLa两种细胞的裸鼠移植瘤,Apatinib+放疗联合治疗组的抑瘤率最高,SiHa细胞移植瘤Apatinib+放疗组的抑瘤率(84.4%±4.38%)明显高于Apatinib组(46.24%±9.52%)及放疗组(71.03%±12.85%)。HeLa 细胞移植瘤 Apatinib+放疗组抑瘤率(73.04%±6.04%)也高于 Apatinib 组(43.59%±19.82%)及放疗组(52.33%±3.25%)。④通过对移植瘤进行CD31免疫组化检测,测得各组的肿瘤微血管密度(MVD)。结果可以看出:实验组的微血管密度与对照组相比较,可以看到显着降低,尤其是Apatinib+放疗联合治疗组,其MVD最低,对血管生成抑制的作用是各组中最强的,有统计差异(P<0.01)。通过免疫组化的方法,我们检测各组的PCNA、Ki-67以及BCL-2分子的蛋白表达情况,分析发现Apatinib及放疗均可抑制上述分子表达,Apatinib+放疗联合治疗组表达最低(P<0.01),对肿瘤增殖抑制作用最强。⑤宫颈癌SiHa细胞裸鼠移植瘤在Apatinib药物干预后,经western blotting方法证实其可通过去磷酸化抑制VEGFR2通路及JAK2/STAT3通路活性,进一步抑制通路的下游分子HIF-1 α表达。Apatinib+放疗联合治疗组的信号分子p-VEGFR2,p-JAK2,p-STAT3表达较放疗组明显下降,相关信号通路抑制更明显,HIF-1 α表达也更低。宫颈癌HeLa细胞裸鼠移植瘤在Apatinib药物干预后各项指标与SiHa细胞趋势具有一致性。研究结论:①肿瘤生长曲线结果显示Apatinib可增加SiHa及HeLa裸鼠移植瘤对放射线的敏感性;②宫颈癌SiHa及HeLa细胞裸鼠移植瘤模型中,VEGFR2信号通路及JAK2/STAT3信号通路存在且处于高表达状态。③Apatinib对宫颈癌SiHa及HeLa细胞裸鼠移植瘤的放疗增敏效果可能是通过抑制VEGFR2通路及JAK2/STAT3通路活性,抑制下游HIF-1 α分子的表达,抑制肿瘤异常血管形成而实现的。第三章Apat i n i b通过VEGFR2通路及JAK2/STAT3信号通路增加宫颈癌细胞放疗敏感性的机制研究研究目的:阿帕替尼(Apatinib)高度选择性抑制VEGFR2通路,本文第二部分我们在体内动物实验中,已经证明了 Apatinib可以增加宫颈癌细胞裸鼠移植瘤对放射线的敏感性,并发现其放疗增敏效果与JAK2/STAT3通路密切相关。本部分实验,将通过建立体外的宫颈癌SiHa及Hela细胞实验模型,进一步探讨Apatinib对宫颈癌细胞放射线敏感性影响的机制。研究方法:(1)应用CCK-8实验,检测阿帕替尼(Apatinib)对宫颈癌细胞(Cervical Cancer Cell)的增殖抑制能力的影响。(2)应用克隆形成实验,建立体外细胞实验模型,检测阿帕替尼(Apatinib)对宫颈癌细胞(Cervical Cαncer Cell)的放射线敏感性的影响。(3)应用western blotting方法检测VEGFR2及JAK2/STAT3信号通路活性状态,以及下游的HIF-1α分子的蛋白表达水平,评价①Apatinib对相关信号通路状态及下游HIF-1α分子表达水平的影响;②Apatinib+放疗联合干预与单纯放疗相比,相关信号通路的活化状态以及下游HIF-1 α分子表达的变化;③Apatinib与STAT3通路阻断剂联合干预与单纯Apatinib干预相比,相关信号通路的活化状态以及下游HIF-1α表达的变化。研究结果:(1)CCK-8实验结果显示:阿帕替尼抑制宫颈癌细胞SiHa及HeLa细胞增殖,其 IC50 分别为(699.4±112.9)μM和(115.8±3.3)μM。(2)克隆集落形成实验结果显示:Apatinib+放疗联合干预组在各实验组中,对细胞增殖的抑制能力是最强的,明显高于放疗组,且抑制作用随着放射线的剂量增高而有所增加。(3)SiHa细胞VEGFR2与JAK2/STAT3信号通路western blotting检测结果显示:①阿帕替尼组(Apatinib)和对照组(Control)相比较而言,VEGFR2分子和STAT3分子表达变化不明显,但是p-VEGFR2,p-STAT3表达均明显下降,表现出明显的去磷酸化趋势;下游HIF-1α分子表达量降低;②Apatinib+放疗组与单纯放疗组相比,VEGFR2,STAT3分子表达变化不明显,Apatinib+放疗组比单纯放疗组的p-VEGFR2,p-STAT3,HIF-1 α分子表达下降明显;③Apatinib与STAT3通路阻断剂联合干预后与Apatinib组相比,STAT3分子表达变化不明显,但是p-STAT3,HIF-1α分子表达下降更明显。HeLa细胞药物干预后western blotting检测各项指标与SiHa细胞趋势具有一致性。研究结论:肿瘤异常血管的形成可导致肿瘤局部缺氧,降低了肿瘤细胞放疗敏感性。同时,缺氧又可调节缺氧诱导因子HIF1-α的增加,作用于血管内皮细胞(vascular endothelial cell,VEC)进一步促进肿瘤血管的生成,形成恶性循环。本篇论文对阿帕替尼放疗增敏机制提出假说:阿帕替尼通过去磷酸化机制抑制宫颈癌SiHa及HeLa细胞VEGFR2通路及JAK2/STAT3信号通路关键信号分子活性,导致下游HIF-1α分子的转录、表达减少,进一步抑制了恶性肿瘤细胞的增殖,而且有效阻断了肿瘤新生血管的形成,打破现有异常的脉管系统,恢复血流灌注及氧供,最终增加肿瘤细胞放疗敏感性。通过本部分实验,SiHa及HeLa细胞均验证了这个结论。

刘昕[6](2020)在《Poly(I:C)对宫颈癌细胞与肿瘤浸润巨噬细胞相互作用的影响及对宫颈癌血管生成的作用》文中研究指明宫颈癌是妇女恶性肿瘤中第四常见的癌症,被认为是高危人乳头瘤病毒(Human papillomavirus,HPV)长期感染的不良结果。大约10%的感染患者发生癌前病变,其中少部分会进展为宫颈癌。HPV疫苗和宫颈癌筛查的普及可有效地降低宫颈癌的发生率。但是宫颈癌存活率并不理想,尤其是晚期患者,同步放化疗是晚期宫颈癌的标准治疗选择。其5年总生存率不足70%,无病生存率仅为58%。然而,治疗性疫苗通过调节宿主体内的免疫系统,从而激发抗肿瘤反应,可能是治疗宫颈癌的一个潜在有效的方法。聚肌胞苗酸(Polyriboinosinic-polyribocytidylic acid,Poly(I:C))是一种人工合成的双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA)类似物,是目前研究最广泛的抗肿瘤疫苗佐剂之一。它可以通过胞内和胞外两种方式激活细胞的先天免疫,并调节适应性免疫,引起一系列免疫炎症因子的释放,发挥抑制肿瘤的作用;此外,对于不同的细胞,poly(I:C)激活Toll样受体3(toll-like re ceptor3,TLR3)、黑色素瘤分化相关抗原5(melanoma differentiation-associated gene 5,MDA5)和维甲酸诱导基因I(retinoic acid inducible gene I,RIG-I),可以起到不同的效应,主要是通过不同途径抑制肿瘤生长,如抑制肿瘤细胞的增生、诱导肿瘤细胞凋亡和促进肿瘤细胞坏死。肿瘤微环境由细胞成分和非细胞成分构成,细胞成分包括肿瘤细胞、免疫细胞和成纤维细胞,非细胞成分包括细胞因子、细胞基质和激素等,而免疫细胞的浸润是肿瘤微环境的标志之一。各种类型的免疫细胞均可浸润肿瘤局部,巨噬细胞是其中最常见的一类。其属于先天性免疫系统,主要作用是识别、吞噬抗原并呈递至T细胞,可以调节获得性免疫应答活性,是先天免疫和获得性免疫之间连接的纽带。宫颈癌具有免疫原性,大量的免疫细胞出现在肿瘤微环境中,poly(I:C)在宫颈癌中的免疫治疗效应及其机制目前研究尚有不足,还需进一步探讨。新生血管的生成对肿瘤的进展和转移有着决定作用,要降低肿瘤的转移和复发,首先要阻止新生血管的生成,这亦是当前肿瘤靶向治疗的研究热点。既往研究发现,宫颈癌组织内微血管密度(microvessel density,MVD)显着高于正常组织,且与淋巴结转移、周边浸润及浸润深度无明显相关,而且MVD越高,其复发率越高。近来有报道poly(I:C)可以联合药物降低裸鼠体内的子宫平滑肌瘤的体积和血管密度,那么poly(I:C)对宫颈癌组织的血管生成作用如何,目前尚无详细报道,为此我们设计了以下研究,探讨poly(I:C)对宫颈癌细胞与肿瘤浸润巨噬细胞(tumor-associated macrophages,TAMs)相互作用的影响及机制;以及 poly(I:C)对宫颈癌血管生成的作用。第一部分poly(I:C)对宫颈癌细胞与肿瘤浸润巨噬细胞募集作用的影响目的肿瘤微环境形成的特点之一即是免疫细胞浸润,这些免疫细胞包括各种T淋巴细胞、不同极化的巨噬细胞及树突状细胞。肿瘤浸润免疫细胞中最常见的细胞类型是属于先天免疫系统的巨噬细胞。poly(I:C)作为有效的佐剂,可以提高多肽疫苗诱导的特异性抗肿瘤免疫应答,但是其作用机制尚未可知。本研究利用transwell小室实验分析poly(I:C)对宫颈癌细胞与肿瘤浸润巨噬细胞的募集的影响,并进一步观察裸鼠宫颈癌移植瘤组织中注射poly(I:C)之后的巨噬细胞浸润的变化,为poly(I:C)在宫颈癌治疗中的应用提供新的理论依据。方法1.观察poly(I:C)处理是否影响宫颈癌细胞对巨噬细胞的募集,利用transwell小室建立的迁移模型来检测这种募集。THP-1来源的巨噬细胞被放置在腔室的上部,下部腔室充满了有/无poly(I:C)作用的宫颈癌细胞条件培养基(conditioned medium,CM)。24h后观察迁移性巨噬细胞的数量。2.建立裸鼠宫颈癌移植瘤模型,待瘤体平均大小约0.6cm时,随机分为两组,分别瘤内局部注射PBS和poly(I:C),每5天用药一次,用药5次后取出移植瘤,免疫组化方法观察两组裸鼠移植瘤内巨噬细胞数量的差别。结果1.Poly(I:C)刺激的宫颈癌细胞CM明显促进THP-1来源巨噬细胞的募集。2.裸鼠宫颈癌移植瘤模型中poly(I:C)组移植瘤内F4/80数量明显大于PBS组。结论在体内体外Poly(I:C)刺激促进宫颈癌细胞对巨噬细胞的募集。第二部分poly(I:C)对宫颈癌细胞与肿瘤相关巨噬细胞细胞因子表达作用及机制的研究目的poly(I:C)激发天然免疫细胞中不同细胞群抗原的产生和表达,从而引起抗肿瘤后天免疫系统。除了对免疫细胞的作用外,Poly(I:C)还可以通过多种凋亡通路诱导细胞凋亡,肿瘤微环境在此过程中起着重要的作用。poly(I:C)对宫颈癌与肿瘤微环境之间是否有影响及机制如何,目前还没有得到充分的探讨。本研究将分析poly(I:C)对宫颈癌细胞及肿瘤浸润巨噬细胞分泌谱的影响及其机制,并利用宫颈癌裸鼠移植瘤模型进一步验证。方法1.用悬浮芯片和荧光定量PCR检测poly(I:C)对宫颈癌细胞多种促炎及抗炎因子分泌的影响2.用ELISA方法检测Poly(I:C)对宫颈癌IL-6表达的调控是否与其浓度和作用时间相关。3.用荧光定量PCR和ELISA方法研究poly(I:C)处理宫颈癌对巨噬细胞细胞因子表达谱的影响。4.研究IL-6是否参与宫颈癌巨噬细胞的分泌调节。首先用对照基因或IL-6 siRNA转染HeLa细胞,抑制IL-6的表达。转染36 h后加入25g/mL poly(I:C),培养12h后收集CM。然后在THP-1诱导巨噬细胞分化的过程中加入CM。在完全分化为THP-1来源的巨噬细胞后,检测细胞因子的转录水平和分泌水平。5.研究IL-6是否参与了宫颈癌细胞对巨噬细胞的募集。THP-1来源的巨噬细胞被放置在腔室的上部,下部腔室充满了 50%的敲除IL-6后未经/经polyIC处理的HeLaCM。并分别设置对照组,24h后观察迁移性巨噬细胞的数量。6.利用western和ELISA方法检测poly(I:C)对宫颈癌细胞作用的相关分子通路。7.建立裸鼠宫颈癌模型,利用体内实验检测poly(I:C)对宫颈癌细胞因子分泌影响。结果1.悬浮芯片和荧光定量PCR结果显示HeLa细胞及CaSki细胞中细胞因子表达基本一致,均不分泌 IL-1β、IL-10、IL-12,而 IL-2、IL-4、IFN-γ、MCP-1 及TNF-α分泌水平较低,且Poly(I:C)处理对这些因子的分泌水平无明显的促进作用。HeLa细胞及CaSki细胞分泌较高水平的IL-6,poly(I:C)处理后显着上调了IL-6的表达水平。2.Poly(I:C)对宫颈癌HeLa细胞及CaSki细胞中IL-6的表达呈剂量依赖性,25μg/mL时影响显着。两株宫颈癌细胞经poly(I:C)处理2h后,IL-6分泌量均有上调。在HeLa细胞中,经poly(I:C)处理10h后,条件反射区IL-6水平相对稳定,而在poly(I:C)处理的前12h,CaSki细胞IL-6水平持续升高.3.我们收集了含poly(I:C)处理和不含poly(I:C)处理的宫颈癌细胞的CM。用PMA诱导THP-1单核细胞系分化为巨噬细胞过程中加入这种条件培养基。结果显示不含poly(I:C)处理的HeLa细胞条件培养基能抑制THP-1衍生巨噬细胞中促炎性细胞因子IL-1和IL-6的表达,而IL-10和CCL22的转录和分泌水平明显升高。相比之下,12h的poly(I:C)处理几乎完全逆转了 HeLa细胞条件培养基对THP-1衍生巨噬细胞分泌的影响。4.利用siRNA抑制HeLa细胞IL-6表达后经poly(I:C)处理,CM对THP-1来源巨噬细胞转录和分泌促炎性细胞因子IL-lβ及IL-6表达的促进作用被抑制,而对IL-10及CCL22表达无明显变化。5.poly(I:C)刺激的宫颈癌细胞CM明显促进THP-1来源巨噬细胞的迁移。本研究进一步探讨IL-6在此过程中的作用。与对照组相比,IL-6 siRNA转染的HeLa细胞条件培养基对巨噬细胞的募集作用明显被抑制。6.本研究发现在HeLa细胞中,poly(I:C)作用5min后NF-κB磷酸化水平上调,在30min时达到高峰,表明信号通路被激活。为了探讨活化的NF-κB信号通路是否参与poly(I:C)调节的IL-6表达,使用常见的NF-κB信号通路抑制剂DDTC(4g/mL)预处理HeLa细胞1 h,然后改变培养基,加入poly(I:C)。EIISA结果表明,PDTA显着地逆转了 poly(I:C)对HeLa细胞分泌IL-6的影响。7.体内模型中poly(I:C)组裸鼠血液中IL-6分泌明显高于PBS对照组。结论poly(I:C)作用于宫颈癌细胞,促进来源于THP-1的Ml型巨噬细胞分泌IL-Iβ和IL-6细胞因子,而对M2型巨噬细胞分泌的细胞因子IL-10和CCL22的表达有抑制作用,通过NF-κB信号通道能上调IL-6的表达,并由此促进巨噬细胞募集。最终改变整个肿瘤微环境的免疫状态。第三部分poly(I:C)对宫颈癌血管生成的作用目的新生血管的生成影响肿瘤的生长,肿瘤的侵袭和转移亦依赖于其生成。肿瘤细胞从这些新生的血管获得充足的营养物质,并且其还是肿瘤细胞浸润转移的必要条件。早期肿瘤浸润和转移是宫颈癌不良预后的首要因素,这些不良预后因素一直困扰着临床决策。抗肿瘤血管生成的靶向药物以其副作用小,耐药低,作用广而广受临床的青睐,poly(I:C)作为抗肿瘤药物的佐剂,其免疫方面的作用已被研究了几十年,但是其在肿瘤血管生成方面的应用研究尚缺乏有力依据。本研究建立宫颈癌移植瘤模型,经poly(I:C)刺激裸鼠移植瘤后,用免疫组化的方法检测移植瘤内的微血管密度,并结合超声造影对移植瘤内血管功能的评价,来分析poly(I:C)对宫颈癌血管生成的作用。方法建立裸鼠宫颈癌皮下移植瘤模型12只,并随机分为用药组和对照组两组,在宫颈癌细胞注入10天后,肿瘤平均大小约0.6cm时,分别瘤内注射PBS、Poly(I:C)(50μg/只),5天给药一次,总共给药5次。用药后,每天观察裸鼠的饮食,精神等日常情况,裸鼠肿瘤的大小每3天测量一次。在末次给药后第4天行超声造影检查,获得移植瘤超声造影的图像资料,用超声造影定量分析软件进行脱机分析。超声造影检查之后处死裸鼠,完整取出肿瘤,用免疫组化方法检测移植瘤组织中CD31和CD34的表达,同时计算移植瘤组织内的微血管密度。结果1.裸鼠一般情况:随着药物的作用时间延长,PBS组裸鼠移植瘤渐渐长大,饮食,活动及精神均较前减弱;Poly(I:C)组裸鼠与用药前相比,无明显改变。2.裸鼠移植瘤大小的变化用药后,发现PBS组裸鼠移植瘤增长速度没有明显变化,而poly(I:C)组用药后移植瘤生长明显减慢,根据测定的移植瘤大小绘制生长曲线。实验结束时实验组移植瘤体积明显小于PBS对照组,两组间比较差异显着(p<0.05)。3.裸鼠移植瘤CD31和CD34免疫组化结果CD31和CD34作为靶向标志物,这两种物质被染成棕黄色,位于血管内皮细胞的胞浆,计数PBS组和Poly(I:C)组CD31和CD34 MVD平均值。两组比较实验组MVD值明显减低,且差异显着(p<0.05)。4.超声造影软件定量分析移植瘤内的血流灌注情况超声造影显示,PBS组移植瘤在造影剂注射后,移植瘤周边慢慢呈环状强化,poly(I:C)组强化不明显。根据不同时间两组移植瘤内的超声造影强度的变化绘制移植瘤造影时间强度曲线。超声造影软件定量分析显示,PBS组和Poly(I:C)组超声造影峰值强度分别为-23.31±0.74db,-52.89±0.41db,PBS组峰值强度明显高于poly(I:C)组,两组比较差异显着(p<0.05)。结论Poly(I:C)可以有效的抑制裸鼠宫颈癌皮下移植瘤的生长和瘤内血管的生成。

赵庆贺[7](2020)在《褪黑素对TNF-α介导的宫颈癌Hela细胞凋亡的影响及其机制研究》文中研究说明宫颈癌(Cervical cancer)是最常见的女性生殖系统恶性肿瘤,根据2018年全球癌症统计显示,在全球女性恶性肿瘤中,宫颈癌每年的新发病例约57万,发病率为6.6%;死亡例数约31万,死亡率为7.5%。在女性肿瘤中,宫颈癌的发病率和死亡率均排在第四位,严重威胁女性的健康和生命。目前,尽管以手术和放疗为主、化疗为辅的治疗模式已经广泛地应用于宫颈癌的治疗中,但是这些传统的治疗方案对于早期患者疗效显着,对于晚期以及复发转移患者的疗效并不理想。而且,手术治疗、放疗和化疗给患者带来的并发症较多,均存在一定的局限性。因此,迫切需要探索更多有效的治疗方法及靶点以期为宫颈癌患者提供更多的治疗选择及临床获益。近年来,免疫治疗在不同的人类恶性肿瘤中得到了令人兴奋的进展。基于细胞因子的免疫治疗可以通过多种机制抑制癌细胞的侵袭和增殖,从而影响癌症的发生和发展。已有研究证实肿瘤坏死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α,TNF-α)具有抑制癌细胞存活的能力,对正常组织无损伤毒性,提示基于TNF-α的免疫治疗是一种有效干预癌症发展的治疗策略。但是,一些研究表明细胞因子免疫治疗的耐药性影响了其临床应用和治疗效果,而且细胞因子免疫治疗的耐药有助于癌细胞从凋亡信号中逃逸。因此,确定增强TNF-α诱导的细胞凋亡的方法是提高治疗效果的关键。线粒体是除红细胞外存在于人体所有细胞中的细胞器,除了在能量产生中起着关键作用外,也在介导哺乳动物细胞凋亡的内在途径中扮演者十分重要的角色。既往研究表明,TNF-α可以通过激活caspase-9依赖的线粒体凋亡途径诱导癌细胞凋亡。因此,我们推测基于TNF-α免疫治疗的耐药可能与线粒体凋亡调节失败有关。最近的研究证实,线粒体可以通过线粒体自噬(mitochondrial autophagy,mitophagy)维持自身的数量和质量。线粒体自噬通过LC3Ⅱ标记受损的线粒体,促进损伤的线粒体进入溶酶体,从而导致有缺陷的线粒体被清除,这种保护机制有助于肿瘤通过及时清除受损的线粒体来阻断线粒体诱导的凋亡。因此,我们认为线粒体自噬可能与基于TNF-α的免疫治疗导致的耐药有关。褪黑素主要是由哺乳动物松果体合成并分泌的一种吲哚胺类激素,对身体的多种生理过程有益。近年来,褪黑素因其在多种肿瘤细胞中的促凋亡作用引起了人们的广泛关注。研究表明,褪黑素通过各种生物学机制发挥抗增殖和促凋亡作用,对乳腺癌、结直肠癌、平滑肌肉瘤、肾细胞癌和胃肠道肿瘤起抑癌作用,是抗癌药或联合治疗的极佳候选药物。化疗药物依托泊苷联合褪黑素可提高源自急性髓性白血病患者的白血病细胞的清除率,褪黑素可以增强顺铂诱导的卵巢癌细胞毒性,促进乳腺肿瘤对阿霉素(DOX)的敏感性以及肿瘤的消退。最近的研究证实了褪黑素对线粒体自噬的抑制作用,如在急性脑损伤中,褪黑素通过调节线粒体自噬来减轻创伤性脑炎。在人类肝细胞癌细胞中,褪黑素通过改变线粒体自噬增加了肝癌细胞对ROS介导的细胞凋亡的敏感性。有关TNF-α与褪黑素协同对人宫颈癌细胞的治疗作用,鲜有资料报道。因此,本研究利用体内外研究方法分别探讨了褪黑素通过调节线粒体自噬对TNF-α诱导的宫颈癌Hela细胞凋亡的影响,并深入研究了与其可能有关的线粒体自噬信号通路,总结如下。第一部分 褪黑素对TNF-α介导的宫颈癌Hela细胞凋亡影响的研究研究目的本部分旨在研究褪黑素对TNF-α介导的宫颈癌Hela细胞凋亡的影响研究方法1.将Hela细胞分为对照组、单用TNF-α组、单用褪黑素组、褪黑素联合TNF-α组。2.采用噻唑蓝比色法(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)及乳酸脱氢酶释放实验(Lactate dehydrogenase,LDH)检测各组对Hela细胞增殖的影响。3.通过TdT介导的dUTP缺口末端标记技术(Terminal deoxynucleotidy transferase-mediated dUTP Nick End Labeling,TUNEL)检测各组 Hela 细胞凋亡的发生率。通过酶联免疫吸附测定试验(Enzyme-linked Immunosorbent Assay,ELISA)检测 caspase-3 的活性以及 Western blot 检测 cleaved caspase-3 的表达水平。4.通过流式细胞术(Flow Cytometry,FCM)检测ROS的产生、线粒体膜通透性转换孔试剂盒检测线粒体膜通透性转换孔(mitochondrial permeablity transition pore,mPTP)开放率、JC-1测定法检测线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,MMP)的变化、免疫荧光检测细胞中Cyt-c的表达水平。5.通过化学发光法检测腺嘌呤核苷三磷酸(Adenosine triphosphate,ATP)含量、Western blot检测线粒体呼吸复合物的表达、ELISA检测线粒体乳酸生成和葡萄糖摄取。结果1.MTT结果显示:TNF-α、褪黑素单独应用时对宫颈癌HeLa细胞的增殖有抑制效应,褪黑素与TNF-α联合应用时抑制率高于TNF-α单用组,差异具有统计学意义(P<0.05)。2.TUNEL检测结果显示:TNF-α、褪黑素单独应用时可促进HeLa细胞的凋亡,褪黑素与TNF-α联合应用时凋亡率高于TNF-α单用组,差异具有统计学意义(P<0.05)。3.ELISA及Western blot结果显示:TNF-α、褪黑素单独应用时caspase-3的活性及cleaved caspase-3的表达水平显着增加,而且褪黑素与TNF-α联合应用时caspase-3的活性及cleaved caspase-3的表达水平高于TNF-α单用组,差异具有统计学意义(P<0.05)。4.TNF-α、褪黑素单独应用时可促进ROS的产生、mPTP的开放率及MMP的下降,褪黑素与TNF-α联合应用时,与TNF-α单用组比较,联合应用显着增加ROS的产生、mPTP的开放率及MMP的进一步下降;与TNF-α组单用组相比,TNF-α和褪黑素联合应用更有效地促进Cyt-c释放,差异具有统计学意义(P<0.05)。5.与TNF-α、褪黑素单用组相比,褪黑素与TNF-α联合应用组可显着降低HeLa细胞中的ATP含量、线粒体呼吸复合物的表达以及葡萄糖的消耗和乳酸的产生,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论1.褪黑素可以增强TNF-α介导的宫颈癌Hela细胞凋亡。2.褪黑素通过线粒体凋亡途径增强TNF-α介导的宫颈癌Hela细胞凋亡。3.褪黑素和TNF-α共同作用可以引起线粒体能量代谢紊乱。第二部分 褪黑素增强TNF-α介导的宫颈癌HeLa细胞凋亡的相关机制研究研究目的探讨褪黑素增强TNF-α介导的宫颈癌HeLa细胞凋亡的潜在相关机制,并深入研究其可能有关的线粒体自噬信号通路。研究方法1.将HeLa细胞分为对照组、单用TNF-α组、单用褪黑素组、褪黑素联合TNF-α组、褪黑素联合TNF-α和自噬激动剂碳酰氰4-(三氟甲氧基)苯腙(Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone,FCCP)处理组、褪黑素联合 TNF-α及钙/钙调素依赖蛋白激酶 Ⅱ(Ca2+/Calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ,CaMKⅡ)特异性激动剂缓激肽(Bradykinin,Brad)处理组。2.采用免疫荧光对线粒体与溶酶体共染色检测线粒体自噬活性、Western blot检测线粒体自噬相关指标LC3-Ⅱ、Beclin1、P62的表达,探讨褪黑素与TNF-α对线粒体自噬的影响。3.将FCCP加入褪黑素与TNF-α联合处理的细胞中,以激活线粒体自噬,采用ELISA检测各组caspase-3和caspase-9的活性变化。4.使用siRNA(Small interfering RNA)转染的方法作用于Hela细胞,实现Parkin 的敲减,然后通过 Western blot 检测对照组、TNF-α组、TNF-α+si-Parkin及TNF-α+褪黑素组的Parkin及线粒体自噬相关指标LC3-Ⅱ、Beclin1的表达。5.将Brad加入褪黑素与TNF-α联合处理的细胞中,以重新激活CaMKⅡ途径,采用免疫荧光及Western blot检测通路相关蛋白p-CaMKⅡ和Parkin的表达。结果1.线粒体与溶酶体共染色检测结果显示:与对照组相比,TNF-α单用时,线粒体与溶酶体融合增加;与TNF-α单用相比,单用褪黑素、褪黑素与TNF-α联合应用时,线粒体与溶酶体融合减少,差异均具有统计学意义(P<0.05)。2.Western blot结果显示:与对照组相比,TNF-α单用时,自噬标记蛋白LC3-Ⅱ、Beclin1表达增加同时P62表达水平降低;而与TNF-α单用相比,单用褪黑素、褪黑素与TNF-α联合应用时,自噬标记蛋白LC3-Ⅱ、Beclin1表达降低,P62表达水平增加,差异均具有统计学意义(P<0.05)。3.ELISA结果显示:与对照组相比,TNF-α、褪黑素单独应用时caspase-3和caspase-9的活性增加;与TNF-α单用相比,褪黑素与TNF-α联合应用时caspase-3和caspase-9的活性显着增加;与褪黑素与TNF-α联合应用相比,褪黑素联合TNF-α及FCCP组caspase-3和caspase-9的活性显着降低,差异均具有统计学意义(P<0.05)。4.Western blot结果表明,与对照组相比,TNF-α组Parkin的表达水平显着增加;而与TNF-α组相比,TNF-α+si-Parkin组和褪黑素与TNF-α联合组Parkin的表达水平显着降低,差异均具有统计学意义(P<0.05)。为了进一步了解Parkin表达水平的增加是否与TNF-α介导的线粒体自噬相关,采用Western blot检测siRNA敲减Parkin后的自噬标记蛋白Beclin1、LC3-Ⅱ表达水平的变化。结果显示:与对照组相比,TNF-α组Beclinl、LC3-Ⅱ的表达水平显着增加;而与TNF-α组相比,TNF-α+si-Parkin组及褪黑素与TNF-α联合应用组Bec1inl、LC3-Ⅱ的表达水平显着降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。5.Western blot及免疫荧光结果显示:与对照组相比,用TNF-α处理时,p-CaMKⅡ和Parkin蛋白的表达水平增加;与TNF-α处理组相比,褪黑素与TNF-α联合组p-CaMKⅡ和Parkin蛋白的表达水平降低;与褪黑素与TNF-α联合应用组相比,褪黑素联合TNF-α和Brad组p-CaMKⅡ和Parkin蛋白的表达水平显着增加,差异均具有统计学意义(P<0.05)。.结论褪黑素通过抑制CaMKⅡ/Parkin/线粒体自噬信号通路增强TNF-α介导的宫颈癌Hela细胞凋亡。第三部分 褪黑素对TNF-α介导的宫颈癌裸鼠移植瘤生长以及线粒体自噬的影响研究目的构建人宫颈癌Hela细胞裸鼠皮下移植瘤模型,研究褪黑素对TNF-α介导的宫颈癌裸鼠移植瘤生长以及线粒体自噬的影响。研究方法1.构建人宫颈癌Hela细胞裸鼠皮下移植瘤模型。2.动物分组:将20只宫颈癌Hela细胞裸鼠随机分为4组,每组5只:(1)对照组:生理盐水;(2)TNF-α单药组:TNF-α 10μg/kg;(3)褪黑素单药组:褪黑素 10mg/kg;(4)TNF-α+褪黑素联合组:TNF-α 10g/kg+褪黑素 10mg/kg。以上4组均采用腹腔注射给药,每天一次,连续12天。3.详细记录各组裸鼠的生长状况,测量裸鼠的体重及移植瘤的体积变化,绘制肿瘤动态生长曲线。给药结束后脱颈椎处死裸鼠,剥离移植瘤,称重、测量大小并取材、拍照。4.采用苏木精—伊红染色法(Hematoxylin-Eosin Staining,HE)观察各组瘤体组织病理形态的变化。5.通过TUNEL检测各组裸鼠肿瘤组织细胞的凋亡。6.通过Western blot检测线粒体自噬相关指标LC3-Ⅱ、Beclin1的表达。结果1.成功建立了人宫颈癌HeLa细胞裸鼠移植瘤模型。2.各组裸鼠移植瘤体积及瘤体重量变化 药物干预后,与对照组相比,TNF-α、褪黑素单用时移植瘤的体积减小;与TNF-α单用相比,褪黑素与TNF-α联合应用时移植瘤的体积减小更明显,差异均有统计学意义(P<0.05)。处死裸鼠后,TNF-α、褪黑素组裸鼠的瘤体重量与对照组相比降低;与TNF-α单用相比,褪黑素与TNF-α联合应用瘤体重量降低更显着,差异有统计学意义(P<0.05)。3.HE染色镜下显示,TNF-α组、褪黑素组、褪黑素联合TNF-α组的瘤体组织均出现明显的凋亡细胞及坏死组织。4.TUNEL检测结果结果显示:与对照组相比,TNF-α、褪黑素单独应用时细胞的凋亡增加;与TNF-α单用相比,褪黑素与TNF-α联合应用时细胞的凋亡明显增加,差异均具有统计学意义(P<0.05)。5.Western blot结果显示:与对照组相比,TNF-α单用时,自噬标记蛋白LC3-Ⅱ、Beclin1表达增加;而与TNF-α单用相比,单用褪黑素、褪黑素与TNF-α联合应用时,自噬标记蛋白LC3-Ⅱ、Beclin1表达降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论褪黑素通过抑制线粒体自噬信号通路增强TNF-α介导的宫颈癌裸鼠移植瘤细胞的凋亡。

石剑林[8](2020)在《成纤维细胞激动蛋白促进肺腺癌增殖的机理研究》文中研究说明[研究目的]越来越多的研究表明,肿瘤的发生、发展过程是与其周围的免疫细胞、血管内皮细胞、成纤维细胞等肿瘤微环境中各种成分动态相互影响的结果。而其内的各种促进肿瘤及抑制肿瘤发展的炎性反应共同影响着肿瘤的演进过程。最新的研究发现肿瘤微环境中Ⅰ型干扰素及其下游关键信号通路分子的缺失(STAT1、STAT2等)可间接促进免疫抑制状态的产生,最终导致肿瘤的增殖及转移;而更重要的是肿瘤细胞可减少其内源性Ⅰ型干扰素的释放,从而导致免疫逃逸。肿瘤微环境内如何实现促炎及免疫抑制的转换仍然是本学科一个未解决的问题。人成纤维细胞激动蛋白(fibroblast activation protein,FAP)是一种整合于细胞膜上的Ⅱ型丝氨酸蛋白酶,为肿瘤相关成纤维细胞(cancer associated fibroblasts,CAFs)表面最重要的标记物之一。目前研究发现FAP主要表达于90%的上皮源性恶性肿瘤周围的活化成纤维细胞表面及一过性表达于骨髓间充质细胞、伤口周围组织及某些纤维化病灶中,而其在良性病变中基本不表达。FAP参与了肿瘤微环境中局部免疫反应的形成,阻断FAP的功能可抑制肿瘤的增殖。而同时给予Interferon-γ和TNF-α的中和性抗体又能促进肿瘤的增殖。这提示FAP可能调控局部干扰素和肿瘤坏死因子的表达。另外在CAFs相关的动物模型中研究发现FAP参与JAK-STAT信号通路的激活,这也是Ⅰ型干扰素的主要效应通路。本课题组在前期工作中成功构建了过表达FAP的小鼠成纤维细胞株(3T3),且分离得到FAP阳性的CAFs。通过转录本测序及生物信息学方法,发现FAP可下调干扰素诱导基因(RIG-I、STAT2、IRF7等)。因此我们有理由相信CAFs表面表达的FAP可能通过下调ISGs的表达并诱导肿瘤微环境对Ⅰ型干扰素产生失能和效应抵抗。为了在人肺癌细胞及动物模型中验证这一科学假说,同时探讨肺腺癌患者中FAP的表达是否与患者预后相关。我们设计并完成了以下实验,实验方法及结果内容如下:[方法]一、组织芯片及TCGA数据分析FAP在肺腺癌人群中的表达和预后通过大样本的人肺腺癌组织芯片结果及对比TCGA数据,分析FAP在肺腺癌组织和癌旁组织内的表达情况及FAP与肺腺癌患者预后之间的关系。二、成纤维细胞激动蛋白促进肺腺癌增殖的机理研究细胞实验:将FAP过表达慢病毒(OE)和空载体对照病毒(NC)分别感染目的细胞株HFF、BJ及SPC-A-1,构建FAP过表达及阴性对照细胞模型。应用Cell counting kit-8(CCK8)检测过表达FAP后各细胞株的增殖能力,将Poly(I:C)通过转染试剂转染至FAP过表达及对照细胞株后,应用ELISA试剂盒检测内源性IFN-β释放的情况。并分别将待测细胞株FAP-3T3、NC-3T3、小鼠CAFs、FAP-HFF、NC-HFF、FAP-BJ及NC-BJ细胞株进行转录本测序并生物信息学分析,行qPCR及Western Blot实验验证下游分子机制。动物模型:给予裸鼠皮下注射FAP过表达及相应对照细胞株(FAP-HFF+SPC-A-1、NC-HFF+SPC-A-1及FAP-SPC-A-1、NC-SPC-A-1),同时在瘤旁皮下注射Ⅰ型干扰素,观察并测量裸鼠体重、肿瘤体积和肿瘤重量。裸鼠移植瘤组织行HE染色及免疫组化检测干扰素诱导基因的表达情况。[结 果]一、临床样本及TCGA数据分析FAP在肺腺癌人群中的表达和预后选择94例临床可手术的肺腺癌患者作为研究对象,对其手术后肺腺癌病理标本进行针对FAP的免疫组化分析发现:FAP在癌胞浆中呈高表达为29例(31.52%),低表达63例(68.48%);而在癌旁胞浆中均为低表达。FAP在癌间质中呈高表达为49例(53.26%),低表达43例(46.74%);在癌旁间质中除2例高表达(2.38%)外,其余均为低表达。肺腺癌及癌旁组织内FAP的表达差异具有统计学意义(P<0.05)。肺腺癌患者术后10年随访的生存分析数据显示肺腺癌间质内FAP高表达的患者预后更差,结果具有统计学差异(P=0.019)。二、成纤维细胞激动蛋白促肺腺癌增殖的机理研究本研究体外实验证实:人成纤维细胞株FAP-HFF、FAP-BJ及肺腺癌细胞株FAP-SPC-A-1,小鼠成纤维细胞株FAP-3T3的增殖能力均高于对照组,同时给予外源性Ⅰ型干扰素刺激后,FAP过表达细胞株的增殖能力同样高于对照组(P<0.05)。将Poly(I:C)转染至FAP过表达及对照细胞株后,ELISA实验证实FAP可减少内源性IFN-β的释放(P>0.05)。同时进行转录本测序及生物信息学分析后提示FAP可能通过上调细胞增殖相关分子(细胞周期、细胞分裂等)及下调Ⅰ型干扰素相关信号分子从而促进肺腺癌细胞增殖,并通过qPCR及Western Blot验证相对于NC-HFF和NC-3T3,FAP-HFF及FAP-3T3细胞株中STAT2蛋白表达有下调。FAP-SPC-A-1细胞中细胞周期相关蛋白CCNB1的表达有上调,而FAP-HFF及NC-HFF细胞株中CCNB1的表达无明显差异。动物实验结果证实:于BALB/c裸鼠背部皮下分别接种FAP-SPC-A-1及对照细胞株,FAP-HFF和SPC-A-1混合细胞液及相应对照细胞株,同时分别于瘤旁注射人IFN-α2b 20000U/只/d,发现Ⅰ型干扰素可促进FAP过表达细胞株的体内成瘤(P<0.05)。裸鼠移植瘤免疫组化染色后显示:未给予外源性Ⅰ型干扰素刺激时,STAT1、STAT2、ISG15、IRF7在各实验组移植瘤中表达无差异,结果无统计学意义(P>0.05)。而给予外源性Ⅰ型干扰素刺激后,干扰素组(FAP-SPC-A-1和FAP-HFF+SPC-A-1)相对于观察组而言,STAT1、ISG15、IRF7表达上调,结果具有统计学意义(P<0.05)。并且在干扰素组中,FAP-SPC-A-1组及FAP-HFF+SPC-A-1 组相对于对照细胞组(NC-SPC-A-1 组及 NC-HFF、SPC-A-1)组而言,STAT2下调明显,结果具有统计学意义(P<0.05)。[结 论]一、FAP在人肺腺癌组织内相比癌旁为高表达,且肿瘤间质内FAP高表达的患者预后更差,结果具有统计学差异(P=0.019);二、FAP可在体外促进人成纤维细胞株HFF、BJ,人肺腺癌细胞株SPC-A-1及小鼠成纤维细胞株3T3的增殖,机制可能为上调细胞周期蛋白CCNB1的表达;三、FAP可在体内外Ⅰ型干扰素的刺激下促进细胞株(HFF、SPC-A-1)的增殖,机制可能为下调STAT2的表达;四、FAP可减少体外小鼠成纤维细胞株3T3及人成纤维细胞株HFF中内源性Ⅰ型干扰素IFN-β的释放。

李浩淼[9](2020)在《LncRNA SNHG1调控食管鳞状细胞癌发展进程的机制研究》文中指出食管癌是人类最常见的消化系统恶性肿瘤之一,其发病率在全世界恶性肿瘤发病率中排名第八位。食管癌在我国也具有较高的发病率。依据食管癌病理类型的不同,可将其分为食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)和食管腺癌(esophageal adenocarcinoma,EAC)。其中,我国约有 90%的食管癌患者为ESCC。由于食管癌早期发病症状不明显,并且缺乏有关食管癌的早期筛查方法,多数患者在就诊时就已经处于中晚期,患者治疗疗效和预后较差。目前,食管癌的发病机制尚不十分明确,因此,深入研究食管癌发病机制并寻找早期诊断的分子生物标记物和临床治疗的潜在作用靶点,对提高食管癌患者生存质量和改善预后具有十分重要的意义。长链非编码RNA(Long non-coding RNA,LncRNA)是一类长度大于200个核苷酸但不编码蛋白质的RNA,可在转录、转录后、表观异常等多个水平调控基因表达。随着研究的深入,发现LncRNA在多种肿瘤中异常表达,这些异常表达的LncRNA可影响肿瘤细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭等生物学行为,与肿瘤的发生发展关系密切,可用作肿瘤诊断的分子标志物以及判断患者预后。研究显示,LncRNA SNHG1在结肠癌、肺癌和前列腺癌等多种肿瘤中高表达,参与肿瘤发生发展过程。但是,SNHG1是否调控ESCC的发展过程及作用机制的相关研究还很少见。微小RNA(micro RNA,miRNA)是一类长度为18~25个核苷酸的单链小分子RNA,其可与特定的mRNA结合或者调节特定mRNA的蛋白质翻译过程来调控基因的表达,广泛的参与各种生理和病理过程。miR-204定位与人9号染色体,在乳腺癌、胃癌、非小细胞肺癌、食管癌等多种肿瘤中异常表达,参与肿瘤的发生和发展。近年来研究表明,LncRNA和miRNA之间还存在密切的相互作用,两者共同参与疾病的发生和发展。通过生物信息网站预测发现,SNHG1与miR-204基因序列存在结合位点,miR-204可能是SNHG1的靶基因。SNHG1能否调控miR-204表达影响ESCC细胞的生物学行为也还未知。生物信息学软件预测还显示,同源异型盒基因8(HOXC8)是miR-204的靶基因。研究显示,HOXC8参与非小细胞肺癌、等肿瘤细胞的增殖、生长和迁移,与肿瘤发生发展密切相关。有报道称,HOXC8高表达的ESCC患者中位生存时间显着低于HOXC8低表达患者,HOXC8表达是ESCC患者预后的独立影响因素,可用作ESCC的预后标志物。但是,HOXC8在ESCC组织和细胞中表达水平及其对ESCC细胞生物学行为的影响也还未知。因此,为了明确SNHG1在ESCC中的作用及可能的作用分子机制,本研究进行了以下三部分研究:第一部分:首先检测了 SNHG1在ESCC组织中的表达,分析了其表达与患者临床病理特征的关系;检测ESCC细胞系EC9706、KYSE450、KYSE150和Eca109中SNHG1的表达水平,并观察下调SNHG1表达对EC9706和KYSE150细胞周期、凋亡、增殖、迁移和侵袭的影响;第二部分:以miR-204/HOXC8轴为切入点,探究SNHG1影响EC9706和KYSE150细胞周期、凋亡、增殖、迁移和侵袭的分子机制;第三部分:通过建立食管鳞癌移植瘤裸鼠模型,探讨了 SNHG1对食管鳞癌移植瘤裸鼠肿瘤生长的影响。第一部分SNHG1在ESCC中的表达及其对细胞生物学行为的影响背景:LncRNA是一类长度大于200个核苷酸的非编码RNA,其在恶性肿瘤的发生发展过程中发挥重要作用,参与肿瘤细胞的恶性生物学行为。研究显示,肿瘤中异常表达的lncRNA与患者临床病理特征以及预后密切相关,可作为肿瘤诊断、预后判断的分子生物学标记物。研究显示,SNHG1在结直肠癌、非小细胞肺癌等多种肿瘤中表达异常,参与肿瘤的发生和发展过程,是肿瘤诊治的潜在生物学标志物。目前,SNHG1在食管鳞状细胞癌中表达的研究相对较少。目的:探索LncRNA SNHG1在食管鳞癌组织及细胞中的表达情况及对食管鳞癌细胞的生物学行为的影响。方法:收集53例ESCC患者的癌组织及对应癌旁组织标本,qRT-PCR法检测SNHG1在ESCC癌组织和癌旁组织中的表达水平。根据ESCC患者癌组织中SNHG1表达水平的均值,将ESCC患者分为SNHG1高表达组和低表达组,卡方检验分析SNHG1表达与ESCC患者年龄、性别、TNM分期、肿瘤位置及预后的相关性。比较不同年龄、性别、TNM分期和肿瘤位置ESCC患者癌组织中SNHG1表达水平。体外培养正常食管上皮细胞Het-1A和ESCC细胞系EC9706、KYSE450、KYSE150、Eca109中SNHG1表达水平,qRT-PCR检测细胞中SNHG1表达水平。EC9706和KYSE150细胞分为空白组、si-NC组和si-SNHG1组,si-NC组和si-SNHG1组分别转染si-NC、si-SNHG1,空白组不做任何处理。应用qRT-PCR法检测转染后细胞中SNHG1表达水平,流式细胞术检测转染后EC9706和KYSE150细胞周期变化和细胞凋亡率,CCK-8法检测细胞增殖,Transwell检测细胞迁移和侵袭。结果:(1)qRT-PCR结果显示,ESCC组织中SNHG1表达水平显着高于对应癌旁组织(P<0.05)。(2)SNHG1表达与ESCC患者TNM分期及预后关系密切(P<0.05),与ESCC患者年龄、性别和肿瘤位置无关(P>0.05)。(3)ESCC患者TNM分期越高,癌组织中SNHG1表达水平越高。而不同年龄、性别和肿瘤位置的ESCC患者癌组织中SNHG1表达水平比较无统计学意义(P>0.05)。(4)与 Het-1A 细胞比,ESCC 细胞系 EC9706、KYSE450、KYSE150、Eca109中SNHG1表达水平均显着升高(P<0.05)。并且ESCC细胞系之间比较,EC9706和KYSE150细胞中SNHG1表达水平相对较高,因此,选择EC9706和KYSE150细胞作为后续实验研究对象。(5)与 si-NC 组相比,si-SNHG1组EC9706 和 KYSE150 细胞中 SNHG1 表达水平显着降低(P<0.01),G0-G1期细胞百分比显着升高(P<0.01),S期显着降低(P<0.01),细胞凋亡率显着升高(P<0.001),细胞0D值显着降低(P<0.001),细胞迁移和侵袭数量显着减少(P<0.01)。空白组与si-NC组各检测指标比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论:SNHG1在ESCC患者癌组织中呈高表达,其高表达与患者TNM分期及预后关系密切。SNHG1在ESCC细胞系中呈高表达,下调SNHG1表达可阻滞EC9706和KYSE150细胞周期进程,促进细胞凋亡,并抑制细胞增殖、迁移和侵袭。第二部分SNHG1对ESCC细胞生物学特性影响的机制研究背景:LncRNA和miRNA均作为重要的基因表达调控分子在肿瘤的发生和发展中扮演重要角色,它们之间还存在密切的相互作用,两者之间的相互作用参与了众多疾病的发生和发展。研究发现,LncRNA可作用于miRNA影响肿瘤的发生和发展过程。通过生物信息网站预测发现,SNHG1与miR-204基因序列存在结合位点,miR-204可能是SNHG1的靶基因。生物信息学软件预测还显示,同源异型盒基因8(HOXC8)是miR-204的靶基因。同源异型盒基因(HOX基因)起初是在研究果蝇胚胎发育的过程中发现的,目前,已被鉴定出的HOX基因有39个。HOX基因家族成员均编码其对应的转录因子,在一系列基因的表达过程中发挥调控作用。HOX基因编码的蛋白质形成一个转录因子调控网络。在机体正常的生命活动中,参与细胞的通讯过程,当HOX基因编码的蛋白质发生改变后可导致肿瘤的产生。HOXC8在ESCC组织和细胞中表达水平及其对ESCC细胞生物学行为的影响以及miR-204能否通过调控HOXC8表达影响ESCC细胞的生物学行为还未知。目的:以miR-204/HOXC8轴为切入点,探讨SNHG1对ESCC细胞系EC9706和KYSE150细胞周期、凋亡、迁移和侵袭的影响的分子机制。方法:qRT-PCR法检测ESCC组织和癌旁组织中miR-204和HOXC8 mRNA表达水平。体外培养正常食管上皮细胞Het-1A和ESCC细胞系EC9706、KYSE450、KYSE150、Eca109中SNHG1表达水平,qRT-PCR法检测细胞中miR-204和HOXC8 mRNA表达水平。Starbase生物信息学软件预测SNHG1与miR-204序列存在结合位点,HOXC8的3’UTR与miR-204序列存在结合位点。双荧光素酶报告基因和RNA免疫共沉淀(RIP)实验验证EC9706和KYSE150细胞中SNHG1与miR-204及miR-204与HOXC8的靶向调控关系。EC9706和KYSE150细胞分为pcDNA组(转染空载体)、SNHG1组(转染SNHG1过表达载体)、si-NC组(转染乱序无意义阴性序列)和si-SNHG1组(转染SNHG1小干扰RNA),qRT-PCR法检测上调或下调SNHG1对细胞中miR-204表达水平的影响。EC9706 和 KYSE150 细胞分为 miR-204 组(转染 miR-204 模拟物 mimics)、miR-NC 组(转染 mimics 对照序列)、si-SNHG1+anti-miR-204 组(共转染 SNHG1小干扰 RNA 和 miR-204 抑制剂)和 si-SNHG1+anti-miR-NC 组(共转染 SNHG1小干扰RNA和抑制剂阴性对照序列),流式细胞术检测各组EC9706和KYSE150细胞周期变化和细胞凋亡率,CCK-8检测各组细胞增殖,Transwell检测各组细胞迁移和侵袭。EC9706 和 KYSE150 细胞分为 miR-204 组(转染 miR-204 模拟物 mimics)、miR-NC组(转染mimics对照序列)、anti-miR-204组(转染miR-204抑制剂)和ani-miR-NC组(转染抑制剂阴性对照序列),Western Blot检测上调或下调miR-204对细胞中HOXC8蛋白表达的影响。EC9706 和 KYSE150 细胞分为将 miR-204+pcDNA 组(共转染 miR-204 mimics 与空载体)和 miR-204+HOXC8 组(共转染 miR-204 mimics 与 HOXC8过载体载体),Western Blot检测各组细胞中HOXC8蛋白表达水平,流式细胞术检测各组细胞周期变化和细胞凋亡率,CCK-8检测各组细胞增殖,Transwell检测各组细胞迁移和侵袭。结果:(1)与 Het-1A 细胞比,ESCC 细胞系 EC9706、KYSE450、KYSE150、Eca109中miR-204表达水平均显着降低(P<0.05),HOXC8 mRNA表达水平均显着升高(P<0.05)。与癌旁组织相比,ESCC癌组织miR-204表达水平均显着降低(P<0.05),HOXC8 mRNA表达水平均显着升高(P<0.05)。(2)双荧光素酶报告基因结果显示,与质粒SNHG1-WT共转染,miR-204组的荧光素酶活性显着低于miR-NC组(P<0.001);与质粒SNHG1-MUT共转染,miR-204组的荧光素酶活性与miR-NC组比较无统计学意义(P>0.05)。RNA免疫共沉淀(RIP)实验结果显示,与miR-NC组相比,miR-204组捕获的SNHG1量显着升高(P<0.001)。(3)与pcDNA组相比,SNHG1组EC9706和KYSE15细胞中miR-204表达水平显着降低(P<0.001);与si-NC组相比,si-SNHG1组EC9706和KYSE150细胞中miR-204表达水平显着升高(P<0.001)。(4)与 miR-NC 组相比,miR-204 组 EC9706 和 KYSE150 细胞中 miR-204 表达水平显着升高(P<0.01),G0-G1期细胞百分比显着升高(P><0.01),S期显着降低(P<0.01),细胞凋亡率显着升高(P<0.001),OD值显着降低(P<0.001),细胞迁移和侵袭数量显着减少(P<0.01)。与si-SNHG1+anti-miR-NC组相比,si-SNHG1+anti-miR-204 组 EC9706 和 KYSE150 细胞中 miR-204 表达水平显着降低(P<0.01),G0-G1期细胞百分比显着降低(P<0.01),S期显着升高(P<0.01),细胞凋亡率显着降低(P<0.001),OD值显着升高(P<0.001)细胞迁移和侵袭数量显着增多(P<0.01)。(5)双荧光素酶报告基因结果显示,与质粒HOXC8-WT共转染,miR-204组的荧光素酶活性显着低于miR-NC组(P<0.001);与质粒HOXC8-MUT共转染,miR-204组的荧光素酶活性与miR-NC组比较无统计学意义(P>0.05)。RNA免疫共沉淀(RIP)实验结果显示,与miR-NC组相比,miR-204组捕获的HOXC8表达量显着升高(P<0.001)。(6)与 miR-NC 组相比,miR-204 组 EC9706 和 KYSE15 细胞中 HOXC8 蛋白表达水平显着降低(P<0.001);与 anti-miR-NC 组相比,anti-miR-204 组EC9706和KYSE150细胞中HOXC8蛋白表达水平显着升高(P<0.001)。(7)与 miR-204+pcDNA 组相比,miR-204+HOXC8 组 EC9706 和 KYSE150 细胞中HOXC8蛋白表达水平显着升高(P<0.01),G0-G1期细胞百分比显着降低(P<0.01),S期显着升高(P<0.01),细胞凋亡率显着降低(P<0.001),OD值显着升高(P<0.001)细胞迁移和侵袭数量显着增多(P<0.01)。结论:miR-204在ESCC组织和细胞系中均呈低表达,HOXC8 mRNA呈高表达。EC9706和KYSE15细胞中SNHG1靶向负调控miR-204表达,miR-204靶向负调控HOXC8表达。下调SNHG1通过靶向miR-204下调HOXC8蛋白表达,阻滞ESCC细胞周期进程,促进细胞凋亡,并抑制细胞增殖、迁移和侵袭。第三部分SNHG1对食管鳞状细胞癌裸鼠体内移植瘤影响背景:食管鳞状细胞癌的发生发展多是由于基因的异常表达引起的。随着人类基因技术的快速进步,通过对基因分子水平的改变及不同基因间的相互关系的研究,探讨某种基因变化与肿瘤发生和发展之间的关系,直接通过调控异常表达的基因可达到治疗肿瘤的目的。短发夹状干扰RNA(shRNA)技术是一种新兴的基因治疗技术,其在基因分子水平沉默异常表达的癌基因,进而实现能够有效且特异性抑制肿瘤生长的作用。自shRNA技术被发现以来,已经在肿瘤基因治疗研究领域被广泛的应用。目的:通过构建重组慢病毒表达载体sh-SNHG1,进一步进行裸鼠体内研究实验,旨在说明SNHG1被干扰抑制后对食管鳞状细胞癌裸鼠皮下移植瘤的生长有无影响。方法:建立食管鳞状细胞癌裸鼠皮下移植瘤模型。裸鼠分为Empty组:接种EC9706细胞;sh-NC组:接种转染sh-NC的EC9706细胞;sh-SNHG1组:接种转染sh-SNHG1 的 EC9706 细胞。观察裸鼠皮下移植瘤生长,每周测量移植瘤长、短径计算瘤体体积,并绘制移植瘤生长曲线。5周后脱颈椎处死小鼠,剥离肿瘤并称重。qRT-PCR检测移植瘤组织中SNHG1和miR-204表达,Western blot法和免疫组化法检测移植瘤组织中HOXC8蛋白表达。结果:(1)与Empty组、sh-NC组相比,sh-SNHG1组裸鼠皮下移植瘤生长缓慢,瘤体体积和重量显着减小(P<0.05)。(2)与Empty组、sh-NC组相比,sh-SNHG1组裸鼠皮下移植瘤组织中SNHG1表达水平显着降低(P<0.05),miR-204表达显着升高(P<0.05),HOXC8蛋白表达水平显着降低(P<0.05)。结论:沉默SNHG1通过上调miR-204表达进而抑制HOXC8蛋白表达,抑制食管鳞状细胞癌裸鼠皮下移植瘤的生长。全文结论:(1)LncRNA SNHG1在食管鳞癌组织以及食管鳞癌细胞系中高表达,属于促癌基因;(2)LncRNA SNHG1通过靶向miR-204表达,进而促进HOXC8蛋白表达,促进ESCC细胞的细胞周期进程、增殖、迁移和侵袭,并抑制细胞凋亡。

樊少臣[10](2020)在《IL-24修饰的人脐带间充质干细胞对胶质瘤靶向治疗的研究》文中提出背景与目的胶质瘤是中枢神经系统中最常见的恶性肿瘤,其发病率和致死率呈逐年上升趋势,严重威胁人类的生命与健康。由于胶质瘤细胞呈现浸润性生长,手术无法完全切除,因此,术后肿瘤容易复发。虽然过去几十年在胶质瘤治疗方面有了很多进展,包括放疗、化疗、免疫治疗等,但胶质瘤患者的总体预后仍然很差。近年来,间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)成为生物、医药研究领域的热点之一。MSCs是一类非造血干细胞,它具有高度自我更新、免疫调控及多向分化能力。MSCs在体外增殖迅速,细胞移植不易引起免疫排斥反应,且其能够向病变部位选择性迁移,因此,MSCs引起众多学者的广泛关注,但MSCs来源匮乏及取材不便等问题限制了其应用。脐带间充质干细胞(umbilical cord-derived mesenchymal stem cells,UC-MSCs)是从新生儿脐带中分离获得的MSCs,因其具有增殖能力强、采集方便、应用没有伦理问题等优点,被认为是近年来最具潜力的基因治疗载体。白介素-24(interleukin-24,IL-24),又称为黑色素瘤分化相关基因7(melanoma differentiation-associated gene-7,MDA-7),属于白介素-10家族,是一种多效的免疫调节因子。近年来的研究表明,IL-24可以诱导多种肿瘤细胞(胰腺癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌等)的凋亡,但对正常细胞没有影响。因此,IL-24在肿瘤的基因治疗中有很好的应用前景。然而,IL-24半衰期短等不利因素限制了其临床应用。本研究拟利用UC-MSCs向肿瘤趋向性迁移的特性和IL-24强烈的抗肿瘤作用,以UC-MSC为基因治疗的载体,利用携带IL-24的慢病毒感染UC-MSCs,构建能够稳定表达并释放IL-24的IL-24-UC-MSCs,通过体外、体内实验观察其对胶质瘤的治疗效果,并探讨其可能的作用机制。方法(1)采用Len-GFP和Len-IL-24慢病毒转染UC-MSCs,构建空白对照UC-MSCs(GFP-UC-MSCs)和携带IL-24基因的UC-MSCs(IL-24-UC-MSCs)。通过倒置显微镜观察基因修饰前后UC-MSCs的形态;通过流式细胞仪检测基因修饰前后UC-MSCs细胞表面标记物CD29、CD105、CD34、CD45的表达;通过诱导分化实验检测基因修饰前后UC-MSCs向成骨细胞、脂肪细胞分化的情况,确定UC-MSCs在基因修饰后是否仍然保持间充质干细胞固有的生物学特性。(2)收集UC-MSCs、GFP-UC-MSCs和IL-24-UC-MSCs全细胞裂解液,通过Western blot技术检测IL-24在其中的表达情况;收集IL-24-UC-MSCs不同时间点的培养上清,通过ELISA法检测IL-24在其中的表达水平。(3)将GFP-UC-MSCs和IL-24-UC-MSCs与胶质瘤U251细胞通过Transwell共培养,检测UC-MSCs在体外向胶质瘤细胞趋向性迁移的能力。(4)利用GFP-UC-MSCs和IL-24-UC-MSCs的培养上清处理U251细胞48h,通过CCK-8实验观察U251细胞活力的变化。(5)将GFP-UC-MSCs和IL-24-UC-MSCs与U251共培养72 h,通过TUNEL法观察U251细胞凋亡情况。(6)构建裸鼠人胶质瘤皮下移植瘤模型,将GFP-UC-MSCs和IL-24-UC-MSCs移植入荷瘤裸鼠体内,观察UC-MSCs在体内对胶质瘤的趋向性迁移能力及治疗效果。(7)通过TUNEL法检测皮下移植瘤组织中细胞凋亡的情况,并通过免疫组化检测肿瘤组织中Akt/Bcl-2信号通路的分子变化,探讨其作用机理。结果(1)倒置显微镜下观察基因修饰前后UC-MSCs的形态可见:细胞呈现扁平的梭形,成簇或旋涡状排列,细胞膜清晰,细胞质丰富,胞核大,核仁清晰;流式细胞仪检测结果显示:基因修饰前后UC-MSCs细胞表面分子CD29、CD105、CD34、CD45的表达无明显变化;诱导分化实验结果显示:UC-MSCs在基因修饰前后均能向成骨细胞、脂肪细胞定向分化。(2)Western blot和ELISA实验结果显示:IL-24蛋白在IL-24-UC-MSCs中可以稳定表达,且表达水平随转染时间的延长而上升,在转染后72 h达到高峰(3345.4±211.837 pg/ml)。(3)体外Transwell迁移实验结果显示:不论是U251细胞还是其培养上清均可以诱导UC-MSCs向其趋向性迁移。(4)CCK-8实验结果显示:对照组、GFP-UC-MSCs组、IL-24-UC-MSCs组U251细胞活力分别为0.82±0.06、0.68±0.04、0.37±0.05;IL-24-UC-MSCs组U251细胞的活力显着低于对照组和GFP-UC-MSCs组(P<0.05)。(5)TUNEL检测结果显示:对照组、GFP-UC-MSCs组、IL-24-UC-MSCs组凋亡细胞所占比例分别为4.57±0.42、6.00±0.60、13.40±0.91;IL-24-UC-MSCs组凋亡细胞所占比例显着高于对照组和GFP-UC-MSCs组(P<0.05)。(6)体内抑瘤实验显示:移植入胶质瘤荷瘤裸鼠模型体内的GFP-UC-MSCs、IL-24-UC-MSCs可以迁移到肿瘤部位,且IL-24-UC-MSCs能够抑制肿瘤的生长,该组肿瘤体积显着小于对照组和GFP-UC-MSCs组(P<0.05)。(7)肿瘤组织的TUNEL检测结果显示:对照组、GFP-UC-MSCs移植组、IL-24-UC-MSCs移植组肿瘤组织中细胞凋亡指数分别为:1.47±0.41、2.37±0.33、5.57±0.54;IL-24-UC-MSCs移植组细胞凋亡指数显着高于对照组和GFP-UC-MSCs组(P<0.05)。(8)免疫组化结果显示:IL-24-UC-MSCs移植组肿瘤组织中p-Akt、Bcl-2的表达水平显着低于对照组和GFP-UC-MSCs组(P<0.05)。结论本研究利用UC-MSCs向肿瘤细胞的趋向性迁移特性及IL-24强烈的抗肿瘤作用来治疗胶质瘤,显示了良好的实验效果。为UC-MSCs作为载体对胶质瘤进行靶向基因治疗提供了理论依据。得出以下结论:(1)采用Len-IL-24慢病毒转染UC-MSCs,可以构建稳定表达并分泌IL-24的IL-24-UC-MSCs,且不改变UC-MSCs的基本生物学特性。(2)IL-24-UC-MSCs在体外和体内均有向胶质瘤细胞迁移的特性,且对胶质瘤细胞生长具有抑制作用。(3)IL-24-UC-MSCs在体内通过调节Akt/Bcl-2信号通路来诱导胶质瘤细胞凋亡,发挥抗肿瘤作用。

二、IFN-α对人宫颈癌裸鼠皮下移植瘤生长的影响(论文开题报告)

(1)论文研究背景及目的

此处内容要求:

首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景,再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题,并提出你的论文准备的观点或解决方法。

写法范例:

本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。

(2)本文研究方法

调查法:该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。

观察法:用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。

实验法:通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。

文献研究法:通过调查文献来获得资料,从而全面的、正确的了解掌握研究方法。

实证研究法:依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。

定性分析法:对研究对象进行“质”的方面的研究,这个方法需要计算的数据较少。

定量分析法:通过具体的数字,使人们对研究对象的认识进一步精确化。

跨学科研究法:运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。

功能分析法:这是社会科学用来分析社会现象的一种方法,从某一功能出发研究多个方面的影响。

模拟法:通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。

三、IFN-α对人宫颈癌裸鼠皮下移植瘤生长的影响(论文提纲范文)

(1)STING对宫颈癌增殖、迁移和侵袭能力的作用及机制的研究(论文提纲范文)

中文摘要
Abstract
英文缩略词表
第1章 引言
第2章 综述 cGAS-STING信号在癌症免疫和免疫治疗中的作用
    2.1 CGAS-STING信号通路抗肿瘤机制
        2.1.1 细胞质DNA如何积聚?
        2.1.2 cGAS-STING通路消除癌细胞机制
    2.2 CGAS-STING通路在治疗中的应用
        2.2.1 单药治疗
        2.2.2 STING激动剂联合疗法
    2.3 STING免疫疗法:一把双刃剑
    2.4 结论
第3章 STING对宫颈癌增殖、迁移、侵袭能力影响的体外实验
    3.1 实验材料
        3.1.1 主要仪器设备
        3.1.2 主要试剂
        3.1.3 主要试剂配制
    3.2 实验流程
    3.3 实验方法
        3.3.1 细胞来源和细胞培养条件
        3.3.2 细胞复苏
        3.3.3 细胞换液
        3.3.4 细胞传代
        3.3.5 细胞冻存
        3.3.6 细胞计数
        3.3.7 Trizol法提取HaCaT、H8、HeLa、SiHa、C33A、CaSki细胞的RNA
        3.3.8 RNA逆转录
        3.3.9 定量实时聚合酶链式反应(real-time quantitativepolymerase chain reaction, qRT-PCR)
        3.3.10 HaCaT、H8、HeLa、SiHa、C33A、CaSki细胞的蛋白样品制备
        3.3.11 蛋白质免疫印迹实验(Western Blot,WB)
        3.3.12 短发夹RNA慢病毒载体的构建及转导
        3.3.13 过表达慢病毒载体的构建及转染
        3.3.14 Trizol法提取vector HeLa、shSTING-Hela、vectorSiHa、shSTING-SiHa、vector C33A、C33A-STING细胞的RNA
        3.3.15 RNA逆转录
        3.3.16 定量实时聚合酶链式反应
        3.3.17 vector HeLa、shSTING-Hela、vector SiHa、shSTING-SiHa、vector C33A、C33A-STNG细胞的蛋白样品制备
        3.3.18 蛋白质免疫印迹实验
        3.3.19 宫颈癌细胞增殖实验
        3.3.20 宫颈癌细胞平板克隆实验
        3.3.21 宫颈癌细胞划痕实验
        3.3.22 宫颈癌细胞Transwell小室迁移实验
        3.3.23 宫颈癌细胞侵袭实验
        3.3.24 统计分析
    3.4 实验结果
        3.4.1 STING在人角质形成细胞、宫颈上皮永生化细胞以及四种宫颈癌细胞系中的表达
        3.4.2 稳定的沉默STING细胞系、STING过表达细胞系的鉴定
        3.4.3 STING沉默或过表达对宫颈癌细胞系细胞增殖和克隆形成的影响
        3.4.4 STING沉默或过表达对宫颈癌细胞迁移能力的影响
        3.4.5 STING沉默或过表达对宫颈癌细胞侵袭能力的影响
    3.5 讨论
    3.6 小结
第4章 STING调控宫颈癌细胞生物学行为信号通路的探索
    4.1 实验材料
        4.1.1 实验设备
        4.1.2 实验试剂
        4.1.3 主要溶液配制
    4.2 实验流程
    4.3 实验方法
        4.3.1 细胞培养、冻存、传代、计数
        4.3.2 总蛋白提取和免疫印迹实验
        4.3.3 核蛋白提取和免疫印迹实验
        4.3.4 免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,co-IP)和免疫印迹实验
        4.3.5 细胞培养、冻存、传代、计数
        4.3.6 总蛋白提取和免疫印迹实验
        4.3.7 CCK8实验
        4.3.8 平板克隆
        4.3.9 Transwell小室迁移
        4.3.10 Transwell小室侵袭
        4.3.11 统计学方法
    4.4 实验结果
        4.4.1 STING对经典Wnt/β-catenin信号通路的作用
        4.4.2 过表达STING对经典Wnt/β-catenin信号通路的影响
        4.4.3 STING调控宫颈癌Wnt/β-catenin信号通路机制探讨
        4.4.4 β-catenin通路抑制剂对沉默STING介导的宫颈癌细胞的增殖、迁移和侵袭作用的影响(rescue实验)
    4.5 讨论
    4.6 小结
第5章 沉默STING促进宫颈癌细胞增殖的体内实验
    5.1 实验材料
        5.1.1 实验设备
        5.1.2 实验试剂
        5.1.3 主要溶液配制
        5.1.4 实验动物
    5.2 实验流程
    5.3 实验方法
        5.3.1 细胞的复苏、传代及培养
        5.3.2 裸鼠皮下移植瘤模型的建立
        5.3.3 裸鼠体重测量
        5.3.4 裸鼠移植瘤组织大小的测量
        5.3.5 肿瘤组织脱水及包埋
        5.3.6 苏木精和伊红染色技术(Hematoxylin and eosin dyeingtechniques,HE)
        5.3.7 免疫组织化学染色技术(Immunohistochemistry,IHC)
        5.3.8 统计学方法
    5.4 实验结果
        5.4.1 沉默STING的宫颈癌细胞移植瘤对裸鼠体重的影响
        5.4.2 沉默STING对裸鼠移植瘤体积的影响
        5.4.3 裸鼠肿瘤组织HE染色结果
        5.4.4 裸鼠肿瘤组织STING免疫组化染色结果
        5.4.5 裸鼠肿瘤组织免疫组化Ki67染色结果
    5.5 讨论
    5.6 小结
第6章 全文结论
参考文献
作者简介及在学期间所取得的科研成果
致谢

(2)药用真菌桑黄通过内质网应激—线粒体损伤诱导人宫颈癌细胞凋亡(论文提纲范文)

英文缩略词表
中文摘要
Abstract
1.前言
2.实验材料
    2.1 材料与试剂
    2.2 仪器与设备
3.实验方法
    3.1 桑黄主要活性成分含量测定
        3.1.1 总多糖含量测定
        3.1.2 总酚含量测定
        3.1.3 总黄酮含量测定
        3.1.4 总三萜含量测定
    3.2 桑黄提取物的制备
    3.3 细胞培养
    3.4 细胞活力检测
    3.5 透射电镜检测Si Ha细胞超微结构改变
    3.6 细胞周期检测
    3.7 细胞凋亡检测
    3.8 线粒体膜电位检测
    3.9 钙离子检测
    3.10 活性氧检测
    3.11 蛋白提取和定量
    3.12 Western Blot检测蛋白表达情况
    3.13 体内移植瘤实验
    3.14 统计分析
4.结果
    4.1 不同栽培方式桑黄多糖、总酚、黄酮和总三萜含量
    4.2 不同栽培方式桑黄提取物体外抗肿瘤活性
    4.3 桑黄提取物对宫颈癌Si Ha细胞超微结构的影响
    4.4 桑黄提取物对宫颈癌Si Ha细胞周期的影响
    4.5 桑黄提取物诱导Si Ha细胞凋亡
    4.6 桑黄提取物诱导Si Ha细胞线粒体膜电位下降
    4.7 桑黄提取物诱导Si Ha细胞内活性氧水平的增加
    4.8 桑黄提取物诱导Si Ha细胞内钙离子水平的增加
    4.9 桑黄提取物诱导Si Ha细胞内质网应激
    4.10 桑黄提取物诱导Si Ha细胞线粒体凋亡
    4.11 桑黄提取物对裸鼠皮下移植瘤的影响
5.讨论
6.结论
参考文献
附录
致谢
综述 针层孔菌属的化学成分和药理作用研究进展
    参考文献

(3)基于PI3K/AKT/mTOR信号通路探讨熊果酸诱导胃癌细胞凋亡及自噬性死亡的机制研究(论文提纲范文)

摘要
Abstract
英文缩略词表
前言
论文一 熊果酸干预PI3K/AKT/mTOR信号通路诱导胃癌移植瘤细胞凋亡及自噬性死亡
    材料与方法
    实验结果
    讨论
    小结
论文二 熊果酸干预PI3K/AKT/mTOR信号通路诱导胃癌细胞凋亡
    材料与方法
    实验结果
    讨论
    小结
论文三 熊果酸干预PI3K/AKT/mTOR信号通路诱导胃癌细胞自噬性死亡
    材料与方法
    实验结果
    讨论
    小结
结论
本研究创新性的自我评价
参考文献
综述
    一 熊果酸抗肿瘤机制研究进展
        参考文献
    二 自噬在胃癌中的研究进展
        参考文献
个人简介
在学期间科研成绩
致谢

(4)重组人血管内皮抑素对宫颈癌放疗敏感性的调控作用和机制研究(论文提纲范文)

英文缩略词表
中文摘要
Abstract
引言
第一部分 重组人血管内皮抑素联合放疗对宫颈癌细胞和脐静脉血管内皮细胞放疗增敏的体外研究
    材料
    方法
    结果
第二部分 重组人血管内皮抑素对人宫颈癌移植瘤模型放疗增敏的研究
    材料
    方法
    结果
讨论
结论
参考文献
个人简历
致谢
综述 抗血管生成与宫颈癌放疗敏感性的研究进展
    参考文献

(5)阿帕替尼联合放化疗对宫颈癌抗肿瘤作用的临床研究及机制研究(论文提纲范文)

中文摘要
英文摘要
缩略词表
第一章 阿帕替尼联合放化疗治疗复发、晚期宫颈癌的疗效及安全性的临床研究
    前言
    研究方法
    实验结果
    讨论
    参考文献
第二章 阿帕替尼联合放疗对人宫颈癌SiHa及HeLa细胞裸鼠移植瘤抑制作用的实验研究
    前言
    研究方法
    实验结果
    讨论
    参考文献
第三章 Apatinib通过VEGFR2通路及JAK2/STAT3信号通路提高宫颈癌细胞放疗敏感性的机制研究
    前言
    研究方法
    实验结果
    讨论
    参考文献
致谢
攻读博士学位期间发表及拟发表的学术论文
学位论文评阅及答辩情况表
外文论文(一)
外文论文(二)

(6)Poly(I:C)对宫颈癌细胞与肿瘤浸润巨噬细胞相互作用的影响及对宫颈癌血管生成的作用(论文提纲范文)

中文摘要
英文摘要
符号说明
研究背景
第一部分 poly(I:C)对宫颈癌细胞与肿瘤浸润巨噬细胞募集作用的影响
    前言
    材料与方法
    结果
    结论
    讨论
    图表
第二部分 poly(I:C)对宫颈癌细胞与肿瘤相关巨噬细胞细胞因子表达及机制的研究
    前言
    材料与方法
    结果
    结论
    讨论
    图表
第三部分 poly(I:C)对宫颈癌血管生成的作用
    前言
    材料与方法
    结果
    结论
    讨论
    图表
综述
参考文献
致谢
攻读博士期间发表的主要学术论文目录
学位论文评阅及答辩情况
外文论文Ⅰ
外文论文Ⅱ

(7)褪黑素对TNF-α介导的宫颈癌Hela细胞凋亡的影响及其机制研究(论文提纲范文)

摘要
Abstract
中英文缩略词表
引言
第一部分 褪黑素对TNF-α介导的宫颈癌Hela细胞凋亡影响的研究
    前言
    1 材料与方法
    2 结果
    3 讨论
    4 结论
第二部分 褪黑素增强TNF-α介导的宫颈癌HeLa细胞凋亡的相关机制研究
    前言
    1 材料与方法
    2 结果
    3 讨论
    4 结论
第三部分 褪黑素对TNF-α介导的宫颈癌裸鼠移植瘤生长以及线粒体自噬的影响
    前言
    1 材料与方法
    2 结果
    3 讨论
    4 结论
总结与展望
参考文献
综述一 褪黑素抗肿瘤作用及其机制的研究进展
    参考文献
综述二 线粒体自噬的生理功能、调控机制及其在相关疾病中的作用
    参考文献
个人简历及在学期间发表的学术论文与研究成果
致谢

(8)成纤维细胞激动蛋白促进肺腺癌增殖的机理研究(论文提纲范文)

缩略词表
中文摘要
英文摘要
第一部分 临床组织样本分析FAP在肺腺癌人群中的表达及预后
    一. 前言
    二. 材料与方法
        2.1. 实验仪器和材料
        2.2. 实验技术路线
        2.3. 实验方法
        2.4. 统计学处理
    三. 结果
        3.1. 组织芯片的基本资料
        3.2 FAP在肺腺癌组织样本中的表达及预后情况
        3.3 TCGA数据分析FAP在人腺癌组织中表达及预后情况
    四. 讨论
    五. 结论
    参考文献
第二部分 FAP促进肺腺癌增殖的机理研究
    一. 前言
    二. 材料与方法
        2.1. 实验仪器和材料
        2.2. 实验技术路线
        2.3. 实验方法
        2.4. 统计学分析
    三. 结果
        3.1. 目的基因过表达慢病毒载体结果
        3.2 FAP基因过表达慢病毒感染目的细胞及稳定细胞系的筛选
        3.3 免疫印迹(Western Blot)检测目的细胞株内FAP蛋白的表达情况
        3.4 Cell counting kit-8 (CCK8)检测过表达FAP后各细胞株增殖能力
        3.5. ELISA法检测FAP抑制内源性IFN-β的释放
        3.6. 小鼠细胞及人细胞转录本测序分析
        3.7. PCR及western blot验证下游分子机制
        3.8. 实验用裸鼠照片
        3.9. 裸鼠移植瘤体积及重量数据分析
        3.10. 各组裸鼠体重变化情况
        3.11 裸鼠移植瘤组织的HE染色情况
        3.12 裸鼠肿瘤组织免疫组化染色
    四. 讨论
    五. 结论
    参考文献
附录 昆明医科大学医学伦理委员会科研课题伦理审核表
综述 成纤维细胞激动蛋白在肿瘤微环境中的研究进展
    参考文献
攻读学位期间获得的学术成果
致谢

(9)LncRNA SNHG1调控食管鳞状细胞癌发展进程的机制研究(论文提纲范文)

摘要
Abstract
缩略词表
引言
    参考文献
第一部分 SNHG1 在ESCC中的表达及对细胞生物学行为的影响
    1. 前言
    2. 材料与方法
    3. 结果
    4. 讨论
    5. 小结
    参考文献
第二部分 SNHG1 对ESCC细胞生物学特性影响的机制研究
    1. 前言
    2. 材料与方法
    3. 结果
    4. 讨论
    5. 小结
    参考文献
第三部分 SNHG1 对食管鳞状细胞癌裸鼠体内移植瘤影响
    1. 前言
    2. 材料与方法
    3. 结果
    4. 讨论
    5. 小结
    参考文献
综述 LncRNA和miRNA在食管癌中的研究进展
    参考文献
个人简历及博士阶段发表的论文
    个人简历
    攻读博士学位期间发表的学术论文
致谢

(10)IL-24修饰的人脐带间充质干细胞对胶质瘤靶向治疗的研究(论文提纲范文)

摘要
Abstract
前言
第一部分 IL-24-UC-MSCs的构建及鉴定
    1.1 前言
    1.2 实验材料
        1.2.1 主要仪器
        1.2.2 主要试剂
        1.2.3 溶液的配制
        1.2.4 UC-MSCs
        1.2.5 实验慢病毒
    1.3 实验方法
        1.3.1 UC-MSCs的培养
        1.3.2 细胞的冻存与复苏
        1.3.3 慢病毒感染UC-MSCs
        1.3.4 基因修饰对UC-MSCs细胞形态学的影响
        1.3.5 基因修饰对UC-MSCs细胞表面分子标记物的影响
        1.3.6 基因修饰对UC-MSCs多向分化能力的影响
        1.3.7 Western blot检测IL-24 表达
        1.3.8 ELISA法检测IL-24 表达
    1.4 实验结果
        1.4.1 慢病毒感染UC-MSCs
        1.4.2 基因修饰对UC-MSCs细胞形态学的影响
        1.4.3 基因修饰对UC-MSCs细胞表面分子标记物的影响
        1.4.4 基因修饰对UC-MSCs多向分化能力的影响
        1.4.5 基因修饰后UC-MSCs中 IL-24 的表达
    1.5 讨论
        1.5.1 UC-MSCs的培养
        1.5.2 UC-MSCs的转染及鉴定
        1.5.3 目的基因的检测
    1.6 结论
第二部分 基因修饰的UC-MSCs治疗胶质瘤的实验研究
    2.1 前言
    2.2 实验材料
        2.2.1 主要仪器
        2.2.2 主要试剂
        2.2.3 溶液的配制
        2.2.4 UC-MSCs
        2.2.5 人胶质瘤U251 细胞
        2.2.6 实验慢病毒
        2.2.7 实验动物
    2.3 实验方法
        2.3.1 UC-MSCs的培养与病毒感染
        2.3.2 U251 细胞的培养
        2.3.3 细胞的冻存与复苏
        2.3.4 IL-24-UC-MSCs在体外向肿瘤细胞的趋向性迁移实验
        2.3.5 IL-24-UC-MSCs对 U251 细胞活力的影响
        2.3.6 IL-24-UC-MSCs诱导U251 细胞凋亡的体外实验
        2.3.7 U251 胶质瘤荷瘤裸鼠模型的建立
        2.3.8 胶质瘤荷瘤裸鼠的细胞移植
        2.3.9 肿瘤生长情况
        2.3.10 病理标本的制备
        2.3.11 IL-24-UC-MSCs在体内向肿瘤趋向性迁移的检测
        2.3.12 Western blot检测IL-24 的体内表达
        2.3.13 胶质瘤组织HE染色
        2.3.14 IL-24-UC-MSCs在体内对胶质瘤细胞凋亡的影响
        2.3.15 p-Akt、Bcl-2 的免疫组化检测
        2.3.16 统计学分析
    2.4 实验结果
        2.4.1 IL-24-UC-MSCs在体外向肿瘤细胞的趋向性迁移
        2.4.2 IL-24-UC-MSCs分泌的IL-24 在体外抑制U251 细胞活力
        2.4.3 IL-24-UC-MSCs分泌的IL-24 在体外诱导U251 细胞凋亡
        2.4.4 IL-24-UC-MSCs抑制裸鼠皮下移植瘤生长
        2.4.5 IL-24-UC-MSCs在体内向肿瘤细胞的趋向性迁移
        2.4.6 IL-24 在皮下移植瘤组织中的表达
        2.4.7 IL-24-UC-MSCs诱导皮下移植瘤组织中细胞凋亡
        2.4.8 p-Akt、Bcl-2 在肿瘤组织中的表达
    2.5 讨论
        2.5.1 基因修饰的UC-MSCs向胶质瘤细胞的趋向性迁移
        2.5.2 IL-24 基因修饰的UC-MSCs在体外抑制胶质瘤
        2.5.3 IL-24 基因修饰的UC-MSCs在体内抑制胶质瘤
        2.5.4 Akt/Bcl-2 信号通路与胶质瘤
        2.5.5 后续思考
    2.6 结论
参考文献
英文缩写词表
综述 间充质干细胞及其在肿瘤治疗中的研究进展
    综述参考文献
在攻读博士学位期间公开发表的论文
在攻读博士学位期间主持和参加的科研项目
在攻读博士学位期间参加的学术交流
致谢

四、IFN-α对人宫颈癌裸鼠皮下移植瘤生长的影响(论文参考文献)

  • [1]STING对宫颈癌增殖、迁移和侵袭能力的作用及机制的研究[D]. 杜华珊. 吉林大学, 2021(01)
  • [2]药用真菌桑黄通过内质网应激—线粒体损伤诱导人宫颈癌细胞凋亡[D]. 贺屏雅. 安徽医科大学, 2021(01)
  • [3]基于PI3K/AKT/mTOR信号通路探讨熊果酸诱导胃癌细胞凋亡及自噬性死亡的机制研究[D]. 陈伟妍. 辽宁中医药大学, 2021(02)
  • [4]重组人血管内皮抑素对宫颈癌放疗敏感性的调控作用和机制研究[D]. 徐中华. 安徽医科大学, 2021(01)
  • [5]阿帕替尼联合放化疗对宫颈癌抗肿瘤作用的临床研究及机制研究[D]. 郭秋芬. 山东大学, 2020(04)
  • [6]Poly(I:C)对宫颈癌细胞与肿瘤浸润巨噬细胞相互作用的影响及对宫颈癌血管生成的作用[D]. 刘昕. 山东大学, 2020(11)
  • [7]褪黑素对TNF-α介导的宫颈癌Hela细胞凋亡的影响及其机制研究[D]. 赵庆贺. 郑州大学, 2020(02)
  • [8]成纤维细胞激动蛋白促进肺腺癌增殖的机理研究[D]. 石剑林. 昆明医科大学, 2020(02)
  • [9]LncRNA SNHG1调控食管鳞状细胞癌发展进程的机制研究[D]. 李浩淼. 郑州大学, 2020(02)
  • [10]IL-24修饰的人脐带间充质干细胞对胶质瘤靶向治疗的研究[D]. 樊少臣. 南通大学, 2020

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IFN-α对人宫颈癌裸鼠皮下移植生长的影响
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