一、甲泼尼龙对大鼠视网膜激光损伤中Müller细胞胶质纤维酸性蛋白和增生细胞核抗原表达的影响（论文文献综述）
吴子健[1]（2021）在《通腑逐瘀法指导下抵当汤加减调控AQP4表达治疗大鼠急性脊髓损伤的作用机制研究》文中研究说明目的 本次研究结合急性脊髓损伤（acute spinal cord injury,ASCI）的研究现状和热点,基于导师的临床经验,以通过抑制水通道蛋白4（aquaporin 4,AQP4）的表达从而减轻ASCI后脊髓水肿为切入点,旨在探讨通腑逐瘀法治则指导下抵当汤加减治疗ASCI的可能作用机制,以期为推广通腑逐瘀法治疗ASCI提供理论依据。方法 第一部分:10周龄SD大鼠30只,按随机数字表法随机分为假手术组（A组）、自制打击器2cm组（B1组）、自制打击器4cm组（B2组）、NYU组1.25cm组（C1组）、NYU组2.5cm组（C2组）,每组各6只。除Sham组外,其余各组采用改良Allen’s法造模。B1、B2组将9g打击杆分别从2cm、4cm处自由坠落撞击T10脊髓,C1、C2组使用NYU打击器分别从1.25cm、2.5cm处撞击T10脊髓。各组造模完成后分别于1、3、5、7d进行BBB评分和Reuter评分,7d后行灌注取材,石蜡包埋切片,尼氏染色,观察各组组织受损程度和神经元存活率。第二部分:10周龄SD大鼠60只按随机分配方法随机分为假手术组（Sham）、模型组（Model）、抵当汤组（DDD）、TGN-020组（TGN-020）和抵当汤联合TGN-020组（DDD+TGN-020）,每组各12只。Sham组仅打开椎板暴露脊髓但不损伤脊髓;其余各组均采用自制脊髓打击器从40mm高度对脊髓进行打击。Sham组和Model组术后不予任何治疗措施干预,DDD组于术后3d予以抵当汤加减每日灌胃,持续3d,根据大鼠与人用药剂量体表面积换算法,DDD组大鼠每日用药剂量为5.04g/kg,采用蒸馏水进行稀释一定比例配制后予以灌胃处理,每日早晚各1次。TGN-020组处理方法:腹腔注射给药,每日用药剂量为5mg/kg,给药时间为3d。DDD+TGN-020组处理方法:予TGN-020腹腔注射给药,随后给予DDD灌胃处理。干预结束后进行行为学评价（BBB评分、斜板实验及Reuter评分）观察大鼠神经功能恢复情况,取材后进行脊髓组织大体观察和含水率检测、HE染色观察组织受损程度,尼氏染色观察神经元形态,免疫荧光检测各组脊髓组织AQP4、GFAP共表达的阳性细胞个数,Western Blot法检测各组脊髓组织中AQP4、GFAP、CSPG、PCNA、NGF、BDNF、GAP-43蛋白的表达量,q PCR法检测各组脊髓组织中CSPG、PCNA基因的表达量,电镜下观察各组髓鞘和神经元组织形态,高尔基染色观察树突和树突棘形态。第三部分:8周龄SD大鼠40只随机分为空白血清组和含药血清组,含药血清组给予5.04g/kg DDD灌胃,持续3d,空白血清组予等剂量超纯水灌胃,持续3d,干预结束后提取血清备用。每次取胚胎大鼠8-12只,通过机械-酶消化法提取星形胶质细胞（Astrocytes,AS）,细胞采用10%的高糖培养基培养,观察细胞传代至第3代进行后续实验。首先,免疫荧光鉴定细胞中GFAP含量,随后进行实验分组:空白组（Control group,CG）、模型组（Model group,MG）、空白血清组（Blank serum group,BSG）、DDD含药血清组（DDD）、TGN-020干预组（TGN-020）、DDD联合TGN-020组（DDD+TGN-020）,除MG外,其余各组均以划痕法进行造模,造模完成后DDD予以含药血清干预,BSG予以等剂量空白血清干预,TGN-020予以100nm TGN-020干预,DDD+TGN-020先予TGN-020干预后再予DDD干预。MTT法检测DDD含药血清干预AS的安全干预浓度、最佳干预时间和干预浓度,MTT法检测各组对RAS活性的影响,免疫荧光染色法检测RAS中AQP4和GFAP共表达的细胞数,Western Blot法检测各组RAS中AQP4、GFAP和NGF、BDNF、GAP-43蛋白的表达量,镜下观察DDD含药血清对RAS迁移率的影响。统计学方法:实验所得数据均使用SPSS21.0软件进行统计学处理,计量资料以均值±标准误（`X±S）表示,所得数据均经过正态性分布检测,若符合正态分布,则采用单因素方差分析,方差齐则采用LSD法,方差不齐则采用Games-Howell法;若不符合正态分布,则采用非参检验。以P<0.05提示差异具有统计学意义。结果 第一部分:自制脊髓打击器与NYU打击器建立脊髓损伤模型研究1.各组脊髓外观形态比较A组T10节段处硬脊膜完整,脊髓组织呈均匀乳白色,形态饱满圆润;B1、B2、C1、C2组T10节段处硬脊膜均完整,颜色呈不同程度的鲜红色或暗红色,损伤处可见水肿、瘀血及瘢痕组织增生,相对于B1、C1组,B2、C2组水肿更严重、瘀血范围更广、颜色更深、瘢痕组织更多。2.行为学评分比较BBB评分结果显示,A组术后除因手术致运动量减少外,未出现双下肢功能异常的表现,评分为21分;其余各组均出现不同程度的运动功能障碍,具体表现为:B2与B1、C2与C1相比,BBB评分显着降低,差异具统计学意义（P<0.05）;B1与C1、B2与C2相比,BBB评分无显着差异（P>0.05）。Reuter评分结果显示,A组术后未发现感觉功能异常现象;其余各组术后均出现不同程度的感觉功能异常现象,具体表现为B2、C2组术后1d牵张反射消失,肌力、肌张力减弱或消失,疼痛回缩反射迟钝,背部感觉存在或消失;B1、C1组术后1d除肌力消失外,牵张反射、肌张力、疼痛回缩反射、背部感觉均存在,术后3d肌力开始恢复。B2与B1、C2与C1相比,Reuter评分显着降低,差异具统计学意义（P<0.05）。B1与C1、B2与C2相比,Reuter评分无显着差异（P>0.05）。3.尼氏染色尼氏染色结果显示,A组脊髓组织结构完整,灰白质边界清晰,神经元细胞形态规则、胞核大、核仁清晰可见、数量多,胞质内可见斑块样尼氏体。相比A组,其余各组结构破坏更严重,灰白质结构不清,组织空白间隙更大,损伤处可见细胞呈空泡样改变或细胞皱缩、体积减小,神经元数量减少,尼氏体模糊或消失。4.脊髓受损面积比结果表明,A组未见受损区域,比值为0,其余各组均高于A组,差异具有统计意义（P<0.05）;相对于B1和C1,B2和C2损伤面积比值明显升高,差异具有统计意义（P<0.05）;B1与B2、C1与C2损伤面积比值差异不具有统计意义（P>0.05）。5.各组脊髓前、后角神经元损伤程度比较通过分析前、后角神经元阳性细胞数结果显示,A组神经元数目多,尼氏体含量多,其余各组均少于A组,差异具有统计意义（P<0.05）;相对于B1和C1,B2和C2神经元阳性细胞数明显减少,差异具有统计意义（P<0.05）;B1与B2、C1与C2神经元阳性细胞数差异不具有统计意义（P>0.05）。第二部分:抵当汤加减调节AQP4表达对SCI大鼠脊髓水肿的作用研究1.各组脊髓组织的大体观察从大体观察上来看,Sham组脊髓组织颜色鲜白,组织完整,未见瘀血部位和水肿;Model组在打击损伤部位可见明显的瘀血区域,瘀血颜色深红,瘀血范围较大,并可见明显脊髓水肿;DDD组在打击损伤部位可见较小的瘀血区域,瘀血部位颜色淡红,可见轻度水肿;DDD组、TGN-020组以及DDD+TGN-020组大体观察相似,肉眼见无显着差异。2.各组脊髓组织含水率与Sham组相比,其余各组脊髓组织含水率均显着增高（P<0.05）;与Model组相比,DDD组、TGN-020组以及DDD+TGN-020组脊髓组织含水率均显着降低（P<0.05）;DDD组、TGN-020组以及DDD+TGN-020组组间比较,脊髓组织含水率没有显着差异（P>0.05）。3.行为学观察结果各组大鼠BBB评分、斜板实验结果以及Reuter评分显示,与Sham组相比,其余各组BBB评分和斜板实验得分均显着降低（P<0.05）,Reuter评分均显着升高（P<0.05）;与Model组相比,DDD组、TGN-020组以及DDD+TGN-020组BBB评分均显着升高（P<0.05）,Reuter评分均显着降低（P<0.05）;DDD组、TGN-020组以及DDD+TGN-020组组间比较无显着差异（P>0.05）。4.HE染色Sham组组织结构完整,神经元等细胞形态结构良好,未见瘢痕组织或空洞形成,未见瘀血区域或炎性物质渗出。Model组损伤部位可见组织结构离乱,大量瘢痕组织和脊髓空洞的形成,可见明显的瘀血区域,并伴有大量的炎性细胞浸润,神经元等细胞皱缩,数量减少。其余三组可见组织形态结构较完整,可见少量脊髓空洞的形成,瘀血区域范围较小,炎性细胞清润较少,神经元等细胞形态结构较完整。使用Image J软件对各组空洞面积进行定量分析,结果显示,与Sham组相比,Model组脊髓空洞面积显着增加（P<0.05）;与Model组相比,DDD组、TGN-020组、DDD+TGN-020组脊髓空洞面积显着降低（P<0.05）;DDD组、TGN-020组和DDD+TGN-020组脊髓空洞面积组间比较不具有显着差异（P>0.05）。5.尼氏染色观察各组神经元形态Sham组脊髓形态结构完整,灰质呈蝴蝶状,灰白质界限清晰,可见较多的神经元分布,神经元胞质内可见染色清晰的斑块状尼氏体,神经元胞体饱满,细胞核大,核仁明显。Model组脊髓组织破坏严重,结构不完整,灰、白质界限不清,可见大量的炎性细胞浸润,神经元皱缩、液化、坏死,形成较多的空泡,尼氏体较小或消失。相对Model组,DDD组、TGN-020组以及DDD+TGN-020组脊髓结构较完整,隐约可见灰白质界限,神经元仍可见,数量较多,空泡样改变减少,尼氏体数量较多、较饱满。但相对于Sham组,神经元仍存在固缩,胞浆减少,核变小,尼氏体减少等病理改变。6.免疫荧光检测各组AQP4、GFAP的阳性细胞表达量AQP4阳性细胞表达呈绿色,GFAP阳性细胞表达呈红色,DAPI染色呈深蓝色,AQP4+/GFAP+细胞表达呈黄色树枝状,各组染色背景干净,表达清晰,细胞核数量无显着差异（P>0.05）,具有可比性。Sham组少见或未见明显的AQP4+/GFAP+细胞,Model组可见较多的AQP4+/GFAP+细胞,且细胞亮度高,胞体肿胀程度严重。与模型组相比,DDD组、TGN-020组以及DDD+TGN-020组细胞数量较少,亮度较低,细胞肿胀程度减轻。对各组的AQP4+/GFAP+细胞进行计数和统计,与Sham组相比,其余各组AQP4与GFAP的阳性细胞占比均显着增高（P<0.05）;与Model组相比,DDD组、TGN-020组和DDD+TGN-020组AQP4与GFAP的阳性细胞占比显着降低（P<0.05）;DDD组、TGN-020组和DDD+TGN-020组间相比较,AQP4与GFAP的阳性细胞占比无显着差异（P>0.05）。7.Western Blot法检测各组AQP4、GFAP、PCNA、CSPG、NGF、BDNF、GAP-43的蛋白表达量各组蛋白条带背景清晰,无杂带现象,蛋白表达量趋势明显,具有可比性。与Sham组相比,各组脊髓组织中AQP4、GFAP、PCNA、CSPG蛋白的灰度值显着增高（P<0.05）,NGF、BDNF、GAP-43蛋白的灰度值显着降低（P<0.05）;与Model组相比,DDD组、TGN-020组和DDD+TGN-020组脊髓组织中AQP4、GFAP、PCNA、CSPG蛋白的灰度值显着降低（P<0.05）,NGF、BDNF、GAP-43蛋白的灰度值显着增高（P<0.05）;DDD组、TGN-020组和DDD+TGN-020组组间比较结果显示,各组脊髓组织中AQP4、GFAP、PCNA、CSPG、NGF、BDNF、GAP-43蛋白的灰度值差异不具有统计学意义（P>0.05）。8.各组脊髓组织中PCNA和CSPG基因表达量各组基因检测的扩增曲线变化平稳,溶解曲线为平滑的单峰形态,说明引物设计好,模板未见污染,实验结果具有可比性。各组目的基因相对表达量结果显示,与Sham组相比,各组脊髓组织中PCNA、CSPG基因的表达量显着增高（P<0.05）;与Model组相比,DDD组、TGN-020组和DDD+TGN-020组脊髓组织中PCNA、CSPG基因的表达量显着降低（P<0.05）;DDD组、TGN-020组和DDD+TGN-020组组间比较结果显示,各组脊髓组织中PCNA、CSPG基因的表达量差异不具有统计学意义（P>0.05）。9.透射电子显微镜观察髓鞘和神经元组织形态Sham组脊髓组织在透射电镜下可见髓鞘外形规则,厚薄均一,形似同心圆状,结构完整,未见破裂、缺失等改变,板层结构均匀致密,胞内线粒体丰富,胞浆饱满,清晰可见。Model组髓鞘结构不规则,部分髓鞘断裂缺失,厚薄不一,局部可见褶皱卷曲,板层结构松散、融合,线粒体肿胀,甚至部分溶解消失;DDD组、TGN-020组、DDD+TGN-020组可见髓鞘结构较完整,形态部分不规则但较Model组改善,部分髓鞘可见卷曲、厚薄不一,板层结构较均匀,虽有部分缺失,但松散程度相对Model组较轻,仍可见清晰的线粒体,但数量较Sham组少,胞体较小。10.电镜观察树突和树突棘形态各组脊髓经高尔基染色后结果显示:Sham组脊髓树突结构完整、形态规则、长度较长,树突上密布树突棘,树突棘分布整齐、均匀致密、数量较多;Model组脊髓树突形态不规则,部分断裂缺失,长度较短,较为纤细,树突棘数量少,稀疏分布,排列紊乱;与Model组相比,DDD组、TGN-020组、DDD+TGN-020组脊髓树突形态有所改善、树突较长、结构较完整、周经较粗,树突棘数量较多,排列更为规则、整齐。对各组脊髓树突长度及树突棘进行定量分析,结果显示,与Sham组相比,Model组树突长度明显降低（P<0.05）,树突棘数量明显减少（P<0.05）;与Model组相比,DDD组、TGN-020组、DDD+TGN-020组树突长度明显增加（P<0.05）,树突棘数量显着增多（P<0.05）;DDD组、TGN-020组、DDD+TGN-020组组间相比,差异不具有统计学意义（P>0.05）。第三部分:抵当汤加减含药血清对反应性星形胶质细胞的活化、迁移及神经生长相关细胞因子分泌的作用1.原代AS镜下观察原代细胞培养2d,镜下可见AS细胞呈不规则形状散在分布,部分细胞形似星形,细胞核大、呈椭圆形,细胞胞浆丰富,从胞体向四周发出长而有分支的突起;将原代细胞传代至第三代可见细胞生长状态良好,适宜进行后续实验。2.AS鉴定免疫荧光染色结果显示,GFAP染色呈阳性,阴性对照组未见任何阳性染色,提示GFAP呈特异性表达,所提取的细胞为AS。3.DDD含药血清对AS的安全干预浓度,以及干预RAS的最佳干预时间和最佳干预浓度DDD含药血清干预AS的安全浓度范围为:0-15%,DDD含药血清干预RAS最佳的干预浓度为10%,最佳干预时间为48h。4.DDD含药血清对RAS活性的影响MTT结果显示,与CG组相比,其余各组RAS活性均降低（P<0.05）;与MG相比,BSG组RAS活性无显着差异（P>0.05）,DDD、TGN-020和DDD+TGN-020组RAS活性均显着下降（P<0.05）;DDD、TGN-020和DDD+TGN-020组间比较无显着差异（P>0.05）。5.DDD含药血清对RAS迁移率的影响损伤24h后,各组RAS与对侧细胞完全分离,中间形成一条空白的划痕区域,划痕区未见或少见RAS;48h后部分细胞开始向对侧延伸突触,划痕区域出现部分肥大的RAS,细胞胞浆丰富,胞体呈球形,发亮,细胞加速分裂;72h后划痕区域缩小,部分RAS与对侧RAS突触交织,划痕开始愈合。在整个愈合过程中,24h各组划痕区域面积比无显着差异（P>0.05）;自48h开始,与MG组相比,BSG划痕区域面积比无显着差异,其余各组均明显较大（P<0.05）。DDD组、TGN-020组和DDD+TGN-020组组间比较无显着差异（P>0.05）。72h后,MG组与BSG组划痕区域面积比无显着差异（P>0.05）。与MG组相比,DDD组、TGN-020组和DDD+TGN-020组划痕区域面积比明显较大（P<0.05）,组间比较无显着差异（P>0.05）。以上划痕区域面积比的改变反映了RAS在损伤发生后向受损区域的迁移速率。6.各组对RAS中AQP4、GFAP荧光表达量的影响使用免疫荧光染色法对RAS中AQP4、GFAP和细胞核进行了标记。染色结果显示,AQP4+细胞呈绿色,GFAP+细胞呈红色,细胞核呈蓝色,荧光双标的细胞呈黄色的不规则树枝状。其中,CG组仅见12个零星分布的AQP4+/GFAP+细胞;MG组和BSG可见较多的AQP4+/GFAP+细胞,亮度较高,细胞肿胀程度严重;DDD组、TGN-020组、DDD+TGN-020组可见较少的AQP4+/GFAP+细胞,亮度较低,细胞肿胀程度较轻。对AQP4+/GFAP+细胞进行计数统计,结果表明,与CG相比,其他各组阳性细胞占比显着增多（P<0.05）;与MG相比,除BSG组无显着差异外（P>0.05）,DDD组、TGN-020组和DDD+TGN-020组阳性细胞占比显着减少（P<0.05）;DDD组、TGN-020组和DDD+TGN-020组阳性细胞占比组间相比无显着差异（P>0.05）。7.各组对RAS中AQP4、GFAP和NGF、BDNF、GAP-43蛋白表达量的影响结果显示,与CG组相比,其余各组AQP4和GFAP蛋白表达量均显着增高（P<0.05）,NGF、BDNF、GAP-43蛋白表达量均显着降低（P<0.05）;与MG组相比,除BSG组无明显差异外（P>0.05）,DDD组、TGN-020组和DDD+TGN-020组AQP4和GFAP蛋白表达量均显着降低（P<0.05）,NGF、BDNF、GAP-43蛋白表达量均显着增高（P<0.05）,3组组间比较无显着差异（P>0.05）。结论 1.自制简易脊髓打击器从20mm、40mm高处垂直撞击脊髓组织具有和NYU打击器从12.5mm、25mm处打击脊髓损伤程度相似的脊髓损伤动物模型,自制简易脊髓打击器安全性高,稳定性好,操作简便,价格低廉,可供科研工作者参考。2.通腑逐瘀法治则指导下抵当汤加减可有效消除SCI大鼠损伤处水肿,促进神经功能康复。其具体的作用机制为:通过抑制AQP4的表达可抑制反应性星形胶质细胞活化,减少胶质瘢痕形成,提高神经营养因子、神经生长因子及细胞膜生长相关蛋白的表达,促进神经功能康复。3.DDD含药血清能通过抑制AQP4的表达,有效减轻RAS水肿,减少RAS活化和减缓RAS迁移,促进RAS中神经营养因子的分泌。
陈临池[2]（2021）在《甲泼尼龙对视神经夹伤模型小鼠视网膜神经节细胞的保护作用》文中进行了进一步梳理视神经作为中枢神经系统的一部分,由视网膜神经节细胞的轴突和神经胶质细胞组成,在视神经受损后,如何维持视网膜神经节细胞的存活仍然是临床上面临的难题。甲泼尼龙作为一种人工合成的皮质类固醇,甲泼尼龙冲击疗法由于其治疗急性脊髓损伤的良好临床结果而被应用于治疗急性外伤性视神经病变。目前有些研究表明高剂量的皮质类固醇在此情况下有效,但对于仅使用低剂量的治疗效果以及其对于视网膜神经胶质细胞的影响却少有研究。本实验选用昆明系小鼠和GFP小鼠作为实验对象,左眼行视神经夹伤手术以建立视神经夹伤模型,通过Neu-N免疫组化染色比较了尾静脉注射和灌胃两种给药方式,确定了最佳给药方式及给药浓度;利用甲苯胺蓝染色法观察视神经损伤后神经退行性病变。采用H-E染色和GFAP免疫荧光染色,分别观察视网膜结构变化和星形胶质细胞表达量变化;并以GFP小鼠作为实验材料观察小胶质细胞数量的变化。通过检测T-SOD活力以及MDA含量研究视网膜的氧化应激反应,并利用qRT-PCR分析星形胶质细胞相关因子表达量变化。以体外培养的视网膜星形胶质细胞作为实验材料,剥夺葡萄糖条件培养建立损伤模型,使用不同浓度的甲泼尼龙进行处理,通过MTT测定细胞活力及GFAP免疫荧光进行形态学观察。以此探讨甲泼尼龙对于视神经损伤后视网膜神经节细胞保护作用中可能的机制。实验结果显示:（1）相比于连续采用高剂量的甲泼尼龙,低剂量的甲泼尼龙治疗组RGC存活量在视神经夹伤后有明显增加;视网膜内核层及外核层厚度在视神经夹伤后减少,而经过甲泼尼龙治疗后保持稳定;（2）视神经纤维束在夹伤后出现排列紊乱的变化,但在甲泼尼龙的治疗下排布有恢复的趋势;（3）视神经夹伤后星形胶质细胞以及小胶质细胞大量激活,经过甲泼尼龙治疗后激活趋势得到抑制;（4）甲泼尼龙的治疗可以在减少星形胶质细胞总量的前提下,反而使A2型星形胶质细胞的数量增加;（5）甲泼尼龙不利于激活状态的星形胶质细胞的存活,而低浓度的甲泼尼龙能够抑制星形胶质细胞的激活从而使星形胶质细胞能够在甲泼尼龙的处理下保持较高的细胞活力。本实验表明,低剂量的甲泼尼龙对小鼠视神经夹伤模型的视网膜神经节细胞有保护作用。视神经夹伤后,尾静脉注射5.4 mg/kg的甲泼尼龙可以通过减轻视网膜中的氧化应激水平和炎症反应,从而抑制星形胶质细胞和小胶质细胞激活;同时还会促进星形胶质细胞向具有神经保护作用的A2激活表型分化来延缓小鼠RGC的凋亡同时维持视网膜结构稳定。
韩梦雨[3]（2021）在《中西医协同治疗视神经脊髓炎相关性视神经炎的应用研究》文中研究表明(一)视神经脊髓炎相关性视神经炎患者临床特点及疗效分析目的:分析视神经脊髓炎相关性视神经炎（NMO-ON）患者的临床特点及针药联合改善NMO所致视神经萎缩的疗效。方法:对2016年1月至2019年12月就诊于中日友好医院的72例以ON为首发临床表现的NMO患者进行回顾性分析总结,包括一般资料、发病特点、病程进展、合并疾病、免疫学检验、治疗反应及预后等。结果:1.一般资料:72例NMO-ON患者,发病年龄中位数33岁;女性61例（84.72%）,男女比约为1:5.54;病程中位数67月,病程以“复发-缓解”为主,单相与复发比约1:5.8。2.临床特点:66例（91.67%）单独ON起病,ON累及单眼者59例（81.94%）;主要症状为急性或亚急性视力下降,可伴转动痛、视野缺损及色觉异常等;14例（19.44%）伴诱因,最常见为上呼吸道感染;11例（15.28%）伴系统性免疫性病,最常伴发干燥综合征及甲状腺疾病;59眼（75.64%）首发视力小于0.1,AQP4-IgG状态（P=0.032,OR=2.55）和发病年龄（P=0.037,OR=3.93）是影响患者首发视力的独立危险因素;整个病程中,44例（61.11%）双眼先后累及,ON发病次数中位数为2次,ON二次发作时间中位数是3月;1年、3年复发率分别约0.56（40/72）和0.74（53/72）;至末次随访时间,单侧致盲率约48.61%,致患者单侧致盲ON发作中位数为2次;53例（73.61%）出现其他神经系统的累及,脊髓（61.1 1%）是最常见的复发部位。3.实验室结果:80%（48/60）患者血清AQP4-IgG抗体阳性;25%（3/12）患者MOG-IgG阳性;18例（25%）伴其他系统性免疫性抗体,最常见伴ANA抗体阳性;4.影像学特点:NMO-ON多累及后视路,病变长度>1/2视神经;45例（84.91%）脊髓MRI病变≥3个锥体;47.17%（25/53）患者同时或相继发生颈髓和胸髓病变。5.针药联合改善NMO所致视神经萎缩:24眼治疗4周有8只眼视力提高≥2行,总有效率91.67%;动态视野平均缺损度（MD）及平均敏感度（MS）较前改善,但与治疗前相比,差异均无统计学意义（P>0.05）;治疗8周有12眼视力提高≥2行,总有效率100%;视野MD显着下降（P<0.05）,MS明显提高（P<0.05）。结论:1.NMO-ON患者首次发病多ON单独起病,单侧累及,女性中青年高发,AQP4-IgG阴性患者更趋年轻化,急性期对患者视功能威胁巨大,恢复期多遗留较差的视力预后;最常见诱因为上呼吸道感染,漫长的病程多见双侧视神经受累及多次复发,脊髓是除视神经外最常见的复发部位;AQP4-IgG状态和发病年龄是影响NMO患者首次发病视功能的独立危险因素;2.大多数（80%）NMO-ON患者AQP4-IgG血清阳性,部分患者伴发以干燥综合征和甲状腺疾病为代表的系统性免疫性疾病,最常见伴有的血清学免疫性抗体是抗ANA抗体;3.NMO-ON患者视神经多累及后视路,病变长度>1/2视神经,脊髓损伤多为连续长节段,约一半患者同时或相继发生颈髓和胸髓病变;4.针药联合可显着提高NMO所致视神经萎缩患者的视功能,明显提高患者视力和动态视野MS,降低患者MD。（二）视神经脊髓炎相关视神经炎（NMO-ON）大鼠模型的构建与评价目的:通过将患者AQP4-IgG强阳性血清显微注射至大鼠视神经周围蛛网膜下腔,诱导视神经NMO样病变,从活体与病理、视神经及脊髓、大脑等多维度评价该模型,为探究药物防治NMO-ON提供模型基础。方法:SD雄性大鼠30只根据血清样本类型随机分为模型组、假手术组,上结膜入路暴露视神经后选择球后2mm处分别将AQP4-IgG强阳性血清和健康人血清缓慢注射到蛛网膜下腔。术后第3天免疫荧光法检测视神经AQP4-IgG表达;术前1天（第0天）、术后第7、14天分别行闪光视觉诱发电位（F-VEP）及瞳孔对光反射（PLR）检测;术后第14天分别处死两组大鼠行视网膜、视神经、大脑及脊髓等组织制片和病理学观察。结果:术后第3天模型组视神经AQP4-IgG强表达,假手术组未见表达（P<0.001）;与假手术组相比,AQP4和胶质纤维酸性蛋白（GFAP）在AQP4-IgG沉积区域表达也显着降低（P<0.001）;模型组N1-P1波振幅和PLR第7天、14天均明显降低,与假手术组相比差异均有统计学意义（P<0.001）;组织病理学观察:与假手术组相比,模型组视神经HE染色肿胀水肿、着色明显加深,轴突数量显着减少伴有不规则空洞化,其间见大量炎症细胞浸润等;RGCs水肿显着,数量明显减少,且大小不一,核仁不清晰;视神经LFB髓鞘染色,模型组可见到蓝色区域显着减少;模型组大鼠视神经电镜则可见到轴突数量明显减少且排列紊乱、横断面形态不规则,微管微丝大量溶解,髓鞘严重分层、结构不完整,且大多数髓鞘松解或者脱失、塌陷,甚至无髓鞘;免疫荧光染色发现,与假手术组相比,模型组神经丝蛋白L（NFL）表达量明显下降（P<0.001）及CD68表达显着升高（P<0.001）;脊髓组织HE发现,假手术组和模型组均未见到脊髓白质炎症浸润、轴突及髓鞘损伤等病理变化;脊髓组织LFB染色可见假手术组和模型组髓鞘染色成蓝色且均匀一致,未见到染色区域减少及白色未着色区等。大脑组织HE和LFB染色也未发现炎症浸润及脱髓鞘等病理损伤;结论:1.我们通过在大鼠视神经蛛网膜下腔显微注射人类AQP4-IgG阳性血清成功构建了NMO-ON大鼠模型,该模型显示NMO-ON的特征性病理变化,包括星形胶质细胞破坏、炎症浸润、轴突损伤及脱髓鞘等;2.大鼠视神经蛛网膜下腔显微注射人类AQP4-IgG阳性血清构建NMO-ON模型,仅能启动局部视神经周围免疫,对脊髓及大脑等其他神经系统未产生病理损伤。（三）调肝活络法防治视神经脊髓炎相关性视神经炎（NMO-ON）的疗效及机制探究目的:通过动物模型的体内研究,观察调肝活络法的干预效果,并深入挖掘方药发挥作用的分子机制,为NMO-ON的临床治疗提供中西医协同的解决方案。方法:SD雄性大鼠60只随机分为模型组、假手术组、中药组、激素组、中药+激素组,显微注射法构建NMO-ON大鼠模型,分别给予无菌蒸馏水、中药、激素及中药+激素等灌胃干预21天,术前1天（第0天）、术后7天、14天及21天分别行F-VEP、PLR检测;第21天处死所有大鼠,制备视网膜、视神经切片,进行HE染色及超微电镜观察;免疫组织化学染色检测RGCs中Brn3a表达;免疫荧光染色检测GFAP、NFL、髓鞘碱性蛋白（MBP）和CD68表达;Western-blotting检测视神经IL-6、IL-10、TNF-α、p-NF-κB p65 蛋白表达。结果:1.视神经功能学评价:与同时间点模型组和激素组相比,中药组和中药+激素组在第7、14和21天均可显着提高视神经F-VEP的N1P1振幅（P<0.001）;在第21天,中药组、中药+激素组与模型组和激素组相比,PLR收缩程度也显着增加（P<0.001）;2.组织病理学评价:与模型组和激素组相比,中药组和中药+激素组视神经HE染色均可见轴突损伤减轻、视神经水肿消退及未见到明显炎症细胞浸润;电镜发现中药组轴突数量明显增加,神经纤维束状形态可循,可见微丝微管结构,髓鞘损伤也较之减轻;与激素组相比,中药+激素组见到更完整的神经轴突、髓鞘结构;免疫组化发现,与模型组和激素组相比,中药组和中药联合激素组RGCs的Brn3a表达量较之均显着升高（P<0.001）;视神经免疫荧光提示中药组及中药+激素组GFAP、MBP和NFL表达量较模型组表达量升高（P<0.001）。CD68视神经染色也发现,与模型组相比,中药组及中药+激素组可见到CD68表达显着降低（P<0.001）;3.Western Blotting:与假手术组相比,模型组大鼠视神经内p-NF-κB p65、TNF-α和IL-6显着升高（P<0.001）;与模型组相比,中药组、激素及中药+激素组均可见到p-NF-κB p65、TNF-α和IL-6降低（P<0.001）;与假手术组相比,模型组大鼠视神经内IL-10显着降低（P<0.001）;与模型组相比,中药组、激素及中药+激素组均可见到 IL-10 升高（P<0.001）。结论:1.调肝活络复方中药可以减轻NMO-ON大鼠模型视神经轴突丢失、髓鞘损伤及炎症浸润,进而提升和改善视觉诱发电位N1P1振幅及瞳孔对光反射收缩能力。2.调肝活络复方中药对NMO-ON视神经及视网膜发挥神经保护和治疗作用可能与其能抑制视神经内NF-κB蛋白磷酸化及调控相关炎症介质（IL-6、TNF-α及IL-10）的产生有关。
易全勇[4]（2020）在《miR-127-5p靶向抑制GLUL调控视网膜Müller细胞活性在特发性黄斑前膜中的作用研究》文中指出第一部分miR-127-5p在特发性黄斑前膜玻璃体中的表达水平及意义研究目的:在视网膜类疾病中miRNAs存在差异表达并有重要调控作用,但是目前在特发性黄斑前膜病变中关于miRNAs的差异表达的研究较少,但是我们推测在特发性黄斑前膜中也存在miRNAs具有差异表达并具有重要的调控作用。因此在本实验中我们主要通过microarray技术筛选在特发性黄斑前膜患者玻璃体中以及对照组存在差异性表达的miRNAs。研究方法:为了寻找与特发性黄斑前膜相关的miRNAs,本研究采用microarray分析方法检测4例特发性黄斑前膜玻璃体组织和4例正常对照组玻璃体组织中miRNAs的表达变化。同时为了进一步验证试验结果,扩大临床样本,应用qRT-PCR方法检测20例正常对照组以及37例特发性黄斑前膜患者玻璃体组织进行验证。研究结果:特发性黄斑前膜玻璃体组织和正常对照玻璃体组织中存在61个miRNA存在差异表达,其中有24个（39.3%）miRNA在特发性黄斑前膜玻璃体中表现为上调,37个（60.7%）miRNA表现为下调。下调最明显的主要有:miR-127-5p、miR-486-3p、miR-660、miR-197、miR-425-5p、miR-518b、miR-376a、miR-145、miR-518d、miR-191、miR-221、miR-564。上调最明显的主要有:miR-454、miR-302a、miR-888、miR-302c、miR-1305、miR-519b-3p。miR-127-5p在特发性黄斑前膜玻璃体中下调最为显着,在37例特发性黄斑前膜玻璃体与20例对照组玻璃体中,qRT-PCR实验验证特发性黄斑前膜患者玻璃体中miR-127-5p表达水平显着下调,miR-127-5p在表达水平升高后可以抑制视网膜Müller细胞的增殖能力。结论:在特发性黄斑前膜患者中玻璃体存在与正常对照组不同的miRNAs表达谱,下调幅度最大的miR-127-5p经扩大样本qRT-PCR得到验证,其主要涉及细胞增殖调控,miR-127-5p在表达水平升高后可以抑制视网膜Müller细胞的细胞增殖能力。第二部分miR-127-5p调控大鼠视网膜Müller细胞增殖、侵袭、迁移与凋亡行为研究目的:在特发性黄斑前膜患者玻璃体中miR-127-5p显着下调,miR-127-5p外源表达水平升高可显着降低大鼠视网膜Müller细胞的增殖活性,因此我们推测miR-127-5p可能会调控在特发性黄斑前膜发生发展中有重要作用的的Müller细胞的其他行为,因此在本部分实验中我们将研究miR-127-5p表达水平升高后对于Müller细胞的增殖、侵袭、迁移和凋亡的影响。研究方法:使用miR-127-5p mimics（10μM、30μM、100μM）转染大鼠视网膜Müller细胞使miR-127-5p表达水平上调。使用CCK-8实验检测大鼠视网膜Müller细胞的增殖能力,Transwell侵袭实验检测大鼠视网膜Müller细胞侵袭能力,Transwell迁移实验检测大鼠视网膜Müller细胞迁移能力,流式细胞仪检测大鼠视网膜Müller细胞凋亡。研究结果:10μM、30μM、100μM的miR-127-5pmimics转染Müller细胞后可显着抑制Müller细胞增殖能力。miR-127-5p表达水平升高显着抑制大鼠视网膜Müller细胞侵袭能力以及迁移能力。miR-127-5p表达水平升高后显着促进了大鼠视网膜Müller细胞的凋亡能力。结论:miR-127-5p表达水平升高可以抑制大鼠视网膜Müller细胞增殖、侵袭和迁移能力,并促进视网膜Müller细胞的凋亡。第三部分miR-127-5p调控大鼠视网膜Müller细胞活性作用机制的研究研究目的:miR-127-5p表达水平升高后可以抑制大鼠视网膜Müller细胞增殖能力、侵袭能力、迁移能力,并促进Müller细胞凋亡,但是目前关于miR-127-5p对于视网膜Müller细胞的调控机制尚不明确,miRNAs通常可以通过调控靶基因表达水平从而调控生理活动,因此在本实验中我们首先需要鉴定miR-127-5p的靶基因并研究该靶基因是否在miR-127-5p对Müller细胞行为调控过程中发挥作用。研究方法:本课题采用Targetscan数据库预测并联合蛋白质谱组学等方法,寻找其潜在的靶点。通过qRT-PCR及蛋白质谱组学数据,并结合生物信息学分析,初步筛选出了miR-127-5p的潜在靶点GLUL,进一步的通过免疫印记法及qRT-PCR进行验证。通过蓄力比对,我们找到了miR-127-5p与其靶基因GLUL结合位点。并通过双荧光素报告基因以及结合位点序列突变进行验证,同时在在Müller细胞中转染miR-127-5p inhibitor,观察降低细胞内源性miR-127-5p后,是否能逆转GLUL的降低。观察应用si RNA敲低GLUL来低表达GLUL后对Müller细胞的活性的影响,为了进一步考察miRNA对细胞功能的影响是否是GLUL依赖的,在Müller细胞中转染miR-127-5p后,再过表达GLUL,观察是否够逆转miR-127-5p效应。研究结果:通过数据库预测及蛋白质谱筛选到GLUL是miR-127-5p潜在靶点。且在临床样本中检测发现特发性黄斑前膜患者玻璃体中GLUL m RNA表达水平在与正常人相比是明显升高的。细胞实验证明miR-127-5p能够明显抑制GLUL m RNA及蛋白水平,报告基因结果显示其能显着抑制GLUL 3’UTR活性。证明GLUL是miR-127-5p的靶基因,si RNA敲低GLUL也能明显抑制大鼠Müller的增殖、侵袭和迁移,并诱导明显的细胞凋亡,这与miR-127-5p效果一致。同时过表达GLUL能够部分的缓解miR-127-5p诱导的细胞活性的下降。结论:我们的研究表明miR-127-5p与特发性黄斑前膜患者存在负相关性。miR-127-5p对Müller细胞功能的影响是通过靶向GLUL来介导的。且临床样本中GLUL m RNA水平呈正相关。我们的研究发现了特发性黄斑前膜相关的调控机制:miR-127-5p直接靶向GLUL抑制其表达进而调控Müller细胞的增殖、侵袭、迁移和凋亡。miR-127-5p与GLUL可能是治疗或者阻止特发性黄斑前膜发展的潜在靶点。
王甜[5]（2020）在《外泌体负载内源性神经保护肽在外伤性视神经病变中的治疗作用研究》文中进行了进一步梳理研究目的:目前,对外伤性视神经病变（Traumatic optic neuropathy,TON）的治疗尚无明确有效的方法。临床上主要以激素和手术治疗为主,但二者的疗效不确切且尚无循证医学研究的支持。生物多肽因其高特异性有望成为TON治疗的新型药物。但是,肽类存在易降解,不稳定和半衰期短的问题,且很多普通肽细胞膜渗透和组织穿透能力很弱,难以穿过眼部屏障。这限制了它们作为治疗剂的用途,同时也对多肽递送系统提出了挑战。本研究旨在利用视神经钳夹（Optic nerve crush,ONC）模型模拟TON的急性视神经损伤过程,首先探讨不同致伤冲量与视网膜神经节细胞（Retinal ganglion cell,RGC）及其轴突丢失的关系,以期深入理解疾病进程,科学选择疾病治疗的时机;其次,构建可高效负载神经肽的外泌体（exosome）新型生物纳米载药系统;最后,基于体内大鼠ONC模型,评估其在TON治疗上的可行性和应用潜力。方法:1.大鼠视神经钳夹模型的探究。1)利用自闭合反向夹持镊,在距视盘1.5mm处进行右侧视神经钳夹,钳夹时间分别为5s,10s,20s,建立不同损伤强度的SD大鼠视神经损伤模型,行Masson视网膜切片染色,评估模型成功建立。2)在不同钳夹时间下,于伤后1、3、5、7、14、21、28天行视网膜切片hematoxylin-eosin（HE）染色,评估视网膜组织的病理形态改变。3)在不同钳夹时间下,于伤后7、14、21、28、35天行SD大鼠OCT扫描观,评估视网膜的神经纤维层（Retinal nerve fiber layer,RNFL）的厚度变化。4)在不同钳夹时间下,于伤后7、14、21天行视网膜铺片检测βⅢ-tubulin+轴索数量,评估视网膜内神经纤维的丢失情况,行视网膜铺片检测RBPMS+RGC数量,评估视网膜神经节细胞的死亡情况。2.外泌体负载神经肽PACAP（Pituitary adenylate cyclase activating polypeptide,PACAP）系统的构建。1)从不同种类的视网膜细胞系中,利用超速离心法获得视网膜细胞外泌体。利用电子显微镜、纳米颗粒跟踪分析仪及Western blot对其进行形态学、粒径范围及特征蛋白表达谱的鉴定。2)利用扫描激光共聚焦显微镜检测视网膜神经节细胞对DIR标记的exosome的摄取。3)利用流式细胞术检测不同视网膜细胞来源的外泌体与神经保护肽PACAP38的连接效率。4)利用扫描激光共聚焦显微镜检测视网膜神经节细胞对不同视网膜细胞来源exosome所负载的FITC标记的CP05-PACAP38的摄取并利用流式细胞术分析其摄取率。3.体内神经保护作用。1)利用视网膜铺片检测RBPMS+RGC数量,评估网膜神经节细胞的存活。2)利用OCT评估视网膜RNFL的厚度。3)利用Western blot及视神经切片免疫荧光染色检测神经再生蛋白GAP-43的蛋白表达,评估视神经的再生潜力。4)利用霍乱毒素B进行视神经示踪,评估距离钳夹部位不同距离的视神经再生数量。5)利用闪光视觉诱发电位（Flash visual-evoked potential,FVEP）进行N2P2波形的振幅及潜伏期检测,评估视神经功能。结果:（1）大鼠视神经钳夹模型的探究。1)视神经钳夹痕迹,指示造模成功。2)组织病理学检测显示从损伤第3天开始出现节细胞数目减少,于损伤第7天出现视网膜核层排列紊乱,此时尚未观察到RNFL及全层厚度变化,于损伤14天开始出现RNFL变薄,视网膜全层变薄,视网膜核层出现不同程度的紊乱。不同损伤程度的各组间无肉眼可见的显着差异。3)OCT结果显示损伤14天时RNFL明显变薄,一直延续到损伤21天,之后RNFL厚度减少趋势相对稳定,虽仍有下降但无统计学差异。不同损伤程度的各组间无肉眼可见的显着差异,神经轴索的βⅢ-tubulin+染色支持OCT结果。在损伤后的同一时期,RGC轴索的丢失程度与损伤冲量有关。4)RBPMS+RGC染色显示,视网膜神经节细胞于损伤第一周时大幅减少,于损伤第二周呈中度下降,相比于第一周下降比例有所缓和,之后RGC数目仍继续衰减,下降幅度趋于平稳。在损伤后的同一时期,RGC丢失程度随损伤冲量的增加而加重,差异有统计学差异。（2）外泌体负载神经肽PACAP38系统的构建。1)RGC源性外泌体(EXORGC)可以高效负载PACAP38进入RGC。2)流式结果显示FITC-CP05-PACAP38与EXORGC的连接效率为92.8%。3)流式结果显示FITC-PACAP38体外细胞摄取率为5.22%,EXORGC负载FITC-PACAP38系统(EXORGC-PACAP38)可使FITC-PACAP38体外细胞摄取率提高至95.7%。4)体内视网膜铺片结果显示相同时间内EXORGCRhodamine B-CP05-PACAP38系统可以提高Rhodamine B-PACAP38被视网膜组织摄取的效率。（3）体内神经保护作用。1)视神经损伤1周。i)损伤组RGC数量为706.31±15.8/mm2,EXORGC对照组为783.63±7.06/mm2,PACAP治疗组为791.37±10.63/mm2,EXORGC-PACAP38治疗组为865.22±18.42/mm2。PACAP38治疗组和EXORGCPACAP38疗组与损伤组相比均有统计学意义。EXORGC-PACAP38治疗组RGC存活率最高,与单纯的PACAP38治疗组相比有统计学意义。ii)OCT结果显示各组之间无统计学差异iii)F-VEP结果显示EXORGC-PACAP38治疗组和PACAP38治疗组相比于损伤组P2波潜伏期缩短,但两治疗组间无统计学差异。两治疗组较损伤组均不能改善P2波的振幅。2)视神经损伤2周。i)损伤组RGC数量为76.84±7.63/mm2,EXORGC对照组为90.48±3.6/mm2,PACAP治疗组为141.79±12.77/mm2,EXORGC-PACAP38治疗组为195.63±11.09/mm2。PACAP38治疗组和EXORGC-PACAP38治疗组与损伤组相比均有统计学意义。EXORGC-PACAP38治疗组RGC存活率最高,与单纯的PACAP38治疗组相比差异有统计学意义。ii)EXORGC-PACAP38治疗组相较与损伤组,可挽救RNFL的厚度的下降,差异有统计学差异。PACAP38不能挽救RNFL厚度的下降。iii)EXORGC-PACAP38治疗组较损伤组及PACAP38治疗组,Gap43的蛋白表达升高,差异有统计学意义。PACAP38不能增加视神经中Gap43的蛋白表达。iv)视神经的CTB示踪显示EXORGC-PACAP38治疗组的视神经再生能力最强,相比于损伤组或单纯的PACAP38治疗组,差异均有统计学意义。v)EXORGC-PACAP38治疗组较损伤组P2波振幅增高,潜伏期缩短,差异有统计学意义。PACAP38治疗组不能改善P2波的潜伏期。（4）毒性试验。治疗剂量的EXORGC-PACAP38未造成视网膜组织组织病理学改变,视网膜各层厚度改变,对应的眼底成像系统未见异常,未造成N2P2波振幅和潜伏期的异常。结论:1.在SD大鼠的视神经钳夹模型中,RGC的死亡和RNFL的变性丢失过程均分为两个阶段发生,即快速丢失阶段和缓慢丢失阶段。但是,二者并不同步,RGC的死亡先于视网膜内轴突的丧失,RGC丢失幅度大于RNFL变薄的幅度。在ONC后的同一时期,RGC丢失程度随损伤冲量的增加而加重,而RGC轴索的丢失程度与损伤冲量无关。2.PACAP38在大鼠ONC模型中发挥了一定的神经保护作用但是不能促进视神经再生。3.视网膜不同细胞来源的外泌体可以作为新型生物纳米载药系统,通过exosome锚定肽CP05与神经保护肽PACAP38形成连接复合体。加载了神经保护肽PACAP38的exosome仍可保持自身结构的稳定性。其中,视网膜神经节细胞源性外泌体相比于所测试的其他眼源性RPE细胞外泌体和Müller细胞外泌体展现出更高的PACAP38负载效率。在体外,可以增加源细胞RGC对PACAP38的摄取,大大提升了PACAP38与源细胞RGC相互作用的能力。在体内,可以迅速穿越视网膜内界膜屏障,布散至视网膜内层组织。4.EXORGC-PACAP38在大鼠ONC模型中介导高效的神经保护和神经再生效应,起到延缓RGC的丢失及促进视神经轴索再生进而改善视神经功能的作用。
孙伟[6]（2019）在《δ-阿片受体在电针治疗大鼠脑缺血伴随的视网膜损伤中的作用及其相关机制的研究》文中研究指明目的:以往对缺血性脑损伤引起的认知功能障碍的研究,往往忽略了造模引起的视觉损伤对认知功能障碍的影响。本研究改良了传统的开颅电凝法脑缺血模型及四血管阻断（4-vessel occlusion,4VO）全脑缺血模型,建立了改良的开颅脑缺血再灌注模型、改良的4VO连续阻断模型与4VO间断阻断模型。此外,又选择经典的Longa线栓阻断模型、SD与Wistar大鼠的双侧颈总动脉结扎模型,比较上述缺血模型中的主要脑损伤及视网膜损伤的差异。在此基础上,选择Longa线栓阻断法作为大鼠脑缺血伴视网膜损伤的动物模型,玻璃体腔内注射δ-阿片受体（delta opioid receptor,DOR）拮抗剂naltrindole,通过组织病理学检查及行为学检测,观察电针大鼠“水沟”、“睛明”穴,对视网膜损伤是否存在神经保护作用,并探讨电针的保护作用与DOR之间是否存在关系。方法:第一部分:常用大鼠脑缺血模型对视网膜损伤的比较研究在第一部分的研究中,首先针对经典开颅电凝法脑缺血模型不能进行再灌注研究的缺点进行了模型改良,建立了新的大鼠开颅脑缺血再灌注模型;针对Pulsinelli建立的4VO模型死亡率高,电凝不全、易伤及脑干及脊髓等缺陷,进行了技术创新,建立新的4VO连续阻断模型与4VO间断阻断模型。在此基础上,选择经典的Longa线栓阻断法模型、SD与Wistar大鼠的两血管阻断（2-vessel occlusion,2VO）模型,比较上述模型中的主要脑缺血及视网膜损伤差异。各模型均分别分为假手术组、D1模型组、D3模型组、D7模型组、D14模型组、D28模型组,于造模1、3、7、14、28天取材,脑及视神经离体样本经HE染色（hematoxylin and eosin staining）与LFB染色（luxol fast blue staining）检查组织病理学改变,眼球离体样本经HE染色进行组织病理学观察并对视网膜各细胞层进行厚度分析与视网膜神经节细胞（retinal ganglion cells,RGCs）细胞密度分析。D28模型组于术后28天使用明暗箱检测大鼠的光线辨识能力,Y迷宫检测学习记忆能力的改变。综合脑、视神经、视网膜的组织病理学检测结果与神经行为学的检测结果,从而评价上述模型在脑损伤与视网膜损伤中的差异。第二部分:δ-阿片受体在电针治疗大鼠脑缺血伴随的视网膜损伤中的作用研究在第二部分研究中,选用Longa线栓阻断法造模,将30只大鼠随机分为假手术组（Sham）、MCAO模型组（MCAO）、MCAO模型电针治疗组（MCAO-E）、MACO模型假电针组（MCAO-S）、MCAO模型+电针治疗+拮抗剂naltrindole组（MCAO-E-N）,每组6只。Sham组、MCAO组、MCAO-E组、MCAO-S组于造模前30 min玻璃体腔内注射生理盐水10μl,MCAO-E-N组玻璃体腔内注射10μl的100 n M拮抗剂naltrindole。电针穴位选取“睛明”和“水沟”,MCAO-E、MCAO-E-N组于缺血30 min时开始电针治疗,并持续至再灌注后30 min,假电针组仅刺入大鼠穴位,不予通电。24 h后取材,CV染色（crystal violet staining）观察脑梗死的组织病理改变并计算脑梗死体积比。眼球离体样本经HE染色进行组织病理学评价并对视网膜各细胞层进行厚度分析与RGCs细胞密度分析,视网膜免疫荧光染色观察胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein,GFAP）、谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase,GS）的阳性表达并进行平均光密度值分析。从而评价电针对于视网膜损伤的改善作用,并探讨这种改善作用是否与DOR有关。结果:第一部分:常用大鼠脑缺血模型对视网膜损伤的比较研究改良的开颅阻断法模型术后脑组织病理学检测发现,该模型的脑梗死区域仅局限于皮层,而纹状体、海马、脑白质未观察到组织病理学改变,视神经、视网膜亦未观察到组织病理学改变,D28的明暗箱、Y迷宫检测未观察到神经功能损伤。线栓阻断法模型采用经典的Longa造模方法,术后1天脑皮层、纹状体即观察到明显的缺血性改变,甚者累及海马区域及脑白质,其后缺血损伤呈渐进性加重。视网膜的HE染色检测,术后1天外核层（outer nuclear layer,ONL）出现了有显着性的细胞层增厚（P?0.05）,术后3天观察到了2只动物的内核层（inner nuclear layer,INL）的空泡形成,其他阶段未观察到明显的视网膜组织病理学的改变。视网膜GFAP、GS免疫荧光标记染色术后1天即开始观察到明显的阳性表达。D28的Y迷宫、明暗箱检测未观察到动物在学习记忆与光线辨识能力上的神经功能损伤。SD大鼠2VO模型,脑缺血损伤区域主要为脑灰质（海马）以及白质（视束）,术后28天有2只大鼠观察到海马CA1区缺血性改变,而皮层、纹状体各阶段未观察到明显的缺血性改变。术后1天可见视神经神经纤维缺血损伤,随后28天渐进性加重。视网膜术后1天即可观察到视网膜组织病理学改变,主要改变可见于神经节细胞层（ganglion cell layer,GCL）与外核层,其后缺血改变渐进性加重,至术后28天视网膜的损伤明显,主要损伤可见于神经节细胞层、内网状层（inner plexiform layer,IPL）及外网状层（outer plexiform layer,OPL）,细胞层厚度与假手术组之间的差别有统计学意义（P<0.001）;RGCs数量变少,细胞密度与假手术组之间的差别有统计学意义（P<0.001）。术后28天的Y迷宫检测结果显示大鼠存在学习记忆损伤。Wistar大鼠2VO模型,脑缺血损伤区域主要为脑白质,尤其是视束,术后3天即可观察到神经元损伤,而各阶段的海马、皮层、纹状体未观察到明显的缺血性改变。视神经术后1天可见神经纤维缺血损伤,随后28天缺血损伤渐进性加重。视网膜术后1天即可观察到视网膜组织病理学改变,主要改变可见于GCL、IPL、INL、ONL,其后缺血改变渐进性加重,至术后28天视网膜的损伤明显,主要损伤可见于神经节细胞层、内网状层、内核层、外网状层、感光细胞层（photoreceptor layer,PL）及视网膜色素上皮层（retinal pigment epithelium,RPE）,视网膜总厚度及各细胞层厚度与对照组之间的差别有统计学意义（P<0.001）,RGCs数量变少,细胞密度与对照组之间的差别有统计学意义（P<0.001）。术后28天的明暗箱检测结果显示大鼠存在视觉功能损伤。改良的4VO连续阻断模型,分离并结扎双侧第1颈椎与第2颈椎间隙中穿过的椎动脉,术后24 h连续夹闭颈总动脉20 min行四血管阻断造模。术后脑缺血损伤区域主要为海马CA1区,术后1天海马CA1区开始观察到锥体细胞缺血损伤,随后损伤持续加重,海马CA3与DG区、皮层、纹状体、白质区域无缺血性改变。视神经、视网膜亦未观察到组织病理学改变。术后28天的Y迷宫检测结果显示大鼠存在学习记忆损伤。改良的4VO间断阻断模型,分离第1颈椎与第2颈椎间隙中穿过的椎动脉,使用动脉夹同时阻断双侧椎动脉与颈总动脉,缺血5 min再灌注5 min,循环3次进行4VO间断阻断造模。术后脑缺血损伤区域主要为海马CA1区,术后1天海马CA1区开始观察到锥体细胞缺血损伤,随后损伤持续加重,海马CA3、DG区神经元未观察到缺血性改变。皮层、纹状体、白质区域无缺血性改变。视神经、视网膜亦未观察到组织病理学改变。术后28天的Y迷宫检测结果表明大鼠存在一定的学习记忆损伤。第二部分:δ-阿片受体在电针治疗大鼠脑缺血伴随的视网膜损伤中的作用研究在第二部分的研究中,Longa线栓阻断法造模后24 h的大脑CV染色结果显示MCAO-E、MCAO-S、MCAO-E-N脑梗死体积与MCAO组之间的差别没有统计学意义（P>0.05）。视网膜组织病理学检测,MCAO组、MCAO-S组、MCAOE-N组ONL、INL细胞层增厚,与假手术组之间的差别有统计学意义（P?0.05）,MCAO-E组未检测到有显着性的增厚。GFAP免疫荧光检测结果可见,MCAO组、MCAO-S组、MCAO-E-N组GCL/NFL层大量表达GFAP,MCAO-E组视网膜仅在GCL/NFL层有微弱GFAP表达。GS免疫荧光检测结果可见,MCAO组、MCAOS组、MCAO-E-N组于GCL/NFL、IPL、INL、OPL、ONL层大量表达,MCAO-E组视网膜仅在GCL/NFL、INL、ONL层有GS表达。提示电针治疗对视网膜损伤有改善作用,而这种改善作用能被naltrindole翻转。结论:1.缺血模型的比较结果显示,开颅脑缺血再灌注模型观察到皮层损伤,改良的4VO连续阻断模型、改良的4VO间断阻断模型,观察到灰质（海马）损伤,但均未观察到白质及视网膜损伤;SD大鼠2VO模型,观察到灰质（海马）、白质损伤并伴有视网膜损伤、Wistar大鼠2VO模型观察到白质损伤并伴有视网膜损伤,而灰质（海马）无明显损伤;Longa线栓阻断法模型观察到皮层、纹状体甚至灰质（海马）、白质损伤并伴随有视网膜损伤。2.电针“水沟”、“睛明”穴对脑缺血伴随的视网膜损伤具有明显的保护作用,而眼球玻璃体注射DOR拮抗剂naltrindole可以翻转电针的保护作用,提示DOR可能在电针抗视网膜损伤中是一关键环节。
卢静[7]（2019）在《补肾活血方对AGEs/缺氧条件下视网膜Müller细胞PEDF及相关因子的影响》文中进行了进一步梳理目的:观察补肾活血方对AGEs/缺氧条件下视网膜Müller细胞PEDF及相关因子的影响,并对其作用机制进行初步探讨,为补肾活血方在糖尿病视网膜病变（DR）的临床应用提供一定的实验依据方法:（1）应用改进的酶消化法培养SD大鼠视网膜Müller细胞;采用HE染色、GFAP和GS免疫细胞化学荧光染色进行细胞鉴定。（2）以中药血清药理学方法获得补肾活血方含药血清。（3）实验分为八组:正常对照组、正常中药干预组、低AGEs组、高AGEs组、低AGEs中药干预组、高AGEs中药干预组、模拟缺氧组、模拟缺氧中药干预组。（4）分别在实验干预24h、48h、72h后,运用酶联免疫吸附法（ELISA）对细胞上清液进行血管内皮生长因子（VEGF）、色素上皮衍生因子（PEDF）及白细胞介素-1β（IL-1β）含量的测定。结果:（1）同时段模拟缺氧组、低AGEs组、高AGEs组VEGF浓度与正常对照组比较均升高（P<0.05）;同时段缺氧中药干预组较模拟缺氧组VEGF分泌量减少（P<0.05）;同时段低AGEs组中药干预较低AGEs组VEGF浓度减少（P<0.05）;同时段高AGEs组中药干预较高AGEs组VEGF浓度均减少（P<0.05）;各组同一时段VEGF浓度均比前一时间升高（P<0.05）。（2）同时段模拟缺氧组、低AGEs组、高AGEs组PEDF浓度与正常对照组比较均降低（P<0.05）;同时段缺氧中药干预组较模拟缺氧组PEDF浓度升高（P<0.05）;同时段低AGEs组中药干预较低AGEs组PEDF浓度升高（P<0.05）;同时段高AGEs组中药干预较高AGEs组PEDF浓度升高（P<0.05）;各组同一时段PEDF浓度均比前一时间降低（P<0.05）。（3）同时段模拟缺氧组、低AGEs组、高AGEs组IL-1β浓度与正常对照组比较均升高（P<0.05）;同时段缺氧中药干预组较模拟缺氧组IL-1β浓度均降低（P<0.05）;同时段低AGEs组中药干预较低AGEs组IL-1β浓度均降低（P<0.05）;同时段高AGEs组中药干预较高AGEs组IL-1β浓度均降低（P<0.05）;各组同一时段IL-1β浓度均比前一时间升高（P<0.05）。（4）正常对照组的VEGF与PEDF呈正相关关系（P<0.05）,缺氧组、低AGEs组的VEGF与PEDF无明显相关性（P>0.05）,高AGEs组的VEGF与PEDF呈负相关关系（P<0.05）。（5）同时段比较,缺氧组、低AGEs组及高AGEs组的VEGF/PEDF比值均较正常对照组增高;同时段比较,缺氧中药干预组较缺氧组VEGF/PEDF的比值降低,高、低AGEs组中药干预分别较高、低AGEs组VEGF/PEDF的比值降低。结论:（1）本实验中,AGEs（终浓度50 mg/L和100mg/L）以及缺氧均可导致视网膜Müller细胞分泌VEGF增加、PEDF减少,IL-1β增高,并且这种改变在高AGEs组比低AGEs组更明显。（2）在AGEs（终浓度50 mg/L和100mg/L）以及缺氧条件下,补肾活血中药复方含药血清可降低视网膜Müller细胞VEGF的表达以及IL-1β的分泌,提高PEDF蛋白的表达,这可能是补肾活血法防治DR的药物干预途径之一。（3）本实验中,正常状态下视网膜Müller细胞的VEGF与PEDF呈动态平衡;AGEs（50mg/L和100mg/L终浓度）以及缺氧条件下不仅使视网膜Müller细胞VEGF与PEDF的动态平衡均被打破,并且AGEs对视网膜Müller细胞VEGF与PEDF动态平衡的损害程度与AGEs浓度有关。（4）补肾活血中药含药血清可减轻在AGEs（终浓度50 mg/L和100mg/L）以及缺氧条件下VEGF与PEDF的不平衡,这可能是其防治DR的一个重要作用机制。
邹婷[8]（2019）在《hEROs来源视网膜祖细胞治疗视网膜色素变性的作用及其机制研究》文中认为研究背景:视网膜色素变性（retinitis pigmentosa,RP）是一组以感光细胞进行性丢失为病理特点的严重致盲性眼病,目前尚无公认有效的治疗方法。干细胞治疗被认为是RP治疗具有潜力的治疗方式。然而,如何获得合适的眼治疗细胞是干细胞治疗RP亟待解决的关键问题。视网膜祖细胞（retinal progenitor cells,RPCs）是一类具有治疗前景的视网膜干细胞。此前研究表明,从捐赠的人胚胎视网膜中分离的人视网膜祖细胞（human fetal retina-derived RPCs,hfRPCs）移植后能改善视网膜变性模型视功能。目前,国内外已开展多项hfRPCs移植治疗RP的临床试验,其应用的初步安全性和有效性得到证实。然而,hfRPCs的来源有限且存在显着的伦理学限制,不利于临床转化。人胚胎干细胞（human Embryonic stem cells,hESCs）具有全能分化潜能,能在体外大量扩增。并且,已有多个课题组建立了临床级的人胚胎干细胞系,由其分化的治疗细胞也通过我国医疗行政部门审批并开始进入临床试验,这为hESCs来源治疗细胞临床应用奠定了基础。然而,hESCs直接应用具有成瘤风险。近来,三维培养技术使hESCs能在体外自发形成结构和功能高度接近体内器官发育的视网膜类器官（human embryonic stem cell derived retinal organoids,hEROs）,为干细胞治疗RP提供了新的种子细胞来源。ESCs来源治疗细胞应用虽极具潜力,但此前有报道显示ESCs来源治疗细胞因混有胚胎发育早期细胞,在移植入动物模型后具有成瘤风险。因此,如何从hEROs中分离出RPCs的同时,排除掉混杂的早期致瘤性细胞,仍然是一个关键挑战。细胞表面标记物能帮助从具有复杂细胞成分的视网膜类器官中筛选目的细胞。细胞表面抗原C-Kit,也被称为CD117,是一种III型酪氨酸激酶受体,表达于多种干细胞细胞表面。在小鼠和人视网膜发育过程中C-Kit也标记了一群RPCs,因此可用于筛选RPCs。SSEA4是胚胎阶段性抗原,主要表达在发育早期细胞表面上,通过其阴性筛选有助于识别和排除混杂的发育早期细胞,降低治疗细胞的成瘤风险。本课题组前期从hfRPCs中分离出C-Kit+/SSEA4-RPCs亚群,并证实其移植后无成瘤,能改善视网膜变性鼠视功能。但能否从hEROs上分离C-Kit+/SSEA4-RPCs尚不清楚。因此,研究从hEROs中富集C-Kit+/SSEA4-RPCs的可行性,并研究C-Kit+/SSEA4-RPCs生物学特性,是临床前研究的必经之路。通过干细胞移植修复损伤或变性视网膜的主要机制包括:1)基于各类视网膜细胞再生的替代效应;2)延缓视网膜变性的保护效应,如营养支持、免疫调节、神经可塑性调节等。近期有研究者提出,视网膜下腔移植干细胞主要是通过与受者视网膜感光细胞发生物质交换而非细胞替代实现对受损感光细胞的修复。这一新机制的发现,促使需要重新评估此前细胞移植治疗方案和结果。干细胞移植后与受者视网膜感光细胞间发生物质交换,作为一种干细胞治疗的新机制,其交换的形式、内容和促发因素还需要进一步认识和研究。干细胞移植的效果,尤其是长期有效性维持,不仅取决于移植干细胞分化为视网膜感光细胞的能力,还受受者视网膜微环境的影响。在视网膜变性发生发展过程中,常常存在小胶质细胞过度激活、神经炎症反应和Müller胶质细胞反应性增生等病理过程。这种视网膜变性微环境不利于植入干细胞的长期存活、分化和有效地迁移、整合,同时小胶质细胞过度激活也是视网膜变性过程中感光细胞死亡的重要原因之一。近年来,研究者通过药物预处理和联合干细胞移植等方法来改善视网膜变性微环境,以期达到更好的细胞移植治疗效果。然而,同时具有RPC特性和改善受者视网膜微环境能力的移植细胞尚无相关报道。在中枢神经系统中,C-Kit/SCF信号通路被认为在小胶质细胞免疫调节中起重要作用,其它系统来源的C-Kit+干细胞也被报道参与免疫调节。但hEROs来源C-Kit+/SSEA4-RPCs是否也能调节视网膜小胶质细胞的免疫反应,进而改善视网膜变性微环境尚不清楚。研究假设:本研究假设:采用细胞表面标记物组合筛选能从hEROs上分离出具有干细胞特性和低成瘤风险的C-Kit+/SSEA4-RPCs;C-Kit+/SSEA4-RPCs移植治疗视网膜变性鼠安全且有效;其有效性机制可能是通过细胞替代、物质交换和改善视网膜变性微环境实现的。研究方法与结果:本研究分为三个部分:第一部分hEROs来源C-Kit+/SSEA4-RPCs的生物学特性研究1.hEROs来源C-Kit+/SSEA4-RPCs的分离通过hESCs经三维培养方法获取视网膜类器官。通过免疫荧光和流式细胞术分析C-Kit和SSEA4抗原在hEROs不同阶段（30D,45D和60D）的表达特性。利用hfRPCs和hEROs来源C-Kit+/SSEA4-RPCs的转录组测序数据,分析二者转录组水平差异。结果显示:在第30天时（30D）,通过三维培养方法从hESCs获得以神经视网膜形成为主的视网膜类器官。30D hEROs中C-Kit和SSEA4表达最高,随后逐渐降低。C-Kit在30D hEROs上与多种RPCs标记共定位,提示其标记的为一群RPCs。转录组测序分析显示,30D,45D和60D hEROs来源C-Kit+/SSEA4-RPCs与hfRPCs基因表达模式上具有高度相似性,其中以30D hEROs来源C-Kit+/SSEA4-RPCs的表达模式和hfRPCs最为接近。上述结果提示:从hEROs上富集C-Kit+/SSEA4-RPCs具有可行性,且30D是最佳分选时间点。2.hEROs来源C-Kit+/SSEA4-RPCs的细胞生物学特性通过流式分选技术从30D hEROs上分离C-Kit+/SSEA4-RPCs并培养,通过免疫荧光鉴定RPCs特异性标记。通过克隆形成和诱导分化实验检测其自我更新能力和多向分化潜能。通过流式细胞术鉴定其胚胎抗原表达。结果显示:培养第3代（P3）C-Kit+/SSEA4-RPCs能维持RPCs特异性标记表达,能形成克隆,具有自我更新能力。在特定分化培养基诱导下可以表达视网膜感光细胞标记和其它视网膜神经元标记,提示C-Kit+/SSEA4-RPCs具有多向分化潜能。通过流式检测其不表达胚胎抗原OCT4和Nanog。结果提示:流式分选的C-Kit+/SSEA4-RPCs,具有自我更新和多向分化潜能,有效排除了混杂的ESCs,因而可以作为治疗视网膜变性临床前研究的种子细胞。第二部分hEROs来源C-Kit+/SSEA4-RPCs移植治疗视网膜色素变性的临床前研究1.hEROs来源C-Kit+/SSEA4-RPCs移植视网膜变性鼠后存活、迁移及分化特点将经慢病毒转染标记EGFP的hEROs来源C-Kit+/SSEA4-RPCs移植入RCS大鼠视网膜下腔,通过免疫荧光鉴定其存活、迁移及分化特点。结果显示:hEROs来源C-Kit+/SSEA4-RPCs移植后能存活至最长观察期术后24周。术后2周,C-Kit+/SSEA4-RPCs主要分布于视网膜下腔。术后4周后其可以较均匀地横向迁移,并且开始纵向迁移至视网膜外核层,甚至进入内层视网膜达节细胞层区域,提示其良好的迁移能力。此外,在术后4周,植入的C-Kit+/SSEA4-RPCs能分化成具有成熟视网膜感光细胞形态的视锥和视杆细胞,并且表达感光细胞特异性标记,其突触末端也表达突触蛋白标记。除了向感光细胞分化,C-Kit+/SSEA4-RPCs还能迁移至视网膜各层表达相应视网膜细胞特异性标记。结果提示:hEROs来源C-Kit+/SSEA4-RPCs移植视网膜变性鼠后具有良好的存活、迁移及多向分化潜能,并且可能与受者视网膜形成突触联系。2.hEROs来源C-Kit+/SSEA4-RPCs移植视网膜变性鼠后安全性将EGFP标记的hEROs来源C-Kit+/SSEA4-RPCs和未分选hEROs来源混合细胞（未分选组）移植入RCS大鼠视网膜下腔,通过免疫荧光分析其是否出现肿瘤形成和异常增殖。结果显示:C-Kit+/SSEA4-RPCs移植后,在最长观察时间24周内,所有大鼠眼内均未发现成瘤,移植细胞也不表达增殖标记Ki67,提示无异常增殖。而未分选组在术后4周有66.7%的大鼠眼内形成肿瘤样组织。经免疫荧光鉴定肿瘤组织富含SSEA4+和Ki67+的低分化细胞,同时也包含分化了的GFAP+胶质细胞和Tuj1+神经元。对未分选组细胞流式鉴定,发现其中有高达24%的SSEA4+细胞。上述结果提示:C-Kit+/SSEA4-RPCs移植入眼内具有安全性,而未分选组可能因包含SSEA4+细胞在眼内移植后成瘤,进一步证实了SSEA4阴性筛选的必要性。3.hEROs来源C-Kit+/SSEA4-RPCs移植视网膜变性鼠后有效性将hEROs来源C-Kit+/SSEA4-RPCs移植入快速视网膜变性RD1小鼠和慢速视网膜变性RCS大鼠视网膜下腔,以评估其治疗有效性,设伪手术组和未处理组为对照,另设C-Kit-/SSEA4-细胞作为实验组对照（RCS大鼠模型）。通过视网膜外核层厚度分析显示移植后对视网膜结构的保护。通过fERG和光栅视动反应评估移植后视功能变化。结果显示:对视网膜外核层结构评估,发现C-Kit+/SSEA4-RPCs移植入RD1小鼠视网膜下腔（术后14天）,和RCS大鼠模型（术后24周）均能有效延缓其视网膜外核层变薄,具有较好的视网膜外核层结构保护作用。采用fERG评估,C-Kit+/SSEA4-RPCs移植入RD1小鼠（术后14天）,和RCS大鼠模型（术后12周）均能显着改善视网膜变性鼠视功能。在RCS大鼠中,C-Kit+/SSEA4-RPCs在移植术后4周和8周比C-Kit-/SSEA4-细胞有更优越的视功能保护作用。光栅视动反应评估提示C-Kit+/SSEA4-RPCs移植后能减缓RCS大鼠视敏度下降至术后24周。通过快速和慢速两种视网膜变性模型充分说明了C-Kit+/SSEA4-RPCs治疗后对变性视网膜结构和功能的保护作用;并且其改善视功能作用具有优越性和长期有效性。第三部分hEROs来源C-Kit+/SSEA4-RPCs移植治疗视网膜色素变性的机制研究1.hEROs来源C-Kit+/SSEA4-RPCs移植视网膜变性鼠后能发生细胞替代以及与受者感光细胞间物质交换采用特异性人源细胞标记抗体确定移植细胞来源,分析hEROs来源C-Kit+/SSEA4-RPCs移植RCS大鼠后发生细胞替代以及和受者感光细胞发生物质交换的特点。结果显示:采用人线粒体抗体MTCO2和人核抗体HuNu识别人源细胞,发现视网膜外核层具有感光细胞形态的EGFP+细胞能同时表达MTCO2或HuNu和成熟感光细胞标记,提示C-Kit+/SSEA4-RPCs移植后能分化、替代变性的感光细胞。此外,视网膜外核层存在EGFP+/HuNu-细胞,可能是由于植入细胞和受者感光细胞间发生了物质交换而使其带上EGFP。结果提示:C-Kit+/SSEA4-RPCs移植后能同时发生细胞替代和与受者感光细胞间物质交换。2.hEROs来源C-Kit+/SSEA4-RPCs移植后改善视网膜变性微环境2.1 hEROs来源C-Kit+/SSEA4-RPCs移植能改善视网膜变性鼠微环境通过将hEROs来源C-Kit+/SSEA4-RPCs移植入RD1小鼠和RCS大鼠,以伪手术组作为对照,研究其对包括小胶质细胞激活和Müller细胞胶质增生为特点的视网膜变性微环境的作用。采用免疫荧光、Western blot和Real-Time PCR对C-Kit+/SSEA4-RPCs移植后对视网膜小胶质细胞数量、形态、炎症因子表达的作用。通过免疫荧光及Western blot分析移植后Müller胶质增生变化。结果显示:C-Kit+/SSEA4-RPCs移植后能显着减少RD1小鼠（术后14天）和RCS大鼠（术后4周和8周）视网膜Iba1+小胶质细胞数量和Iba1蛋白表达。能显着减少RCS大鼠视网膜中具有吞噬活性的Iba1+/CD68+小胶质细胞数量,降低激活小胶质细胞标记TSPO水平,同时也能使外层视网膜小胶质细胞向分枝静息态转变。Real-Time PCR显示移植后视网膜炎症因子水平也受到抑制。此外,在RD1和RCS模型中,C-Kit+/SSEA4-RPCs移植均能显着抑制Müller细胞胶质增生。以上结果提示C-Kit+/SSEA4-RPCs移植两种视网膜变性鼠后能通过抑制小胶质细胞激活、伴随的炎症反应和抑制Müller细胞胶质增生来改善视网膜变性微环境。2.2 hEROs来源C-Kit+/SSEA4-RPCs调节小胶质细胞免疫机制及通路研究将hEROs来源C-Kit+/SSEA4-RPCs与LPS处理的人/小鼠小胶质细胞系共培养,采用Real-Time PCR分析炎症因子表达变化。通过转录组测序分析C-Kit+/SSEA4-RPCs与hfRPCs间免疫与炎症相关差异基因和富集信号通路,并对调节小胶质免疫相关基因进行Real-Time PCR验证。结果显示:hEROs来源C-Kit+/SSEA4-RPCs能抑制人/小鼠小胶质细胞激活引起的炎症因子表达,并且在抑制某些炎症因子方面,作用优于hfRPCs和C-Kit-/SSEA4-细胞。转录组测序提示C-Kit+/SSEA4-RPCs与hfRPCs有700个免疫与炎症相关差异基因。KEGG信号通路分析提示细胞因子与细胞因子受体相互作用通路为C-Kit+/SSEA4-RPCs调节小胶质细胞免疫的重要信号通路之一。RT-PCR验证,发现C-Kit+/SSEA4-RPCs发挥免疫调节作可能是通过高表达抑制小胶质细胞基因,低表达小胶质募集基因实现的。上述结果提示:hEROs来源C-Kit+/SSEA4-RPCs具有独特的调节小胶质细胞免疫的作用,提示其可能是更优化的治疗细胞,对其小胶质细胞免疫调节机制的阐释为理解干细胞改善视网膜变性微环境作用提供了思路。研究结论:1.采用细胞表面标记（C-Kit+/SSEA4-）联合筛选从人胚胎干细胞三维形成视网膜类器官（human embryonic stem cells derived retinal organoids,hEROs）上分离出C-Kit+/SSEA4-视网膜祖细胞（retinal progenitor cells,RPCs）,并证实其与hfRPCs基因表达模式相似,是具有自我更新能力、多向分化潜能及较低成瘤风险的RPCs亚群。2.证实hEROs来源的C-Kit+/SSEA4-RPCs视网膜下腔移植无成瘤和异常增殖,验证SSEA4阴性筛选的重要性。3.研究了hEROs来源的C-Kit+/SSEA4-RPCs移植后具有优越的存活、迁移和多向分化潜能,并且通过移植快速和慢速两种视网膜变性模型（RD1小鼠和RCS大鼠）证实其治疗长期有效性,为视网膜色素变性临床治疗提供了新的种子细胞。4.证实了hEROs来源的C-Kit+/SSEA4-RPCs移植后可实现感光细胞替代,并可能与受者感光细胞间进行物质交换。5.采用快速和慢速两种视网膜变性模型显示hEROs来源的C-Kit+/SSEA4-RPCs移植后对包括小胶质细胞激活和Müller细胞反应性增生的视网膜变性微环境具有独特的改善作用,其调节小胶质细胞免疫可能是通过高表达抑制小胶质细胞基因,低表达小胶质细胞募集基因实现的。
刘丽华[9]（2017）在《柚皮苷对糖尿病视网膜病变的保护作用及机制研究》文中研究说明目的1.通过动物体内实验,探讨柚皮苷（Naringin）对糖尿病视网膜病变（Diabetic retinopathy,DR）的干预作用。并进一步探讨其对胶质纤维酸性蛋白（Glial fibrillary acidic protein,GFAP）表达的影响,揭示Naringin对糖尿病视网膜Müller细胞的作用。2.利用高糖培养液培养视网膜Müller细胞（Retinal Müller cell line,rMC-1）,模拟体内的糖尿病环境。分析Naringin对高糖诱导的rMC-1氧化应激及炎症反应的影响,明确Naringin对rMC-1的干预作用。3.探讨NF-κB通路在动物实验的视网膜组织中及细胞实验的rMC-1中的活化情况,揭示Narigin保护DR的可能机制。材料与方法:选取8周龄健康SPF级SD（Sprague-Dawley）雄性（以排除雌激素影响）大鼠36只,体重220±30g,大鼠适应性饲养1W。随机分为6组即:对照组、高剂量Naringin（80mg/kg）组、糖尿病组、糖尿病+低剂量Naringin（20mg/kg）组、糖尿病+中剂量Naringin（40mg/kg）组、糖尿病+高剂量Naringin（80mg/kg）组,每组各6只大鼠。糖尿病模型组大鼠造模前12h禁食,不禁水,以65mg/kg链脲佐菌素（Streptozotocin,STZ）腹腔注射。第3d和第5d测量大鼠空腹血糖,两次血糖≥16.7mmol/L的大鼠用于后续实验。高剂量Naringin（80mg/kg）组,糖尿病+低剂量Naringin（20mg/kg）组,糖尿病+中剂量Naringin（40mg/kg）组,糖尿病+高剂量Naringin（80mg/kg）组中的大鼠每天经腹腔注射相应剂量的Naringin,对照组和糖尿病组中的大鼠给予等体积的生理盐水,连续注射12周。每隔2周监测大鼠的体重和血糖。12周造模期结束时,隔夜禁食,测量各组大鼠的体重及血糖,明确Naringin对糖尿病大鼠体重和血糖的影响。各组大鼠腹腔注射3.5ml/kg（10%）水合氯醛麻醉大鼠,下腔静脉取血后大鼠自然死亡,然后取视网膜组织,将其固定于10%中性甲醛溶液中。石蜡包埋,组织学切片。行HE染色,IPP（Image Pro Plus 6.0）测量视网膜神经节细胞层厚并计数细胞数量,分析Naringin对视网膜神经节细胞的影响。行免疫荧光检测,分析各组GFAP表达的变化,揭示Naringin对DR中Müller细胞的影响。将购自齐氏生物的rMC-1（冻存）,复苏后接种于含DEME、Ham’s F-12.5%小牛血清和0.5mg/ml庆大霉素的培养基中,置于37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱内进行培养,待细胞密度达70-80%,换用低血清培养基进行培养,生长至对数期。将rMC-1培养至密度为90%左右,进行细胞计数,接种于3块96孔培养板中,每孔的细胞个数为3×103个,每组设计5个复孔,单次实验重复3次以上。细胞给药时培养基血清浓度降为0.2%,接种后置于37℃、5%CO2培养箱中按如下分组细胞:对照组,高糖组,高糖组+1μM Naringin组,高糖组+5μM Naringin组,高糖组+10μM Naringin组,高糖组+25μM Naringin组,高糖组+50μM Naringin组,高糖组+100μM Naringin组,分别在培养24h、48h、72h后进行MTT实验,筛选最佳的柚皮苷使用浓度和细胞培养时间进行后续实验。实验设置为:空白对照组,Naringin组,高糖诱导组（高糖组）,高糖诱导+Naringin组（高糖+Naringin组）。高糖组和高糖+Naringin组的细胞采用25mM葡萄糖进行诱导,高糖+Naringin组细胞在高糖诱导前加入最佳使用浓度的Naringin预处理2h,继续培养至最佳细胞培养时间。抽提并定量细胞中总蛋白质,样品用于后续实验。应用试剂盒检测样品中超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase,SOD）、过氧化氢酶（Cata-lase,CAT）及谷胱甘肽（Glutathione,GSH）的变化情况,分析Naringin对高糖诱导的rMC-1中氧化应激的影响。ELISA法测量各组细胞上清液中白细胞介素-1β（Interleukin-1β,IL-1β）、白细胞介素-6（Interleukin-6,IL-6）及肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor-α,TNF-α）的表达情况,明确Naringin对高糖诱导的rMC-1炎症反应的影响。取动物实验中组织学切片的第Ⅲ套,进行免疫组化法,明确NF-KB p65在各组大鼠视网膜组织中是否有表达。将细胞实验中的各组细胞进行免疫荧光检测,观察NF-κB p65在各组rMC-1中核移位情况,分别提取并定量rMC-1的核蛋白和胞浆蛋白,进行Western Blot检测,明确NF-κB p65在各组rMC-1胞核和胞浆表达的变化,进一步揭示NF-κB通路是Naringin干预DR的可能机制。结果:1.Naringin对各组大鼠体重及血糖的影响:经给药12W后,高剂量Naringin组大鼠的体重和血糖与对照组比较,无统计学差异（P>0.05）。糖尿病模型组（糖尿病组及糖尿病+低、中、高剂量Naringin组）大鼠与对照组比较,体重明显减轻,血糖明显升高（P<0.01）。糖尿病+低剂量Naringin组大鼠与糖尿病组比较,体重和血糖均无统计学差异（P>0.05）。随着Naringin使用剂量的增加,糖尿病+中剂量Naringin组大鼠与糖尿病组比较,体重增加（P<0.05）,血糖降低（P<0.05）。糖尿病+高剂量Naringin组大鼠与糖尿病组比较,体重明显增加（P<0.01）;血糖降低（P<0.05）。糖尿病+高剂量Naringin组大鼠与糖尿病+低剂量Naringin组比较,体重增加（P<0.05）,血糖降低（P<0.05）。2.Naringin对视网膜神经节细胞的影响:给药12W后,高剂量Naringin组大鼠视网膜神经节细胞层厚和细胞数与对照组比较,无统计学差异（P>0.05）。糖尿病组、糖尿病+低、中剂量Naringin组与对照组比较,视网膜神经节细胞层厚和细胞数均明显减少（P<0.01）,而糖尿病+高剂量Naringin组与对照组比较,视网膜神经节细胞层厚和细胞数减少并不明显（P<0.05）。随着Naringin使用剂量的增加,糖尿病+低剂量Naringin组的视网膜神经节细胞层厚和细胞数与糖尿病组比较,无统计学差异（P>0.05）。糖尿病+中剂量Naringin组与糖尿病组比较,视网膜神经节细胞层厚增加（P<0.05）,细胞数无统计学意义（P>0.05）;但糖尿病+高剂量Naringin组与糖尿病组比较,视网膜神经节细胞层厚明显增加（P<0.01）,细胞数增多（P<0.05）;糖尿病+高剂量Naringin组与糖尿病+低剂量Naringin组比较,视网膜神经节细胞层厚和细胞数均增加（P<0.05）。3.Naringin对视网膜Müller细胞的影响:给药12周后,对照组和高Naringin组,在神经纤维层及神经节细胞层可见GFAP阳性红色荧光染色,荧光均较弱。糖尿病组,在神经纤维层、神经节细胞层以及内网状层内GFAP荧光强度均明显增强,长长的突起呈丝状荧光甚至贯穿内外核层,表现为Müller细胞样贯穿视网膜全层的趋势。糖尿病+低、中、高剂量Naringin组与糖尿病组比较,GFAP荧光强度不同程度减弱,而以糖尿病+高剂量Naringin组减弱最明显。4.MTT实验检测rMC-1增殖活力:各组间rMC-1培养24h后细胞增殖活力比较,无统计学差异（P>0.05）。培养48h和72h后,高糖组与对照组比较,rMC-1增殖活力明显增强（P<0.01）,而随着Naringin使用剂量的增加,对rMC-1增殖活力的抑制作用就越强。其中培养48h后,高糖+Naringin（50μM）、高糖+Naringin（100μM）组与高糖组比较,rMC-1增殖活力明显降低（P<0.01）。培养72h后,高糖+Naringin（1μM、5μM、10μM）组与高糖组比较,rMC-1增殖活力降低（P<0.05）;而高糖+Naringin（25μM、50μM、100μM）组与高糖组比较,rMC-1增殖活力均明显降低（P<0.01）。如此得出:培养48h时,与高糖组比较,相邻的高糖+Naringin（25μM）组rMC-1增殖活力未见增强或降低（P>0.05）,而高糖+Naringin（50μM）组rMC-1增殖活力明显降低（P<0.01）,因此筛选Naringin最佳使用浓度为50μM,最佳的细胞培养时间为:48h,用于后续细胞实验。5.Naringin对高糖诱导的rMC-1氧化应激的影响:Naringin组中rMC-1蛋白质中SOD、CAT和GSH的表达与对照组比较,无统计学差异（P>0.05）。高糖组与对照组比较,SOD、CAT和GSH表达明显减少（P<0.01）。而高糖+Naringin组与高糖组比较,GSH、SOD及CAT的表达增多（P<0.05）。6.Naringin对高糖诱导的rMC-1炎症反应的影响:Naringin组rMC-1上清液中TNF-α、IL-1β和IL-6的表达与对照组比较,无统计学差异（P>0.05）。高糖组与对照组比较,TNF-α、IL-1β和IL-6表达明显增多（P<0.01）。而高糖+Naringin组与高糖组比较,TNF-α、IL-1β和IL-6的表达减少（P<0.05）。7.免疫组化法,明确NF-κB p65在各组大鼠视网膜组织中是否有表达:NF-κB p65在对照组和高剂量Naringin组视网膜组织的胞核和胞浆中仅有少量表达。而在糖尿病模型组（糖尿病组及糖尿病+低、中、高剂量Naringin组）视网膜神经纤维层、神经节细胞层及内网状层的胞核和胞浆中均呈颗粒状,棕黄色表达。其中以糖尿病组表达最明显,而随着Naringin使用剂量的增加,其表达逐渐减弱。8.免疫荧光法,观察NF-κB p65在各组rMC-1中核转位情况。结果显示,NF-κB p65在对照组和Naringin组rMC-1中主要表现为胞浆表达;在高糖组rMC-1中,NF-κB p65胞浆表达减少,而核表达明显增多;高糖+Naringin组与高糖组比较,NF-κB p65胞浆表达增多,核表达减少。9.Western Blot明确NF-κB p65在各组rMC-1胞核和胞浆表达的变化:NF-κB p65核表达结果显示:NF-κB p65在对照组和Naringin组rMC-1的核表达量均较低,差异无统计学意义（P>0.05）;高糖组中,NF-κB p65的核表达量较对照组明显增多（P<0.01）;高糖+Naringin组与高糖组比较,NF-κB p65的核表达量减少（P<0.05）。胞浆表达结果显示:NF-κB p65在对照组和Naringin组rMC-1的胞浆表达量均较高,差异无统计学意义（P>0.05）;高糖组中,NF-κB p65的胞浆表达量较对照组明显减少（P<0.01）;高糖+Naringin组与高糖组比较,NF-κB p65的胞浆表达量增多（P<0.05）。结论:1.高剂量Naringin对正常大鼠的体重,血糖,视网膜神经节细胞及Müller细胞均无毒副作用,但可以使1型糖尿病大鼠的体重增加,血糖降低,抑制Müller细的增殖活化,保护视网膜神经节细胞,并且随着Naringin使用剂量的增多,这种保护性作用越明显。2.Naringin对正常的rMC-1无毒副作用,但可以上调高糖诱导的rMC-1中抗氧化酶SOD、CAT及GSH的活性,降低炎症因子IL-1β、IL-6及TNF-α的过表达,从而抑制高糖诱导的rMC-1的过度角质化,对早期干预治疗DR起到积极作用。3.单纯的Naringin对正常大鼠的视网膜组织中NF-κB p65的表达无影响,对正常的Müller细胞中胞核和胞浆的表达也无影响;但可以下调糖尿病组视网膜组织中NF-κB p65的表达,抑制NF-κB p65在高糖诱导rMC-1中的核转位,从而降低核表达。提示NF-κB通路参与了Naringin对DR的保护性作用。
苏吉儿[10]（2013）在《Müller细胞反应性胶质化在急性高眼压致大鼠视网膜损伤中作用》文中研究指明青光眼是一种常见的致盲性眼病，其病理基础是视网膜神经节细胞（RGCs）及其神经纤维的丧失。多种因素与其发病有关，其中病理性高眼压可以造成视网膜的缺血低氧性损伤并导致RGCs最终主要以凋亡的形式丢失。RGCs凋亡在青光眼的病理损害中起重要作用，因此研究具有抗凋亡作用的RGCs保护药物，对青光眼的防治有重要意义。视网膜Müller细胞是视网膜内最主要的神经胶质细胞，不仅起着支持和营养神经元的作用，还有维持细胞外离子的稳定及参与谷氨酸盐循环、突触传递等作用。此外，Müller细胞参与RGCs的代谢、内环境稳态以及神经递质的运输、摄取，因此它在RGCs的生长、损伤、修复和再生中都起到重要的作用。最新研究发现，Müller细胞参与多种病理和生理过程，并且在视网膜的多种疾病中都发现Müller细胞的活化，即反应性胶质化（Reactivegliosis）。中间丝蛋白胶质细胞纤维酸性蛋白（GFAP）高表达致胞体肥大是Müller细胞活化最主要的特征性改变。本实验利用前房灌注升高眼内压的方法建立急性高眼压（AOH）动物模型，探讨视网膜Müller细胞在急性高眼压大鼠视网膜中的活化情况，以及抑制其反应性胶质化对高眼压视网膜的影响，为青光眼患者神经保护的治疗提供实验依据。实验在室温20-22oC下进行，选用成年雄性SD大鼠（8-10W,200-250g），动物实验操作遵循美国视觉与眼科学研究会（ARVO）有关眼科和视觉科学实验动物使用规范，并得到首都医科大学动物管理委员会的许可。所用药物为胶质毒素α-氨基己二酸（AAA），给药方式是玻璃体内注射5μl （50μg/μl），其能选择性抑制Müller细胞反应性胶质化。实验动物分组如下：正常对照组（Ctrl）、急性高眼压（AOH，14.63kPa）1h后再灌注1、3和5d组、急性高眼压+给药（AOH+AAA）后再灌注1、3和5d组、单纯AAA给药及AOH+PBS对照组。造模后不同时间点，GFAP免疫荧光染色观察Müller细胞反应性胶质化程度，TdT介导的dUTP缺口末端标记（TUNEL）染色检测细胞凋亡情况，Thy-1染色标记视网膜RGCs细胞，蛋白免疫印迹（Western blot）方法检测视网膜肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的蛋白表达水平。实验数据使用单一因素方差分析（One way ANOVA）和Bonferroni显着性检验进行统计学处理，数值以均数±标准误（X±SEM）表示，其中p<0.05为差异显着。实验结果如下：1. AOH对大鼠视网膜的影响应用Hochest荧光染料标记视网膜内细胞核的结果表明，AOH（14.63kPa,1h）后再灌注1、3和5d组大鼠眼视网膜内丛状层（IPL）和内核层（INL）均显着变薄，且随再灌时间延长，损伤加重（P<0.05,每组n=4）。同时，再灌注3和5d组神经节细胞层（GCL）和INL细胞排列紊乱，GCL细胞核数目明显减少。GFAP免疫组化检测结果示，正常大鼠视网膜内Müller细胞不表达或很少表达GFAP；AOH后再灌注1d，Müller细胞开始表达GFAP，再灌注3-5d后，视网膜内Müller细胞GFAP表达增加显着，甚至贯穿视网膜全层（P<0.05,每组n=4）。结果提示，AOH确实引起视网膜损伤，并诱发Müller细胞反应性胶质化，即急性闭角型青光眼造模成功。2. AAA对AOH鼠视网膜内Müller细胞反应性胶质化的影响与AOH组相应再灌注时间点相比，应用玻璃体内注射AAA（5μl,50μg/μl）抑制Müller细胞反应性胶质化，即AOH+AAA组，可明显抑制视网膜Müller细胞内GFAP的表达（P<0.05,每组n=4），但对GFAP在星形胶质细胞的表达没有明显影响。此外，AOH+PBS组视网膜内GFAP的表达与高眼压组相近，排除了溶剂干扰。结果提示，AAA确实可以选择性抑制AOH鼠视网膜内Müller细胞反应性胶质化的发生。3. AAA对AOH鼠视网膜损伤的影响与Ctrl和单纯AAA组（未见凋亡细胞）相比，AOH可引起视网膜GCL层凋亡细胞（TUNEL阳性）显着增加，而AOH+AAA组凋亡细胞数明显减少（P<0.05,每组n=4）。与Ctrl组相比，AOH引起视网膜内RGCs细胞（Thy-1阳性）大量丢失，而AOH+AAA组RGCs的丢失有所减轻（P<0.05,每组n=4）。应用Hochest染色观察视网膜形态，AOH+AAA组缓解了AOH所引起的视网膜厚度变薄、细胞核排列紊乱及视网膜GCL层细胞数目的减少。结果提示，应用AAA抑制Müller细胞反应性胶质化的发生，可对AOH鼠视网膜起到保护作用。4.抑制Müller细胞反应性胶质化对AOH鼠视网膜内TNF-α表达的影响Western blot结果表明，AOH处理后5d，视网膜内TNF-α蛋白的表达量明显高于Ctrl组，而AOH+AAA组视网膜内TNF-α蛋白表达水平较AOH组显着降低（P<0.05,每组n=4）。同时，AOH+PBS组视网膜内TNF-α蛋白的表达水平与AOH组相近，即可排除溶剂干扰。结果提示，AAA抑制Müller细胞反应性胶质化可能是通过降低视网膜内TNF-α蛋白的表达，来减少其对RGCs细胞的毒性作用，从而促进神经节细胞的存活。综上所述，我们的研究结果表明，Müller细胞反应性胶质化参与了AOH所致视网膜损伤，应用AAA抑制Müller细胞反应性胶质化可降低视网膜内TNF-α蛋白的表达水平，从而有效保护高眼压视网膜。所获成果丰富了人们对AOH致视网膜损伤的分子机制，同时为临床改善急性闭角型青光眼视网膜病变提供了一种有效治疗方法。
二、甲泼尼龙对大鼠视网膜激光损伤中Müller细胞胶质纤维酸性蛋白和增生细胞核抗原表达的影响（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、甲泼尼龙对大鼠视网膜激光损伤中Müller细胞胶质纤维酸性蛋白和增生细胞核抗原表达的影响（论文提纲范文）
（1）通腑逐瘀法指导下抵当汤加减调控AQP4表达治疗大鼠急性脊髓损伤的作用机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 自制脊髓打击器与NYU打击器建立脊髓损伤模型研究 |
| 1.目的 |
| 2.材料和方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 5.小结 |
| 6.不足和展望 |
| 第二部分 抵当汤加减调节AQP4 表达对SCI大鼠脊髓水肿的作用研究 |
| 1.目的 |
| 2.材料 |
| 3.方法 |
| 4.实验结果 |
| 5.讨论 |
| 6.小结 |
| 7.不足与展望 |
| 第三部分 抵当汤加减含药血清对反应性星形胶质细胞的活化、迁移及神经生长相关细胞因子分泌的作用 |
| 1.目的 |
| 2.材料 |
| 3.实验方法 |
| 4.实验结果 |
| 5.讨论 |
| 6.小结 |
| 7.不足和展望 |
| 本研究的创新点 |
| 参考文献 |
| 附件 |
| 附件1 自制简易打击器与NYU打击器 |
| 附件2 脊髓打击损伤模型 |
| 附录3 BBB评分 |
| 附录4 Reuter评分 |
| 附录5 综述 水通道蛋白在急性脊髓损伤中的作用机制 |
| References |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（2）甲泼尼龙对视神经夹伤模型小鼠视网膜神经节细胞的保护作用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 视觉系统与视网膜神经节细胞 |
| 1.2 视神经损伤及再生研究进展 |
| 1.2.1 视网膜损伤的研究进展 |
| 1.2.2 视神经损伤研究进展 |
| 1.2.3 视网膜及视神经再生的研究进展 |
| 1.3 中枢神经系统中的胶质细胞 |
| 1.3.1 正常生理条件下星形胶质细胞的形态特征及功能 |
| 1.3.2 中枢神经系统损伤后星型胶质细胞的反应 |
| 1.3.3 正常生理条件下小胶质细胞的形态特征及功能 |
| 1.3.4 中枢神经系统损伤后小胶质细胞的反应 |
| 1.3.5 视网膜中特殊的胶质细胞 |
| 1.4 甲泼尼龙的研究进展 |
| 1.5 研究目的及意义 |
| 第二章 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 实验试剂及溶液配制 |
| 2.1.3 实验主要仪器及耗材 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 小鼠视神经夹伤模型的建立 |
| 2.2.2 甲泼尼龙药物处理模型的建立 |
| 2.2.3 形态学组织样品制备 |
| 2.2.4 小鼠视网膜组织石蜡切片及H-E染色 |
| 2.2.5 小鼠视网膜组织冰冻切片及免疫荧光染色 |
| 2.2.6 小鼠视网膜铺片免疫荧光染色 |
| 2.2.7 小鼠视网膜组织冰冻切片免疫组化染色 |
| 2.2.8 小鼠视神经冰冻切片及甲苯胺蓝染色 |
| 2.2.9 T-SOD、MDA检测 |
| 2.2.10 荧光实时定量PCR检测星形胶质细胞相关因子表达量 |
| 2.2.11 原代视网膜星型胶质细胞培养 |
| 2.2.12 细胞样品取材 |
| 2.2.13 细胞免疫荧光染色 |
| 2.2.14 MTT法检测细胞活力 |
| 2.3 数据统计及分析 |
| 第三章 实验结果 |
| 3.1 甲泼尼龙药物浓度筛选 |
| 3.1.1 不同浓度的甲泼尼龙对视神经夹伤小鼠RGC的保护作用 |
| 3.1.2 不同浓度甲泼尼龙对视神经夹伤后小鼠视网膜结构变化的影响 |
| 3.1.3 甲泼尼龙对于小鼠视神经夹伤后视神经轴突排列的影响 |
| 3.2 甲泼尼龙对视神经夹伤后CNS免疫细胞的影响 |
| 3.2.1 甲泼尼龙对小鼠视神经夹伤后视网膜星形胶质细胞数目的影响 |
| 3.2.2 甲泼尼龙对小鼠视神经夹伤后视网膜小胶质细胞数目的影响 |
| 3.2.3 甲泼尼龙与小鼠视神经夹伤后星形胶质细胞相关因子表达量的关系 |
| 3.3 甲泼尼龙对小鼠视神经夹伤后氧化应激反应的影响 |
| 3.4 原代培养视网膜星形胶质细胞纯度鉴定 |
| 3.5 甲泼尼龙对小鼠视网膜星形胶质细胞活力的影响 |
| 3.6 甲泼尼龙对激活星形胶质细胞的影响 |
| 3.6.1 甲泼尼龙对糖剥夺条件培养下视网膜星形胶质细胞活力的影响 |
| 3.6.2 甲泼尼龙对糖剥夺条件培养下视网膜星型胶质细胞形态的影响 |
| 第四章 讨论与结论 |
| 4.1 讨论 |
| 4.1.1 GC的使用剂量和给药方式 |
| 4.1.2 GC的抑炎作用 |
| 4.1.3 GC与氧化应激 |
| 4.1.4 GC与星形胶质细胞 |
| 4.2 主要结论 |
| 4.3 研究展望 |
| 参考文献 |
| 附录 缩略词表 |
| 在学期间的研究成果 |
| 致谢 |
（3）中西医协同治疗视神经脊髓炎相关性视神经炎的应用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一 视神经脊髓炎相关性视神经炎实验模型的建立及应用研究进展 |
| 1 前言 |
| 2 动物实验模型 |
| 3 离体组织实验模型 |
| 4 细胞实验模型 |
| 5 结语 |
| 参考文献 |
| 综述二 视神经脊髓炎谱系疾病发病相关抗体的研究进展 |
| 1 NMO概述 |
| 2 AQP4-IgG |
| 3 MOG-IgG |
| 4 GFAP抗体 |
| 5 AQP1-IgG |
| 6 其他相关性抗体 |
| 7 结语 |
| 参考文献 |
| 综述三 细胞因子与视神经脊髓炎谱系疾病 |
| 1 前言 |
| 2 Th17细胞相关的细胞因子 |
| 3 Th2细胞相关细胞因子 |
| 4 Treg细胞相关细胞因子 |
| 5 其他细胞因子 |
| 6 结语 |
| 参考文献 |
| 综述四 非侵入性电刺激在眼科应用的研究进展 |
| 1 前言 |
| 2 经角膜电刺激 |
| 3 经眼眶电刺激 |
| 4 经眼睑电刺激 |
| 5 结语 |
| 参考文献 |
| 第二部分 临床研究视神经脊髓炎相关性视神经炎患者临床特点及疗效分析 |
| 研究背景 |
| (一) 视神经脊髓炎相关性视神经炎患者的临床特点分析 |
| 1 研究方案 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 诊断标准 |
| 1.3 纳入标准 |
| 1.4 排除标准 |
| 1.5 临床评估 |
| 1.6 统计方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 一般资料 |
| 2.2 临床特点 |
| 2.3 实验室检查 |
| 2.4 影像学特点 |
| (二) 针刺联合中药治疗NMO所致视神经萎缩的临床疗效 |
| 1 临床资料 |
| 1.1 视神经萎缩诊断标准 |
| 1.2 纳入标准 |
| 1.3 排除标准 |
| 2 治疗方案 |
| 3 疗效指标 |
| 3.1 最佳矫正视力 |
| 3.2 动态视野 |
| 3.3 统计学分析 |
| 4 结果 |
| 4.1 NMO视神经萎缩患者一般资料 |
| 4.2 临床表现 |
| 4.3 治疗前后最佳矫正视力比较 |
| 4.4 针刺治疗前后动态视野变化 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 实验研究 视神经脊髓炎相关视神经炎大鼠模型的构建与评价 |
| 研究背景 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验用动物及患者血清 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 实验仪器 |
| 1.4 实验方案 |
| 1.5 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 模型诱导后视神经内AQP4-IgG的沉积 |
| 2.2 大鼠视神经功能学变化 |
| 2.3 视神经光镜观察结果 |
| 2.4 视神经LFB染色结果 |
| 2.5 脊髓光镜观察结果 |
| 2.6 脊髓组织形态LFB染色结果 |
| 2.7 大脑光镜及HE染色观察结果 |
| 2.8 视网膜的光镜观察结果 |
| 2.9 视神经电镜超微结构观察 |
| 2.10 视神经NFL免疫荧光结果 |
| 2.11 视神经内CD68免疫荧光结果 |
| 3 讨论 |
| 3.1 NMO-ON动物模型构建国内外进展 |
| 3.2 本研究的主要结果与未来展望 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 第四部分 实验研究 调肝活络法治疗视神经脊髓炎相关性视神经炎的疗效及机制探究 |
| 研究背景 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验用动物及血清 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 实验仪器 |
| 1.4 实验方法 |
| 1.5 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 大鼠视神经F-VEP变化 |
| 2.2 大鼠视神经PLR变化 |
| 2.3 大鼠视网膜Brn3a变化 |
| 2.4 大鼠视神经形态学变化(HE染色) |
| 2.5 大鼠视神经超微结构变化(电镜) |
| 2.6 大鼠视神经组织免疫荧光染色结果 |
| 2.7 Western Blotting法检测视神经内目标蛋白阳性表达结果 |
| 3 讨论 |
| 3.1 NMO-ON的中西医防治现状 |
| 3.2 NMO-ON发病机制研究进展 |
| 3.3 调肝活络防治NMO-ON的疗效及潜在机制 |
| 4 结论 |
| 5 本研究主要创新、局限及未来展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在读期间主要研究成果 |
（4）miR-127-5p靶向抑制GLUL调控视网膜Müller细胞活性在特发性黄斑前膜中的作用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 背景 |
| 1.黄斑前膜简介 |
| 2.黄斑前膜致病机制研究现状 |
| 3.miRNA在黄斑前膜致病机制中的作用 |
| 第一部分 miR-127-5p在特发性黄斑前膜玻璃体中的表达水平及意义 |
| 前言 |
| 实验材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 miR-127-5p调控大鼠视网膜Müller细胞增殖、侵袭、迁移及凋亡行为 |
| 前言 |
| 实验材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 miR-127-5p调控大鼠视网膜Müller细胞活性作用机制的研究 |
| 前言 |
| 实验材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 Müller细胞的功能及在常见视网膜病变的作用机制 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 |
| 攻读学位期间发表的文章 |
| 致谢 |
（5）外泌体负载内源性神经保护肽在外伤性视神经病变中的治疗作用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、外伤性视神经病变模型的构建与探究 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 实验动物、主要仪器 |
| 1.1.2 实验试剂、耗材 |
| 1.1.3 实验方法 |
| 1.1.4 统计学方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 大鼠视神经钳夹伤模型的建立 |
| 1.2.2 不同损伤冲量下RNFL厚度的体内分析 |
| 1.2.3 不同损伤冲量下RNFL密度的体外分析 |
| 1.2.4 不同损伤冲量下RGC数目的存活 |
| 1.2.5 不同损伤冲量下RNFL与RGC的联系 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 二、外泌体负载内源性神经保护肽在外伤性视神经病变治疗中的研究 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.1.1 实验动物、主要仪器 |
| 2.1.2 实验试剂、耗材 |
| 2.1.3 实验方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 构建并筛选高效负载神经肽PACAP38的“外泌体-肽”系统 |
| 2.2.2 EXO_(RGC)-PACAP38系统在TON治疗中的研究 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 综述 外伤性视神经损伤与治疗的研究现状 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（6）δ-阿片受体在电针治疗大鼠脑缺血伴随的视网膜损伤中的作用及其相关机制的研究（论文提纲范文）
| 缩略语对照表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一部分 常用大鼠脑缺血模型对视网膜损伤的比较研究 |
| 前言 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要实验仪器与设备 |
| 1.3 主要实验材料与试剂 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 技术路线 |
| 2.2 实验用品及试剂的准备 |
| 2.3 大鼠开颅阻断法脑缺血再灌注模型 |
| 2.4 大鼠线栓阻断法脑缺血再灌注模型 |
| 2.5 SD大鼠2VO模型 |
| 2.6 Wistar大鼠2VO模型 |
| 2.7 4VO连续阻断法大鼠全脑缺血模型 |
| 2.8 4VO间断阻断法大鼠全脑缺血模型 |
| 2.9 术后检测指标 |
| 2.10 大鼠脑及视神经样本组织病理学检查 |
| 2.11 大鼠眼离体样本组织病理学检查与视网膜图像分析 |
| 2.12 数据统计处理 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 大鼠生存状况比较 |
| 3.2 大鼠瞳孔对光反射比较 |
| 3.3 大鼠前肢抓力检测结果比较 |
| 3.4 明暗箱检测结果比较 |
| 3.5 Y迷宫检测结果比较 |
| 3.6 大鼠脑组织病理学检查结果比较 |
| 3.7 大鼠视神经组织病理学检查结果比较 |
| 3.8 大鼠眼离体样本组织病理学检查结果比较 |
| 4 讨论 |
| 4.1 开颅阻断法模型 |
| 4.2 线栓阻断法模型 |
| 4.3 SD大鼠2VO模型 |
| 4.4 Wistar大鼠2VO模型 |
| 4.5 4VO连续阻断模型 |
| 4.6 4VO间断阻断模型 |
| 5 小结 |
| 第二部分 δ-阿片受体在电针治疗大鼠脑缺血伴随的视网膜损伤中的作用研究 |
| 前言 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要实验仪器及设备 |
| 1.3 主要实验材料和试剂 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 技术路线 |
| 2.2 实验用品及试剂的准备 |
| 2.3 电针治疗大鼠脑缺血伴随的视网膜损伤的研究 |
| 2.4 术后检测指标 |
| 2.5 大鼠脑组织病理学检查 |
| 2.6 大鼠眼离体样本组织病理学检查与视网膜图像分析 |
| 2.7 数据统计处理 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 大鼠生存状况观察及神经功能评分 |
| 3.2 大鼠瞳孔对光反射检查 |
| 3.3 大鼠脑组织病理学检查 |
| 3.4 大鼠眼离体样本组织病理学检查与视网膜图像分析 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 文献综述 两血管阻断法致大鼠脑慢性灌注不足模型的研究综述 |
| 参考文献 |
| 已发表及待发表论文 |
（7）补肾活血方对AGEs/缺氧条件下视网膜Müller细胞PEDF及相关因子的影响（论文提纲范文）
| 中英文缩略词表 |
| 一. 引言 |
| 二.材料与方法 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 纯化培养SD大鼠原代视网膜Müller细胞所用主要试剂及仪器 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 SD大鼠视网膜Müller细胞原代纯化培养方法(图片F-K) |
| 2.2 鉴定SD大鼠视网膜Müller细胞 |
| 2.3 视网膜Müller细胞生长情况及鉴定结果 |
| 2.4 补肾活血方中药含药血清制备方法(见图A-E) |
| 2.5 实验分组方法 |
| 2.6 VEGF、PEDF、IL-1β 的检测 |
| 三. 结果 |
| 1.补肾活血中药血清对视网膜Müller细胞PEDF表达量的影响 |
| 1.1 AGEs/缺氧条件对视网膜Müller细胞PEDF表达量的影响(表 7) |
| 1.2 补肾活血中药血清对正常条件视网膜Müller细胞PEDF表达量的影响(表 8) |
| 1.3 补肾活血中药血清对缺氧条件视网膜Müller细胞PEDF表达量的影响(表 9) |
| 1.4 补肾活血中药血清对AGEs条件下视网膜Müller细胞的PEDF表达量的影响(表 10、11) |
| 2. AGEs/缺氧条件对视网膜Müller细胞VEGF表达量的影响 |
| 2.1 AGEs/缺氧条件对视网膜Müller细胞VEGF表达量的影响(表 12) |
| 2.2 补肾活血中药血清对正常条件下视网膜Müller细胞VEGF表达量的影响(表 13) |
| 2.3 补肾活血中药血清对缺氧条件下视网膜Müller细胞VEGF表达量的影响(表 14) |
| 2.4 补肾活血中药血清对AGEs条件下视网膜Müller细胞VEGF表达量的影响(表 15、16) |
| 3. 补肾活血中药血清对视网膜Müller细胞IL-1β 表达量的影响 |
| 3.1 AGEs/缺氧条件对视网膜Müller细胞IL-1β 表达量的影响(表 17) |
| 3.2 补肾活血中药血清对正常条件视网膜Müller细胞IL-1β 表达量的影响(表 18) |
| 3.3 补肾活血中药血清对缺氧条件视网膜Müller细胞IL-1β 表达量的影响(表 19) |
| 3.4 补肾活血方对AGEs条件下视网膜Müller细胞IL-1β 表达量的影响(表 20、21) |
| 4. VEGF及PEDF比值 |
| 5. 各指标相关性分析 |
| 四. 讨论 |
| 1.补肾活血方的立题依据 |
| 2 研究指标的选择 |
| 3.视网膜Müller细胞体外纯化培养的方法选择 |
| 4.补肾活血方对AGEs、缺氧条件下视网膜Müller细胞PEDF蛋白表达量的影响及机理探讨 |
| 5.补肾活血中药血清对AGEs/缺氧条件下视网膜Müller细胞分泌VEGF的影响及机理探讨 |
| 6.补肾活血方对AGEs、缺氧条件下视网膜Müller细胞分泌 1L-1β的影响及机理探讨 |
| 7.补肾活血方对视网膜Müller细胞VEGF/PEDF比值及相关性的影响及机理探讨 |
| 五.结论 |
| 六.创新点 |
| 七.问题与展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附件 1 |
| 附件 2 |
| 参考文献 |
| 附件 3 在读期间公开发表的学术论文、专着及科研成果 |
（8）hEROs来源视网膜祖细胞治疗视网膜色素变性的作用及其机制研究（论文提纲范文）
| 主要英文缩略词表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 hEROs来源C-Kit~+/SSEA4~-RPCs的生物学特性研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 hEROs来源 C-Kit~+/SSEA4~-RPCs移植治疗视网膜色素变性的临床前研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 hEROs来源C-Kit~+/SSEA4~-RPCs移植治疗视网膜色素变性的机制研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 视网膜疾病微环境和移植干细胞相互作用 |
| 参考文献 |
| 研究生期间发表文章及成果 |
| 致谢 |
（9）柚皮苷对糖尿病视网膜病变的保护作用及机制研究（论文提纲范文）
| 中文论着摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 论文一 Naringin对大鼠DR的作用研究前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 论文二 Naringin对高糖诱导的r MC-1 的作用研究前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 论文三 Naringin抵抗DR损伤的可能机制前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 柚皮苷治疗糖尿病视网膜病变的机制研究 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
| 在学期间科研成绩 |
| 致谢 |
（10）Müller细胞反应性胶质化在急性高眼压致大鼠视网膜损伤中作用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 实验材材与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 主要参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 附录：英文缩写词表 |
| 攻读学位期间发表文章情况 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
四、甲泼尼龙对大鼠视网膜激光损伤中Müller细胞胶质纤维酸性蛋白和增生细胞核抗原表达的影响（论文参考文献）
- [1]通腑逐瘀法指导下抵当汤加减调控AQP4表达治疗大鼠急性脊髓损伤的作用机制研究[D]. 吴子健. 湖北中医药大学, 2021(01)
- [2]甲泼尼龙对视神经夹伤模型小鼠视网膜神经节细胞的保护作用[D]. 陈临池. 兰州大学, 2021(09)
- [3]中西医协同治疗视神经脊髓炎相关性视神经炎的应用研究[D]. 韩梦雨. 北京中医药大学, 2021(01)
- [4]miR-127-5p靶向抑制GLUL调控视网膜Müller细胞活性在特发性黄斑前膜中的作用研究[D]. 易全勇. 苏州大学, 2020(06)
- [5]外泌体负载内源性神经保护肽在外伤性视神经病变中的治疗作用研究[D]. 王甜. 天津医科大学, 2020(06)
- [6]δ-阿片受体在电针治疗大鼠脑缺血伴随的视网膜损伤中的作用及其相关机制的研究[D]. 孙伟. 上海中医药大学, 2019(03)
- [7]补肾活血方对AGEs/缺氧条件下视网膜Müller细胞PEDF及相关因子的影响[D]. 卢静. 成都中医药大学, 2019(04)
- [8]hEROs来源视网膜祖细胞治疗视网膜色素变性的作用及其机制研究[D]. 邹婷. 中国人民解放军陆军军医大学, 2019(03)
- [9]柚皮苷对糖尿病视网膜病变的保护作用及机制研究[D]. 刘丽华. 辽宁中医药大学, 2017(05)
- [10]Müller细胞反应性胶质化在急性高眼压致大鼠视网膜损伤中作用[D]. 苏吉儿. 首都医科大学, 2013(05)