一、CD40-CD40配体相互作用对人脐静脉内皮细胞组织因子、基质金属蛋白酶及其抑制物表达的影响（论文文献综述）
窦曼曼[1]（2021）在《TSP-1/CD47信号通路调节动脉粥样硬化易损斑块的稳定性及其相关调控机制研究》文中认为背景:脑血管疾病在当代社会中是一个普遍存在的疾病,在人群中有着高发病率、高致残率和高死亡率的特点。而动脉粥样硬化是导致脑血管疾病的主要原因,动脉粥样硬化是一个慢性炎症过程,其发展过程包括脂质在血管壁的沉积、血管内皮细胞功能障碍、血管平滑肌细胞向内膜的迁移和增殖、炎症细胞在病变血管的聚集和泡沫细胞的形成。动脉粥样硬化斑块主要包括稳定斑块和不稳定斑块,即易损斑块。斑块结构包括脂质核心、纤维帽、胆固醇结晶、新生血管和细胞外基质。斑块内脂质核心的坏死,细胞外基质降解,纤维帽变薄破裂,新生血管生成都可以导致动脉粥样硬化斑块的易损性,使斑块破裂,引发血栓形成、脑卒中等脑血管疾病。目的:通过研究TSP-1/CD47/VEGF/VEGFR2信号通路对动脉粥样硬化（atherosclerosis,AS）中易损斑块新生血管的负性调控作用,包括下调VEGF的表达及VEGFR2下游磷酸化,进而抑制新生血管生成,从而讨论TSP-1/CD47信号通路在动脉粥样硬化斑块中的作用及其之间的调控机制。方法:给予8周龄载脂蛋白E缺陷（apoE-/-）雄鼠高脂喂养,取不同时间点（sham组、4周、8周、10周、12周）apoE-/-雄鼠的腹主动脉,观察其油红染色中脂质成分含量、蛋白质印记（Western blot）中TSP-1、CD47、VEGF、VEGFR2的表达;在高脂喂养6周和8周时加入抗CD47（B6H12）药物,继续高脂喂养2周后通过Western blot中TSP-1、CD47、VEGF、VEGFR2的表达变化。在人脐静脉内皮细胞（HUVECs）中,加入一定浓度的脂多糖（LPS）,形成HUVEC的炎症模型。在此模型中分别加入抗TSP-1（LSKL）、外源性TSP-1、抗CD47（B6H12）药物干预后,即正常对照组（control组）、control+LPS组、LSKL组、外源性TSP-1组、抗CD47组,采用Western blot观察HUVECs中TSP-1、CD47、VEGF、 VEGFR2的蛋白表达水平。结果:1.8周龄ApoE-/-雄鼠高脂喂养按不同时间点获取腹主动脉后进行油红O染色,利用Image-Pro Plus 6.0对油红染色的脂质含量进行统计分析,结果显示,不同实验组相比,apoE-/-小鼠腹主动脉脂质含量在8周时达到高峰,说明小鼠腹主动脉动脉粥样硬化程度在8周时最严重,脂质含量明显增加（P<0.001）,且加入抗CD47药物干预后,高脂喂养8周时小鼠腹主动脉脂质含量明显增加（P<0.01）。高脂喂养8周时小鼠腹主动脉的脂质含量与10周和12周相比也显着增加（P值分别为P<0.01,P<0.001）。2.8周龄ApoE-/-雄鼠高脂喂养按实验分组获取腹主动脉,提取总蛋白后利用Western blot法检测分析HIF-1、TSP-1、CD47、VEGF、VEGFR2的蛋白表达水平,以GAPDH为内参蛋白,其比值为相对蛋白表达量。结果显示:在apoE-/-小鼠腹主动脉实验组内各因子的蛋白表达如下:HIF-1在高脂喂养8周时表达量最高。与对照组相比,apoE-/-小鼠高脂喂养8周时蛋白表达量显着增加（P<0.001）,与高脂喂养12周相比,高脂喂养8周HIF-1的蛋白相对表达量显着升高（P<0.01）;TSP-1在高脂喂养10周时表达量最高。与高脂喂养4周相比,10周时TSP-1蛋白表达量显着增加（P<0.001）,与高脂喂养12周时相比,高脂喂养10周TSP-1的蛋白表达明显增加（P<0.05）;CD47在高脂喂养8周时表达量最高。与对照组相比,8周时CD47蛋白表达量明显增加（P<0.05）,与高脂喂养12周时相比,高脂喂养8周CD47的蛋白表达亦明显增加（P<0.05）;VEGF在高脂喂养8周时表达量最高。与对照组相比,8周时VEGF蛋白表达量明显增加（P<0.05）,与高脂喂养10周和12周时相比,高脂喂养8周CD47的蛋白表达亦明显增加（P<0.05）;VEGFR2在高脂喂养8周时表达量最高。与对照组相比,8周时VEGFR2蛋白表达量显着增加（P<0.01）,与高脂喂养10周时相比,高脂喂养8周VEGFR2的蛋白表达也明显增加（P<0.05）,与高脂喂养12周时相比,高脂喂养8周VEGFR2的蛋白表达亦显着增加（P<0.001）。3.8周龄ApoE-/-雄鼠高脂喂养,分别在高脂喂养6周和8周时加入抗CD47（B6H12）,在2周后（8周和10周）获取不同组别小鼠腹主动脉,提取总蛋白后利用Western blot法检测分析HIF-1、TSP-1、CD47、VEGF、VEGFR2的蛋白表达水平,以GAPDH为内参蛋白,其比值为相对蛋白表达量,结果表明:与未加药物高脂喂养同周龄的小鼠相比,加入抗CD47后小鼠腹主动脉CD47的表达明显下降（P<0.05）,HIF-1的蛋白表达亦明显下降;与高脂喂养8周不加药组相比,高脂喂养8周加药组TSP-1的蛋白表达明显下降（P<0.05）,与高脂喂养10周不加药组相比,高脂喂养10周加药组TSP-1的蛋白表达显着下降（P<0.05）;高脂喂养8周加药组与高脂喂养8周不加药组相比,VEGF的蛋白表达显着下降（P<0.01）;高脂喂养8周加药组与高脂喂养8周不加药组相比,VEGFR2让的蛋白表达明显下降（P<0.05）。4.按照实验分组,将培养好的各组细胞提取总蛋白进行Western blot检测分析各组别间TSP-1、HIF-1、CD47、VEGF、VEGFR2的相对表达量,以GAPDH作为内参蛋白进行对照,各待测因子分子量与内参比值作为其相对表达量。结果显示:HUVECs加入LPS后,HIF-1、CD47、VEGF、VEGFR2的表达量均增加,而TSP-1表达下降（P<0.05）。TSP-1拮抗剂（LSKL）、外源性TSP-1和抗CD47（B6H12）药物作用时,HIF-1的表达不具有统计学意义,而TSP-1、CD47、VEGF、VEGFR2的表达均收到影响。结论:（1）apoE-/-雄鼠高脂喂养8周时体内腹主动脉脂质含量达高峰,动脉粥样硬化程度最严重。（2）apoE-/-雄鼠高脂喂养后,HIF-1、CD47、VEGF、VEGFR2等表达量在8周时达高峰,而TSP-1表达增加时CD47、VEGF、VEGFR2等表达量均下降。（3）TSP-1/CD47/VEGF/VEGFR2通路通过抑制新生血管生成来调控动脉粥硬化进展。HIF-1/CD47/VEGF/VEGFR2信号通路可促进新生血管形成加速动脉粥样硬化进展。（4）炎症反应时HIF-1表达增加,通过HIF-1/VEGF通路影响动脉粥样硬化斑块稳定性。（5）TSP-1拮抗剂和CD47拮抗剂均可以增加HUVECs内VEGF和VEGFR2的表达;外源性TSP-1减少HUVECs内VEGF和VEGFR2的表达。（6）TSP-1/CD47信号通路通过影响VEGF和VEGFR2的表达抑制血管新生。
陈芳芳[2]（2021）在《脂肪细胞来源外泌体在糖尿病动脉粥样硬化疾病中的作用及机制研究》文中研究表明研究背景糖尿病是21世纪全球最严重的公共卫生问题之一,我国已成为糖尿病患者总数最多的国家。与未患糖尿病的成年人相比,大约75%的2型糖尿病患者死于心血管并发症。研究表明,冠心病合并2型糖尿病患者的冠状动脉受累程度高且弥漫病变较多、狭窄程度较重,临床治疗困难明显增加。经皮冠状动脉介入治疗（Percutaneous coronary interventions,PCI）是目前用于治疗冠心病合并糖尿病的有效手段。但是在PCI日臻完善的今天,糖尿病一直是PCI术中并发症和术后近、远期预后不良的独立危险因素。糖尿病患者PCI术后支架内再狭窄发生率显着升高,是严重影响患者预后的主要因素。支架内再狭窄（Int-stentrestenosis,ISR）是涉及多种机制的复杂疾病过程,是恶化2型糖尿病心血管并发症患者预后的核心问题。现有观点认为以平滑肌细胞增殖为核心的血管内膜增生是支架内再狭窄的主要病理过程和关键环节。以此为靶点开发的雷帕霉素、紫杉醇药物洗脱支架可在一定程度上降低支架内再狭窄的发生率,但存在“晚期追赶现象”,且晚期支架内再狭窄发生率仍高达10%。由此推测平滑肌细胞增殖可能只是血管内膜增生的主要中间过程而非启动因素,而糖尿病导致PCI术后支架内再狭窄发生率显着增高的关键机制也尚未阐明。因此,探索糖尿病条件下血管内膜增生的启动环节,寻找以此为靶点的干预方法,才能从源头上阻断支架内再狭窄的发生发展。对于血管结构而言,内皮细胞作为管壁组织与血液中各种病理性刺激的天然屏障,是保护平滑肌细胞免受刺激因素干扰的关键,在血管内膜增生过程中可能是先于平滑肌细胞发挥作用的核心角色。支架的植入过程中存在内皮细胞受损,内皮细胞损伤是启动动脉粥样硬化的关键步骤。围手术期药物的规范应用已在最大程度上保护了内皮细胞的完整性,而平滑肌细胞仍能不断受到刺激而增殖。近期关于内皮细胞在刺激因素下向间质细胞转变即内皮间质转化（Endothelial-Mesenchymal Transition,EndMT）的研究给了我们一定的启示。EndMT 是指在某些特定的生理或病理条件下,内皮细胞失去其自身特异性抗原,而获得间质细胞抗原,同时其生物学特性明显改变,获得较强的增殖、迁移、收缩能力。EndMT在冠状动脉和肺动脉的发育过程中可使内皮细胞向平滑肌细胞进行转化,对心血管系统的正常发育有至关重要的作用。EndMT参与了诸多与血管内膜增生相关疾病的发生过程,促进动脉粥样硬化,但未涉及PCI术后再狭窄防治的研究。因此,EndMT可能是支架内再狭窄发生的关键步骤。近来研究证实,多种外界刺激因素在内皮细胞发生EndMT中起重要作用,包括高糖、炎症、低氧、脂代谢异常、氧化应激、机械牵张力、吸烟等,但是糖尿病、动脉粥样硬化及支架内再狭窄的发病机制复杂,涉及上述多种机制的协同作用。外泌体（Exosomes）能够携带大量蛋白质、核酸及脂质成分,整合来源细胞的有效刺激信息,有效实现信号的级联放大和远距离传输。Exosomes所携带、传递的信息成分多与其来源细胞/组织密切相关。糖尿病状态下,脂肪细胞来源外泌体（Adipocyte-derived exosomes,AdExos）含有脂肪组织炎症及胰岛素抵抗的相关蛋白及核酸成分,能够通过作用于靶细胞诱发多种生物学功能,可能是链接胰岛素抵抗的脂肪组织与糖尿病动脉血管之间的重要桥梁,是整合机体多种刺激因素,诱发EndMT的关键载体。Sonic hedgehog（Shh）作为Hedgehog蛋白三种同源形式之一,表达最广泛,活性最高,是参与胚胎发育的关键蛋白。在肿瘤领域的研究发现,Shh具有激活Snail信号通路促进上皮间质转化（Epithelial-mesenchymal transition,EMT）的作用,而EndMT是EMT的一种特殊类型。进一步研究证实,Snail信号通路亦是调节EndMT形成的关键信号通路。综上,我们提出研究假说:糖尿病状态下,携带Shh的AdExos增多,被内皮细胞摄取,AdExos通过其表面携带的Shh激活Snail依赖的EndMT过程,导致内皮细胞发生表型转换,逐渐向间质细胞转化,促进血管内膜增生,最终导致支架内再狭窄的发生。鉴于以上假说,我们将进行体内及体外实验,在整体和细胞水平研究脂肪细胞来源外泌体在血管再狭窄中的作用及具体机制。研究目的1.在整体动物水平证实AdExos通过其携带的Shh促进内皮间质转化,加剧血管内膜增生,进而影响糖尿病血管再狭窄的发生;2.从细胞水平探索AdExos促内皮间质转化的特性,验证AdExos通过其携带的Shh激活内皮细胞Snail信号通路并促进EndMT,为2型糖尿病PCI术后支架内再狭窄防治提供新的靶点。研究方法1.培养、诱导分化3T3-L1前脂肪细胞并建立胰岛素抵抗模型首先,我们通过胰岛素、3-异丁基-1-甲基,黄嘌呤与地塞米松联合诱导的方法将3T3-L1前脂肪细胞诱导分化为成熟的脂肪细胞,再通过高糖联合高胰岛素的方法建立胰岛素抵抗的脂肪细胞模型,采用无exosomes血清培养并收集细胞上清,获取对照组（Control,Ctrl）及胰岛素抵抗组（Insulin resistance,IR）脂肪细胞上清。2.Shh腺病毒转染3T3-L1脂肪细胞在建立胰岛素抵抗模型的基础上,我们再将Shh干扰及过表达的腺病毒转染入成熟脂肪细胞中,采用无exosomes血清培养后,收集细胞上清,获取胰岛素抵抗组、Shh干扰的胰岛素抵抗组、Shh过表达的胰岛素抵抗组及空载体胰岛素抵抗组的脂肪细胞上清。3.AdExos的分离提取及特征鉴定将前文中获得的多种脂肪细胞上清通过超速差速离心法,分离提取上清中的外泌体,由此获得对照组外泌体（Ctrl-AdExos）、胰岛素抵抗组外泌体（IR-AdExos）、Shh干扰的胰岛素抵抗组外泌体（IR-AdExosshh-）、Shh过表达的胰岛素抵抗组外泌体（IR-AdExosshh+）及空载体胰岛素抵抗组外泌体（IR-AdExosvector）;再采用透射电镜、动态光散射粒度仪、流式细胞仪及Western blot等方法进行AdExos的特征鉴定。4.2型糖尿病血管再狭窄ApoE-/-小鼠模型的构建4周龄的雄性ApoE-/-小鼠,适应性喂养1周后,禁食处理12～14小时,进行腹腔糖耐量试验（Intraperitoneal glucose tolerance test,IPGTT）后随机分为高脂饮食组和普通饮食组,高脂饮食组予以高脂饲料喂养,普通饮食组予以普通生长繁殖饲料喂养;6周后再次进行IPGTT试验,出现胰岛素抵抗的高脂饮食组小鼠给予一次性腹腔注射链脲佐菌素（Streptozotocin,STZ）（剂量标准为75mg/kg）,普通饮食组小鼠给予同等剂量的枸橼酸钠缓冲液进行腹腔注射;继续以原饲料喂养2周后,再次进行IPGTT试验和随机血糖检测,如果小鼠的随机血糖水平≥11.1mmol/L,且有多饮、多尿、多食等现象,则纳入2型糖尿病组。对2型糖尿病组小鼠和对照组小鼠通过植入股动脉袖套的方法构建血管再狭窄模型。分别给予生理盐水、IR-AdExos及IR-AdExosshh-经尾静脉注射,最后得到动物分组分别为普通饮食再狭窄组（Chow）、普通饮食+IR-AdExos再狭窄组（Chow+IR-AdExos）、普通饮食+IR-AdExosshh-再狭窄组（Chow+IR-AdExosshh）、糖尿病再狭窄组（DM）、糖尿病+IR-AdExos再狭窄组（DM+IR-AdExos）及糖尿病+IR-AdExosshh-再狭窄组（DM+IR-AdExosshh-）。5.小鼠体内血管对AdExos的摄取为了验证小鼠血管能够摄取AdExos,我们采用PKH26染料标记AdExos,经尾静脉注射入再狭窄模型小鼠,制作血管标本切片,通过免疫荧光染色观察AdExos在体内的摄取情况。6.病理组织学染色观察血管再狭窄情况对股动脉再狭窄部位组织标本切片进行Hematoxylin-eosin staining（HE）染色、Verhoeffs Van Gieson弹性纤维染色及免疫组化染色,观察血管再狭窄情况。7.免疫荧光染色检测再狭窄部位EndMT发生情况通过进行 CD31 和 SM22α、CD31 和 Vimentin、Ve-Cadherin 和 SM22α、Ve-Cadherin和Vimentin免疫荧光共定位染色的方法检测血管再狭窄部位EndMT的发生情况。8.分离提取小鼠主动脉内皮细胞,验证内皮细胞对AdExos的摄取为了进一步研究AdExos对内皮细胞发生内皮间质转化的影响,我们进行了体外细胞实验,通过酶消法提取小鼠主动脉内皮细胞,给予PKH26标记的AdExos,采用鬼笔环肽标记细胞骨架蛋白,显微镜下观察内皮细胞对AdExos的摄取。9.AdExos刺激孵育小鼠主动脉内皮细胞,检测细胞中EndMT发生情况再将所获取的Ctrl-AdExos、IR-AdExos、IR-AdExosshh-、IR-AdExosshh+、IR-AdExosvector等不同培养条件来源的AdExos及TGF-β、SHH重组蛋白用以刺激孵育小鼠主动脉内皮细胞,通过免疫荧光染色及Western blot的方法评价内皮标记物和间质标记物的表达变化及EndMT的发生情况。10.Western blot 检测分子机制方面,取AdExos及重组蛋白刺激孵育后的小鼠主动脉内皮细胞,提取蛋白质,采用Western blot方法检测Shh、内皮细胞及间质细胞标记物的表达及信号通路分子的表达情况。研究结果1.建立3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗模型3T3-L1前脂肪细胞诱导分化至成熟脂肪细胞后,细胞质内出现较多、较大的脂滴;高糖高胰岛素条件培养成熟脂肪细胞24h后,脂肪细胞总蛋白中总IRS1表达量显着减少,磷酸化Ser307位点的IRS1表达量显着增高,Akt的磷酸化水平降低;脂肪细胞细胞膜蛋白Glut4表达减少而细胞浆蛋白Glut4表达增加,提示胰岛素抵抗状态下Glut4细胞膜转位减少;胰岛素抵抗状态下,脂肪细胞脂质沉积增多。上述结果表明我们成功建立了 3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗模型。2.AdExos的分离提取及特征鉴定透射电镜观察下发现AdExos呈膜包被的囊泡状,直径在30～100nm范围内;动态光散射粒度仪结果表明AdExos直径范围分布于30～100nm;Western blot及流式细胞学结果表明AdExos阳性表达CD63、TSG101及CD81,而不表达GRP94和Calnexin。3.构建2型糖尿病血管再狭窄ApoE-/-小鼠模型ApoE-/-小鼠通过高脂饮食饲养联合链脲佐菌素（Streptozotocin,STZ）一次性注射的方法构建2型糖尿病模型,糖尿病小鼠随机血糖≥11.1 mmol/L,且有多饮、多尿、多食等现象。在此模型的基础上,通过股动脉袖套植入的方式构建再狭窄模型。4.糖尿病脂肪组织来源外泌体富集Shh分子通过Western blot方法检测对照组和糖尿病组小鼠脂肪组织来源外泌体蛋白中Shh分子的表达情况,结果表明糖尿病组小鼠脂肪组织来源外泌体中Shh含量显着高于对照组,证明糖尿病脂肪组织来源外泌体富集Shh分子。5.小鼠体内血管对AdExos的摄取在免疫荧光显微镜下进行观察,发现PKH26标记的AdExos呈红色荧光,分布于小鼠血管范围内,证明小鼠血管能够成功摄取AdExos。6.IR-AdExos通过携带的Shh分子促进血管再狭窄高分辨率显微超声技术检测股动脉收缩期最大流速（Peak systolic velocity,PSV）,HE染色分析血管再狭窄,综合二者结果确定血管再狭窄情况。结果表明,糖尿病组小鼠股动脉再狭窄情况与普通饮食组相比明显加重;与普通饮食组或糖尿病组相比,普通饮食+IR-AdExos组或糖尿病+IR-AdExos组的再狭窄情况进一步加重;而Shh蛋白敲减后的IR-AdExos,其促血管再狭窄的能力有所下降,即普通饮食+IR-AdExosshh-组小鼠股动脉再狭窄较普通饮食+IR-AdExos组小鼠更轻,糖尿病+IR-AdExosshh-组小鼠股动脉再狭窄程度比糖尿病+IR-AdExos组小鼠更轻。7.IR-AdExos通过携带的Shh分子促进股动脉再狭窄部位EndMT的发生通过免疫荧光共定位的方法检测血管再狭窄部位发生EndMT的情况,免疫荧光共定位时,如果内皮细胞同时表达内皮细胞特征性标志物（CD31、Ve-Cadherin）和间充质细胞特征性标志物（SM22α、Vimentin）则记为发生内皮细间质转化的细胞。结果表明糖尿病状态下,内皮细胞标志物减少,间质细胞标志物增加,提示发生EndMT;尾静脉注射IR-AdExos能够进一步促进EndMT的发生,而敲减Shh的IR-AdExos其促EndMT作用减弱,证明IR-AdExos表面的Shh分子是IR-AdExos发挥促EndMT作用的主要分子靶点。8.成功提取原代小鼠主动脉内皮细胞,小鼠主动脉内皮细胞能够摄取AdExos我们采用酶消法成功提取小鼠主动脉内皮细胞,经免疫荧光染色证明所提取的内皮细胞阳性表达内皮细胞标记物CD31,证明小鼠主动脉内皮细胞提取成功。将PKH26标记的AdExos与小鼠主动脉内皮细胞共同孵育,显微镜下观察可见细胞浆内有红色荧光,即为被小鼠主动脉内皮细胞摄取的AdExos,证明小鼠主动脉内皮细胞能够摄取AdExos。9.AdExos促进内皮细胞发生EndMT将 Ctrl-AdExos、IR-AdExos、IR-AdExosshh-、IR-AdExosshh+、IR-AdExosvector等不同培养条件来源的AdExos及TGF-β、SHH重组蛋白刺激孵育小鼠主动脉内皮细胞后,通过免疫荧光共定位的方法检测内皮细胞EndMT的发生。免疫荧光共定位时,如果内皮细胞同时表达内皮细胞特征性标志物（CD31、Ve-Cadherin）和间充质细胞特征性标志物（α-SMA、FAP、FSP-1）则记为发生内皮细间质转化的细胞。与Ctrl组相比,IR-AdExos组内皮细胞发生EndMT增多;与IR-AdExos组相比,IR-AdExosshh-组发生EndMT的内皮细胞数量并无显着增加,而IR-AdExosshh+组中发生EndMT的内皮细胞数量进一步增加;TGF-β作为阳性对照,在其刺激下,发生EndMT的内皮细胞数量显着增加;SHH重组蛋白刺激组中,发生EndMT的内皮细胞数量也有显着增加。上述结果表明,IR-AdExos能够促进内皮细胞发生EndMT,且该作用是经由其携带的Shh分子发挥的。另,TGF-β及SHH也具有促进内皮细胞发生EndMT的作用。10.IR-AdExos促进血管再狭窄EndMT的分子机制与Ctrl组相比,IR-AdExos组内皮细胞中Snail和Slug表达显着升高。证明IR-AdExos的促EndMT作用是通过其表面的Shh作用于下游的Snail和Slug分子发挥作用。研究结论1.胰岛素抵抗条件下,脂肪细胞中脂质含量增多,脂肪细胞来源外泌体富集Shh分子;2.IR-AdExos能够通过携带的Shh分子,经由Shh/Snail/Slug信号通路促进小鼠主动脉内皮细胞发生EndMT;3.富集Shh的IR-AdExos能够明显促进血管内皮细胞发生间质转化,进而加剧糖尿病小鼠血管再狭窄的发生,可能是糖尿病脂肪组织促进血管再狭窄的重要机制之一,IR-AdExos有望成为进一步防治糖尿病ISR的新靶点。研究背景糖尿病已成为21世纪威胁人类生命健康的重大慢性疾病之一。近年来,我国糖尿病患病率增长迅速,中国已成为全球糖尿病患者总数最多的国家。心血管疾病是糖尿病患者的主要死亡原因。粥样斑块破裂导致的急性冠脉综合征是糖尿病患者心血管事件的主要原因。但是糖尿病患者冠状动脉病变严重、易损斑块发生率高的机制尚未完全阐明。循证医学证据表明,积极控制血糖可以降低糖尿病患者微血管病变的发生率,但强化降糖治疗能否降低2型糖尿病患者心血管事件的发生率尚未得到证实。这提示血糖和胰岛素水平仅能反映代谢水平,而不是糖尿病患者冠状动脉病变严重、易损斑块发生率高的根本原因。因此,亟需深入探讨糖尿病患者大血管并发症增加的深层次机制。既往研究发现动脉粥样硬化斑块内常出现病理性新生血管,且在易损斑块和斑块易损部位尤为明显,与斑块稳定性密切相关。病理性新生血管是动脉粥样硬化易损斑块形成的关键环节。越来越多的证据表明,动脉损伤部位病理性新生血管形成与粥样硬化斑块引起的急性冠脉综合症有关,这些斑块脆性较大且易发生破裂,进而导致血管阻塞。除了斑块内出血机制以外,病理性新生血管还通过白细胞征募来促进动脉粥样硬化斑块的不稳定性。2型糖尿病和动脉粥样硬化同属慢性炎症性疾病,在2型糖尿病状态下,脂质在脂肪细胞中不断存储,随着脂肪细胞逐渐增大,导致脂肪细胞功能失调,脂肪因子分泌紊乱,大量促炎因子合成释放,引发全身代谢性炎症反应、胰岛素抵抗,从而加速斑块进展,促进易损斑块的形成。此外,有研究发现,脂肪细胞能够分泌内皮特异性丝裂原和促血管生长因子,参与新生血管的形成。但功能失调的脂肪组织如何促进斑块内新生血管的形成,从而促进斑块发生发展的确切机制至今尚未见报道。近期,有学者认为外泌体（Exosomes）是脂肪组织与血管间信息传递的重要载体。Exosomes是由多种细胞（如血小板、内皮细胞、单核细胞等）产生的,携带大量与其细胞/组织来源和功能密切相关的蛋白质、核酸和脂质成分。可实现信号的级联放大和远距离传输。在人体内所有exosomes中,脂肪细胞来源的exosomes（Adipocyte-derived exosomes,AdExos）与糖尿病动脉粥样硬化的发生发展及新生血管形成的关系日益引起人们的关注。Hulsmans等认为,AdExos是将脂肪组织产生的炎症及氧化应激信息传递到血管的重要使者,从而引起内皮损伤、诱发动脉粥样硬化。但是,AdExos对于斑块稳定性变化及斑块内病理性新生血管的形成有无影响尚未见报道。研究发现AdExos富含纤粘连蛋白、层粘连蛋白,有利于循环中的AdExos粘附、迁移、浸润于内皮细胞。糖尿病慢性低度炎症状态下,受损的内皮细胞通透性增加且炎症因子（IL-6、IL-8）、趋化因子（MCP-1）、粘附因子（VCAM-1、E-selectin）表达上调,为循环中的AdExos粘附、浸润创造了良好的条件。此外,AdExos携带丰富的促血管生成miRNA,如miR221、miR27b、miR21、miR17～92等。脂肪组织作为内分泌器官,是多器官间相互联系的纽带。Hedgehog 蛋白在哺乳动物中有 Sonichedgehog（Shh）、Indianhedgehog（Ihh）及Desert hedgehog（Dhh）三种同源形式,其中Shh表达最广泛,活性最高。Hedgehog在斑马鱼胚胎发育中通过VEGF促进主动脉生成。Shh缺失的小鼠发育中的肺缺乏正常血管化的能力。Hedgehog信号可通过控制众多促血管生成因子包括VEGF-a,VEGF-b,VEGF-c及AngII的表达而调控新生血管的生成。Hedgehog蛋白促血管生成功能的发挥是通过连接到一种12次跨膜受体蛋白--Patched实现的。在正常情况下,Patched受体与另一种7次跨膜受体蛋白——Smoothened（Smo）相结合且抑制Smo的作用。当Hedgehog蛋白与Patched受体结合后,解除了对Smo的抑制作用,进而启动信号转导。Smo是Hedgehog信号通路的信息转换器,把细胞外的Hedgehog蛋白信号向细胞内传递,激活胶质瘤相关原癌基因（Glioma-associated oncogene homolog,Gli）转录因子。综上所述,我们提出了如下假说:糖尿病状态下,功能失调的脂肪组织释放入循环血液中的AdExos数量增多,其通过其表面的Hedgehog蛋白与内皮细胞上的Patched受体结合,促进病理性新生血管的形成,加速斑块进展及易损斑块的形成。研究目的1.从细胞水平分析AdExos促血管生成的特性;2.体外验证AdExos是否通过启动Hedgehog信号通路,促进新生血管的形成。研究方法1.培养、诱导分化3T3-L1前脂肪细胞并建立胰岛素抵抗模型通过胰岛素、3-异丁基-1-甲基-黄嘌呤与地塞米松联合诱导的方法将3T3-LI前脂肪细胞诱导分化为成熟的脂肪细胞。再通过高糖+高胰岛素的方法建立胰岛素抵抗的脂肪细胞模型。采用无exosomes血清培养并收集细胞上清,获取对照组（Control,Ctrl）及胰岛素抵抗组（Insulin resistance,IR）脂肪细胞上清。2.Shh腺病毒转染3T3-L1脂肪细胞在建立胰岛素抵抗模型的基础上,我们再将Shh干扰及过表达的腺病毒转染入成熟脂肪细胞中,采用无exosomes血清培养后,收集细胞上清,获取胰岛素抵抗组、Shh干扰的胰岛素抵抗组、Shh过表达的胰岛素抵抗组及空载体胰岛素抵抗组的脂肪细胞上清。3.AdExos的分离提取将前文中获得的多种脂肪细胞上清通过超速差速离心法,分离提取上清中的外泌体,由此获得对照组外泌体（Ctrl-AdExos）、胰岛素抵抗组外泌体（IR-AdExos）、Shh干扰的胰岛素抵抗组外泌体（IR-AdExosshh-）、Shh过表达的胰岛素抵抗组外泌体（IR-AdExosshh+）及空载体胰岛素抵抗组外泌体（IR-AdExosvector）。4.分离提取小鼠主动脉内皮细胞,验证内皮细胞对AdExos的摄取为了进一步研究AdExos对内皮细胞血管新生能力的影响,我们进行了体外细胞实验,通过酶消法提取小鼠主动脉内皮细胞,给予PKH26标记的AdExos,显微镜下观察内皮细胞对AdExos的摄取。5.AdExos刺激孵育小鼠主动脉内皮细胞,检测内皮细胞功能的改变将所获取的 Ctrl-AdExos、IR-AdExos、IR-AdExosshh-、IR-AdExosshh+、IR-AdExosvector等不同培养条件来源的AdExos及VEGF、SHH重组蛋白用以刺激孵育小鼠主动脉内皮细胞,通过PCNA/KI67免疫荧光染色检测内皮细胞增殖功能,通过细胞划痕实验检测迁移功能。6.小管形成实验检测AdExos促血管新生的特性将 Ctrl-AdExos、IR-AdExos、IR-AdExosshh-、IR-AdExosshh+、IR-AdExosvector等不同培养条件来源的AdExos及VEGF、SHH重组蛋白用以刺激孵育小鼠主动脉内皮细胞,通过小管形成实验观察小管形成的数量及分支长度,评价AdExos的促血管新生的能力。7.Hedgehog信号通路在AdExos促血管新生中的作用分子机制方面,给予Hedgehog蛋白阻断剂——环巴胺阻断Hedgehog信号通路,通过小管形成实验观察小管形成的数量及分支长度,检测内皮细胞的小管形成功能。给予Hedgehog蛋白阻断剂——环巴胺和Gli抑制剂——Gant61刺激孵育,提取小鼠主动脉内皮细胞的蛋白质,通过Western blot方法检测信号通路分子的表达情况。研究结果1.成功提取原代小鼠主动脉内皮细胞,小鼠主动脉内皮细胞能够摄取AdExos我们采用酶消法成功提取小鼠主动脉内皮细胞,经免疫荧光染色证明所提取的内皮细胞阳性表达内皮细胞标记物CD31,证明小鼠主动脉内皮细胞提取成功。将PKH26标记的AdExos与小鼠主动脉内皮细胞共同孵育,显微镜下观察可见细胞浆内有红色荧光,即为被小鼠主动脉内皮细胞摄取的AdExos,证明小鼠主动脉内皮细胞能够摄取AdExos。2.IR-AdExos改变小鼠主动脉内皮细胞的增殖和迁移功能用Ctrl-AdExos、IR-AdExos、VEGF及SHH重组蛋白刺激孵育小鼠主动脉内皮细胞。首先进行PCNA和KI67免疫荧光染色,结果显示:与对照组相比,Ctrl-AdExos刺激组的PCNA和KI67的表达量有所增加,IR-AdExos刺激组的PCNA和KI67的表达量显着增加,以VEGF作为促血管新生的阳性对照用以刺激内皮细胞,结果发现,与对照组相比,VEGF刺激组中内皮细胞的PCNA及KI67表达量均显着增加。表明IR-AdExos、VEGF能够显着增强内皮细胞的增殖功能。细胞划痕实验结果显示:与对照组相比,Ctrl-AdExos刺激组的细胞迁移率有增加,IR-AdExos细胞迁移率显着增加,VEGF刺激组细胞迁移率明显增加。表明IR-AdExos、VEGF能够显着增强内皮细胞的迁移功能。3.AdExos促进小鼠主动脉内皮细胞的小管形成功能用Ctrl-AdExos、IR-AdExos、VEGF及SHH重组蛋白刺激孵育小鼠主动脉内皮细胞。进行小管形成实验,结果发现:与对照组相比,Ctrl-AdExos刺激组细胞小管形成数量、分支长度增加,IR-AdExos刺激组细胞小管形成数量、分支长度显着增加,VEGF阳性对照组内皮细胞小管形成数量、分支长度显着增加。表明IR-AdExos、VEGF能够明显增强内皮细胞的小管形成功能。4.Shh基因干预的IR-AdExos影响小鼠主动脉内皮细胞的增殖和迁移功能用 IR-AdExos、IR-AdExosshh-、IR-AdExosshh+、IR-AdExosvector 等不同培养条件来源的AdExos及VEGF、SHH重组蛋白刺激孵育小鼠主动脉内皮细胞。进行PCNA和KI67免疫荧光染色,结果显示:与IR-AdExos组相比,IR-AdExosshh-组中内皮细胞PCNA、KI67的表达量有所降低,IR-AdExosshh+组内皮细胞中PCNA、KI67的表达量显着增加。表明Shh是IR-AdExos促进内皮细胞增殖功能的重要分子。细胞划痕实验结果显示:与IR-AdExos组相比,IR-AdExosshh-组中细胞迁移率降低,IR-AdExosshh+组内皮细胞细胞迁移率显着增加。表明Shh是IR-AdExos促进内皮细胞迁移功能的重要分子。5.Shh基因干预的IR-AdExos影响小鼠主动脉内皮细胞的小管形成功能用 IR-AdExos、IR-AdExosshh-、IR-AdExosshh+、IR-AdExosvector 等不同培养条件来源的AdExos及VEGF、SHH重组蛋白刺激孵育小鼠主动脉内皮细胞。进行小管形成实验,结果显示:与IR-AdExos组相比,IR-AdExosshh-组中内皮细胞小管形成数量、分支长度降低,IR-AdExosshh+组内皮细胞小管形成数量、分支长度显着增加。表明Shh是IR-AdExos促进内皮细胞血管新生的重要分子。6.Hedgehog信号通路在AdExos促血管新生中的作用给予 Hedgehog 抑制剂环巴胺和 IR-AdExos、IR-AdExosshh-、IR-AdExosshh+、IR-AdExosvector等不同培养条件来源的AdExos以及VEGF重组蛋白刺激孵育小鼠主动脉内皮细胞和人脐静脉内皮细胞,检测内皮细胞小管形成功能,结果表明IR-AdExos+环巴胺组的小管形成数量、分支长度显着降低,证明Hedgehog是AdExos促血管新生的关键分子。7.AdExos促血管新生信号通路分子的表达情况给予Hedgehog抑制剂环巴胺、Gli抑制剂Gant61及IR-AdExosshh+刺激孵育小鼠主动脉内皮细胞和人脐静脉内皮细胞。Western blot结果显示:IR-AdExosshh+刺激条件下,小鼠主动脉内皮细胞中Gli表达量显着升高;给予环巴胺和Gant61（Gli抑制剂）后,Gli表达量显着降低,证明AdExos通过Patched/Gli信号通路促进血管新生。研究结论1.IR-AdExos能够增强小鼠主动脉内皮细胞增殖、迁移和小管形成功能,促进血管新生;2.Shh是IR-AdExos促进内皮细胞功能改变的关键分子;3.IR-AdExos通过Patched/Gli信号通路促进血管新生。
占钻[3]（2021）在《咖啡酸苯乙酯对早期腹主动脉瘤保护作用的研究》文中研究说明第1部分人体腹主动脉瘤组织的病理学研究目的:观察人体腹主动脉瘤（Abdominal aortic aneurysm,AAA）组织的病理学特点及沉默信息转录调控因子1（silent information regulator of transcription 1,SIRT1）、核因子κB（Nuclear factorκB,NF-κB）及CD40等蛋白的表达情况,为后续深入研究早期AAA的药物治疗方法及相关机制建立基础。方法:1、收集我院外科手术切除的人体AAA标本及正常人腹主动脉标本（各3例）,HE染色观察组织的病理学表现,VG染色观察血管壁弹力纤维破坏程度;2、通过免疫组织化学染色法检测CD31及CD68表达水平,评估AAA瘤壁组织新生血管形成及巨噬细胞浸润水平;3、免疫组织化学染色法检测SIRT1、NF-κBp65、基质金属蛋白酶2（Matrixmetalloproteinase-2,MMP-2）、基质金属蛋白酶9（Matrixmetalloproteinase-9,MMP-9）及CD40蛋白表达水平。结果:1、HE染色显示人体AAA组织中膜变薄,中膜和外膜见明显炎症细胞浸润聚集,可见明显新生血管形成。VG染色显示血管壁弹力纤维降解,连续性中断,大量的炎性细胞浸润破坏分隔中膜;2、免疫组化染色显示人体正常腹主动脉组织CD31及CD68几乎不表达,AAA瘤壁CD31及CD68表达明显增多,以中膜及外膜区域为主,与正常腹主动脉相比差异有显着性（p<0.05）;3、正常腹主动脉组织CD40、NF-κB p65、MMP-2及MMP-9蛋白呈较低表达,SIRT1蛋白呈高表达,与正常腹主动脉组织相比,AAA瘤壁CD40、NF-κB p65、MMP-2及MMP-9蛋白表达水平明显升高,SIRT1蛋白表达水平下降,差异有显着性（p<0.05）。结论:人体AAA形成与炎症浸润、新生血管形成、MMPs、SIRT1、NF-κB及CD40等蛋白表达有关,从这些角度出发通过体内外实验进一步研究AAA的内科治疗方法及机制具有一定的意义。第2部分咖啡酸苯乙酯对大鼠AAA形成早期保护作用的研究目的:研究咖啡酸苯乙酯（Caffeic acid phenethyl ester,CAPE）在大鼠AAA形成早期的保护作用及可能的相关机制,探索CAPE在早期AAA的内科治疗中的潜力。方法:1、18只健康雄性SD大鼠被随机分为假手术组、模型组及CAPE干预组（每组各6只）。模型组通过注射（猪胰）弹性蛋白酶法建立AAA模型,CAPE干预组腹腔注射CAPE 10μmol/kg/d,持续14 d,模型组和假手术组在相同时间点注射等剂量生理盐水。14 d后处死大鼠,采用游标卡尺测量瘤体及腹主动脉最大直径,判断动脉瘤大小,模型组及CAPE干预组留取弹性蛋白酶灌注处动脉组织,假手术组留取正常肾下腹主动脉组织标本,;2、HE染色、VG染色分别观察动脉瘤组织炎症浸润和弹力纤维破坏程度等病理改变;3、免疫组化法检测α平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）表达,TUNEL检测血管平滑肌细胞凋亡水平;4、组织ROS水平测定判断氧化应激水平;5、CD31免疫组织化学染色研究内膜新生血管形成;6、CD68、i NOS及CD206免疫组织化学染色研究巨噬细胞表型变化;7、免疫组织化学法检测MMP-2、MMP-9蛋白表达;8、蛋白印迹法检测IL-6、SIRT1、NF-κBp65、MCP-1、MMP-2、MMP-9、CD40蛋白的表达。结果:1、所有大鼠均存活,模型组大鼠术后14 d AAA成瘤率100%。CAPE干预组术后14 d有一只未达AAA标准,其余5只瘤体直径均超过灌注前直径的50%,成瘤率83%。三组大鼠腹主动脉直径于弹性蛋白酶灌注前无显着差异（p>0.05）。模型组及CAPE干预组大鼠腹主动脉直径于弹性蛋白酶灌注后即刻无显着差异（p>0.05）,但均较假手术组显着增加（p<0.05）。术后14 d模型组及CAPE干预组大鼠腹主动脉直径较假手术组显着增加（p<0.05）,但CAPE干预组较AAA模型组显着下降（p<0.05）;2、HE染色显示模型组动脉管壁呈瘤样扩张,组织结构紊乱,管壁炎症浸润明显。而在CAPE干预后瘤样扩张不明显,组织结构相对完整,有炎症浸润,但较模型组明显减少。VG染色结果显示,模型组AAA管壁中膜肌纤维较假手术组明显减少,胶原纤维紊乱不连续,降解明显,外膜增厚,与模型组相比,CAPE干预组中管壁中膜肌纤维增加,胶原纤维断裂及降解情况好转;3、与假手术组相比,模型组大鼠动脉管壁组织α-SMA水平显着降低（p<0.05）,与模型组相比,CAPE干预组表达则显着升高（p<0.05）。TUNEL法检测各组血管壁平滑肌细胞凋亡水平,结果显示,假手术组凋亡细胞几乎不可见,模型组及CAPE组可见明显增多（p<0.05）,而CAPE干预组凋亡细胞数量较模型组明显减少（p<0.05）;4、与假手术组相比,模型组大鼠动脉管壁组织ROS含量显着增加（p<0.05）;与模型组相比,CAPE干预组ROS含量明显降低（p<0.05）;5、与假手术组相比,模型组大鼠动脉管壁组织CD31表达水平显着增加（p<0.05）,与模型组相比,CAPE干预组中CD31表达水平显着降低（p<0.05）;6、与假手术组相比,模型组大鼠动脉管壁组织CD68、CD206及iNOS表达水平显着增加（p<0.05）,与模型组相比,CAPE干预组CD68、iNOS表达水平显着降低（p<0.05）,而CD206表达水平增加（p<0.05）;7、与假手术组相比,模型组大鼠动脉管壁组织MMP-2及MMP-9表达水平显着增加（p<0.05）,与模型组相比,CAPE干预组MMP-2及MMP-9表达水平显着降低（p<0.05）;8、与假手术组相比,模型组大鼠动脉管壁组织CD40、IL-6、MCP-1、MMP2、MMP9和NF-κBp65的蛋白表达水平均显着上升（p<0.05）,SIRT1表达显着下降（p<0.05）;与模型组相比,CAPE干预组中CD40、IL-6、MCP-1、MMP9和NF-κBp65的蛋白表达水平均显着降低（p<0.05）,SIRT1表达显着升高（p<0.05）,MMP-2无显着差异（p>0.05）,但呈下降趋势。结论:CAPE对大鼠早期AAA具有保护作用,这种保护作用可能与其抑制炎症反应、氧化应激、新生血管形成、血管平滑肌细胞凋亡、巨噬细胞促炎型M1极化及影响SIRT1、NF-κB、CD40等蛋白表达有关。第3部分CAPE抑制TNF-α诱导人脐静脉内皮细胞炎症反应的机制研究目的:研究CAPE对肿瘤坏死因子α（Tumor necrosis factor alpha,TNF-α）刺激人脐静脉内皮细胞后炎症反应的抑制作用及与SIRT1、NF-κB、CD40蛋白相关的可能分子学机制,为探讨CAPE对早期AAA的保护作用提供理论基础。方法:1、体外培养人脐静脉内皮细胞,将细胞分为对照组及40μg/L、20μg/L及10μg/L的TNF-α刺激组,通过Western blot检测细胞孵育12 h后白介素6（Interleukin-6,IL-6）及单核细胞趋化因子1（Monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1）蛋白的表达水平;2、将细胞分为对照组、TNF-α组及80μM、40μM、10μM三种浓度CAPE干预组,通过Western blot检测各组细胞IL-6及MCP-1蛋白的表达水平;3、将细胞分为对照组、TNF-α组及CAPE+TNF-α组,Western blot检测比较各组细胞中SIRT1蛋白的表达;4、将细胞分为对照组、TNF-α组,CAPE组、NAM+CAPE+TNF-α组及PDTC+TNF-α组,Western blot检测比较各组细胞中CD40蛋白的表达;5、将细胞分为对照组、TNF-α组、CAPE+TNF-α组及NAM+CAPE+TNF-α组,Western blot检测比较各组细胞中NF-κBp65蛋白的表达。结果:1、TNF-α呈浓度依赖性影响IL-6及MCP-1蛋白的表达,且10μg/L的TNF-α刺激后IL-6及MCP-1表达水平即较对照组显着升高（p<0.05）;2、各浓度组CAPE预刺激可显着抑制TNF-α刺激后MCP-1表达水平的升高,80μM及40μM的CAPE显着抑制TNF-α刺激后IL-6表达水平的升高（p<0.05）,但10μM干预组IL-6表达水平与TNF-α刺激组无显着差异（p>0.05）;3、正常内皮细胞SIRT1呈高表达,10μg/L TNF-α刺激后SIRT1表达水平较正常细胞组显着降低（p<0.05）,而40μM CAPE干预后SIRT1表达水平较TNF-α组显着升高（p<0.05）;4、10μg/L TNF-α刺激后CD40表达水平较对照组显着升高（p<0.05）,40μM CAPE干预后CD40表达水平较TNF-α组显着下降（p<0.05）,加入NAM后CAPE对CD40的抑制作用减弱,与CAPE组相比有显着差异（p<0.05）,与TNF-α组相比,加入PDTC对CD40有显着抑制作用（p<0.05）,且作用与CAPE组无明显差异（p>0.05）;5、与对照组相比,10μg/L TNF-α刺激后HUVECs的NF-κBp65表达水平显着升高（p<0.05）,而40μM CAPE干预后可以显着抑制TNF-α刺激引起的NF-κBp65表达升高（p<0.05）。加入NAM后,CAPE对NF-κBp65的抑制作用减弱。结论:CAPE可抑制TNF-α诱导人脐静脉内皮细胞后的炎症反应,这种作用与其通过SIRT1介导的NF-κB p65亚基去乙酰化抑制TNF-α诱导的内皮细胞中CD40表达有关。因此我们推测CAPE对早期AAA保护作用的机制可能与SIRT1/NF-κB/CD40通路有关。
王佳丽[4]（2020）在《脂多糖通过诱导IFIT1表达促进人脐静脉内皮细胞炎症反应》文中进行了进一步梳理研究背景和目的:动脉粥样硬化（Atherosclerosis,AS）是一种严重危害人类健康的慢性炎症性疾病,其发病率和死亡率呈明显上升趋势,尽管AS形成过程非常复杂,但目前普遍认为从内皮细胞损伤、AS斑块的破裂到血栓形成,炎症反应贯穿了 AS发生发展的全部阶段。血管壁在AS早期表现为急性渗出性炎症,在AS进展期表现为慢性增生性炎症。既往的研究证明,促炎因子白细胞介素（Interleukin,IL）-1β、IL-6、肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor-α,TNF-α）和核转录因子-kappa B（Nuclear factor kappa B,NF-κB）在AS的发生发展及其转归中发挥关键作用。脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）是革兰氏阴性细菌细胞壁的主要成分,是细菌死亡溶解后,从细菌胞壁中释放出来的重要免疫调节分子,所以又称内毒素（Endotoxin）。吸收外源性脂多糖导致血管内皮细胞损伤,引起促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α和核转录因子NF-κB的表达升高,从而诱导机体的炎症反应。尽管众多研究表明LPS可诱导IL-1β、IL-6、TNF-α和NF-κB的表达,但其具体机制仍不清楚,还有待进一步研究。干扰素刺激基因（IFN stimulated genes,ISGs）共有 4 个成员:IFIT1/ISG56,IFIT2/ISG54,IFIT3/ISG60 和 IFIT5/ISG5,其中 ISG56 又称为 IFIT1（Interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats 1）基因,人类 IFIT1 基因定位于10q23.31,IFIT1诱导蛋白为胞浆蛋白,正常生理状态时,绝大多数细胞不表达IFIT1,但干扰素、病毒感染或LPS可以诱导其转录。研究发现IFIT1 mRNA水平在M1极化的巨噬细胞中明显上调,IFIT1在AS小鼠主动脉窦和头臂动脉切片的巨噬细胞亚群中高表达,说明IFIT1可能与炎症反应有关。但是IFIT1是否参与内皮细胞炎症反应,及其相关机制仍需要进一步探索。研究材料与方法:1.LPS对人脐静脉内皮细胞IFIT1的影响使用0,250,500,1000ng/mL四个浓度梯度的LPS处理人脐静脉内皮细胞,24h后,提取mRNA和总蛋白,分别用实时荧光定量PCR（Real-time Quantitative polymerase chain reaction,qRT-PCR）和 western blotting（WB）检测IFIT1 mRNA和蛋白的表达水平。此外,为研究LPS处理人脐静脉内皮细胞不同时间对IFIT1表达的影响,分别使用1000ng/mL的LPS处理内皮细胞0,6,12,24h后,提取mRNA和总蛋白,采用qRT-PCR和WB检测IFIT1的mRNA和蛋白表达水平。2.构建IFIT1过表达的人脐静脉内皮细胞模型构建过表达IFIT1的质粒以及阴性对照质粒载体,转染人脐静脉内皮细胞后,分别通过qRT-PCR技术和WB检测IFIT1的表达情况,验证IFIT1过表达效率;加或不加LPS处理24h后,用qRT-PCR和WB检测IFIT1、IL-1β、IL-6、TNF-α和NF-κB的mRNA和蛋白表达水平。3.构建IFIT1敲减的人脐静脉内皮细胞模型构建特异靶向IFIT1的siRNA以及阴性对照siRNA载体,转染人脐静脉内皮细胞后,分别通过qRT-PCR技术和WB检测IFIT1的表达情况,验证IFIT1干扰效率;加或不加LPS处理24h后,用qRT-PCR和WB检测IFIT1、IL-1β、IL-6、TNF-α和NF-κB的mRNA和蛋白表达水平。研究结果:1.使用0,250,500,1000ng/mL四个浓度梯度的LPS处理人脐静脉内皮细胞24h后,通过qRT-PCR和western blotting检测IFIT1的mRNA和蛋白表达水平,结果发现LPS可浓度依赖性上调IFIT1的表达,且1000ng/mL时效果较明显。此外,用1000ng/mL的LPS分别处理人脐静脉内皮细胞0,6,12,24h后,通过qRT-PCR和WB检测IFIT1的mRNA和蛋白表达水平,结果发现LPS可呈时间依赖性上调人脐静脉内皮细胞中IFIT1 mRNA和蛋白的表达水平。2.对转染IFIT1过表达的质粒以及阴性对照质粒载体的人脐静脉内皮细胞中IFIT1的表达量进行qRT-PCR和WB检测,结果发现转染IFIT1过表达质粒载体的人脐静脉内皮细胞中IFIT1的表达量明显高于对照细胞株（P<0.05）;使用LPS处理已成功构建的过表达IFIT1的人脐静脉内皮细胞模型,通过qRT-PCR 和 WB 检测 IFIT1、IL-1β、IL-6、TNF-α 和 NF-κB 的 mRNA 和蛋白表达水平,结果发现过表达IFIT1可上调IL-1β、IL-6、TNF-α和NF-κB的mRNA和蛋白的表达水平,且发现LPS处理过表达IFIT1的人脐静脉内皮细胞模型可进一步上调上述炎性因子和NF-κB的mRNA和蛋白表达水平。3.对转染IFIT1小干扰RNA载体以及阴性对照载体的人脐静脉内皮细胞中IFIT1的表达量进行qRT-PCR和WB检测,结果发现干扰细胞株中IFIT1的表达量明显低于对照细胞株（P<0.05）,表明敲减IFIT1的人脐静脉内皮细胞模型已成功构建。使用LPS处理已成功构建的敲减IFIT1的人脐静脉内皮细胞模型,通过qRT-PCR和WB检测IL-1β、IL-6、TNF-α和NF-κB的mRNA和蛋白表达水平,结果发现敲减IFIT1可下调IL-1β、IL-6、TNF-α和NF-κB的mRNA和蛋白的表达水平,且可抑制LPS诱导的IL-1β、IL-6、TNF-α和NF-κB的高表达。结论:IFIT1在动脉粥样斑块组织中的表达明显升高;LPS可以上调IFIT1的表达,并诱导人脐静脉内皮细胞IL-1β、IL-6、TNF-α和NF-κB的表达;IFIT1通过上调IL-1β、IL-6、TNF-α和NF-κB的水平调节细胞的炎症反应,进而促进AS的发生发展。因此,针对IFIT1的干预措施可能有助于减轻与AS相关的炎症反应。
哈略[5]（2020）在《艾灸及艾烟改善动脉粥样硬化的细胞自噬机制研究》文中研究指明背景:动脉粥样硬化（Atherosclerosis,AS）是多种心脑血管疾病的主要病理基础,是一种以粥样斑块为显着特征的慢性病理过程,在中医理论上属于“痰”、“瘀”的范畴,属于艾灸疗法的适应症范围。艾灸疗法改善AS的临床及机制研究已有大量报道,为艾灸抗AS的安全性和有效性提供了一定的科学依据。现代研究证明,艾灸可以通过改善AS过程中的脂质代谢、炎症反应、氧化应激、血小板活化以及内皮细胞功能多个方面,起到多靶点治疗AS的作用。艾烟是艾灸起效的重要因素之一,课题组前期研究也证明了艾烟在抗AS中不可替代的作用。细胞自噬是机体中的一项重要促存活机制,与AS各种发病机制均有深入的联系,也是近年来抗AS治疗中新的靶点和焦点。学者们认为自噬不足及过度自噬都会对AS的病理进程产生不利影响,这一现象反映了中医理论中阴阳平衡、对立统一的理念,同时自噬在微观层面上改善能量代谢、清除病理产物的作用与气的“气化”和“驱邪外出”等功能具有高度一致性。因此,已有不少学者着手研究中医药疗法调控自噬,改善心血管疾病的机制,并且取得了一定的成果。针刺、艾灸调控自噬防治心血管疾病的研究已有报道,但直接观察艾灸调控自噬对AS的研究还亟待开展。文献报道及课题组前期研究发现,艾灸对自噬通路及相关自噬蛋白展现出确切的调控作用,课题组预实验结果也体现了艾灸对AS过程中自噬的确切调控作用。基于上述基础,我们提出假说,艾灸及艾烟可以通过调控AS过程中的自噬功能,来实现防治AS的作用。目的:观察艾灸及艾烟两种干预手段对AS动物模型的影响,从病理改变、脂质代谢、斑块稳定性等方面探讨艾灸及艾烟防治AS的效应,然后通过对自噬特异性、自噬信号通路及凋亡水平等方面指标观察,从自噬角度探讨艾灸防治AS的作用机制。方法:54只8周龄ApoE载脂蛋白基因敲除小鼠按照随机数字表方法随机分为三组:模型组、艾灸组和艾烟组。18只同龄C57BL/6小鼠作为空白对照。艾灸组小鼠每日抓取,固定,予以艾灸膻中穴治疗,每次20 min,每日1次,每周6次,共干预12周。艾烟组小鼠每日接受固定浓度的艾烟暴露。模型组和空白组每日抓取固定,但不予任何干预。采用血液生化方法检测血脂四项（TC、TG、HDL、LDL）,采用Elisa法检测VLDL、ApoA1及ox-LDL,分别使用油红“O”和HE染色法观察主动脉病理切片。采用Masson染色法处理主动脉切片,计算ELA、CA、CD68、FCT、Ⅵ等斑块稳定性指标。采用免疫组化法检测主动脉内TNF-α、P38MAPK、NF-κB蛋白表达,采用Elisa法检测主动脉内MMP-2、MMP-9、TIMP-1。使用透射电镜观察血管内皮自噬小体数目,使用 Western blot 法检测小鼠主动脉 P62、Beclin-1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Atg5、Atg12 蛋白表达,使用免疫荧光法检测小鼠主动脉及肝脏P62、Beclin-1、LC3-Ⅱ表达。使用Western blot法及RT-PCR方法观察自噬信号通路p-Akt、Akt、p-mTOR、mTOR、PI3K在蛋白及mRNA水平上的的表达,使用Western blot法检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Caspase-3表达。结果:1.AS病理进程及血脂水平模型组小鼠经过12周高脂喂养,体内存在较为明显的AS病变（血脂紊乱,AS斑块形成）;与空白组相比,小鼠血清TC（P<0.01）、TG（P<0.01）、LDL（P<0.01）、VLDL（P<0.01）显着升高,载脂蛋白ApoA1（P<0.05）及HDL（P<0.01）含量显着下降。以上AS常规指标结果提示本次研究AS模型建立成功。相比于模型组,经过12周的干预治疗,艾灸组小鼠体内AS病理改变减轻（血脂紊乱减轻、主动脉斑块缩小、内皮损伤改善）;艾灸组小鼠血清TC（P<0.01）、TG（P<0.01）、LDL（P<0.05）、VLDL（P<0.01）显着下降,载脂蛋白ApoA1及HDL含量有升高趋势,但无显着差异（P>0.05）。艾烟组小鼠体内AS病理改变减轻（血脂紊乱减轻、主动脉斑块缩小、内皮损伤改善）;艾烟组小鼠血清 TC（P<0.05）、TG（P<0.05）、VLDL（P<0.05）显着下降,LDL含量有下降趋势,但无显着差异（P>0.05）。载脂蛋白ApoA1及HDL含量有升高趋势,但无显着差异（P>0.05）。2.斑块稳定性相比于模型组,经过12周的干预治疗,艾灸组小鼠体内CA（P<0.01）、FCT（P<0.01）水平显着升高,ELA（P<0.01）水平显着下降,斑块易损指数Ⅵ（P<0.05）显着降低;炎症因子 TNF-α（P<0.05）、NF-κB（P<0.05）、MMP-9（P<0.05）、MMP-2（P<0.05）水平显着下降,TIMP-1（P<0.05）水平显着升高。艾烟组小鼠体内CA（P<0.01）、FCT（P<0.01）水平显着升高,ELA（P<0.01）水平显着下降,易损斑块指数Ⅵ（P<0.05）显着降低;炎症因子TNF-α（P<0.05）、MMP-9（P<0.05）、MMP-2（P<0.05）水平显着下降,TIMP-1水平升高但无统计学差异（P>0.05）。3.自噬特异性相比于模型组,经过12周的干预治疗,电镜下艾灸组小鼠主动脉内皮自噬小体及自噬溶酶体显着增多。Western blot显示艾灸组小鼠主动脉促自噬蛋白Beclin-1（P<0.01）、LC3-Ⅱ/LC-Ⅰ比值（P<0.01）、Atg12（P<0.05）显着升高,Atg5表现出升高趋势,但无统计学差异（P>0.05）;自噬抑制蛋白P62（P<0.01）显着降低。免疫荧光显示艾灸组小鼠主动脉Beclin-1（P<0.05）、LC3-Ⅱ（P<0.05）表达显着增强。艾灸组小鼠肝脏内Beclin-1（P<0.05）、LC3-Ⅱ（P<0.05）显着升高,P62 表达无显着差异（P>0.05）。相比于模型组,经过12周的干预治疗,电镜下艾烟组小鼠主动脉内皮细胞自噬小体及自噬溶酶体显着增多。Western blot显示艾烟组小鼠主动脉促自噬蛋白Beclin-1（P<0.01）、LC3-Ⅱ/LC-Ⅰ 比值（P<0.05）、Atg12（P<0.05）显着升高,Atg5 表现出升高趋势,但无统计学差异（P>0.05）;自噬抑制蛋白P62（P<0.01）显着降低。免疫荧光显示艾烟组小鼠主动脉Beclin-1（P<0.05）、LC3-Ⅱ（P<0.05）表达显着增强。艾烟组小鼠肝脏内Beclin-1、LC3-Ⅱ、P62表达与模型组无显着差异（P>0.05）。4.PI3K/Akt/mTOR 信号通路结果显示,相比于模型组,经过12周的干预治疗,艾灸组小鼠主动脉内p-Akt/Akt比值（P<0.01）、p-mTOR/mTOR/比值（P<0.01）显着下降,PI3K相对表达量无显着差异（P>0.05）。相比于模型组,经过12周的干预治疗,艾烟组小鼠主动脉内p-mTOR/mTOR/比值（P<0.01）显着下降、p-Akt/Akt比值有下降趋势,但无显着差异（P>0.05）,PI3K相对表达量无显着差异（P>0.05）。RT-PCR结果显示,相比于模型组,艾灸组小鼠mTOR mRNA及AktmRNA含量显着下降（P<0.05）。相比于模型组,艾烟组小鼠mTOR mRNA含量显着下降（P<0.05）,AktmRNA有下降趋势,但无统计学差异（P>0.05）。5.细胞凋亡蛋白相比于模型组,经过12周的干预治疗,艾灸组小鼠主动脉内Bcl-2蛋白含量显着升高（P<0.05）,Caspase-3蛋白含量显着下降（P<0.05）。相比于模型组,经过12周的干预治疗,艾烟组小鼠主动脉内Caspase-3蛋白含量显着下降（P<0.05）,Bcl-2蛋白含量有升高趋势,但无统计学差异（P>0.05）。结论:1.艾灸和艾烟都可以改善AS小鼠体内病理进展,减轻炎症反应,纠正血脂紊乱,增强斑块稳定性。2.艾灸和艾烟都可以上调AS小鼠体内自噬水平,艾灸改善自噬是艾灸防治AS的全新靶点。3.艾灸及艾烟可通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路中的相关活性分子,从而提升细胞内自噬水平,起到延缓AS病理进程,改善斑块稳定性的作用。4.艾灸及艾烟通过上调Bcl-2、下调Caspase-3蛋白表达,抑制细胞凋亡,展现出一定的调控自噬/凋亡平衡的作用。5.艾灸和艾烟的调节作用基本一致,在调控血脂方面艾灸干预的效果优于艾烟干预。
耿小勇[6]（2020）在《血小板微粒在心肌梗死、压力负荷心肌病中的价值》文中研究指明第一部分血小板微粒与心肌梗死面积相关性研究血小板激活或凋亡后可释放一种超微膜状囊泡,即血小板微粒（Platelet microparticles,PMPs）,PMPs可通过其表面携带或释放的多种炎性因子、受体及微核糖核酸等发挥众多的病理生理学作用,与多种疾病发病及预后相关。近年来研究显示PMPs不仅参与了动脉粥样硬化发生、发展及不稳定化全程,为急性冠脉综合征相关标志物,而且与心肌梗死损伤范围相关。PMPs在心肌梗死损伤评估中确切价值以及药物对其表达的影响、调控机制均需进一步研究明确。目的:1.观察PMPs与心肌梗死面积的相关性,探讨PMPs在心肌梗死损伤定量评估中的价值;2.观察抗血小板药物（阿司匹林、氯吡格雷、替格瑞洛）对PMPs及心肌梗死面积的影响,探讨药物干预对PMPs调控机制。方法:1.入选30只Wistar大鼠适应性喂养1周后随机分为5组:心肌梗死模型组（MI）、假手术组（sham）、心肌梗死+阿司匹林组（MI+A）、心肌梗死+阿司匹林+氯吡格雷组（MI+A+B）、心肌梗死+阿司匹林+替格瑞洛组（MI+A+T）。结扎左冠状动脉前降支制作心肌梗死模型。术前一周起至术后一周进行药物（阿司匹林10.42mg/kg,硫酸氢氯吡格雷18.75mg/kg,替格瑞洛7.81mg/kg）灌胃干预;2.术后7天处死大鼠,采集血液和心脏标本。血液标本经3000rmp,10min离心分离血清,Elisa检测PMPs及Calpain10水平;心脏标本用保鲜膜包裹好置于-20℃冷冻10-15min,1%TTC溶液37℃避光染色,使用数码相机拍照留取图片,并应用ipp6.0计算梗死面积;3.统计学分析:应用方差分析进行多均数比较,均数间两两比较采用LSD法和SNK检验。Pearson相关分析明确PMPs、Calpain10、心肌梗死面积之间相关性,线性回归分析PMPs与梗死面积相关性。结果:1.各干预组（MI+A+B、MI+A+T、MI+A）PMPs均较MI组降低（25±2.2 vs 84±6.9,27±2.5 vs 84±6.9,49±2.8 vs 84±6.9,P<0.01）;MI+A+B、MI+A+T组PMPs较MI+A组明显降低（25±2.2 vs 49±2.8,27±2.5 vs 49±2.8,P<0.01）;Sham组、MI+A+B组及MI+A+T组之间无统计学差异;2.各干预组（MI+A+B、MI+A+T、MI+A）心肌梗死面积均较MI组显着降低（10±0.96 vs 28±2.3,12±0.97 vs 28±2.3,20±1.6 vs 28±2.3,P<0.01）;MI+A+T组较MI+A组显着降低（12±0.97vs 20±1.6,P=0.001）;MI+A+B组与MI+A+T组之间无统计学差异;3.PMPs与梗死面积显着正相关（r=0.85 P<0.01）;4.应用线性回归分析得到PMPs与梗死面积回归模型y=4.61+0.28*x（y:梗死面积,x:血小板微粒）。结论:1.血清PMPs水平与梗死面积明显相关;2.可依据回归模型:y=4.61+0.28*x（y:梗死面积,x:PMPs）评估心肌梗死面积;3.抗血小板药物可能直接或通过Calpain10间接通过抑制血小板激活降低PMPs生成。。第二部分钙蛋白酶在心肌梗死中的作用及对血小板微粒的影响钙蛋白酶（Calpain）作为一种钙依赖蛋白酶,最初发现其作用主要为Z盘和蛋白水解活性,主要参与分解细胞膜和细胞骨架。后续研究发现Calpain参与了细胞信号转导、基因表达调控及细胞凋亡等众多病生理过程,与糖尿病、糖尿病并发症、肾功能不全及脑损伤等众多疾病相关。越来越多的证据显示Calpain参与了心肌缺血及缺血/再灌注损伤,并参与了PMPs调控过程。但其在心肌梗死损伤中的价值以及对PMPs表达的具体作用尚有待于进一步明确。目的:1.观察Calpain10与心肌梗死损伤的相关性,探讨Calpain10在心肌梗死损伤评估中的价值;2.观察Calpain10与PMPs相关性,探讨Calpain10对PMPs影响及调控机制;3.观察抗血小板药物（阿司匹林、氯吡格雷、替格瑞洛）对Calpain10及心肌梗死面积的影响,探讨抗血小板药物对Calpian10的作用机制。方法:1.入选30只Wistar大鼠,经适应性喂养1周后,随机分为5组,分别为心肌梗死模型组（MI）、假手术组（Sham）、心肌梗死+阿司匹林+氯吡格雷干预组（MI+A+B）、心肌梗死+阿司匹林+替格瑞洛干预组（MI+A+T）、心肌梗死+阿司匹林干预组（MI+A）。通过结扎左冠状动脉前降支方法制作心肌梗死模型。自模型制作术前一周起至术后一周进行药物（干预剂量分别为:阿司匹林10.42mg/kg,替格瑞洛7.81mg/kg,硫酸氢氯吡格雷18.75mg/kg）干预;2.术后7天处死大鼠,分别采集血液和心脏标本。Elisa检测血清Calpain10、PMPs表达水平;心脏标本处理后经1%TTC溶液37℃避光染色梗死心肌,使用数码相机拍照留取图片,并应用ipp6.0计算梗死面积;3.统计学分析:多均数比较应用方差分析,均数间两两比较采用LSD法和SNK检验。Calpain10与心肌梗死面积之间以及Calpain10与PMPs之间相关性应用Pearson相关分析及线性回归分析处理;结果:1.Sham组与MI+A+B组之间Calpain10无统计学差异（18±1.5 vs 21±1.9,P=0.422）;Sham组较MI组、MI+A组、MI+A+T组Calpain10明显降低（18±1.5 vs 67±4.2,18±1.5 vs 47±1.9,18±1.5 vs 30±2.4,P<0.01）;MI+A+B组较MI+A+T组Calpian10降低（21±1.9 vs 30±2.4,P=0.03）;MI+A+B组、MI+A+T组较MI+A组Calpain10明显降低（21±1.9 vs 47±1.9,30±2.4 vs 47±1.9,P<0.01）;2.Calpain10与梗死面积明显正相关（r=0.84 P<0.01）,PMPs与Calpain10明显正相关（r=0.90,P<0.01）;3.应用线性回归分析得到Calpain10与梗死面积回归模型Infarction Area=3.350+0.342×Calpain10;3.。结论:1.Calpain10与心肌梗死面积相关,可能直接或间接通过PMPs参与心肌梗死损伤过程;2.Calpain10可能通过血小板激活后α颗粒分泌、血小板聚集、伸展、突起形成、脱落等过程促进PMPs生成;3.抗血小板药物可能通过降低血小板细胞内钙内流而抑制Calpain10生成进而影响降低PMPs表达。第三部分血小板微粒在压力负荷心肌病评估中的作用既往研究显示血小板微粒（Platelet microparticles,PMPs）作为血小板激活、凋亡后产物参与了冠心病、心力衰竭等众多疾病发病过程,并在高血压病、肺动脉高压等疾病中具有重要的病情评估价值。但PMPs在心肌病中的具有何种价值,传统心肌病治疗药物是否能影响PMPs影响等一系列问题有待于研究明确。目的:1.观察PMPs在主动脉弓缩窄（transverse aortic constriction,TAC）压力负荷心肌病模型小鼠中的表达变化,探讨PMPs与肥厚性心肌病心肌重构及心功能的相关性;2.观察氯沙坦对PMPs及TAC模型小鼠心肌重构的影响,探讨其对PMPs影响机制;方法:1.研究共入选18只雄性C57BL/6J小鼠,经适应性喂养1周后,随机分为3组,分别为TAC模型组（TAC group）、假手术组（sham group）及TAC+氯沙坦干预组（TAC+ARB group）。通过结扎主动脉弓方法制作TAC模型。自模型制作术前一周起至术后一周进行药物（氯沙坦5mg/kg/day）干预;2.术后7天超声测定心功能后处死小鼠,采集血液标本。Elisa检测血清PMPs表达水平;3.满足正态分布且方差齐性数据采用方差分析进行多均数比较。均数间两两比较采用最小显着差异t检验（least significant difference,LSD）法检验;不满足正态分布或方差不齐数据采用Kruskal Wallis检验进行多均数比较,进一步采用Wilcoxon检验进行均数间两两比较。结果:1.TAC+ARB组与Sham组PMPs水平无统计学意义差异（23±2.9 vs 19±3.3,P=0.055）;TAC+ARB组较TAC组PMPs显着降低（23±2.9 vs 54±9.4,P=0.004）;TAC组较Sham组PMPs显着升高（54±9.4 vs 19±3.3,P=0.004）;2.各组间LVEF无统计学差异;3.TAC+ARB组较TAC组LV Mass明显降低（30±3.3 vs 38±2.2,P<0.001）;Sham组较TAC组LV Mass明显降低（27±3.5 vs 38±2.2,P<0.001）;TAC+ARB组与Sham组LV Mass无统计学差异（30±3.3 vs 27±3.5,P=0.106）;4.Pearson相关分析显示PMPs与LV Mass显着正相关（r=0.908,P<0.001）;PMPs与LVEF显着负相关相（r=-0.5,P=0.034）。结论:1.TAC压力负荷心肌病模型小鼠早期即可观察到PMPs升高,其水平与心肌重构显着相关,为心肌重构标志物;2.PMPs为心肌病、心力衰竭潜在干预靶点;3.氯沙坦可降低PMPs水平,对PMPs的作用可能为其改善心肌病、心力衰竭预后的又一作用机制;4.PMPs在压力负荷心肌病模型早期与LVEF呈显着负相关,为反应心功能的重要标志物。
曾志刚[7]（2019）在《IGF-1和MGF干预对巨噬细胞剔除所致骨骼肌再生受损的影响及其作用机制研究》文中进行了进一步梳理目的:骨骼肌损伤是运动医学中最常见的损伤之一。我们之前的研究发现,巨噬细胞剔除导致挫伤骨骼肌中胰岛素样生长因子1（IGF-1）、机械生长因子（MGF）的下调和肌肉再生受损。据此我们假设,注射IGF-1或MGF可能至少部分地改善巨噬细胞剔除导致的肌肉修复受损。因此,我们探讨了注射IGF-1或MGF是否在改善受损肌肉的修复中起重要作用。方法:在C57BL/6小鼠的腓肠肌中建立了IGF-1或MGF注射的肌肉挫伤和巨噬细胞剔除的动物模型。将小鼠随机分为4组:（1）挫伤与安慰剂处理组（C组）,（2）挫伤与巨噬细胞剔除处理组（CD组）,（3）挫伤、巨噬细胞剔除与IGF-1处理组（CDI组）,（4）挫伤、巨噬细胞剔除与MGF处理组（CDM组）。在C、CD、CDI和CDM组中,除第0天（非挫伤小鼠）外,每组小鼠均产生腓肠肌双侧挫伤,并分别在挫伤前（Con）和挫伤后第1、3、7、14天取样。在巨噬细胞剔除和IGF-1或MGF注射后对挫伤的肌肉进行综合的组织形态学和遗传学分析,在挫伤骨骼肌中检测骨骼肌再生（HE染色）、纤维化（masson染色）、巨噬细胞及其亚群表面标志物、炎性细胞因子、趋化因子、肌源性调节因子（MRFs）、血管生成调节因子、氧化应激因子和基质金属蛋白酶（MMP）的表达（实时定量PCR和免疫荧光染色）。结果:1含氯膦酸盐的脂质体对受损骨骼肌巨噬细胞标志物的影响。与单纯肌肉挫伤后相比,巨噬细胞剔除后的巨噬细胞总数（F4/80）明显受到抑制（ρ<0.01）。这些结果表明巨噬细胞有效剔除了。2注射IGF-1未改善挫伤肌肉中巨噬细胞剔除所致的再生肌纤维减少和纤维化加重。巨噬细胞剔除后损伤14天的挫伤肌肉中再生肌纤维的总数目、总面积和总直径比单纯肌肉挫伤后的再生肌纤维显着减少（ρ<0.05）,注射IGF-1后受损的肌肉再生没有改善（ρ>0.05）。再者,巨噬细胞剔除引起肌肉挫伤后纤维化明显增加（ρ<0.05）,而增加的纤维化没有通过IGF-1注射得以改善（ρ>0.05）。3注射IGF-1未能促进巨噬细胞剔除后巨噬细胞之间的协调,从而未改善挫伤肌肉的再生和修复。通过注射IGF-1,挫伤后的细胞免疫反应得到了改善,巨噬细胞总数（F4/80）、促炎巨噬细胞（CD68）、抗炎巨噬细胞（CD163和CD206）有一定程度的显着增加（ρ<0.05）。在修复后期,注射IGF-1后的巨噬细胞总数（F4/80）高于单纯肌肉挫伤和巨噬细胞剔除后的巨噬细胞总数（F4/80）（ρ<0.05）,而注射IGF-1后的CD68和CD206巨噬细胞的水平仅高于单纯肌肉挫伤后的水平（ρ<0.05）,CD163巨噬细胞水平低于单纯肌肉挫伤后的水平（ρ<0.01）。4注射IGF-1未能改善巨噬细胞剔除所致的挫伤肌肉延迟修复（其表现为MRFs增加,特别是修复后期）。与单纯肌肉挫伤后的表达水平相比,在巨噬细胞剔除后的不同时间点,MyoD,Myf5,myogenin和Myf6的表达水平显着增加（ρ<0.05）,在注射IGF-1后14d,MyoD和myogenin的表达也显着增加（ρ<0.001）。5注射IGF-1部分改善了巨噬细胞剔除所致的血管生成调节因子的抑制,但未能改善挫伤肌肉的再生受损。与单纯肌肉挫伤后相比,在巨噬细胞剔除后修复的初始阶段HIF-1α和VEGF的表达增加（ρ<0.01）,在巨噬细胞剔除后的所有修复阶段Angpt-1的表达均低于单纯肌肉挫伤后的表达（ρ<0.01）。与巨噬细胞剔除后相比,注射IGF-1后各修复阶段HIF-1α的表达均显着降低（ρ<0.05）,VEGF在修复后期和Angpt-1在所有修复阶段的表达显着增加（ρ<0.001）。然而,注射IGF-1后修复后期HIF-1α、VEGF和Angpt-1的表达均低于单纯肌肉挫伤后的表达（ρ<0.001）。6注射MGF对巨噬细胞剔除后肌纤维再生无保护作用,但减轻挫伤骨骼肌的纤维化。巨噬细胞剔除显着降低了损伤14天后再生肌纤维的总直径、总数量和总面积（ρ<0.01）。然而,注射MGF对再生肌纤维的直径、数量和面积没有影响（ρ>0.05）。再者,与损伤后14天的单纯肌肉挫伤组纤维化比较,巨噬细胞剔除组的骨骼肌纤维化显着增加（ρ<0.01）。然而,与损伤后14天的巨噬细胞剔除组纤维化面积比较,注射MGF后纤维化面积显着降低（ρ<0.05）。同时,在损伤后1天和3天,注射MGF后I型和III型胶原蛋白水平明显低于巨噬细胞剔除后的水平（ρ<0.01）。7注射MGF不影响巨噬细胞剔除后挫伤骨骼肌中卫星细胞的功能状态。巨噬细胞剔除不影响MyoD的表达（ρ>0.05）,但在肌肉损伤后3天显着降低Myogenin的表达（p<0.01）。然而,注射MGF并不影响巨噬细胞剔除后受损骨骼肌中MyoD和Myogenin的表达（ρ>0.05）。8注射MGF不影响巨噬细胞剔除后挫伤骨骼肌巨噬细胞标志物的表达,但降低炎性细胞因子和趋化因子的表达。与巨噬细胞剔除相比,注射MGF后挫伤骨骼肌的巨噬细胞标记物表达无明显变化（ρ>0.05）。在骨骼肌损伤后3天,巨噬细胞剔除使促炎细胞因子（TNF-α,IL-1β和TGF-β）的水平显着高于单纯肌肉挫伤（ρ<0.05）。相反,与巨噬细胞剔除相比,注射MGF导致损伤后TNF-α,IFN-γ,IL-1β和TGF-β水平显着降低（ρ<0.05）。再者,巨噬细胞剔除显着增加趋化因子（CCL2、CCL5和CXCR4）的表达（ρ<0.05）。然而,注射MGF显着降低巨噬细胞剔除后受损肌肉组织三种趋化因子（CCL2,CCL5和CXCR4）的表达（ρ<0.05）。9注射MGF降低巨噬细胞剔除后挫伤骨骼肌中gp91phox的表达。与巨噬细胞剔除比较,注射MGF显着降低了伤后3天gp91phox的表达（ρ<0.01）。10注射MGF降低巨噬细胞剔除后挫伤骨骼肌中基质金属蛋白酶的表达。巨噬细胞剔除导致损伤骨骼肌中MMP-1,MMP-2,MMP-9,MMP-10和MMP-14水平比单纯肌肉挫伤显着升高（ρ<0.05）。与巨噬细胞剔除比较,注射MGF在损伤后第3天显着抑制其增加（ρ<0.01）。结论:通过上述研究结果得出以下结论:（1）在巨噬细胞持续剔除的情况下,注射IGF-1可以促进巨噬细胞亚群（CD206）和VEGF、Angpt-1的表达的部分恢复。（2）IGF-1注射并不能完全弥补巨噬细胞在肌肉再生相关调节因子、肌源性调节因子和血管生成调节因子中的重要作用。因此,外源性补充IGF-1并不能改善由巨噬细胞剔除引起的小鼠挫伤骨骼肌的再生和修复受损。（3）注射MGF可部分改善由巨噬细胞剔除导致的小鼠骨骼肌再生受损和纤维化。（4）注射MGF降低了巨噬细胞剔除后挫伤骨骼肌炎性细胞因子、趋化因子、基质金属蛋白酶和gp91phox的表达,有利于减少挫伤骨骼肌的纤维化。
陈凯[8]（2018）在《黄连解胰汤通过抑制肿瘤微环境M2型巨噬细胞分化介导抗胰腺癌的作用及其机制》文中认为胰腺癌恶性程度高,治疗效果差,寻找新的治疗手段,是临床上亟待解决的课题。而炎症在胰腺癌恶性进展中扮演着了重要角色。针对该特点,我们以经典方剂黄连解毒汤（黄连、黄芩、黄柏、栀子）为基础,设计了黄连解胰汤方剂（Huang-Lian-Jie-Yi-Tang,HLJYT）。该方剂由黄连、黄芩、黄柏、栀子、柴胡配伍而成,具有清化湿热、泻火解毒的功效。在临床应用中该方具有一定抗肿瘤作用并能改善胰腺癌患者的临床症状。为了探明黄连解胰汤方剂的作用及其机制,本论文通过一系列体外、体内实验,研究了黄连解胰汤对胰腺癌细胞生长转移的影响,并通过基因芯片和生物信息学分析,探讨了黄连解胰汤抗肿瘤的分子机制。第一部分 黄连解胰汤对胰腺癌细胞生长及迁移的影响目的:中医学理论认为,大多数胰腺癌患者以“湿热”为主要证候。临床应用显示,具有清热解毒功效的黄连解胰汤可改善胰腺癌患者的临床症状。本部分旨在研究黄连解胰汤在体外是否能抑制胰腺癌PANC-1细胞的生长和迁移。方法:应用黄连解胰汤汤剂灌胃及腹主动脉取血法,制备大鼠黄连解胰汤含药血清以及对照血清,作为体外细胞实验用药;应用MTT法观察黄连解胰汤含药血清对PANC-1细胞的生长的作用;应用划痕实验观察黄连解胰汤含药血清对PANC-1细胞的迁移的作用。结果:MTT实验显示黄连解胰汤含药血清对PANC-1细胞体外生长无明显的效应;但划痕实验表明黄连解胰汤含药血清可有效抑制PANC-1细胞的迁移。结论:本部分研究结果发现,虽然黄连解胰汤含药血清对胰腺癌细胞生长并无直接的抑制作用,但可以抑制胰腺癌细胞的迁移能力。第二部分 黄连解胰汤对胰腺癌移植瘤生长的作用目的:本部分拟探讨黄连解胰汤在体内是否能影响裸鼠胰腺癌原位移植瘤的生长。方法:应用水煎剂法制备黄连解胰汤汤剂,作为动物实验用药;应用尾静脉注射二丁基二氯化锡（dibutyltindichloride,DBTC）技术建立裸鼠慢性炎症模型;采用胰腺原位包膜下注射PANC-1细胞悬液构建裸鼠胰腺原位移植瘤模型,及小动物活体成像Luminex技术检测裸鼠体内移植瘤萤光强度,评价移植瘤的生长;剥离瘤体测量并称重。应用免疫组化检测胰腺癌移植瘤组织标本的Ki-67、CD68、CD163的表达。结果:黄连解胰汤抑制胰腺癌移植瘤生长,并且这种抑制作用在具有炎症基础的模型中更为显着;黄连解胰汤抑制肿瘤组织Ki-67表达水平,以及巨噬细胞浸润。结论:本部分研究证实黄连解胰汤能够减少肿瘤组织中肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophages,TAMs）浸润,提示黄连解胰汤可能通过重组胰腺癌的免疫微环境,发挥抗肿瘤作用。第三部分 黄连解胰汤对肿瘤微环境M2型巨噬细胞分化和血管生成的作用及机制目的:研究表明,肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）更多地类似于M2型巨噬细胞,其释放的细胞因子、趋化因子以及生长因子等涉及肿瘤血管生成及肿瘤细胞浸润转移。本部分旨在研究黄连解胰汤对肿瘤微环境M2型巨噬细胞分化和血管生成的作用。方法:通过Transwell小室建立巨噬细胞与PANC-1细胞的共培养模型;应用流式细胞术,检测巨噬细胞表面标志物;采用基因芯片和生物信息学方法,检测及分析巨噬细胞的基因表达谱;通过体外血管生成实验检测巨噬细胞条件培养基对体外血管生成的影响结果:黄连解胰汤含药血清可在体外抑制M2型肿瘤相关巨噬细胞的分化;基因芯片及生信分析结果显示黄连解胰汤含药血清处理影响巨噬细胞多个基因表达及多条信号通路的活化,涉及与M2型巨噬细胞分化相关的MAPK信号通路、Notch信号通路、WNT信号通路、JAK/STAT信号通路等;体外血管生成实验显示,巨噬细胞条件培养基（macrophage conditioned medium,MCM）促进血管生成;黄连解胰汤方处理组,肿瘤组织标本中CD34+血管内皮细胞丰度下降、微血管密度（microvessel density,MVD）降低。结论:本部分研究证实黄连解胰汤通过抑制M2型巨噬细胞分化,减少TAMs浸润,调节胰腺癌肿瘤微环境,进而抑制肿瘤血管生成。
李晓丹[9]（2019）在《CXXC5表达通过CD40/CD40L通路对博来霉素小鼠肺纤维化的影响》文中指出研究目的:1.明确博来霉素（bleomycin,BLM）诱导肺纤维化小鼠（C57BL）肺组织中CXXC5表达情况及在CD4/CD40L通路中的表达情况。2.探讨CXXC5过表达对BLM诱导的C57BL/6小鼠肺纤维化及CD4/CD40L通路的影响。3.探讨BLM诱导的肺纤维化小鼠中,CXXC5是否经CD40/CD40L通路来抑制上皮-间质转化（EMT）来抑制肺纤维化。研究方法:1.构建含绿色萤光蛋白（Greenfluorescenceprotein,GFP）的CXXC5过表达的腺病毒表达载体。2.分组:随机将小鼠分为6组:生理盐水组（M组）、纤维化组（B组）、生理盐水+Ad-GFP组（M+Ad-GFP组）、生理盐水+Ad-CXXC5组（N+Ad-CXXC5组）、纤维化+Ad-GFP组（B+Ad-GFP组）、纤维化+Ad-CXXC5组（B+Ad-CXXC5组）,构建肺纤维化小鼠模型,并于造模后第7、14、28天脱颈处死小鼠,留取肺组织标本供实验用。3.肺组织进行HE染色和Masson染色,显微镜下观察纤维化程度,进一步行Ashcroft纤维化评分并测定羟脯氨酸含量。4.对各组小鼠肺组织进行RT-qPCR,检测CXXC5 mRNA、CollaⅠmRNA、CollaIIImRNA的表达。5.对各组小鼠肺组织进行Western Blot,检测CXXC5、CD40、CD40L、Fibronectin、Keratin-14的表达量。6.ELISA法测出各组肺组织中CollaⅠ和CollaⅢ的表达量。研究结果:1.构建出CXXC5过表达的腺病毒表达载体,并构建了BLM诱导的肺纤维化小鼠模型。2.对肺组织进行HE染色、Masson染色及纤维化评分,测定羟脯氨酸含量,我们发现B组与M组相比,肺纤维化程度明显加重;N+Ad-GFP、B+Ad-GFP分别与M组、B组相比,肺纤维化程度未见明显变化,说明绿色萤光蛋白对肺纤维化无影响;B组、B+Ad-GFP组比B+Ad-CXXC5组肺纤维化程度明显加重,说明CXXC5的过表达能抑制肺纤维化进展。3.经对各组小鼠在三个时间点BALF中细胞总数、巨噬细胞百分比（MACR%）及中性粒细胞百分比（NEUT%）的变化的比较,我们发现在7、14、28天,M+Ad-CXXC5组与M组、M+Ad-GFP组相比,上述指标均无明显差异;B组与M组相比,肺泡灌洗液中细胞总数、NEUT%明显增高,而MACR%显着低于M组;B+Ad-CXXC5组与B组、B+Ad-GFP组相比,细胞总数及NEUT%均明显降低,而MACR%较两组显着升高。4.Western blot检测小鼠肺组织中CXXC5及CXXC5相关蛋白表达。我们发现M组与B组在三个时间点相比,B组间充质细胞标记物Fibronectin及胶原成分CollaⅠ、CollaIII的表达较M组显着升高,上皮细胞标志物Keratin-14表达明显降低,CXXC5显着降低,CD40/CD40L信号通路相关蛋白CD40、CD40L表达量明显增加。M组和M+Ad-GFP组比较、B组和B+Ad-GFP组分别在三个时间点比较,肺组织中CXXC5、Fibronectin的表达水平未见明显变化。B组、B+Ad-GFP组与B+Ad-CXXC5组在三个时间点相比,Fibronectin的表达明显增加,CXXC5明显降低,CD40/CD40L信号通路相关蛋白CD40/CD40L表达量明显增加。5.RT-qPCR测CXXC5 mRNA、CollaⅠmRNA、CollaⅢmRNA表达发现,B组CXXC5 mRNA、CollaⅠmRNA、CollaⅢmRNA的表达较M组显着升高。M组和M+Ad-GFP组比较、B组和B+Ad-GFP组分别在三个时间点比较,肺组织中CollaⅠmRNA、CollaⅢmRNA的表达水平未见明显变化。B组、B+Ad-GFP组与B+Ad-CXXC5组在三个时间点相比,CollaⅠmRNA及CollaⅢmRNA的表达明显增加。6.ELISA法测各组肺组织中CollaI、CollaIII的表达发现,B组CollaI、CollaIII的表达较M组显着升高。M组和M+Ad-GFP组比较、B组和B+Ad-GFP组分别在三个时间点比较,肺组织中CollaI、CollaIII的表达水平未见明显差异。B组、BLM+Ad-GFP组与BLM+Ad-CXXC5组在三个时间点相比,CollaI、CollaIII的表达明显增加。研究结论:1.博来霉素诱导肺纤维化C57BL小鼠肺组织中CXXC5表达降低。2.博来霉素诱导肺纤维化C57BL小鼠肺组织中CD4/CD40L通路表达增加。3.CXXC5过表达经抑制CD4/CD40L通路抑制博来霉素小鼠EMT的发生,进而影响纤维化进展。4.CXXC5过表达抑制了纤维化进展,可能作为肺纤维化治疗提供新靶点。
潘玮[10]（2017）在《白藜芦醇通过SIRT1/NF-κB/CD40途径调控动脉粥样硬化免疫炎性反应的机制研究》文中认为目的白藜芦醇被证实具有延长寿命、抗氧化、抗衰老、抗炎症等心血管保护作用,但其抗炎机制尚未完全清楚,近年研究证实CD40与其配体CD40L相互作用在动脉粥样硬化炎症反应中扮演着非常重要的角色,本研究旨在通过细胞及动物实验,模拟人体动脉粥样硬化模型,研究CD40/CD40L信号轴对血管内皮炎性损伤和动脉粥样硬化的影响及机制,阐明白藜芦醇通过SIRT1激活,调控CD40/CD40L信号通路抑制血管炎症反应及抗动脉硬化的可能分子机制,发掘白藜芦醇重要的生物学意义和临床使用价值。方法:1.白藜芦醇对HUVECs增殖活力及炎症环境下释放的炎症因子、趋化因子和活性氧的影响,不同浓度TNF-α和白藜芦醇作用于HUVECs,观察细胞的增殖活力,ELISA法检测细胞上清液的炎症因子IL-6,趋化因子MCP-1的水平,流式细胞法检测活性氧的水平。2.观察SIRT1在白藜芦醇作用下HUVEC内的表达定位,细胞免疫荧光染色法检测在白藜芦醇、SIRT1小干扰RNA作用下SIRT1在TNF-α刺激的HUVECs内细胞质和细胞核内的表达定位。3.筛选白藜芦醇干预TNF-α刺激的HUVECs后的差异表达基因,检测SIRT1和CD40表达水平改变,全基因组表达谱芯片筛选白藜芦醇干预TNF-α刺激的HUVECs后的差异表达基因。采用RT-PCR和WB法,观察一定TNF-α浓度诱导后,内皮细胞在白藜芦醇作用下SIRT1、CD40、NF-κB、p38 MAPK的转录水平和蛋白水平表达变化。4.采用免疫共沉淀法观察SIRT1蛋白与NF-κB蛋白的结合情况,采用双荧光素酶报告基因实验检测NF-κB结合对CD40启动子区的转录活性的调节。通过p38MAPK的抑制剂SB203580干预观察p38 MAPK对NF-κB的活性的影响。5.高脂喂养LDLR-/-转基因小鼠,构建动脉粥样硬化模型,观察白藜芦醇对动脉粥样硬化小鼠的脂质代谢及斑块大小的影响,将LDLR-/-小鼠分四组,分别为普通饲料组,高脂饮食加丙二醇溶剂组,高脂饮食组,高脂饮食加白藜芦醇干预组。检测血脂水平,HE染色及病理组化检测斑块大小及CD40表达。结果:1.白藜芦醇保护内皮细胞的增殖活力抑制炎性反应下释放的炎症因子、趋化因子和活性氧:CCK-8结果显示10μg/L TNF-α对HUVECs的细胞活力产生抑制作用,在10-20μmol/L的浓度范围内白藜芦醇预处理HUVECs可保护损伤的细胞活力,并且呈浓度依赖性。TNF-α促进HUVECs炎症因子IL-6、趋化因子MCP-1的释放,增加胞内活性氧的产生。白藜芦醇抑制上述炎症因子及趋化因子的释放,抑制活性氧的产生,抑制单核细胞的迁移活动。2.SIRT1在细胞胞质与胞核内均有表达,白藜芦醇活化SIRT1促进SIRT1从细胞质转向细胞核调节下游信号分子。3.白藜芦醇促进TNF-α刺激的HUCECs的SIRT1转录及蛋白水平的表达,抑制CD40、NF-κB的表达水平的改变,抑制p38 MAPK的磷酸化。4.白藜芦醇可以通过SIRT1活化抑制NF-κB的活性并抑制p38 MAPK的磷酸化水平。白藜芦醇可能通过抑制NF-κB与CD40启动子的结合抑制CD40的转录水平。5.白藜芦醇控制高脂喂养LDLR-/-转基因小鼠体重,调节动脉粥样硬化小鼠血浆中总甘油三酯、总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇的水平,升高动脉粥样硬化小鼠血浆中高密度脂蛋白胆固醇的水平。白藜芦醇减少脂质斑块的产生,减小脂质斑块的面积,抑制内膜增生,降低CD40表达水平。结论:1.白藜芦醇抑制TNF-α刺激脐静脉内皮细胞上清液IL-6和MCP-1的水平并调节SIRT1、CD40、p38 MAPK和NF-κB的表达,提示其抗炎症的分子机制可能为:白藜芦醇激活SIRT1抑制它的下游信号分子p38 MAPK和NF-κB的活性,进而抑制CD40的转录及蛋白表达水平,使炎性细胞因子及趋化因子减少,单核巨噬细胞迁移减少。2.高脂饮食喂养成功建立了LDLR-/-小鼠动脉粥样硬化模型;白藜芦醇可有效降低血脂水平,改善LDLR-/-模型小鼠的动脉粥样硬化炎症及斑块稳定性,其机制与部分抑制CD40的表达有关,为CD40作为白藜芦醇治疗动脉粥样硬化的重要靶点奠定基础。
二、CD40-CD40配体相互作用对人脐静脉内皮细胞组织因子、基质金属蛋白酶及其抑制物表达的影响（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、CD40-CD40配体相互作用对人脐静脉内皮细胞组织因子、基质金属蛋白酶及其抑制物表达的影响（论文提纲范文）
（1）TSP-1/CD47信号通路调节动脉粥样硬化易损斑块的稳定性及其相关调控机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 第1章 前言 |
| 第2章 文献综述 |
| 2.1 动脉粥样硬化发展的始终过程 |
| 2.2 炎性反应在动脉粥样硬化中的作用 |
| 2.3 动脉粥样硬化中的先天性和适应性免疫应答 |
| 2.4 各种信号通路在动脉粥样硬化形成中的作用 |
| 2.4.1 TSP-1/CD47 通路对动脉粥样硬化斑块的作用 |
| 2.4.2 HIF/VEGF通路对动脉粥样硬化斑块形成的作用 |
| 2.4.3 CD40/CD40L在动脉粥样硬化斑块中的作用 |
| 2.4.4 CD137 在动脉粥样硬化发展中的作用 |
| 2.4.5 AP-2α/IkBα/NF-κB/NAD(P)H通路的抗动脉粥样硬化作用 |
| 2.4.6 OPG/RANK/RANKL通路在动脉粥样硬化中的作用 |
| 2.5 CD47 信号通路对动脉粥样硬化的影响 |
| 2.6 动脉粥样硬化中的相关因子可以作为治疗靶点 |
| 第3章 动脉粥样硬化体内模型的建立 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.3 统计学分析 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 结论 |
| 第4章 动脉粥样硬化apoE~-/-小鼠模型内HIF-1、TSP-1、CD47、VEGF和VEGFR2等因子的变化 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验方法 |
| 4.3 统计学分析 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 Western blot法测定不同实验组中小鼠腹主动脉HIF-1、TSP-1、CD47、VEGF、VEGFR2的蛋白表达水平 |
| 4.4.2 Western blot法测定加入抗CD47 药物干预后不同实验组中小鼠腹主动脉HIF-1、TSP-1、CD47、VEGF、VEGFR2的蛋白表达水平 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 结论 |
| 第5章 人脐静脉内皮细胞(HUVECs)炎症模型的建立及药物干预后各因子的表达变化 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 主要实验材料 |
| 5.2.2 实验方法 |
| 5.3 统计学分析 |
| 5.4 实验结果 |
| 5.4.1 Western blot法测定LPS的加药浓度 |
| 5.4.2 CCK-8测定HUVECs细胞存活率和合适药物浓度的选择 |
| 5.4.3 Western blot法测定HUVECs细胞各实验组别TSP-1、HIF-1、CD47、VEGF、VEGFR2的蛋白表达水平 |
| 5.5 讨论 |
| 5.6 结论 |
| 5.7 不足与展望 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（2）脂肪细胞来源外泌体在糖尿病动脉粥样硬化疾病中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 论文Ⅰ 脂肪细胞来源外泌体介导的内皮间质转化在糖尿病血管再狭窄中的作用及机制研究 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 创新点 |
| 限制性 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 论文Ⅱ 脂肪细胞来源外泌体在血管新生中的作用及机制研究 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 创新点 |
| 限制性 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的论文 |
| SCI论文Ⅰ |
| SCI论文Ⅱ |
| SCI论文Ⅲ |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（3）咖啡酸苯乙酯对早期腹主动脉瘤保护作用的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 前言 |
| 第1 部分 人体AAA组织的病理学研究 |
| 1 引言 |
| 2.材料与方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 人AAA组织HE及 VG染色 |
| 3.2 免疫组化检测组织SIRT1、CD40、NF-κBp65、MMP-2及MMP-9的表达 |
| 3.3 免疫组化检测组织CD31 及CD68 的表达 |
| 4.讨论 |
| 5 结论 |
| 第2 部分 咖啡酸苯乙酯对大鼠AAA形成早期保护作用的研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要材料与试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 CAPE对大鼠AAA直径的影响 |
| 3.2 CAPE对大鼠AAA形成早期血管管壁病理结构的影响 |
| 3.3 CAPE对大鼠AAA形成早期平滑肌细胞的影响 |
| 3.4 CAPE对大鼠AAA形成早期组织ROS含量的影响 |
| 3.5 CAPE对大鼠AAA形成早期瘤壁组织CD31 表达的影响 |
| 3.6 CAPE对大鼠AAA形成早期瘤壁组织巨噬细胞浸润表达的影响 |
| 3.7 免疫组化检测CAPE对大鼠AAA形成早期瘤壁组织MMP-2 和MMP-9 表达的影响 |
| 3.8 Westernblot法检测CAPE对大鼠AAA形成早期瘤壁组织IL-6、SIRT1、NF-κBp65、单核细胞趋化蛋白1(Monocytechemoattractant protein-1,MCP-1)、MMP-2、MMP-9、CD40 蛋白的表达 |
| 4 讨论 |
| 4.1 CAPE对 AAA形成早期新生血管形成的影响。 |
| 4.2 CAPE对 AAA形成早期氧化应激的影响 |
| 4.3 CAPE对 AAA形成早期VSMC的影响 |
| 4.4 CAPE对 AAA形成早期管壁炎症反应的影响 |
| 4.5 CAPE对 AAA形成早期管壁浸润的巨噬细胞表型变化的影响 |
| 4.6 CAPE对 AAA形成早期CD40、SIRT1、NF-κB表达的影响 |
| 5 结论 |
| 第3 部分 CAPE抑制TNF-α诱导人脐静脉内皮细胞炎症反应的机制研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 原代HUVECs鉴定 |
| 3.2 不同浓度TNF-α刺激对HUVECs表达IL-6及MCP-1 的影响 |
| 3.3 不同剂量CAPE对 TNF-α刺激后HUVECs表达IL-6及MCP-1 的影响 |
| 3.4 CAPE对 TNF-α刺激后HUVECs表达SIRT1 的影响 |
| 3.5 CAPE对 TNF-α刺激后HUVECs表达CD40 的影响 |
| 3.6 CAPE对 TNF-α刺激HUVECs后 NF-κB通路的影响 |
| 4 讨论 |
| 4.1 CAPE减轻TNF-α刺激HUVECs后细胞的炎症反应水平 |
| 4.2 CAPE对 TNF-α刺激HUVECs后 SIRT1及CD40 蛋白表达的影响 |
| 4.3 CAPE对 TNF-α刺激HUVECs后 SIRT1及CD40 的影响与NF-κB通路相关性 |
| 5 结论 |
| 全文结论 |
| 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 综述 腹主动脉瘤的发病机制研究进展 |
| 参考文献 |
（4）脂多糖通过诱导IFIT1表达促进人脐静脉内皮细胞炎症反应（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 实验结果 |
| 1. LPS处理人脐静脉内皮细胞后,IFIT1的表达上调 |
| 2. pcDNA-IFIT1上调LPS诱导的NF-κB和炎症因子的表达 |
| 3. siRNA-IFIT1下调LPS诱导的NF-κB和炎症因子的表达 |
| 讨论 |
| 1. 炎症在动脉粥样硬化病理形成中发挥重要作用 |
| 2. IFIT1介导LPS诱导的人脐静脉内皮细胞炎症反应 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 缩写词简表 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间成果 |
| 致谢 |
（5）艾灸及艾烟改善动脉粥样硬化的细胞自噬机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一 细胞自噬在动脉粥样硬化发病机制中的作用研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述二 艾灸疗法防治高脂血症并动脉粥样硬化症的研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述三 中医药疗法调控自噬机制防治心血管疾病的研究进展 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 第二部分 实验研究 |
| 第一章 艾灸及艾烟对APOE~(-/-)小鼠AS斑块、血脂及一般状况的实验研究 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二章 艾灸及艾烟对APOE~(-/-)小鼠AS斑块稳定性的实验研究 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第三章 艾灸及艾烟对APOE~(-/-)小鼠自噬特异性的实验研究 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第四章 艾灸及艾烟调控APOE~(-/-)小鼠自噬信号通路及细胞凋亡的实验研究 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 讨论 |
| 1. 动物模型的选择 |
| 2. 艾灸疗法改善AS过程中自噬水平的作用机制 |
| 3. 艾灸改善自噬调控AS斑块稳定性的作用机制 |
| 4. 艾燃烧生成物的生物效应 |
| 结语 |
| 创新与展望 |
| 创新点 |
| 研究不足与未来研究方向 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在学期间主要研究成果 |
（6）血小板微粒在心肌梗死、压力负荷心肌病中的价值（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩写 |
| 引言 |
| 第一部分 血小板微粒与心肌梗死面积相关性研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 钙蛋白酶在心肌梗死中的作用及对血小板微粒的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 血小板微粒在压力负荷心肌病评估中的作用 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 血小板相关因子在动脉粥样硬化中价值 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（7）IGF-1和MGF干预对巨噬细胞剔除所致骨骼肌再生受损的影响及其作用机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 论文总体设计 |
| 第一部分 IGF-1或MGF和巨噬细胞介导的损伤骨骼肌再生的关系研究综述 |
| 1 前言 |
| 2 巨噬细胞及其亚群和损伤骨骼肌的再生与修复 |
| 2.1 在肌再生中巨噬细胞和骨骼肌肌源性调节因子 |
| 2.2 在肌再生中巨噬细胞和骨骼肌肌再生调节因子 |
| 2.3 在肌再生中巨噬细胞和骨骼肌炎症性细胞因子 |
| 2.4 在肌再生中巨噬细胞和骨骼肌趋化因子 |
| 2.5 在肌再生中巨噬细胞和骨骼肌血管再生调节因子 |
| 2.6 在肌再生中巨噬细胞和骨骼肌基质金属蛋白酶 |
| 2.7 在肌再生中巨噬细胞和骨骼肌氧化应激因子 |
| 3 IGF-1和损伤骨骼肌的再生与修复 |
| 3.1 在肌再生中IGF-1和骨骼肌肌源性调节因子 |
| 3.2 在肌再生中IGF-1和巨噬细胞及其亚群 |
| 3.3 在肌再生中IGF-1和骨骼肌炎症性细胞因子 |
| 3.4 在肌再生中IGF-1和骨骼肌趋化因子 |
| 3.5 在肌再生中IGF-1和骨骼肌血管再生调节因子 |
| 3.6 在肌再生中IGF-1和骨骼肌基质金属蛋白酶 |
| 4 MGF和损伤骨骼肌的再生与修复 |
| 4.1 在肌再生中MGF和骨骼肌肌源性调节因子 |
| 4.2 在肌再生中MGF和巨噬细胞及其亚群 |
| 4.3 在肌再生中MGF和骨骼肌炎症性细胞因子 |
| 4.4 在肌再生中MGF和骨骼肌血管再生调节因子 |
| 4.5 在肌再生中MGF和骨骼肌基质金属蛋白酶 |
| 第二部分 注射IGF-1未改善巨噬细胞剔除所致的骨骼肌再生受损的影响及其作用机制研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 动物 |
| 2.2 实验设计 |
| 2.3 骨骼肌挫伤动物模型 |
| 2.4 脂质体注射 |
| 2.5 IGF-1注射 |
| 2.6 肌肉再生和纤维化的组织形态学评价 |
| 2.7 免疫荧光染色 |
| 2.8 RNA分离与逆转录聚合酶链反应(RT-PCR) |
| 2.9 实时定量PCR(Rt-qPCR) |
| 2.10 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 注射IGF-1对巨噬细胞剔除后挫伤骨骼肌肌再生的影响 |
| 3.2 注射IGF-1对巨噬细胞剔除后挫伤骨骼肌纤维化的影响 |
| 3.3 注射IGF-1对巨噬细胞剔除后挫伤骨骼肌巨噬细胞及其亚型的影响 |
| 3.4 注射IGF-1对巨噬细胞剔除后挫伤骨骼肌肌源性调节因子的影响 |
| 3.5 注射IGF-1对巨噬细胞剔除后挫伤骨骼肌血管生成调节因子的影响 |
| 4 讨论 |
| 4.1 注射IGF-1未改善挫伤肌肉中巨噬细胞剔除所致的再生肌纤维减少 |
| 4.2 注射 IGF-1 未能改善由巨噬细胞剔除引起的挫伤肌肉的延迟修复(其取决于MRFs 增加),特别是在修复的后期 |
| 4.3 注射 IGF-1 未改善挫伤肌肉中巨噬细胞剔除所致的肌肉纤维化加重 |
| 4.4 注射 IGF-1 未能促进巨噬细胞剔除后巨噬细胞亚群之间的协调,从而未改善挫伤肌肉的再生和修复 |
| 4.5 注射IGF-1部分改善了巨噬细胞剔除诱导的血管生成调节因子的抑制,但不能改善挫伤肌肉受损的再生和修复 |
| 5 结论 |
| 第三部分 注射 MGF 对巨噬细胞剔除所致的骨骼肌再生受损的影响及其作用机制研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 动物 |
| 2.2 骨骼肌挫伤模型 |
| 2.3 巨噬细胞剔除 |
| 2.4 MGF处理 |
| 2.5 HE染色 |
| 2.6 Masson三色染色 |
| 2.7 免疫荧光染色 |
| 2.8 RNA提取,cDNA合成和实时聚合酶链式反应(PCR) |
| 2.9 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 注射MGF对巨噬细胞剔除后挫伤骨骼肌肌再生的影响 |
| 3.2 注射MGF对巨噬细胞剔除后挫伤骨骼肌纤维化的影响 |
| 3.3 注射MGF对巨噬细胞剔除后挫伤骨骼肌卫星细胞功能状态的影响 |
| 3.4 注射MGF对巨噬细胞剔除后挫伤骨骼肌巨噬细胞标志物的影响 |
| 3.5 注射MGF对巨噬细胞剔除后挫伤骨骼肌炎性细胞因子的影响 |
| 3.6 注射MGF对巨噬细胞剔除后挫伤骨骼肌趋化因子的影响 |
| 3.7 注射MGF对巨噬细胞剔除后挫伤骨骼肌基质金属蛋白酶的影响 |
| 3.8 注射MGF对巨噬细胞剔除后挫伤骨骼肌gp91phox的影响 |
| 4 讨论 |
| 4.1 注射MGF对巨噬细胞剔除后肌纤维再生无改善作用,但能减轻巨噬细胞剔除后挫伤骨骼肌的纤维化 |
| 4.2 注射MGF不影响巨噬细胞剔除后挫伤骨骼肌卫星细胞的功能状态 |
| 4.3 注射MGF不影响巨噬细胞剔除后挫伤骨骼肌巨噬细胞标志物的表达 |
| 4.4 注射MGF降低巨噬细胞剔除后挫伤骨骼肌炎性细胞因子的表达 |
| 4.5 注射MGF降低巨噬细胞剔除后挫伤骨骼肌趋化因子的表达 |
| 4.6 注射MGF降低巨噬细胞剔除后挫伤骨骼肌基质金属蛋白酶的表达 |
| 4.7 注射MGF降低巨噬细胞剔除后挫伤骨骼肌gp91phox的表达 |
| 5 结论 |
| 全文总结 |
| 缩略词表 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士期间科研与发表论文情况 |
（8）黄连解胰汤通过抑制肿瘤微环境M2型巨噬细胞分化介导抗胰腺癌的作用及其机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 黄连解胰汤对胰腺癌细胞生长及迁移的影响 |
| 1 材料及试剂 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 黄连解胰汤对胰腺癌移植瘤生长的作用 |
| 1 材料及试剂 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 黄连解胰汤对肿瘤微环境M2型巨噬细胞分化和血管生成的作用及机制 |
| 1 材料及试剂 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文小结 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 中英文对照缩略词表 |
| 攻读博士学位期间取得的学术成果 |
| 致谢 |
（9）CXXC5表达通过CD40/CD40L通路对博来霉素小鼠肺纤维化的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 第一章 实验材料 |
| 1.实验试剂 |
| 2.实验仪器 |
| 3.实验动物 |
| 第二章 实验方法及步骤 |
| 1.过表达CXXC5 重组腺病毒表达载体的构建 |
| 2.纤维化小鼠模型的制备 |
| 3.肺泡灌洗液分类、计数 |
| 4.小鼠肺组织HE染色、Masson染色 |
| 5.各组小鼠肺组织羟脯氨酸含量测定 |
| 6.Western Blot测各组肺组织CXXC5、CD40、CD40L、Fibronectin、Keratin-14的表达 |
| 7.RT-qPCR测 CXXC5、CollaImRNA、CollaIIImRNA表达 |
| 8.ELISA检测各组肺组织中CollaI、Colla III的表达 |
| 9.统计学方法 |
| 第三章 实验结果 |
| 1 构建CXXC5 过表达的腺病毒载体 |
| 2 小鼠肺组织的结构变化 |
| 3 肺泡灌洗液中细胞分类和计数 |
| 4 Western Blot测各组肺组织CXXC5、CD40、CD40L、Fibronectin、Keratin-14的表达 |
| 5 RT-qPCR测 CXXC5mRNA、CollaImRNA、CollaIIImRNA表达 |
| 6 ELISA检测各组肺组织中CollaI、Colla III的表达 |
| 讨论 |
| 实验结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 综述参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 致谢 |
（10）白藜芦醇通过SIRT1/NF-κB/CD40途径调控动脉粥样硬化免疫炎性反应的机制研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 白藜芦醇对脐静脉内皮细胞炎症因子的影响 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分 白藜芦醇对脐静脉内皮细胞CD40表达的机制探讨 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三部分 白藜芦醇对LDLR-/-动脉粥样硬化小鼠的脂质和CD40的影响 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
四、CD40-CD40配体相互作用对人脐静脉内皮细胞组织因子、基质金属蛋白酶及其抑制物表达的影响（论文参考文献）
- [1]TSP-1/CD47信号通路调节动脉粥样硬化易损斑块的稳定性及其相关调控机制研究[D]. 窦曼曼. 吉林大学, 2021(01)
- [2]脂肪细胞来源外泌体在糖尿病动脉粥样硬化疾病中的作用及机制研究[D]. 陈芳芳. 山东大学, 2021(10)
- [3]咖啡酸苯乙酯对早期腹主动脉瘤保护作用的研究[D]. 占钻. 南昌大学, 2021(01)
- [4]脂多糖通过诱导IFIT1表达促进人脐静脉内皮细胞炎症反应[D]. 王佳丽. 南方医科大学, 2020
- [5]艾灸及艾烟改善动脉粥样硬化的细胞自噬机制研究[D]. 哈略. 北京中医药大学, 2020(04)
- [6]血小板微粒在心肌梗死、压力负荷心肌病中的价值[D]. 耿小勇. 河北医科大学, 2020(01)
- [7]IGF-1和MGF干预对巨噬细胞剔除所致骨骼肌再生受损的影响及其作用机制研究[D]. 曾志刚. 上海体育学院, 2019
- [8]黄连解胰汤通过抑制肿瘤微环境M2型巨噬细胞分化介导抗胰腺癌的作用及其机制[D]. 陈凯. 苏州大学, 2018(04)
- [9]CXXC5表达通过CD40/CD40L通路对博来霉素小鼠肺纤维化的影响[D]. 李晓丹. 青岛大学, 2019(03)
- [10]白藜芦醇通过SIRT1/NF-κB/CD40途径调控动脉粥样硬化免疫炎性反应的机制研究[D]. 潘玮. 福建医科大学, 2017(07)
标签：内皮细胞论文; 糖尿病论文; 基质金属蛋白酶论文; 主动脉粥样硬化论文; 胰岛素抵抗综合征论文;