一、间接ELISA检测羊伪狂犬病抗体的研究（论文文献综述）
宋健颖[1]（2021）在《规模化母猪场五种疫病血清学监测及部分病原鉴定、免疫程序调整》文中认为随着我国养猪业的规模化发展,猪瘟、圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征、口蹄疫和猪伪狂犬五种主要疾病防控尤为重要,一旦发病就会造成重大经济损失。本研究通过对新疆南疆某地区3个规模化母猪场母猪群的猪瘟、圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征、伪狂犬和口蹄疫等五种主要疫病进行抗体水平监测、病原检查,了解规模化母猪场抗体水平、是否存在野毒感染、野毒基因型,更好地评价免疫程序是否合理,以期提高免疫效果。1.2018年至2020年,对新疆南疆某地区3个规模猪场（A～C）采集的1604份血液进行了猪瘟、伪狂犬、猪繁殖与呼吸综合征、口蹄疫和圆环病毒2型的抗体检测。检测结果显示,猪瘟抗体阳性率分别为:A场92.30%（2018）、97.74%（2019）和89.22%（2020）;B场95.27%（2018）、93.04%（2019）和86.81%（2020）;C场91.67%（2018）、86.50%（2019）和90.80%（2020）;伪狂犬病抗体分阳性率别为:A场100.00%（2018）、99.25%（2019）和97.06%（2020）;B场98.82%（2018）、93.67%（2019）和94.44%（2020）;C场98.12%（2018）、84.00%（2019）和96.55%（2020）;猪繁殖与呼吸综合征抗体阳性率分别为:A场86.15%（2018）、75.19%（2019）和55.88%（2020）;B场86.39%（2018）、88.61%（2019）和88.89%（2020）;C场91.94%（2018）、96.50%（2019）和95.40%（2020）。口蹄疫抗体阳性率分别为:A场90.77%（2018）、100%（2019）和98.04%（2020）;B场100%（2018）、97.47%（2019）和96.53%（2020）;C场95.97%（2018）、97.50%（2019）和96.55%（2020）;圆环病毒2型抗体阳性率分别为:A场80.00%（2018）、100.00%（2019）和92.16%（2020）;B场95.27%（2018）、97.47%（2019）和96.53%（2020）;C场97.04%（2018）、97.50%（2019）和98.85%（2020）。2.以“发现疫病或证明无疫”的抽样策略采集A规模化母猪场血清样本,采用圆环病毒2型抗原ELISA检测,检测结果阳性率为4.4%,证明A场存在圆环病毒2型感染。3.对A规模化母猪场疑似猪繁殖与呼吸综合征发病猪的样本,采用猪繁殖与呼吸综合征ORF5基因序列特异性引物经RT-PCR扩增、测序、核苷酸同源性比较、系统进化树分析,结果证明,该样本测序结果与NADC30毒株同源性最高,为93.5%,属于类NADC30毒株。4.猪繁殖与呼吸综合征免疫程序进行调整初探,调整后母猪每年普免3次,每次免疫间隔4个月,采集调整后试验的猪群50份血清,进行猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体ELISA检测,抗体阳性率达到96%以上。
傅欣玲[2]（2021）在《伪狂犬病病毒gB蛋白单克隆抗体的制备及竞争ELISA方法的建立》文中研究表明猪伪狂犬病（Pseudorabies,PR）的病原为伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus,PRV）,是一种急性传染病,能引起新生仔猪的突发死亡与成年猪的繁殖障碍。2011年以来,伪狂犬病病毒变异株在我国开始流行,传统疫苗如Bartha-K61等不能为免疫猪提供完全的保护。伪狂犬病病毒变异株的出现给我国养猪业疫病净化及防控带来的巨大的挑战。囊膜糖蛋白gB在疱疹病毒中序列保守,促进病毒囊膜与细胞膜的融合以利于病毒的感染入侵和传播。gB是PRV主要的免疫原性蛋白,且对变异毒株毒力的改变具有很大影响。因此,gB也作为PRV基因工程疫苗和临床抗体检测的靶蛋白被广泛研究和应用。为了建立检测PRV-gB蛋白抗体的检测方法,本研究使用各种不同形式的抗原免疫小鼠,比较了不同抗原诱导抗体的效果,制备了伪狂犬病病毒gB蛋白单克隆抗体,并证实该单克隆抗体具有一定特异性,可用于竞争ELISA方法的建立,为后续研究奠定了良好的基础。本研究分别采用昆虫细胞-杆状病毒表达系统和原核表达系统表达了gB蛋白,并构建了携带gB基因的重组质粒DNA,用gB蛋白和质粒DNA分别免疫小鼠。用蛋白质印迹法（Western-blotting）、酶联免疫吸附测定（ELISA）和间接免疫荧光（IFA）等方法评价了不同抗原诱导的抗体水平。其中,质粒DNA免疫诱导的抗体能与病毒发生良好反应,IFA检测抗体效价较高。随后,选择质粒DNA作为免疫原免疫小鼠,并筛选到了一株单克隆抗体2E10。IFA和Western blotting实验证实2E10与PRV具有良好的反应性和特异性。用2E10初步建立了检测gB抗体的竞争ELISA方法。在建立该方法优化各种反应条件时发现:包被缓冲液最佳浓度为0.01M;每孔最佳包被蛋白量为200ng;最佳封闭条件为37℃、2h;血清最佳稀释倍数设定为4倍;一抗最佳稀释倍数设定为104倍;二抗最佳稀释倍数为5000倍;最佳孵育时间都为1h;TMB最佳显色条件为避光、37℃、0.5h。判定标准为:抑制率大于等于24.2%判定为阳性;抑制率小于等于22.8%判定为阴性;两者之间判定为可疑。特异性试验结果显示只有PRV阳性血清具有较高抑制率,猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）阳性血清、猪圆环病毒2型（PCV-2）阳性血清抑制率很低,证实了该方法具有一定的特异性。敏感性试验结果为1:128,证实了该方法较好的敏感性。该法的符合率试验结果显示,阴性符合率为100%,阳性符合率为91%,总符合率为94.6%,具有一定使用价值。总之,本研究选择了质粒DNA作为免疫原,制备单克隆抗体。单克隆抗体2E10与PRV具有良好反应性,可用于建立竞争性ELISA方法。这些都为PRV抗体的制备和抗体检测方法的建立提供了有价值的信息和材料。
赵静[3]（2021）在《猪伪狂犬病病毒gB抗体阻断ELISA检测方法的建立及初步应用》文中指出猪伪狂犬病（Pseudorabies,PR）是一种由伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus,PRV）引起的高度传染性疾病。PRV能感染包括猪、羊、牛在内的多种哺乳动物,该病以种猪繁殖障碍、成年猪呼吸困难、仔猪死亡为临床特征,给我国养猪业造成了严重的经济损失。2011年,国内PRV变异株暴发流行,此后分离到的PRV毒株基本都与国内经典株间存在明显遗传差异,与PRV变异株处于相同的独立分支。减毒活疫苗Bartha-K61不能针对PRV变异株为猪提供完全保护,而针对PRV变异株的疫苗目前已有上市产品。PRV g B抗体检测试剂盒常用于监测疫苗免疫情况,近年来国内应用的g B抗体试剂盒主要是国外公司生产的试剂盒。随着国内PRV变异株疫苗的应用,这些试剂盒暴露出敏感性不高的缺点,另外国外试剂盒存在价格较贵或某些品牌的试剂盒在国内没有批准文号等问题,因此需要研制使用效果更好的国产试剂盒替代这些国外产品。针对以上问题,本研究以超离纯化的PRV变异株TP株为包被抗原,以本实验室保存的由PRV变异株制备和筛选的g B单克隆抗体（m Ab）312H为阻断抗体,经过条件优化,建立了一种PRV g B抗体阻断ELISA检测方法。结果显示:最佳包被条件为使用碳酸盐缓冲液（CBS）将抗原蛋白稀释至625 ng/孔,4℃包被12 h;最佳封闭条件是以含1%BSA的PBST为封闭液,37℃封闭1.5 h;阻断抗体最佳稀释度为1:30;二倍稀释待检血清最佳反应条件为37℃孵育0.5 h;最佳底物反应条件为37℃避光显色15 min。通过统计对400份的阻断ELISA结果得出判定标准:血清样本S/N值≤0.6判定为阳性,S/N值>0.6判定为阴性。特异性试验结果显示,本方法仅能检测出PRV阳性血清,与猪圆环病毒2型病毒（PCV2）、非洲猪瘟病毒（ASFV）、猪瘟病毒（CSFV）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪繁殖与呼吸综合征1型病毒（PRRSV-1）DV株、猪繁殖与呼吸综合征2型病毒（PRRSV-2）F112株阳性血清无交叉反应。重复性试验结果显示,批内和批间重复性试验的变异系数均小于3%。对PRV变异株二倍梯度稀释（1:2～1:2048）阳性血清的检测结果显示,本试验建立的g B抗体阻断ELISA方法敏感性普遍比IDEXX试剂盒敏感性高2～8倍。使用本方法和IDEXX试剂盒检测158份PRV阴、阳性血清,结果显示本方法与IDEXX试剂盒的符合率为99.37%,表明本方法与IDEXX试剂盒具有较好的一致性。使用本方法和IDEXX试剂盒同时检测492份猪场收集的临床血清样品,结果显示IDEXX试剂盒与本方法的符合率为98.78%,进一步证明了本方法作为IDEXX试剂盒替代产品良好的应用前景。综上所述,本研究成功建立了一种特异性强、敏感度高的PRV g B抗体阻断ELISA检测方法,能够有效对猪只体内PRV抗体水平进行监测,为我国PR流行监测及防控提供技术支持,为标准化检测试剂盒的研制奠定了基础。
王春芳[4]（2021）在《PRV新型检测方法的建立及亚单位疫苗的免疫原性研究》文中研究指明伪狂犬病毒（Pseudorabies virus,PRV）引起的伪狂犬病（Pseudorabies,PR）是一种急性传染病,以侵袭动物神经系统和繁殖系统为主要特征。近年来陆续有人感染PRV的报道,因此PRV越来越引起研究人员的重视。本研究设计的针对PRV g B基因和g E基因的双重纳米PCR检测方法,能更好地提高该病的检测效率。目前,针对PRV的手段仍然以预防为主,因此,本试验针对PRV g D蛋白制备了亚单位疫苗,并进一步研究其免疫原性。针对这两部分的主要研究内容包括:1.PRV g B和g E基因双重纳米PCR检测方法的建立本研究参照Gen Bank中公布的PRV毒株（登录号为:KX451219.1）,设计特异性PRV检测引物,利用纳米金颗粒,通过优化PCR体系和条件,建立了PRV g B和g E基因双重纳米PCR检测方法。此方法与常见猪源病毒均无交叉反应,表明建立的方法特异性较好。对构建的p MD18-T-PRV-g E和p MD18-T-PRV-g B阳性质粒进行检测,可检测到的最低限分别为1.6×102拷贝/μL和1.96×102拷贝/μL,其敏感性较普通PCR高出100倍。重复检测阳性质粒,结果均为阳性,表明其重复性良好。对80份不同动物的疑似样品进行检测,本研究建立的方法与普通PCR检测方法符合率为98.8%。结果表明本研究建立的检测方法为单个样本量更小的病料提供了有效的技术支持。2.亚单位疫苗的免疫原性研究本试验通过对PRV g D基因胞外区进行密码子优化,构建p CAGGS-PRV-g D真核表达质粒,并纯化重组蛋白。三次皮下免疫BALB/c小鼠,分别在免疫0 d、14 d、28 d、42 d采血,收集血清。在42 d处死小鼠,分离淋巴结淋巴细胞。测定小鼠血清Ig G并进行血清中和试验,测定淋巴细胞增值率、细胞亚型比例和细胞因子（IFN-γ和IL-4）。结果表明:实验组产生了较高水平的Ig G抗体,g D蛋白的中和效价为1∶132;g D蛋白免疫的小鼠CD3+CD4+T淋巴细胞较PBS组升高37.53%,CD3+CD8+T淋巴细胞较PBS组升高49.95%;MTT法检测g D组淋巴细胞增殖率较PBS组升高184.18%;g D免疫组小鼠细胞因子检测IFN-γ水平均值是844.04 pg/m L、IL-4水平均值是174.37 pg/m L相比于PBS组均差异极显着。本试验的试验组有不同程度的免疫效果,综合来看,构建的真核表达蛋白有较好的免疫效果。本试验可以为后期制备临床应用的亚单位疫苗打下基础,但也还是需要进一步研究。本试验利用HEK-293F细胞上清表达,纯化更简便、效果更好,为兽用亚单位疫苗打下基础。
张洪亮[5]（2021）在《伪狂犬病病毒的基因工程疫苗构建及其感染PK-15细胞的转录组和蛋白质组学分析》文中研究指明伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus,PRV）,是一种可感染猪、牛、羊等家畜,犬猫等宠物,家兔、狐、貉、水貂等毛皮动物和野生动物,以引起发热、奇痒（猪除外）及脑脊髓炎等主要临床症状的疱疹病毒。该病毒可感染各年龄段的猪群,主要造成种猪繁殖障碍、仔猪发生神经系统和呼吸道症状。自2011年PRV变异株出现以来,导致Bartha-K61等传统疫苗的保护力有所降低,我国多个地区已免疫PRV疫苗的猪场发生伪狂犬病疫情,严重威胁了我国生猪养殖业的健康可持续发展。因此,本研究开展了PRV变异株的病原学、快速鉴别诊断技术、新型基因工程疫苗、转录组和蛋白质组学的研究,为该病有效防控奠定技术和理论基础。取得的主要研究成果有:1.本研究对山东某Bartha-K61疫苗免疫猪场感染的PRV野毒株进行了分离鉴定,成功分离鉴定到PRV SD-2017株,并完成了生物学特性分析。基于g E、TK和g B等毒力基因的遗传进化分析,确定该毒株为我国当前流行的PRV变异毒株。透射电镜观察病毒粒子直径大约在140～180 nm,有厚囊膜,囊膜表面有放射状纤突,粒子核心致密,呈现出疱疹病毒典型的病毒粒子形态结构。该毒株在PK-15细胞上的病毒滴度可达到109.0TCID50/m L,对家兔的半数致死量(LD50)为3.2×102.0TCID50/m L。2.针对PRV疫苗株与野毒株的鉴别诊断,筛选到特异性引物和探针,成功建立了PRV g B和g E基因的酶促重组等温扩增（ERA）荧光检测方法。g B和g E基因的ERA检测方法的敏感性分别为10copies/μL、103copies/μL,与荧光定量PCR方法比对,g B和g E基因检测结果符合率分别为100%和92.31%。该方法在38℃恒温反应25 min,能够实现对PRV g B和g E基因的特异性鉴别检测,将反应体系进行预冻干后,可组装成检测试剂盒进行现场应用,可有效应用于PRV野毒和疫苗毒的临床快速诊断。3.以PRV变异毒株SD-2017株作为亲本毒株,利用同源重组技术对g E/g I/TK毒力基因进行了缺失,分别构建了PRV SD-2017Δg E/g I株和SD-2017Δg E/g I/TK-EGFP株,并分析了其一步生长曲线、致病性等生物学特性,基因缺失株的病毒含量在PK-15细胞上仍能达到108.0TCID50/m L,SD-2017Δg E/g I/TK-EGFP株对家兔的LD50>1.0×106.0TCID50/m L,为针对PRV变异株开发基因缺失灭活疫苗和减毒活疫苗提供了理想的候选疫苗种毒。4.将树突状细胞靶向诱导肽DCpep作为分子内佐剂,脑膜炎奈瑟氏球菌Por B蛋白作为疫苗佐剂,分别构建了含有蛋白分泌信号肽gp67的重组杆状病毒Ac-g B-DCpep和Ac-Por B,利用昆虫细胞真核表达系统进行了PRV g B-DCpep蛋白融合表达和Por B蛋白真核表达,基于前期研究构建的PRV毒力基因缺失株,分别制备了PRV SD2017株Δg E/g I/TK三基因缺失活疫苗和Δg E/g I双基因缺失灭活疫苗,与g B-DCpep基因工程亚单位疫苗、Bartha K61活疫苗一同在家兔上进行了对PRV变异株感染的免疫保护效果评价。构建的SD2017Δg E/g I/TK减毒活疫苗、PRV-g B+Por B亚单位疫苗和SD2017Δg E/g I+Por B灭活疫苗,在家兔上显示了对变异株SD-2017良好的免疫保护作用。结果说明DCpep可作为潜在的分子佐剂,Por B蛋白可以作为新型疫苗佐剂,对体液免疫和细胞免疫均具有显着的诱导刺激作用,后续可应用于新型基因工程疫苗的制备,为PRV新型疫苗开发提供了新的策略。5.基于Illumina转录组测序技术对PRV SD-2017株、SD-2017Δg E/g I/TK株、Bartha K61株感染PK-15细胞的转录组差异进行了全面分析,发现差异上调的基因多集中在细胞周期、m TOR信号通路、自噬-动物、PI3K-Akt信号通路、细胞衰老、癌症的途径、胞吞作用、HTLV-I感染、ap1信号通路、MAPK等信号通路。差异下调的基因多集中在有氧化磷酸化、RNA转运、碳代谢、HTLV-I感染、人乳头瘤病毒感染和MAPK等信号通路。差异表达下调的基因富集最多的通路是核糖体、氧化磷酸化RNA转运、m RNA监测途径、卵母细胞减数分裂、内质网中的蛋白质加工、丙酸酯代谢、基因复制、帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、生热等信号通路。相关基因的其生物学意义需要进一步研究揭示。6.利用TMT标记定量蛋白质组学技术对PRV SD-2017株、SD-2017Δg E/g I/TK株、Bartha K61株感染PK-15细胞的蛋白质组学差异进行了全面分析,解析了差异蛋白参与不同毒力PRV感染细胞中的生物学过程、分子功能及细胞定位。差异蛋白涉及的主要信号通路有抗原处理和展示、初级胆汁酸合成、醚脂质代谢、矿物质吸收、过氧化物酶体、HTLV-I感染、催产素信号通路、单纯疱疹感染、卡波济氏肉瘤相关疱疹病毒感染、细胞衰老、趋化因子信号通路、Notch信号通路等。PRV病毒-宿主细胞相互作用的机制值得进一步研究,尤其是蛋白质组差异中涉及的关键基因如何调节PRV感染方面,将有助于更好地了解PRV的特定感染机制。另外,本研究通过PRV感染PK15细胞的转录组和蛋白质组GO功能富集关联性分析发现,两者在细胞部分、细胞、细胞器部分大分子复合物、催化活性、结合、细胞过程、代谢过程等方面的显着差异相关联,为后续深入研究不同PRV毒株的致病机理提供了有利条件。
朱冰[6]（2020）在《猪伪狂犬病抗体磁微粒化学发光检测方法的建立及初步应用》文中认为伪狂犬病（Pseudorabies,PR）是由伪狂犬病毒（Pseudorabiesvirus,PRV）引起的一种以侵害中枢神经系统为主要特征的高度接触性动物传染病,猪是其唯一的天然宿主。20世纪80年代我国从匈牙利引进了伪狂犬Bartha-K61减毒活疫苗,有效地控制了PRV在我国的流行;然而从2011年开始,暴发了PRV变异毒株并持续扩散,PRV再一次成为引起我国养猪业重大损失的主要病原之一。针对当前PRV的流行现状,建立更为高效、准确的检测方法对疫情的防控乃至该病的最终根除均有重要意义。本研究首先利用2013年采集于黑龙江省某猪场经鉴定为PRV阳性的组织样品进行病毒分离,经细胞病变观察、PCR检测、间接免疫荧光以及电镜检测证实成功分离出一株RPV,并命名为PRV HLJ-2013。随后,利用高通量测序技术对该病毒的全基因组序列进行了测定,并在基因组、编码蛋白基因以及氨基酸序列等水平上对病毒的进化特征做了分析。结果显示,PRV HLJ-2013的基因组全长为142.56 kbp;该毒株与国内参考毒株同属于基因II型,但在进化树上介于国内分离株和国外分离株之间的一个独立的分支上;该毒株各编码蛋白基因与其他参考毒株相应的编码蛋白基因表现出不同的进化关系,其中UL10（gM）、UL44（gC）、UL36（VP1/2）与国外毒株亲缘关系较近,而US6（gD）、UL19（VP5）与国内早期毒株（如SC、Fa和Ea毒株）处于同一进化分支。以上结果表明PRV HLJ-2013毒株可能为一株出现较早,且持续存在的毒株。PRV HLJ-2013及国内PRV经典株SC和变异株HeN1的细胞接种实验及小鼠致病性实验结果表明,PRV HLJ-2103在PK15细胞上的生长特性与SC及HeN1没有显着差异;HLJ-2013感染小鼠可引起明显的脑及肺组织的损伤,且致病力强于SC毒株,但弱于HeN1毒株。以上结果表明,本研究成功分离并鉴定了一株在遗传及部分生物学特性上与当前其他PRV毒株存在一定差异的新毒株,并且该毒株是我国早起流行毒株的分支。为制备PR化学发光抗体检测方法包被抗原,对PRV HLJ-2013进行了扩大培养,获得浓度为5.2 mg/mL的纯化病毒抗原,满足方法建立需求。利用磁微粒将浓缩PRV抗原包被至其表面,同时将碱性磷酸酶与兔抗猪IgG抗体进行偶联获取酶标二抗,并对封闭剂浓度、洗涤液浓度、酶促发光反应检测时间以及两步免疫反应时间等反应条件进行优化。实验最终确定磁珠最适抗原包被浓度为400μg/mL、酶标二抗的最佳稀释度为1:10000、封闭剂BSA的最佳浓度为2%、PBST洗涤液的最适浓度为0.2%、两步免疫反应的最佳时间是10 min+10 min、酶促发光反应后最佳检测时间为5 min。对猪伪狂犬病抗体磁微粒化学发光检测方法在灵敏度、重复性、特异性和稳定性等方面进行了初步评价,结果表明,本研究建立的诊断方法相对于PRV gB抗体ELISA试剂盒,其灵敏度更高;批内及批间变异系数均小于10%,方法的重复性较好;与猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征、非洲猪瘟等十种不同病原抗体阳性血清不存在交叉反应;检测方法的各试剂组分稳定性良好。使用本研究建立的方法与商品化ELISA试剂盒共同检测临床猪血清样品,两种检测方法的总体符合率为96.83%;并且两种方法在免疫猪血清检测实验中获得了一致的检测结果。本研究成功分离并鉴定了一株在遗传及部分生物学特性上与国内毒株存在一定差异的PRV HLJ-2013毒株,并以纯化浓缩的全病毒作为包被抗原,建立了基于全病毒的磁微粒化学发光检测方法。该方法灵敏度高、检测时间短、重复性和特异性良好,具有一定的应用前景,可以为免疫猪的PRV抗体监测提供另一种快速的新型检测手段。
尹成伟[7]（2020）在《检测猪伪狂犬病毒gB抗体间接ELISA方法的初步建立及单克隆抗体的制备》文中研究表明猪伪狂犬病（Pseudorabies）是猪伪狂犬病毒（Pseudorabies virus,PRV）引起的一种急性、热性传染病。引起妊娠母猪流产、死胎、木乃伊胎,新生仔猪神经系统紊乱及死亡。自2011年以来,我国猪伪狂犬病在多个省份大面积爆发。由于PRV具有隐性感染的特点,随时可能被体内外和环境因素刺激爆发,建立有效的血清抗体诊断方法对控制乃至净化猪伪狂犬病有着举足轻重的作用。本研究首先利用pGEX-6P-1原核表达载体成功表达了 PRV gB重组蛋白,表达的区域为三个连续的抗原表位区域,共741bp;并以纯化后的重组蛋白成功建立间接ELISA方法;纯化后的gB重组蛋白免疫6～8周龄BALB/c小鼠,通过间接免疫荧光方法筛选获得了 4株能够稳定分泌抗PRV单克隆抗体的细胞株。1伪狂犬病毒gB基因片段的原核表达为了获得用于免疫小鼠的PRVgB免疫原,本研究将PRV gB基因三个连续的抗原表位扩增出来,克隆至线性化载体pGEX-6P-1上,成功构建原核表达载体pGEX-6P-1-gB。将构建正确的质粒转化至BL21感受态中,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析发现PRV gB重组蛋白在上清中表达。用8M尿素将PRV gB蛋白进行变性复性后,利用GST凝胶柱获得纯化的PRV gB重组蛋白。PRV gB重组蛋白的获得为后续建立间接ELISA检测方法和免疫BALB/c小鼠,研制抗PRV gB蛋白的单克隆抗体提供了抗原。2间接ELISA方法的初步建立以纯化后的PRV gB重组蛋白作为包被抗原,用实验室保存的抗PRV阴阳性血清作对照。对间接ELISA的反应条件进行一系列优化,确定最佳抗原包被浓度为0.313μg/mL、待检血清1:400稀释、5%脱脂乳封闭液、封闭时间2h、一抗最佳反应时间为1h、二抗最佳反应时间为45min、显色液的最佳反应时间为15min。运用本检测方法检测抗PRRSV、PEDV、CSFV阳性血清,结果均为阴性,说明该方法具有良好的特异性。通过对18份阴性血清检测确定阴阳性临界值,当OD450nm≤0.273时判为阴性,OD450nm≤0.31时判为阳性,OD450nm值在两者之间判为可疑,批内批间重复性良好,变异系数均小于10%。3伪狂犬病毒gB蛋白单克隆抗体的制备为了获得抗PRV gB蛋白单克隆抗体,本研究将纯化的PRV gB重组蛋白作为免疫原,免疫6周龄BALB/c雌性小鼠,通过间接免疫荧光方法筛选阳性杂交瘤细胞,经有限稀释法进行两次亚克隆,最终获得4株能够稳定分泌抗PRV gB蛋白抗体的杂交瘤细胞,分别命名为 PRV gB-3H9、PRV gB-4C3、PRV gB-5F7、PRV gB-6B9。Western Blot 实验结果显示只有PRV gB-5F7单抗能与PRV病毒蛋白发生特异性反应,这株单抗亚类为IgG,其余单抗亚类为IgM。PRV gB-5F7单抗腹水的ELISA效价达1:102400,荧光效价达1:12800。
黄文祥[8]（2020）在《表达猪圆环病毒3型衣壳蛋白的重组伪狂犬病毒构建及伪狂犬病毒gC、gG蛋白单克隆抗体制备》文中进行了进一步梳理伪狂犬病毒（Pseudorabies Virus,PRV）属于疱疹病毒科疱疹病毒属,该病毒的天然宿主是猪,可引起母猪发生流产、产出死胎,并伴有呼吸障碍。自2011年以来,Ⅱ型PRV在我国出现并流行,给我国养猪业造成巨大经济损失。猪圆环病毒3型（Porcine circovirus type 3,PCV3）是2015年新出现的一种猪病毒性传染病病原,能够产生猪生殖障碍、心脏和多系统炎症等临床症状,其衣壳（Capsid,Cap）蛋白是唯一的结构蛋白,能刺激动物机体产生针对PCV3的血清抗体,也是研制基因工程疫苗理想的抗原蛋白。迄今为止,PRV和PCV3共感染情况在兽医临床上屡见不鲜,所以研制预防PRV和PCV3双重感染的重组病毒疫苗工作显得尤为迫切。本研究以II型PRVHD/c株为亲本株,选择非结构蛋白基因gC和gG作为靶标位点,设计特异性引物扩增针对两个基因缺失的同源重组臂片段,同时构建了表达GFP的荧光表达盒和带有CMV启动子的PCV3 Cap表达盒。采用经典的分子生物学方法将各片段依次连接到pUC18载体上,构建了针对两个位点的同源重组转移载体并进行了测序验证,并且验证了两个载体质粒能够在细胞水平上稳定表达PCV3 Cap蛋白,为后续构建表达PCV3 Cap的PRV重组病毒提供重要分子工具。同时,本研究以Ⅱ型PRV HD/c基因组为模板,扩增出囊膜蛋白gC和gG基因截短序列,并通过构建到pET-28a（+）载体上进行原核表达gC和gG的主要抗原表位区域。以变性纯化的重组His-gC和His-gG蛋白为免疫原分别免疫BALB/c小鼠和新西兰白兔,从而获得了 WB和IFA反应性良好的多克隆抗体。同时取免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合,随后采用有限稀释法进行4次亚克隆筛选,分别获得了 3株稳定分泌gC和gG单克隆抗体的杂交瘤细胞株。通过WB和IFA检测可知,所制备的两种单克隆抗体分别与外源转染样品和PRV感染样品均有良好反应,并进行了抗原表位的初步鉴定。通过使用针对gC的单克隆抗体可用于临床检测PRV疫苗毒株与流行毒株,并且PRV gC和gG单克隆抗体的制备也为研究其生物学功能以及基因缺失疫苗株的鉴定提供了基本工具。
唐雯[9]（2020）在《表达猪圆环病毒2衣壳蛋白的重组伪狂犬病毒构建》文中提出猪圆环病毒2（Porcine circovirus type 2,PCV2）可以导致几种猪病综合征。其中,危害最为严重的是猪断奶后多系统衰竭综合征（PMWS）。PCV2的衣壳蛋白（Capsid,Cap）是它最重要的免疫保护性抗原,它可以引起机体产生针对PCV2的特异性抗体,所以Cap是用于研发基因工程疫苗的一种理想的靶抗原。伪狂犬病（Pseudorabies,PR）,又称作奥耶斯基氏病（Aujeszky’s disease,AD）,是由伪狂犬病毒（Pseudorabies virus,PRV）导致的一种急性传染病。猪场一旦感染很难根除。猪圆环病毒2和伪狂犬病毒对我国养猪业造成的危害巨大。相较于普通的将PCV2及PRV病原进行混合而制成的二联疫苗,PCV2/PRV重组疫苗具有更好的安全性及免疫原性。但迄今为止还没有有效的表达猪圆环病毒2 Cap的重组伪狂犬病毒的二联疫苗研制成功,所以构建表达PCV2 Cap蛋白的重组伪狂犬病毒对于上述疾病防治及技术的升级来讲非常重要。本研究选择以PRV复制非必需蛋白gI（US7）作为插入位点,以TK、gE缺失的HD/c株为亲本,利用CRISPR/Cas9技术结合经典的同源重组技术对重组病毒进行拯救,最终我们得到了 1株TK-/gE-/gI-/Cap+重组伪狂犬病毒。对拯救的重组病毒进行验证,结果显示PCV2b的cap基因已经正确插入到HD/c株基因组中,与亲本株相比,重组毒株和亲本HD/c株的一步生长曲线及蚀斑大小并无明显差异,表明PCV2 cap基因的插入并不影响重组病毒的复制。通过Western Blot及间接免疫荧光试验对Cap蛋白的表达进行验证,结果显示cap基因虽然成功插入到亲本株基因组中,但其并不能成功表达Cap蛋白,且EGFP表达盒的删除并不是影响Cap蛋白表达的原因,查阅文献推测可能的原因为依赖PRV自身的启动子不足以启动外源基因的表达,需要强大的启动子以确保外源基因的稳定表达。为了给重组伪狂犬病毒提供配套的检测工具,本研究制备了抗伪狂犬病毒囊膜gB糖蛋白的单克隆抗体。以伪狂犬病毒HD/c株为模板,扩增gB基因并将其构建到pET-28a原核表达载体上,并利用IPTG诱导表达gB蛋白。再以变性纯化的gB蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠的脾细胞和同品系小鼠的骨髓瘤细胞融合。通过亚克隆筛选出阳性杂交瘤细胞,得到3个能稳定分泌抗gB蛋白抗体的单克隆杂交瘤细胞。对制备的gB单克隆抗体的特性进行鉴定,结果显示制备的gB单克隆抗体能和原核表达、真核表达和病毒感染细胞中的gB蛋白具有良好的Western Blot及间接免疫荧光反应性,且3个单克隆抗体细胞株识别的抗原表位区域位于第63-124 aa区域。
黄雨晴,华涛,唐波,常晨,刘国阳,张雪花,卢宇,侯继波,张道华,许家荣[10]（2019）在《猪伪狂犬病病毒IgA抗体间接ELISA检测方法的建立》文中认为为了建立检测猪伪狂犬病病毒（PRV）黏膜免疫时特异的IgA抗体的间接ELISA方法,本研究采用PCR方法扩增了PRV gB基因截短片段,并将其连入原核表达质粒pGEX-6P-1,构建的表达质粒转化至大肠杆菌Transetta（DE3）菌株后,采用IPTG进行诱导表达,得到gB重组蛋白的可溶性表达,并用谷胱甘肽亲和层析柱进行蛋白纯化。以纯化的gB重组蛋白作为包被抗原,以山羊抗猪IgA-HRP为二抗,建立了猪伪狂犬病病毒IgA的间接ELISA检测方法。经ELISA反应条件优化,确定抗原包被浓度为2.4μg/mL,封闭液为10 g/L明胶,一抗37℃孵育1.5 h,二抗1∶20 000稀释后37℃孵育0.5 h,TMB显色液显色10 min。该方法的批内和批间变异系数均小于10%,重复性较好。利用该间接ELISA方法对PRV黏膜免疫的仔猪进行检测,结果可以在鼻腔黏液中检测出特异的IgA抗体。本试验为PRV黏膜免疫提供了初步检测方法。
二、间接ELISA检测羊伪狂犬病抗体的研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、间接ELISA检测羊伪狂犬病抗体的研究（论文提纲范文）
（1）规模化母猪场五种疫病血清学监测及部分病原鉴定、免疫程序调整（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 猪瘟的研究概况 |
| 1.1.1 概述 |
| 1.1.2 病原学 |
| 1.1.3 猪瘟流行病学和临床症状 |
| 1.1.4 诊断方法 |
| 1.2 伪狂犬的研究概况 |
| 1.2.1 概述 |
| 1.2.2 病原学 |
| 1.2.3 伪狂犬流行病学和临床症状 |
| 1.2.4 诊断方法 |
| 1.3 猪繁殖与呼吸综合征的研究概况 |
| 1.3.1 概述 |
| 1.3.2 病原学 |
| 1.3.3 猪繁殖与呼吸综合征流行病学和临床症状 |
| 1.3.4 诊断方法 |
| 1.4 口蹄疫病的研究研究概况 |
| 1.4.1 概述 |
| 1.4.2 病原学 |
| 1.4.3 口蹄疫病流行病学和临床症状 |
| 1.4.4 诊断方法 |
| 1.5 圆环病毒2 型的研究概况 |
| 1.5.1 概述 |
| 1.5.2 病原学 |
| 1.5.3 圆环病毒2型病流行病学和临床症状 |
| 1.5.4 诊断方法 |
| 1.6 本研究的目的及意义 |
| 第二章 3 个规模化母猪场5 种疫病抗体检测与分析 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验样品来源 |
| 2.1.2 仪器设备 |
| 2.1.3 实验试剂 |
| 2.1.4 样品处理 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 猪瘟病毒抗体ELISA检测 |
| 2.2.2 伪狂犬病毒抗体ELISA检测 |
| 2.2.3 猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体ELISA检测 |
| 2.2.4 口蹄疫病毒抗体ELISA检测 |
| 2.2.5 圆环病毒2 型抗体ELISA检测 |
| 2.3 试验结果 |
| 2.3.1 规模母猪场猪瘟病毒抗体ELISA检测 |
| 2.3.2 规模母猪场伪狂犬病毒抗体ELISA检测 |
| 2.3.3 规模母猪场猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体ELISA检测 |
| 2.3.4 规模母猪场口蹄疫病毒抗体ELISA检测 |
| 2.3.5 规模母猪场圆环病毒2 型抗体ELISA检测 |
| 2.4 讨论与分析 |
| 2.4.1 猪瘟病毒抗体ELISA检测结果分析 |
| 2.4.2 伪狂犬病毒抗体ELISA检测结果分析 |
| 2.4.3 猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体ELISA检测结果分析 |
| 2.4.4 口蹄疫病毒抗体ELISA检测结果分析 |
| 2.4.5 圆环病毒2 型抗体ELISA检测结果分析 |
| 第三章 A规模化母猪场圆环病毒2 型抗原检测 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验样品来源及抽样原则 |
| 3.1.2 仪器设备 |
| 3.1.3 实验试剂 |
| 3.1.4 样品处理 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 圆环病毒2 型抗原ELISA检测 |
| 3.3 检测结果 |
| 3.4 讨论与分析 |
| 第四章 A规模化猪场猪繁殖与呼吸综合征病毒基因型鉴定及分析 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 病料采集 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 仪器 |
| 4.1.4 引物设计与合成 |
| 4.1.5 样品处理 |
| 4.1.6 病毒核酸提取 |
| 4.1.7 PCR产物纯化回收、测序 |
| 4.1.8 序列分析 |
| 4.2 试验结果 |
| 4.2.1 PCR扩增结果 |
| 4.2.2 基因核苷酸同源性分析 |
| 4.2.3 基因遗传进化树分析 |
| 4.3 .讨论 |
| 第五章 A规模化母猪场猪繁殖与呼吸综合征免疫程序调整试验 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 材料 |
| 5.1.2 方法 |
| 5.2 试验结果 |
| 5.2.1 调整后母猪抗体检测结果 |
| 5.2.3 调整前后母猪抗体合格率对比 |
| 5.3 讨论与分析 |
| 第六章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（2）伪狂犬病病毒gB蛋白单克隆抗体的制备及竞争ELISA方法的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 伪狂犬病概述 |
| 1.2 形态与结构 |
| 1.3 基因组与基因型 |
| 1.4 蛋白及其功能 |
| 1.5 理化特性 |
| 1.6 病毒入侵与体内免疫 |
| 1.7 2011年后猪伪狂犬病的流行概况 |
| 1.8 毒株的序列比较 |
| 1.9 gB蛋白及其抗体检测方法 |
| 第二章 gB抗原的不同表达形式与多抗制备 |
| 第一节 昆虫细胞杆状病毒系统表达gB蛋白与多抗制备 |
| 2.1.1 材料与方法 |
| 2.1.2 结果 |
| 2.1.3 讨论 |
| 第二节 gB蛋白的原核表达与多抗制备 |
| 2.2.1 材料与方法 |
| 2.2.2 结果 |
| 2.2.3 讨论 |
| 第三节 gB基因的质粒免疫与多抗制备 |
| 2.3.1 材料与方法 |
| 2.3.2 结果 |
| 2.3.3 讨论 |
| 第三章 gB蛋白的单抗制备与竞争ELISA的初步建立 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 试剂与溶液 |
| 3.1.2 免疫程序 |
| 3.1.3 单克隆抗体的制备 |
| 3.1.4 腹水的制备与鉴定 |
| 3.1.5 竞争ELISA检测方法的建立与优化 |
| 3.1.6 竞争ELISA检测方法临界值的测定 |
| 3.1.7 敏感性试验 |
| 3.1.8 特异性试验 |
| 3.1.9 符合率试验 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（3）猪伪狂犬病病毒gB抗体阻断ELISA检测方法的建立及初步应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 伪狂犬病毒病原学 |
| 1.1.1 病毒粒子结构 |
| 1.1.2 病毒基因组与蛋白 |
| 1.2 流行病学 |
| 1.3 致病机理 |
| 1.4 诊断方法 |
| 1.5 防控 |
| 1.6 本研究目的与意义 |
| 第二章 猪伪狂犬病病毒gB抗体阻断ELISA检测方法的建立与初步应用 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 病毒与单克隆抗体 |
| 2.1.2 主要试剂及耗材 |
| 2.1.3 配制试剂 |
| 2.1.4 实验仪器 |
| 2.1.5 抗原蛋白的制备 |
| 2.1.6 单克隆抗体312H上清的收集和阻断效果的验证 |
| 2.1.7 包被液和最佳包被时间的确定 |
| 2.1.8 封闭液和最佳封闭时间的确定 |
| 2.1.9 最佳抗原包被量和mAb最佳稀释度的确定 |
| 2.1.10 血清样品最佳孵育时间与温度的确定 |
| 2.1.11 最佳底物反应时间的确定 |
| 2.1.12 阻断ELISA临界值的确定 |
| 2.1.13 敏感性试验 |
| 2.1.14 特异性试验 |
| 2.1.15 重复性试验 |
| 2.1.16 阻断ELISA与商品试剂盒的符合率对比 |
| 2.1.17 临床血清样品的检测 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 抗原蛋白纯化 |
| 2.2.2 单克隆抗体312H阻断效果的验证 |
| 2.2.3 包被液和最佳包被时间的确定 |
| 2.2.4 封闭液和最佳封闭时间的确定 |
| 2.2.5 最佳抗原包被量和mAb最佳稀释度的确定 |
| 2.2.6 血清样品最佳孵育时间与温度的确定 |
| 2.2.7 底物最佳作用时间的确定 |
| 2.2.8 阻断ELISA临界值的确定 |
| 2.2.9 敏感性试验 |
| 2.2.10 特异性试验 |
| 2.2.11 重复性试验 |
| 2.2.12 阻断ELISA与商品试剂盒的符合率对比 |
| 2.2.13 临床血清样品的检测 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（4）PRV新型检测方法的建立及亚单位疫苗的免疫原性研究（论文提纲范文）
| 缩略词 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 PR的流行病学 |
| 1.2.1 国内PR流行病学 |
| 1.2.2 国外PR流行病学 |
| 1.2.3 PR的临床症状 |
| 1.2.4 PRV在不同物种之间的传播 |
| 1.3 PRV的生物学特征 |
| 1.3.1 PRV的形态结构 |
| 1.3.2 基因编码的主要结构蛋白及其功能 |
| 1.4 PRV的致病机理 |
| 1.5 PR的诊断方法 |
| 1.5.1 病毒检测 |
| 1.5.2 聚合酶链式反应(PCR) |
| 1.5.3 血清学检测 |
| 1.6 PRV的疫苗研究 |
| 1.7 研究的目的与意义 |
| 第二章 PRV gB和 gE基因双重纳米PCR检测方法的建立 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 试验病料的来源和处理 |
| 2.1.2 所用毒株及载体 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 主要耗材 |
| 2.1.5 试剂配制 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 引物的设计与合成 |
| 2.2.2 DNA提取 |
| 2.2.3 目的片段扩增 |
| 2.2.4 PCR产物回收纯化 |
| 2.2.5 产物连接与转化 |
| 2.2.6 重组质粒的提取鉴定 |
| 2.2.7 双重纳米PCR反应条件和反应体系优化 |
| 2.2.8 普通双重PCR反应条件 |
| 2.2.9 特异性检验 |
| 2.2.10 敏感性检验 |
| 2.2.11 重复性试验 |
| 2.2.12 临床样品检测 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 质粒标准品鉴定结果 |
| 2.3.2 退火温度及引物条件优化结果 |
| 2.3.3 特异性试验结果 |
| 2.3.4 敏感性试验结果 |
| 2.3.5 重复性试验 |
| 2.3.6 临床样品的检测 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 PRV亚单位疫苗的免疫原性研究 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 细胞、菌液和质粒 |
| 3.1.2 主要仪器和设备 |
| 3.1.3 主要试剂溶液 |
| 3.1.4 ELISA相关试剂 |
| 3.1.5 SDS-PAGE相关试剂 |
| 3.1.6 真核表达融合蛋白纯化相关试剂 |
| 3.1.7 Western Blot相关试剂 |
| 3.1.8 试验动物 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 优化并合成PRVgD基因 |
| 3.2.2 PRVgD基因与真核质粒pCAGGS的连接 |
| 3.2.3 pCAGGS-PRV-g D的提取及鉴定 |
| 3.2.4 重组质粒pCAGGS-PRV-gD转染HEK-293T细胞 |
| 3.2.5 Western blot鉴定 |
| 3.2.6 重组真核蛋白pCAGGS-PRV-gD的大量制备 |
| 3.2.7 pCAGGS-PRV-gD重组真核蛋白纯化 |
| 3.2.8 pCAGGS-PRV-gD重组真核蛋白浓度测定 |
| 3.2.9 纯化重组蛋白的动物免疫试验 |
| 3.2.10 免疫小鼠血清IgG测定 |
| 3.2.11 免疫小鼠血清中和试验 |
| 3.2.12 流式细胞术检测淋巴结淋巴细胞亚型比例 |
| 3.2.13 MTT法检测小鼠淋巴结淋巴细胞增殖 |
| 3.2.14 小鼠细胞因子的检测 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 pCAGGS-PRV-gD的鉴定 |
| 3.3.2 重组质粒pCAGGS-PRV-gD在 HEK-293T细胞中试表达及Western blot鉴定 |
| 3.3.3 pCAGGS-PRV-gD真核表达蛋白纯化和浓度测定 |
| 3.3.4 免疫小鼠血清IgG的测定 |
| 3.3.5 免疫小鼠血清中和试验 |
| 3.3.6 流式细胞术检测淋巴结淋巴细胞亚型比例 |
| 3.3.7 MTT法检测小鼠淋巴结淋巴细胞增殖 |
| 3.3.8 小鼠细胞因子的检测 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 致谢 |
（5）伪狂犬病病毒的基因工程疫苗构建及其感染PK-15细胞的转录组和蛋白质组学分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略语表 |
| 1 引言 |
| 1.1 伪狂犬病病毒概述 |
| 1.2 病原学研究 |
| 1.2.1 分子结构 |
| 1.2.2 基因组特征 |
| 1.2.3 主要蛋白功能 |
| 1.2.4 遗传变异分析 |
| 1.3 诊断技术研究 |
| 1.3.1 病原学诊断 |
| 1.3.2 血清学诊断 |
| 1.4 新型疫苗研究 |
| 1.4.1 基因缺失疫苗 |
| 1.4.2 重组载体疫苗 |
| 1.4.3 亚单位疫苗 |
| 1.4.4 核酸疫苗 |
| 1.5 生物信息学研究 |
| 1.6 本研究的目的意义 |
| 1.7 技术路线 |
| 2 猪源PRV SD-2017 株的分离鉴定及其遗传变异分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 试验材料 |
| 2.1.2 试验仪器 |
| 2.1.3 试验方法 |
| 2.1.3.1 细胞培养 |
| 2.1.3.2 引物设计与合成 |
| 2.1.3.3 基因组DNA提取及目的基因扩增 |
| 2.1.3.4 病毒分离培养 |
| 2.1.3.5 病毒传代纯化 |
| 2.1.3.6 病毒形态观察 |
| 2.1.3.7 病毒滴度测定 |
| 2.1.3.8 动物感染试验(LD50 测定) |
| 2.1.3.9 主要毒力基因遗传变异分析 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 目的基因的扩增和克隆 |
| 2.2.2 病毒的分离培养及纯化 |
| 2.2.3 病毒的形态观察 |
| 2.2.4 PRV SD-2017 株病毒滴度的测定 |
| 2.2.5 PRV SD-2017 株家兔感染试验 |
| 2.2.6 PRV SD-2017 株遗传变异分析 |
| 2.2.6.1 gE基因的序列分析 |
| 2.2.6.2 gB基因的序列分析 |
| 2.2.6.3 gC基因的序列分析 |
| 2.2.6.4 gD基因的序列分析 |
| 2.2.6.5 TK基因的序列分析 |
| 2.2.6.6 gI基因的序列分析 |
| 2.2.6.7 gM基因的序列分析 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 3 PRV gB和 gE基因酶促重组等温扩增(ERA)检测方法的建立及应用 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 试验材料 |
| 3.1.2 试验仪器 |
| 3.1.3 试验方法 |
| 3.1.3.1 核酸提取 |
| 3.1.3.2 引物和探针设计 |
| 3.1.3.3 PRV gB和 gE基因标准质粒的构建及其鉴定 |
| 3.1.3.4 ERA反应体系的优化 |
| 3.1.3.5 特异性试验 |
| 3.1.3.6 敏感性试验 |
| 3.1.3.7 重复性试验 |
| 3.1.3.8 临床样本检测 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 PRV gB和 gE基因重组质粒的构建 |
| 3.2.2 ERA反应体系的建立 |
| 3.2.3 特异性试验 |
| 3.2.4 敏感性试验 |
| 3.2.5 重复性试验 |
| 3.2.6 临床样品的检测 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 4 PRV SD-2017 基因缺失株的构建及其生物学特性分析 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 试验材料 |
| 4.1.2 试验仪器 |
| 4.1.3 试验方法 |
| 4.1.3.1 引物和质粒 |
| 4.1.3.2 gE/gI和 TK转移载体的构建 |
| 4.1.3.3 PRV2017 基因缺失株的构建和纯化 |
| 4.1.3.4 PRV一步生长曲线和噬斑大小测定 |
| 4.1.3.5 动物接种试验(LD50 测定) |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 rPRV SD-2017ΔgE/gI-EGFP的构建与纯化 |
| 4.2.2 rPRV SD-2017ΔgE/gI-EGFP报告基因的敲除 |
| 4.2.3 rPRV SD-2017ΔgE/gI/TK-EGFP的构建和纯化 |
| 4.2.4 rPRV一步生长曲线和噬斑大小测定 |
| 4.2.5 动物接种试验(LD50 测定) |
| 4.2.6 病理组织学观察 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 5 基于PRV SD-2017 株三种基因工程新型疫苗的构建及其免疫原性研究 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 试验材料 |
| 5.1.2 试验仪器 |
| 5.1.3 试验方法 |
| 5.1.3.1 重组蛋白序列的优化与合成 |
| 5.1.3.2 重组杆状病毒穿梭质粒的构建与鉴定 |
| 5.1.3.3 重组杆状病毒的转染和蛋白表达纯化 |
| 5.1.3.4 家兔的疫苗接种和攻毒保护试验 |
| 5.1.3.5 血清PRV特异性抗体测定 |
| 5.1.3.6 血清PRV中和抗体测定 |
| 5.1.3.7 外周血淋巴细胞增殖测定 |
| 5.1.3.8 外周血细胞因子检测 |
| 5.1.3.9 剖检和病理病变观察 |
| 5.1.3.10 统计分析 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 重组杆状病毒穿梭质粒的构建与鉴定 |
| 5.2.2 重组蛋白PRV gB-DCpep和 PorB的表达和纯化 |
| 5.2.3 PRV疫苗体液免疫反应的测定 |
| 5.2.4 PRV疫苗细胞免疫反应的测定 |
| 5.2.5 PRV疫苗血清中和抗体滴度的测定 |
| 5.2.6 PRV疫苗的攻毒保护试验 |
| 5.3 讨论 |
| 5.3.1 PRV变异株基因缺失疫苗的构建 |
| 5.3.2 PRV变异株基因工程亚单位疫苗的构建 |
| 5.4 小结 |
| 6 PRV感染引起PK-15 细胞的转录组变化及差异表达基因分析 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 细胞及毒株 |
| 6.1.2 试剂与耗材 |
| 6.1.3 仪器设备 |
| 6.1.4 主要数据库、网站和软件 |
| 6.2 方法 |
| 6.2.1 PRV感染PK-15 细胞 |
| 6.2.2 细胞总RNA的提取 |
| 6.2.3 RNA样本测序 |
| 6.2.3.1 样本检测 |
| 6.2.3.2 文库构建与质检 |
| 6.2.3.3 上机测序 |
| 6.2.4 RNA-Seq数据处理及分析 |
| 6.2.4.1 数据输出与质控 |
| 6.2.4.2 序列比对到参考基因组 |
| 6.2.4.3 新转录本预测 |
| 6.2.4.4 基因表达水平定量 |
| 6.2.4.5 基因表达差异分析 |
| 6.2.4.6 差异基因的GO功能富集及KEGG信号通路分析 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 PRV毒株感染PK-15 细胞的时间与剂量效应 |
| 6.3.2 RNA-seq测序样本检测结果 |
| 6.3.3 RNA-seq测序数据评估及质控 |
| 6.3.4 PRV感染PK-15 细胞差异表达基因分析 |
| 6.3.4.1 差异基因统计 |
| 6.3.4.2 差异表达基因可视化分析 |
| 6.3.4.3 差异表达基因叠加关系分析 |
| 6.3.4.4 差异表达基因聚类分析 |
| 6.3.5 PRV毒株感染PK-15 细胞差异表达基因富集分析 |
| 6.3.5.1 GO功能富集分析 |
| 6.3.5.2 KEGG通路富集分析 |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 小结 |
| 7 伪狂犬病病毒感染引起PK-15 细胞的蛋白质组学变化分析 |
| 7.1 材料与方法 |
| 7.1.1 试剂与耗材 |
| 7.1.2 仪器设备 |
| 7.2 方法 |
| 7.2.1 PRV感染PK-15 细胞 |
| 7.2.2 蛋白质组学分析的细胞样品制备 |
| 7.2.3 细胞总蛋白的提取 |
| 7.2.4 蛋白质检 |
| 7.2.5 TMT标记 |
| 7.2.6 馏分分离 |
| 7.2.7 液质检测 |
| 7.2.8 生物信息学分析 |
| 7.2.9 蛋白质组与转录组的关联性分析 |
| 7.3 结果 |
| 7.3.1 提取蛋白质检结果 |
| 7.3.2 数据质控与蛋白鉴定结果 |
| 7.3.2.1 鉴定到的蛋白总体情况 |
| 7.3.2.2 肽段长度分布 |
| 7.3.2.3 母离子质量容差分布 |
| 7.3.2.4 Unique肽段数分布 |
| 7.3.2.5 蛋白覆盖度分布 |
| 7.3.2.6 蛋白分子量分布 |
| 7.3.2.7 蛋白重复性分析 |
| 7.3.3 蛋白差异分析结果 |
| 7.3.3.1 差异蛋白统计 |
| 7.3.3.2 差异蛋白可视化分析 |
| 7.3.4 差异蛋白GO功能注释分析 |
| 7.3.5 差异蛋白KEGG分析 |
| 7.3.6 差异蛋白亚细胞定位分析 |
| 7.3.7 转录组和蛋白组表达调控关联分析 |
| 7.3.8 转录组和蛋白质组表达量关联分析 |
| 7.3.9 转录组和蛋白质组GO功能富集关联分析 |
| 7.4 讨论 |
| 7.5 小结 |
| 8 结论 |
| 9 创新点 |
| 10 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
（6）猪伪狂犬病抗体磁微粒化学发光检测方法的建立及初步应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 伪狂犬病 |
| 1.1.1 伪狂犬病及其流行病学概述 |
| 1.1.2 PRV简述 |
| 1.1.3 PR诊断方法研究进展 |
| 1.2 化学发光免疫分析技术 |
| 1.2.1 化学发光免疫分析技术原理概述 |
| 1.2.2 化学发光免疫分析技术的分类及其应用 |
| 1.2.3 磁性微粒及其在化学发光免疫分析中的应用 |
| 1.3 本研究的目的及意义 |
| 第二章 PRV HLJ-2013 毒株的分离及鉴定 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 组织病料 |
| 2.1.2 细胞及实验动物 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 组织病料的处理 |
| 2.2.2 病毒的培养及PCR鉴定 |
| 2.2.3 电镜观察 |
| 2.2.4 病毒全基因组的提取及测序 |
| 2.2.5 病毒全基因组序列及编码蛋白基因序列分析 |
| 2.2.6 PRV HLJ-2013 毒株的IFA鉴定 |
| 2.2.7 PRV HLJ-2013 毒株一步生长曲线的测定 |
| 2.2.8 PRV HLJ-2013 毒株的致病性实验 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 病毒PCR鉴定及电镜观察 |
| 2.3.2 病毒全基因组序列及编码蛋白基因序列分析 |
| 2.3.3 PRV HLJ-2013 毒株的IFA鉴定及生长特性测定 |
| 2.3.4 PRV HLJ-2013 毒株的致病性实验 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 猪伪狂犬病抗体磁微粒化学发光检测方法的建立及初步应用 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 细胞、病毒及血清 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器及设备 |
| 3.1.4 主要溶液的配置 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 实验原理 |
| 3.2.2 PRV HLJ-2013 分离株病毒的培养与纯化 |
| 3.2.3 AP酶标记的兔抗猪IgG抗体的制备 |
| 3.2.4 猪伪狂犬病抗体磁微粒化学发光检测方法相关实验条件的确定 |
| 3.2.5 猪伪狂犬病抗体磁微粒化学发光检测方法的评估及初步应用 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 PRV HLJ-2013 毒株的纯化浓缩 |
| 3.3.2 猪伪狂犬病抗体磁微粒化学发光检测方法的建立 |
| 3.3.3 猪伪狂犬病抗体磁微粒化学发光检测方法的评估及初步应用 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（7）检测猪伪狂犬病毒gB抗体间接ELISA方法的初步建立及单克隆抗体的制备（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 文献综述 |
| 1. 伪狂犬病的研究进展 |
| 1.1 伪狂犬病的发现 |
| 1.2 伪狂犬病的流行病学研究 |
| 1.3 猪伪狂犬病的防控现状 |
| 2. 伪狂犬病毒概述 |
| 2.1 伪狂犬病毒特征 |
| 2.2 伪狂犬病毒基因组 |
| 2.3 伪狂犬病毒主要的囊膜糖蛋白和功能 |
| 3. 伪狂犬病毒的诊断方法 |
| 3.1 临床诊断 |
| 3.2 病原学诊断 |
| 3.3 血清学诊断方法 |
| 3.4 分子生物学诊断方法 |
| 3.5 电子显微镜观察 |
| 4 单克隆抗体技术的研究进展 |
| 4.1 单克隆抗体技术 |
| 4.2 单克隆抗体的进展 |
| 4.3 单克隆抗体的应用 |
| 5 研究目的及意义 |
| 第一章 伪狂犬病毒gB基因片段的原核表达 |
| 1. 材料 |
| 1.1 病毒、细胞及质粒 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要试剂配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 引物设计 |
| 2.2 PCR扩增 |
| 2.3 PCR产物胶回收 |
| 2.4 目的基因和pGEX-6P-1载体的双酶切 |
| 2.5 目的基因与表达载体的连接 |
| 2.6 转化 |
| 2.7 重组质粒pGEX-6P-1-gB提取及鉴定 |
| 2.8 重组蛋白的诱导表达 |
| 2.9 SDS-PAGE分析蛋白表达 |
| 2.10 Western验证重组蛋白PRV-gB表达 |
| 2.11 PRV gB重组蛋白纯化 |
| 3 结果 |
| 3.1 PRV gB基因片段扩增结果 |
| 3.2 目的基因与pGEX-6P-1载体双酶切鉴定结果 |
| 3.3 重组质粒pGEX-6P-1-gB的双酶切鉴定 |
| 3.4 SDS-PAGE验证重组蛋白表达 |
| 3.5 Western-blot验证重组蛋白表达 |
| 3.6 SDS-PAGE分析重组蛋白纯化效果 |
| 4. 讨论 |
| 第二章 PRVgB蛋白间接ELISA抗体检测方法的初步建立 |
| 1 材料 |
| 1.1 包被抗原和血清 |
| 1.2 主要溶液和试剂 |
| 2 主要仪器 |
| 3. 方法 |
| 3.1 最佳包被浓度和最佳待检血清稀释度 |
| 3.2 最佳封闭液的选择和封闭时间的确定 |
| 3.3 最佳一抗作用时间的摸索 |
| 3.4 最佳二抗作用时间的摸索 |
| 3.5 最佳显色时间的摸索 |
| 3.6 确定阴阳性判定标准 |
| 3.7 特异性实验 |
| 3.8 重复性实验 |
| 3.9 与上海酶联公司gB ELISA试剂盒和IFA比较 |
| 4 结果 |
| 4.1 最佳包被浓度和最佳血清稀释度 |
| 4.2 最佳封闭液的选择和封闭时间的确定 |
| 4.3 最佳一抗作用时间的确定 |
| 4.4 最佳二抗作用时间的确定 |
| 4.5 最佳显色时间的确定 |
| 4.6 阴阳性临界值的确定 |
| 4.7 特异性实验结果 |
| 4.8 重复性实验结果 |
| 4.9 与上海酶联公司gB ELISA试剂盒和IFA比较结果 |
| 5 讨论 |
| 第三章 伪狂犬病毒gB蛋白单克隆抗体的制备 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 生物材料 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 主要试剂及配制 |
| 2 单克隆抗体的制备 |
| 2.1 动物免疫 |
| 2.2 SP2/0细胞的制备 |
| 2.3 饲养细胞的制备 |
| 2.4 SP2/0与脾细胞融合 |
| 2.5 间接免疫荧光法(IFA)筛选 |
| 2.6 阳性杂交瘤细胞的亚克隆 |
| 2.7 腹水制备 |
| 2.8 单克隆抗体的生物学特性鉴定 |
| 3 结果 |
| 3.1 阳性杂交瘤细胞株的建立 |
| 3.2 单抗亚类鉴定结果 |
| 3.3 Western-blot验证单抗特异性 |
| 3.4 单抗腹水的ELISA效价 |
| 3.5 单抗腹水的荧光效价 |
| 4. 讨论 |
| 全文小结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（8）表达猪圆环病毒3型衣壳蛋白的重组伪狂犬病毒构建及伪狂犬病毒gC、gG蛋白单克隆抗体制备（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词 |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 猪圆环病毒3型研究概述 |
| 1 猪圆环病毒3型的生物学研究进展 |
| 1.1 PCV的起源与发现 |
| 1.2 PCV3的生物学特性 |
| 1.3 PCV3编码蛋白 |
| 1.3.1 结构蛋白 |
| 1.3.2 复制酶相关蛋白 |
| 2 猪圆环病毒3型的病原学及感染情况 |
| 2.1 PCV3的基因型分类及致病性 |
| 2.2 PCV3的感染情况 |
| 第二章 伪狂犬病病毒研究概述 |
| 1 伪狂犬病毒的生物学研究进展 |
| 1.1 PRV的起源与发现 |
| 1.2 PRV的生物学特性 |
| 1.2.1 基因组 |
| 1.2.2 衣壳蛋白 |
| 1.2.3 被膜蛋白 |
| 1.2.4 囊膜蛋白 |
| 2 PRV的流行病学 |
| 3 伪狂犬病毒的检测方法 |
| 3.1 核酸检测方法 |
| 3.1.1 环介导等温扩增法 |
| 3.1.2 纳米PCR法 |
| 3.1.3 实时荧光定量PCR法 |
| 3.2.4 多重PCR法 |
| 3.2 免疫学相关检测方法 |
| 3.2.1 酶联免疫吸附实验 |
| 3.2.2 免疫层析技术 |
| 4 伪狂犬病毒疫苗研究进展 |
| 4.1 灭活疫苗 |
| 4.2 弱毒活疫苗 |
| 4.3 基因工程疫苗 |
| 4.3.1 单基因缺失疫苗 |
| 4.3.2 双基因缺失疫苗 |
| 4.3.3 三基因缺失疫苗 |
| 4.4 重组病毒疫苗 |
| 第二部分 研究内容 |
| 第一章 表达PCV3 Cap的重组PRV转移载体的构建 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要仪器和器材 |
| 1.2 分子生物学试剂 |
| 1.3 毒株、菌株、细胞株以及载体 |
| 2 方法 |
| 2.1 PRV HD/c基因组抽提 |
| 2.2 感受态细胞的制备 |
| 2.3 重组载体设计与引物合成 |
| 2.4 PRV gC转移载体的构建 |
| 2.4.1 gC同源臂的扩增 |
| 2.4.2 EGFP荧光表达盒的设计 |
| 2.4.3 含有PCV3 Cap表达盒的设计 |
| 2.4.4 gC重组载体的分子构建及验证 |
| 2.5 PRV gG转移载体的构建 |
| 2.5.1 gG同源臂的扩增 |
| 2.5.2 GFP荧光表达盒的设计 |
| 2.5.3 含有PCV3 Cap表达盒的设计 |
| 2.5.4 gG重组载体的分子构建及验证 |
| 2.6 PCV3 Cap蛋白表达验证 |
| 3 结果 |
| 3.1 PRV gC转移载体的构建 |
| 3.1.1 gC同源臂扩增结果 |
| 3.1.2 EGFP表达盒扩增结果 |
| 3.1.3 PCV3 Cap表达序列扩增结果 |
| 3.2 PRV gG转移载体的构建 |
| 3.2.1 gG同源臂扩增结果 |
| 3.2.2 EGFP表达盒扩增结果 |
| 3.2.3 gG同源左臂和Cap融合序列获取 |
| 3.3 PRV重组表达载体鉴定 |
| 3.4 PCV3 Cap蛋白表达验证 |
| 4 讨论 |
| 第二章 猪伪狂犬病毒gC蛋白单克隆抗体的制备及鉴定 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要仪器和器材 |
| 1.2 分子生物学试剂 |
| 1.3 其他生物学相关试剂 |
| 1.4 毒株、菌株以及载体 |
| 1.5 实验动物和细胞 |
| 2 方法 |
| 2.1 PRV gC基因原核表达载体的构建 |
| 2.1.1 PRV gC基因分析 |
| 2.1.2 引物设计与合成 |
| 2.1.3 目的基因的获取 |
| 2.1.4 酶切、连接 |
| 2.1.5 菌液PCR鉴定 |
| 2.2 His-gC蛋白的表达与纯化 |
| 2.2.1 重组PRV gC蛋白的诱导表达 |
| 2.2.2 His-gC蛋白的可溶性分析 |
| 2.2.3 His-gC蛋白的纯化及验证 |
| 2.3 PRV gC多克隆抗体制备及鉴定 |
| 2.3.1 新西兰白兔的免疫 |
| 2.3.2 兔的多抗血清采取及反应性鉴定 |
| 2.4 PRV gC单克隆抗体的制备 |
| 2.4.1 BA LB/C小鼠免疫 |
| 2.4.2 杂交瘤细胞株的建立 |
| 2.4.3 杂交瘤细胞的选择性培养 |
| 2.5 阳性细胞株的筛选 |
| 2.5.1 ELISA法检测 |
| 2.5.2 IFA检测 |
| 2.5.3 阳性杂交瘤细胞株的亚克隆 |
| 2.6 单抗腹水的制备 |
| 2.7 单克隆抗体特性鉴定 |
| 2.7.1 ELISA检测腹水效价和抗体亚型 |
| 2.7.2 WB检测单抗的反应性 |
| 2.7.3 IFA检测单抗的反应性 |
| 2.7.4 PRV gC单克隆抗体可变区基因分析 |
| 2.8 单克隆抗体抗原表位的初步鉴定 |
| 2.8.1 PRV gC截短体构建 |
| 2.8.2 PRV gC单抗与截短载体转染样品的反应 |
| 2.9 PRV Ⅰ型和Ⅱ型病毒的通用性检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 PRV gC基因原核表达载体的构建 |
| 3.1.1 PRV gC氨基酸序列分析 |
| 3.1.2 PRV gC基因的克隆 |
| 3.2 His-gC重组蛋白表达及鉴定 |
| 3.2.1 His-gC蛋白诱导表达及可溶性分析 |
| 3.2.2 His-gC蛋白纯化及阳性血清验证 |
| 3.3 His-gC小鼠多抗血清反应性鉴定 |
| 3.3.1 ELISA鉴定 |
| 3.3.2 WB鉴定 |
| 3.3.3 IFA鉴定 |
| 3.4 His-gC兔子多抗血清反应性鉴定 |
| 3.4.1 ELISA鉴定 |
| 3.4.2 WB鉴定 |
| 3.4.3 IFA鉴定 |
| 3.5 PRV gC单克隆抗体制备 |
| 3.5.1 单克隆抗体杂交瘤细胞筛选 |
| 3.5.2 单克隆抗体腹水制备 |
| 3.6 PRV gC单克隆抗体特性鉴定 |
| 3.6.1 间接ELISA鉴定 |
| 3.6.2 WB鉴定 |
| 3.6.3 IFA鉴定 |
| 3.7 PRV gC抗体基因可变区克隆与分析 |
| 3.7.1 抗体可变区基因的扩增 |
| 3.7.2 抗体可变区比对分析, |
| 3.8 PRV gC单抗表位的初步鉴定分析 |
| 3.8.1 PRV gC蛋白抗原性分析 |
| 3.8.2 PRV gC基因截短体的构建 |
| 3.8.3 WB鉴定分析 |
| 3.8.4 IFA鉴定分析 |
| 3.9 PRV Ⅰ型和Ⅱ型病毒的通用性检测 |
| 4 讨论 |
| 第三章 猪伪狂犬病毒gG蛋白单克隆抗体的制备以及鉴定 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 2.1 PRV gG基因原核表达载体的构建 |
| 2.1.1 PRV gG基因分析 |
| 2.1.2 引物设计与合成 |
| 2.1.3 PRV基因组DNA抽提 |
| 2.1.4 目的基因的获取 |
| 2.1.5 双酶切、连接和转化 |
| 2.1.6 菌液PCR鉴定 |
| 2.2 His gG蛋白的表达与纯化 |
| 2.3 PRV gG多克隆抗体制备及鉴定 |
| 2.3.1 新西兰白兔的免疫 |
| 2.3.2 兔血清的采取及反应性鉴定 |
| 2.4 PRV gG单克隆抗体的制备 |
| 2.4.1 BA LB/C小鼠免疫 |
| 2.4.2 杂交瘤细胞株的建立 |
| 2.5 阳性细胞株的筛选 |
| 2.5.1. ELISA检测 |
| 2.5.2 IFA检测 |
| 2.5.3 阳性杂交瘤细胞株的亚克隆 |
| 2.6 单抗腹水的制备 |
| 2.7 单克隆抗体特性鉴定 |
| 2.7.1 ELISA检测腹水效价和抗体亚型 |
| 2.7.2 WB检测单抗的反应性 |
| 2.7.3 IFA检测单抗的反应性 |
| 2.7.4 PRV gG单克隆抗体可变区基因分析 |
| 2.8 单克隆抗体抗原表位的初步鉴定 |
| 2.8.1 PRV gG截短体构建 |
| 2.8.2 PRV gG单抗与截短体转染样品的反应 |
| 3 结果 |
| 3.1 PRV gG基因原核表达载体的构建 |
| 3.1.1 PRV gG基因蛋白序列分析 |
| 3.1.2 PRV gG基因的克隆 |
| 3.2 His-gG重组蛋白表达及鉴定 |
| 3.2.1 His-gG蛋白诱导表达及可溶性分析 |
| 3.2.2 His-gG蛋白纯化及阳性血清验证 |
| 3.3 His-gG小鼠多抗血清反应性鉴定 |
| 3.3.1 ELISA鉴定 |
| 3.3.2 WB鉴定 |
| 3.3.3 IFA鉴定 |
| 3.4 His-gG兔子多抗血清反应性鉴定 |
| 3.4.1 ELISA鉴定 |
| 3.4.2 WB鉴定 |
| 3.4.3 IFA鉴定 |
| 3.5 PRV gG单克隆抗体制备 |
| 3.5.1 单克隆抗体杂交瘤细胞筛选 |
| 3.5.2 单克隆抗体腹水制备 |
| 3.6 PRV gG单克隆抗体特性鉴定 |
| 3.6.1 间接ELISA鉴定 |
| 3.6.2 WB鉴定 |
| 3.6.3 IFA鉴定 |
| 3.7 PRV gG抗体基因可变区克隆与分析 |
| 3.7.1 抗体可变区基因的扩增 |
| 3.7.2 抗体可变区分析 |
| 3.8 PRV gG单抗表位的初步鉴定分析 |
| 3.8.1 PRV gG蛋白抗原性分析 |
| 3.8.2 PRV gG基因截短体的构建 |
| 3.8.3 WB鉴定分析 |
| 3.8.4 IFA鉴定分析 |
| 4 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 附录 常用缓冲液、试剂及培养基配方 |
（9）表达猪圆环病毒2衣壳蛋白的重组伪狂犬病毒构建（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 伪狂犬病毒的分子生物学特征 |
| 1.1 基因组 |
| 1.2 衣壳蛋白 |
| 1.3 被膜蛋白 |
| 1.4 囊膜蛋白 |
| 1.5 毒力相关基因 |
| 2 伪狂犬病毒的疫苗研究 |
| 2.1 灭活疫苗 |
| 2.2 弱毒活疫苗 |
| 2.3 基因缺失疫苗 |
| 2.4 重组伪狂犬病毒疫苗 |
| 2.4.1 PCV2/PRV重组病毒疫苗 |
| 2.4.2 PRRSV/PRV重组病毒疫苗 |
| 2.4.3 PPV/PRV重组病毒疫苗 |
| 2.4.4 CSFV/PRV重组病毒疫苗 |
| 2.4.5 FMDV/PRV重组病毒疫苗 |
| 2.4.6 SIV/PRV重组病毒疫苗 |
| 2.4.7 JEV/PRV重组病毒疫苗 |
| 2.4.8 RV/PRV重组病毒疫苗 |
| 3 伪狂犬病毒的单抗研究 |
| 3.1 抗伪狂犬病毒糖蛋白的单克隆抗体 |
| 3.1.1 抗gE糖蛋白的单克隆抗体 |
| 3.1.2 抗gB糖蛋白的单克隆抗体 |
| 3.1.3 抗gC糖蛋白的单克隆抗体 |
| 3.2 抗伪狂犬病毒其他蛋白的单克隆抗体 |
| 3.3 抗伪狂犬病毒全病毒的单克隆抗体 |
| 第二章 表达PCV2-Cap蛋白的重组伪狂犬病TK~-/gE~-/gI~-/Cap~+的构建 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞、毒株及质粒 |
| 1.2 试剂 |
| 2 方法 |
| 2.1 引物设计及合成 |
| 2.2 病毒基因组的提取 |
| 2.2.1 PRV-HD/c病毒基因组提取 |
| 2.2.2 PCV2-HZ0201病毒基因组提取 |
| 2.3 同源重组载体构建 |
| 2.3.1 同源臂的扩增与连接 |
| 2.3.2 EGFP表达盒的扩增与连接 |
| 2.3.3 cap基因的扩增与融合 |
| 2.4 CRISPR/Cas9基因编辑载体构建 |
| 2.5 重组伪狂犬病毒的拯救 |
| 2.6 重组伪狂犬病毒TK~-/gE~-/gI~-/Cap~+/EGFP~+株的蚀斑纯化 |
| 2.7 EGFP表达盒的删除 |
| 2.8 重组伪狂犬病毒TK~-/gE~-/gI~-/Cap~+的蚀斑纯化 |
| 2.9 PRV-TK~-/gE~-/gI~-/Cap~+毒株基因组中插入cap基因的鉴定 |
| 2.10 重组伪狂犬病毒遗传稳定性的鉴定 |
| 2.11 重组伪狂犬病毒复制能力的鉴定 |
| 2.11.1 一步生长曲线的测定 |
| 2.11.2 蚀斑的鉴定 |
| 2.12 间接免疫荧光试验鉴定Cap蛋白的表达 |
| 2.13 Western Blot鉴定Cap蛋白的表达 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 同源重组质粒的构建 |
| 3.2 同源重组转移载体pUC18-L-Cap-EGFP-R的鉴定 |
| 3.3 重组伪狂犬病毒的拯救 |
| 3.4 重组伪狂犬病毒的蚀斑纯化 |
| 3.5 EGFP表达盒的删除鉴定 |
| 3.6 HD/c基因组中插入cap基因的鉴定 |
| 3.7 重组伪狂犬病毒遗传稳定性鉴定 |
| 3.8 重组伪狂犬病毒复制能力的鉴定 |
| 3.8.1 一步生长曲线的测定 |
| 3.8.2 蚀斑的测定 |
| 3.9 间接免疫荧光试验及Western Blot鉴定Cap蛋白的表达 |
| 4 讨论 |
| 第三章 表达PCV2 Cap蛋白的重组伪狂犬病毒的同源重组载体构建 |
| 1 材料 |
| 1.1 病毒、载体及菌株 |
| 1.2 试剂 |
| 2 方法 |
| 2.1 引物设计及合成 |
| 2.2 病毒基因组的提取 |
| 2.3 同源重组载体构建 |
| 2.3.1 同源臂的扩增与连接 |
| 2.3.2 Cap表达盒的扩增与连接 |
| 2.4 辅助筛选载体构建 |
| 2.5 CRISPR/Cas9基因编辑载体构建 |
| 2.6 重组伪狂犬病毒的拯救及蚀斑纯化 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 同源重组质粒和辅助筛选质粒的构建 |
| 3.2 重组伪狂犬病毒的拯救 |
| 3.3 重组伪狂犬病毒的拯救 |
| 4 讨论 |
| 第四章 伪狂犬病毒gB蛋白单克隆抗体的制备 |
| 1 材料 |
| 1.1 病毒、菌株及质粒 |
| 1.2 细胞和实验动物 |
| 1.3 酶与试剂 |
| 2 方法 |
| 2.1 PCR扩增gB基因 |
| 2.2 原核表达载体的构建 |
| 2.2.1 PCR纯化产物的双酶切与纯化 |
| 2.2.2 空载的制备 |
| 2.2.3 目的片段的连接 |
| 2.2.4 pET-28a-gB的转化和鉴定 |
| 2.3 gB蛋白的诱导、纯化及鉴定 |
| 2.3.1 gB蛋白的表达 |
| 2.3.2 gB蛋白的纯化 |
| 2.4 纯化后蛋白SDS-PAGE鉴定 |
| 2.5 纯化后蛋白Western Blot分析 |
| 2.6 BALB/c小鼠的免疫 |
| 2.7 杂交瘤细胞株的建立 |
| 2.7.1 制备饲养细胞 |
| 2.7.2 细胞融合 |
| 2.8 阳性细胞株的筛选 |
| 2.8.1 采用间接酶联免疫吸附试验法检测筛选 |
| 2.8.2 Western Blot检测杂交瘤细胞分泌抗体的反应性 |
| 2.8.3 间接免疫荧光试验检测杂交瘤细胞分泌抗体的反应性 |
| 2.8.4 阳性杂交瘤细胞株的亚克隆 |
| 2.9 单抗腹水的制备 |
| 2.10 单克隆抗体ELISA反应性的鉴定 |
| 2.11 单克隆抗体Western Blot和间接免疫荧光实验反应性鉴定 |
| 2.11.1 gB蛋白真核表达载体的构建 |
| 2.11.2 Western Blot反应性测定 |
| 2.11.3 间接免疫荧光的反应性测定 |
| 2.12 gB蛋白抗体识别的抗原区域鉴定 |
| 2.13 单抗亚类的鉴定 |
| 3 结果 |
| 3.1 gB基因的扩增 |
| 3.2 重组质粒的鉴定 |
| 3.3 重组蛋白的表达与鉴定 |
| 3.4 三免后血清ELISA的检测结果 |
| 3.5 筛选获得单克隆细胞株 |
| 3.6 单克隆抗体腹水的制备 |
| 3.7 单克隆抗体反应性鉴定 |
| 3.7.1 Western Blot反应性的检测 |
| 3.7.2 间接免疫荧光试验反应性的检测 |
| 3.8 gB蛋白抗体识别的抗原表位区域鉴定 |
| 3.8.1 pEGFP-C3-gB-A/B/C截短基因的扩增 |
| 3.8.2 gB蛋白抗体识别的抗原表位区域鉴定 |
| 3.9 单克隆抗体亚类鉴定 |
| 4 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 附录 常用试剂与配方 |
| 作者简历 |
四、间接ELISA检测羊伪狂犬病抗体的研究（论文参考文献）
- [1]规模化母猪场五种疫病血清学监测及部分病原鉴定、免疫程序调整[D]. 宋健颖. 塔里木大学, 2021(08)
- [2]伪狂犬病病毒gB蛋白单克隆抗体的制备及竞争ELISA方法的建立[D]. 傅欣玲. 中国农业科学院, 2021(09)
- [3]猪伪狂犬病病毒gB抗体阻断ELISA检测方法的建立及初步应用[D]. 赵静. 中国农业科学院, 2021(09)
- [4]PRV新型检测方法的建立及亚单位疫苗的免疫原性研究[D]. 王春芳. 河北科技师范学院, 2021(08)
- [5]伪狂犬病病毒的基因工程疫苗构建及其感染PK-15细胞的转录组和蛋白质组学分析[D]. 张洪亮. 内蒙古农业大学, 2021
- [6]猪伪狂犬病抗体磁微粒化学发光检测方法的建立及初步应用[D]. 朱冰. 中国农业科学院, 2020(01)
- [7]检测猪伪狂犬病毒gB抗体间接ELISA方法的初步建立及单克隆抗体的制备[D]. 尹成伟. 扬州大学, 2020
- [8]表达猪圆环病毒3型衣壳蛋白的重组伪狂犬病毒构建及伪狂犬病毒gC、gG蛋白单克隆抗体制备[D]. 黄文祥. 浙江大学, 2020(01)
- [9]表达猪圆环病毒2衣壳蛋白的重组伪狂犬病毒构建[D]. 唐雯. 浙江大学, 2020(01)
- [10]猪伪狂犬病病毒IgA抗体间接ELISA检测方法的建立[J]. 黄雨晴,华涛,唐波,常晨,刘国阳,张雪花,卢宇,侯继波,张道华,许家荣. 中国兽医科学, 2019(11)