一、添加化学试剂对红豆杉培养细胞生长的影响（论文文献综述）
张智慧[1]（2021）在《东北红豆杉产紫杉醇内生真菌Alternaria alternata F3的分离鉴定及体外抗癌活性研究》文中认为东北红豆杉（Taxus cuspidata）是红豆杉科红豆杉属植物的一种,主要分布在中国东北、日本、韩国、朝鲜和俄罗斯远东,因其能产生一线抗癌药物紫杉醇而受到广泛关注。红豆杉是我国珍稀濒危保护树种,其紫杉醇含量极低。传统方法从红豆杉树皮中提取分离紫杉醇,对植物资源造成了严重破坏。寻找紫杉醇新的药源途径是本领域的研究热点。与从植物中提取的传统方法相比,微生物发酵法具有不受植物生长季节、地域限制、容易进行遗传操作和规模化生产等优点,成为获取紫杉醇的重要研究方向。内生真菌是指生活在健康宿主的内部组织中,能够与植物长期共存生活,通常不会对植物本身带来任何损害或疾病,且能够产生与其宿主相同或相似结构的代谢产物的微生物。因此内生真菌可以作为次级代谢产物的重要来源。本研究拟从东北红豆杉植株中分离纯化内生真菌,通过薄层色谱（TLC）、高效液相色谱（HPLC）和超高效液相—质谱联用（UPLC-MS/MS）筛选到可以产紫杉醇的内生真菌,并对内生真菌发酵培养条件优化,使内生真菌紫杉醇的产量最大化;并对产紫杉醇内生真菌发酵液提取物的抗癌活性进行研究。主要研究结果如下:1.从东北红豆杉的根、茎、叶、果实不同组织中,共分离纯化得到84株内生真菌。依据《真菌鉴定手册》对内生真菌分类,并结合分子生物学方法鉴定其种属,其主要分为以下10个种属:镰刀菌属（Fusarium sp.）,附球胞属（Epicoccum sp.）,派伦霉属（Peyronellaea sp.）,链格胞属（Alternaria sp.）,单梗双胞霉属（Didymella sp.）,茎点霉属（Phoma sp.）,类壳小圆孢（Paraconiothyrium sp.）,地霉属（Geotrichum sp.）,盾壳霉属（Coniothyrium sp.）,轮层炭壳属（Daldinia sp.）。2.通过TLC、HPLC和UPLC-MS/MS方法对分离得到的内生真菌二氯甲烷提取物进行分析,鉴定内生真菌粗提物是否含有紫杉醇。利用TLC检测,以氯仿/甲醇（5:1,v/v）为展开剂,利用UV254nm显色,发现一株果实中分离出的内生真菌F3粗提物与紫杉醇标准品在同一位置具有相同颜色的斑点,Rf值为0.75;利用HPLC对该真菌发酵液提取物进一步分析,确定了 HPLC检测条件:色谱柱:HiQ sil C18W（4.6 mm×250 mm,5μm）,柱温30℃,流动相为乙腈和水,检测波长:227 nm,流速为1 mL/min,内生真菌F3提取物与紫杉醇标准品在26.7 min出现相同的色谱峰;利用UPLC-MS/MS对F3真菌发酵液提取物中紫杉醇进行鉴定,其在1.7 min可以产生和紫杉醇同样的m/z为876的一级母离子,对该峰进一步分析,F3真菌发酵液提取物和紫杉醇标准品同样可以产生m/z308的二级子离子峰,证明该内生真菌F3可以特异性产紫杉醇。通过形态学观察和ITS基因序列鉴定分析,比对序列同源性,确定了 F3菌株为链格孢菌Alternaria alternata。3.通过单因素试验,考察了不同发酵培养基,不同接种量,培养基不同初始pH,不同培养温度,不同的培养时间对内生真菌Alternariaalternata F3紫杉醇产量的影响;通过Plackett-Burman试验和中心组合设计（CCD）试验,筛选最佳的前体与诱导子的种类和浓度。最终优化出该真菌的最佳培养条件:在YPD培养基中,接种量2%,培养基初始pH 6.0,培养温度28℃,在培养基中添加乙酸钠0.1 g/L,水杨酸0.25 g/L,硝酸银0.00125 g/L;在最佳培养条件下,紫杉醇的产量195.4±0.23 μg/L,是基础培养条件的2.17 倍。4.采用MTT法,探究了内生真菌Alternaria alternata F3发酵液二氯甲烷提取物对肺癌A549和宫颈癌HeLa细胞存活率的影响。实验结果表明,F3真菌发酵液提取物对A549和HeLa细胞存活率的抑制作用呈时间和剂量依赖性;不同浓度F3真菌发酵液提取物处理 A549,其 IC50在 24 h、48h、72 h 分别为 26.36 μg/mL、23.89 μg/mL 和 15.95μg/mL;当用相同浓度F3真菌发酵液提取物处理Hela细胞时,其IC50在24 h、48h、72 h 分别为 14.24 μg/mL、11.15 μg/mL 和 11.70 μg/mL。综上所述,本研究通过对东北红豆杉内生真菌分离,共分离出84株内生真菌,筛选出一株特异性产紫杉醇内生真菌Alternaria alternata F3。通过发酵条件优化,提高紫杉醇的产量。通过对真菌紫杉醇提取物的抗癌活性研究,证实了真菌发酵液提取物对A549和HeLa细胞的存活率具有显着的抑制作用。本试验为未来利用分子生物学方法改良和培育新型的产紫杉醇内生真菌品种,提供了菌株基础,为未来利用微生物发酵法工业化生产紫杉醇奠定了基石。本论文的研究成果丰富了紫杉醇新的药物来源,值得开发利用。
李弘琨[2]（2021）在《东北红豆杉内生真菌多样性与紫杉烷积累的相关性规律解析及其高产菌株的应用》文中提出红豆杉是地球上濒临灭绝的天然抗癌植物,是经过了 250万年的古老孑遗树种,有植物界“活化石”之称。红豆杉植物中含有多种生物活性的代谢产物,如紫杉烷类、生物碱类、黄酮类、有机酸类、苯丙素类、木脂素类、萜类等,其中紫杉醇因活性强、抗癌机制独特成为世界各国医院首选的一线广谱抗癌药物的原料药。自然条件下红豆杉生长速度缓慢,再生能力差,并且红豆杉中紫杉醇浓度约为0.02-0.069%,市场供不应求,原料短缺问题日益严峻。自上世纪90年初Stierle等首次获得产紫杉醇的内生真菌,植物内生真菌成为筛选新的具有生物活性代谢产物的重要来源,以期代替繁琐而低效的“不可持续的资源利用方式”。据报道,内生真菌种群的生物多样性和产与宿主相同成分的次生代谢产物多样性,对宿主植物化合物的产生、积累及其他生命活动起着重要的作用。本研究以东北红豆杉（Taxus cuspidata Sieb.et Zucc.）为研究对象,利用UPLC-Q Exactive Focus Orbitrap/MS技术对东北红豆杉的整体代谢成分进行快速、全面的成分分析。结合UPLC-MS/MS技术对东北红豆杉四个器官的紫杉烷标志性代谢物进行定量比较,并系统地研究内生真菌生物多样性及与宿主植物紫杉烷类代谢产物的相关性,建立新的策略来筛选具有产生生物活性的菌株并探究内生真菌在不同部位紫杉烷差异代谢形成中的作用,为东北红豆杉植物与内生真菌的进一步开发利用提供科学依据。本论文主要研究内容及结果如下:1、首次系统地对东北红豆杉不同器官内生真菌进行分类鉴定及种群多样性分析从东北红豆杉4个器官部位（根部、枝条、针叶、果实）共分离出内生真菌262株,其中根部内生真菌98株,枝条中内生真菌86株,针叶中内生真菌69株,果实中内生真菌9株,通过核糖体DNA中的内转录间隔区（ITS）序列Blast比对并对分离得到的内生真菌构建系统发育进化树,聚类到真菌界子囊菌门Ascomycota的4纲10目14科17属。器官对东北红豆杉内生真菌组成、优势类群（目、属、种水平上）的分布有显着的影响,其中仅4个种属为四个组织共有;果实中的内生真菌多样性及丰度最低,7个种属为根部、枝条、针叶三个组织共有;3个种属为根部和枝条两个器官共有;头孢菌属（Cephalosporium sp.）为仅枝条和针叶两个器官共有。本研究中木霉属Trichoderma表现出根部组织专一性;Eurotiales、Pleosporales和Hypocreales为最优势目;Penicillium、Aspergillus、Alternaria、Fusarium、Xylaria、Botrytis、Phoma和Trichoderma最优势属的分布具有显着的组织特异性。器官对东北红豆杉内生真菌多样性及丰度也有显着的影响,根部和枝条中内生真菌物种丰富度分别是针叶的1.91-2.36倍;果实的17.19-21.37倍;针叶的丰度约果实的9倍;多个优势菌种不同程度地体现出显着的组织特异性。2、植物代谢组学对东北红豆杉整体代谢成分的研究全面分析了东北红豆杉的代谢成分,结合一级、二级质谱及裂解规律确定了 12466个离子特征,对应5498个具有注释的潜在代谢物,初步鉴定了 239个化合物,包括紫杉烷类、黄酮类、萜类、生物碱类、有机酸类、苯丙素类、甾体类、糖类及氨基酸类等。主成分分析（PCA）表明根部和枝条间的代谢物差异较小,具有相同或相似的代谢成分;与针叶和果实间的代谢物差异明显。这些代谢产物参与了 80条代谢途径,主要包括柠檬酸循环（TCA循环）、氨基糖和核苷酸糖的生物合成途径、苯丙氨酸代谢途径、萜类骨架生物合成途径、脂肪酸生物合成途径、苯丙烷生物合成途径、甾体生物合成途径、花青素生物合成类黄酮生物合成途径、黄酮和黄酮醇生物合成途径、异喹啉生物碱生物合成途径等。东北红豆杉中紫杉烷总量最高,紫杉烷类化合物分布在红豆杉植物全身,且不同部位的含量和种类分布差异较大。对紫杉醇途径前体物质、中间产物和紫杉烷类代谢物进行差异分析,结合UPLC-MS/MS对器官的标志性代谢物进行定量比较,对7个目标紫杉烷类化合物进行分析检测,推测紫杉烷类物质在器官部位中合成,运输和积累的方式。3、东北红豆杉不同器官紫杉烷差异代谢物与内生真菌的相关性分析采用Pearson分析对东北红豆杉紫杉烷类化合物与内生真菌之间的相关性进行评估,东北红豆杉内生真菌菌群结构物种丰富度（H’）与宿主植物常见的七种紫杉烷类化合物的相关性显着,并且发现优势菌与含量之间存在正相关性;显着性差异的优势菌种对特有的紫杉烷代谢产物（紫杉醇途径前体物质、中间产物和其他紫杉烷类化合物等）中的21个差异化合物的峰面积之间存在一定的正相关和负相关关系,说明内生真菌对东北红豆杉化合物积累、产生及其他生命活动起着重要的影响作用;通过多元线性回归分析模型对东北红豆杉内生真菌优势菌属与紫杉醇等化合物含量进行评估,验证优势菌和紫杉烷含量的密切关系,建立新的策略来筛选具有产生物活性的菌株并探究内生真菌在不同部位紫杉烷差异代谢形成中的作用。4、东北红豆杉内生真菌R8-3-4的发酵工艺优化及应用通过PCR扩增生物合成关键酶基因和UPLC-MS/MS的MRM模式从东北红豆杉根部的内生真菌筛选出能产生与宿主相同次生代谢产物的目标菌株。以R8-3-4菌株为研究对象,考察不同因素对10-脱乙酰基巴卡亭Ⅲ（10-DAB）产量的影响,对发酵培养条件、发酵液中诱导子添加量进行优化。最优生产发酵条件为:PDB培养基、葡萄糖为碳源、硫酸铵为氮源,初始pH 6.0、温度30℃、转速160 r/min、培养14天、CuSO4 0.10 mg/L,水杨酸10 mg/L,乙酸钠8 g/L,发酵优化培养后R8-3-4菌株产10-DAB产量为983.41μg/L,是未优化前产量的2.96倍。利用磁固定化技术对优化后Penicillium oxalicum R8-3-4菌株进行半连续生产应用,经过五次循环在5 L生物反应器中10-DAB最终总浓度达到4873.08 μg,以使10-DAB的产量最大化,有望解决紫杉醇类药物的供需矛盾,从而在商业规模上实现巨大的经济可持续预期的可能性。
白贺[3]（2020）在《东北红豆杉细胞悬浮培养与紫杉醇提取分离技术研究》文中进行了进一步梳理紫杉醇是应用最广泛的一种天然抗癌药物,但由于紫杉醇在红豆杉中含量极低,且直接提取紫杉醇比较困难。所以,利用植物细胞培养法高效生产紫杉醇以及采用有效的提取和分离手段对紫杉醇及其类似物进行提取,才可以从根本上解决红豆杉原料不足的问题。因此,本论文主要以东北红豆杉十年生的幼茎为材料,诱导愈伤组织并筛选高产细胞株系,优化东北红豆杉细胞悬浮培养条件,研究细胞分泌促进剂对东北红豆杉细胞生长与紫杉醇合成积累的影响,并探究其与调节因子的协同作用对紫杉醇产量的影响,得到高效生产紫杉醇的最佳培养方案。同时在提取分离方面,以磁性离子液体作添加剂辅助超声波萃取紫杉醇。最后利用本体聚合法,合成三尖杉宁碱（紫杉醇类似物）的分子印迹聚合物,分离三尖杉宁碱,简化紫杉醇的分离难度。奠定了东北红豆杉细胞培养法生产紫杉醇的工业化基础,并提供了高效开发药用植物资源的理论依据。本文通过试验研究获得的结论如下:（1）探究四种不同类型的细胞分泌促进剂对紫杉醇合成与积累的影响,分别考察了其对细胞生长、细胞膜通透性、丙二醛（MDA）及紫杉醇合成与释放的影响,最终得到了四种细胞分泌促进剂均能显着的提高紫杉醇产量和渗透率的结论。确定了DMSO、Tween-80、氯化镁和甘露醇的最适浓度分别为4%、300μg·g-1、12mmol·L-1和300mmol·L-1。（2）利用Box-Behnken设计,对DMSO与调节因子（茉莉酮酸甲酯和乙烯利）的协同作用进行优化试验,得到最优DMSO与茉莉酮酸甲酯和乙烯利协同作用的浓度组合为:DMSO浓度为4.721%,茉莉酮酸甲酯浓度为103.389μmol/L,乙烯利浓度为73.771μmol/L时,此时悬浮培养红豆杉细胞的紫杉醇总含量达到最大值15.705mg/L。（3）在磁性离子液体作添加剂辅助超声波提取紫杉醇的实验中,采用Box-Behnken设计探究了3个因素（固液比、超声时间和{C4（Mim）2}Fe Cl3/Br2添加量）的交互作用对紫杉醇提取量的影响,得到最佳的提取工艺为固液比（g/ml）1:43.5,超声时间50分钟,{C4（Mim）2}Fe Cl3/Br2的添加量1.5wt%,此时的紫杉醇提取量为2.828mg/g。（4）利用本体聚合法合成三尖杉宁碱分子印迹聚合物的优化实验中发现,在氯仿为致孔剂时,2VP为功能单体（三尖杉宁碱:功能单体=1:8）来制备的分子印迹聚合物的吸附性能最佳,此时其吸附量和印迹因子分别为1.18mg/g与2.23。
房洪舟[4]（2020）在《刺梨果实愈伤组织诱导及影响其主要活性物质含量的因素》文中进行了进一步梳理刺梨（Rosa roxburghii Tratt.）属蔷薇科蔷薇属果树,其果实富含维生素C、酚类、黄酮类、三萜类等营养及活性物质。由于果实的生长发育受季节及气候条件的影响,通过离体培养探索目标活性物质的种类与含量具有培养周期短且不受自然条件影响等优势。本研究以刺梨果实为外植体,筛选其适合的愈伤组织诱导、增殖及生长条件,并在此基础上摸索不同培养基、培养条件对其重要营养与活性物质积累的影响,可在遗传转化体系建立之前为在细胞水平探究代谢物质的积累和调控建立方便适宜的技术体系。主要研究结果如下:1、刺梨果实愈伤组织的诱导受多种因素影响。果实的成熟度、基本培养基类型以及植物生长调节剂的浓度,均对刺梨果实愈伤组织的诱导产生不同程度的影响。单因素实验结果表明,花后20 d的刺梨果实褐化程度最高,且难以脱分化产生愈伤组织;而花后80 d的果实其愈伤组织诱导率最高,可达80.83%。植物生长调节剂的浓度配比在愈伤组织诱导中起着关键作用,在本研究中1.5 mg·L-12,4-D结合0.1 mg·L-1 BA的处理下,刺梨果实愈伤组织的诱导率达到最大值。不同培养基类型对诱导率有显着影响,其中WPM最适合用于愈伤组织的诱导培养。综合以上因素,刺梨果实愈伤组织诱导最佳条件为:花后80 d的健康、无病虫害果实接种到添加有0.1 mg·L-1BA+1.5 mg·L-12,4-D的WPM培养基中,黑暗条件下可培养出状态良好的愈伤组织。2、影响刺梨果实愈伤组织增殖生长的因素及最佳培养基、培养条件的确定。植物生长调节剂TDZ和NAA组合有利于刺梨果实愈伤组织的生长,在TDZ浓度为3.0 mg·L-1时,愈伤组织的增殖速度最快、状态最佳。在MS、WPM和1/2MS三种基本培养基中的刺梨果实愈伤组织生长速度和状态差别较大,其中在MS培养基中的生长状态最好,长速适中。以葡萄糖作为碳源的愈伤组织生长速度整体上快于蔗糖,但状态稍差。蔗糖浓度为30g·L-1时的愈伤组织质地致密,呈现黄绿色。光照和温度显着影响刺梨果实愈伤组织的增殖速度和生长状态,培养温度为30℃时使刺梨果实愈伤组织褐化加重,20℃时愈伤组织增殖速度减慢。每天光照12 h的愈伤组织生长速度较快,愈伤组织较致密。据此确定刺梨果实愈伤组织培养条件为:MS+3.0 mg·L-1 TDZ+0.1 mg·L-1 NAA+30 g·L-1蔗糖,培养温度为25℃,光照时间以每天光照12 h为宜。3、培养因素对刺梨果实愈伤组织中主要活性物质的影响。在筛选刺梨果实愈伤组织继代培养基的条件的同时测定了愈伤组织中主要活性物质的含量和生产量的差异。TDZ对刺梨果实愈伤组织活性物质含量的影响较显着,Vc、总酚、总黄酮和总三萜含量随TDZ浓度增加表现为先增高后降低的趋势。在TDZ浓度为3.0 mg·L-1时各活性物质含量最高,Vc、总酚、总黄酮和总三萜含量分别为45.12 mg·100g-1、785.05 mg·100g-1、381.16 mg·100g-1和320.33 mg·100g-1。MS培养基有利于刺梨果实愈伤组织Vc、总三萜和总酚积累,而在WPM培养基上愈伤组织中总黄酮、总三萜积累更高。当蔗糖或者葡萄糖浓度达到60 g·L-1时,均获得较高的活性物质积累量,高浓度的蔗糖比葡萄糖更有利于Vc的积累。光照时间也是影响刺梨果实愈伤组织中主要活性物质含量的重要因素,每天光照12h时愈伤组织中各活性物质含量达到最高。不同温度对刺梨果实愈伤组织中主要活性物质的含量有不同程度的影响,25℃的培养温度最有利于刺梨果实愈伤组织中活性物质的积累。
王歆悦[5]（2020）在《红豆杉多糖纳米制剂的制备及评价》文中提出黑色素是一种天然的生物色素,广泛分布于头发、眼睛、皮肤等多种器官。它可以防止紫外线辐射并保护光损伤。其合成过程涉及一系列复杂的化学反应和酶反应。黑色素合成过度,会导致色素沉着,引发如色斑、黄褐斑、黑皮病等疾病,且病灶不仅发生在皮肤还会发生在脏器,影响人体的内分泌、代谢、脏器功能等,从而危害着人体的健康。目前已经发现了许多能够有效抑制黑色素合成的活性成分,然而这些药物都被证明或多或少的具有副作用,如过敏、刺激性皮炎、弱氧化等。因此,本论文通过研究红豆杉果实多糖抑制黑色素合成活性及其纳米脂质体制剂的制备及评价,为寻找天然且安全的黑色素合成抑制剂提供了实验基础。本论文主要研究内容如下:（1）第一章:绪论。首先通过引言部分介绍了本课题的研究背景及意义。其次,对红豆杉多糖进行了简要介绍,主要包括红豆杉、多糖和红豆杉果实多糖的相关内容。与此同时,本章对黑色素的合成及调控进行了简要介绍,主要从黑色素的生物合成、PI3K/Akt信号通路对黑色素合成的调控以及常用的黑色素合成抑制剂几个方面进行了介绍。除此之外,本章还对脂质体经皮给药进行了概述,主要包括经皮给药系、脂质体经皮给药的特点、作用机制以及研究现状。最后,本章主要概述了本课题的选题和研究内容。（2）第二章:红豆杉多糖的活性研究。首先选用不同来源的红豆杉多糖（包括红豆杉叶子来源的多糖TMLP和红豆杉果实来源的多糖TMFP）,通过测定药物对人表皮永生化细胞（HACAT）、小鼠黑色素瘤细胞（B16F10）活力的影响,筛选出了较为安全的红豆杉果实多糖TMFP。在确定了后续实验的研究目标是红豆杉果实多糖TMFP之后,基于小鼠黑色素瘤细胞（B16F10）测定了TMFP对细胞活力、黑色素含量和酪氨酸酶活力的影响,初步证明了红豆杉果实多糖TMFP的抗黑色素生成活性。与此同时,通过Western Blot实验探究了其可能的作用机制,并发现该活性可能与PI3K/Akt信号通路的激活有关。此外,为了进一步证明TMFP的抗黑色素生成活性,通过斑马鱼胚胎的相关实验发现,经TMFP处理后的斑马鱼胚胎呈明显的白化状态。同时,PCR检测结果显示TMFP的处理能够显着降低Tyr m RNA的表达。最后,本章还进行了清除氧自由基抗氧化活性的研究,证明了TMFP对羟自由基有较为明显的清除作用,对ABTS自由基也有一定程度的清除作用。（3）第三章:红豆杉果实多糖TMFP脂质体的制备与评价。首先通过采用不同的制备方法并施加不同的实验条件制备了粒径不同的脂质体。通过体外经皮渗透实验筛选出了皮肤累积透过量和皮肤累积滞留量均最高的脂质体。后续相关实验将围绕该处方的脂质体展开。（4）第四章:红豆杉果实多糖TMFP脂质体的功效评价。首先通过测定TMFP脂质体对小鼠黑色素瘤细胞（B16F10）细胞活力、黑色素含量以及酪氨酸酶活力的影响,证明了TMFP脂质体对小鼠黑色素瘤细胞的抗黑色素生成功效。此外,利用紫外线照射ICR小鼠皮肤建立皮肤黑化模型,并持续给药治疗皮肤黑化模型各组小鼠皮肤以及未经照射的各组小鼠正常皮肤后通过组织切片以评价药效。结果显示,脂质体作为经皮给药方式的药物载体能够有效的提高水溶性多糖TMFP的透皮效率,帮助TMFP更好的发挥功效。（5）第五章:红豆杉果实多糖TMFP脂质体的安全性评价。首先测定了TMFP-脂质体（脂质体E）对人表皮永生化细胞（HACAT）的细胞活力的影响,证明了TMFP-脂质体对HACAT细胞的安全性。同时,持续给药TMFP-脂质体于小鼠正常皮肤,通过观察肝脏、肾脏组织切片并结合小鼠的生存状态评价TMFP-脂质体对动物机体的安全性。结果显示,小鼠肝脏、肾脏结构完整无病理性改变,生存状态良好,证明了TMFP脂质体对动物机体了安全性。（6）第六章:总结与展望。总结了本课题的实验过程中遇到的问题,需要改进和完善的不足之处,并展望了本课题进一步研究的方向。
王馨[6]（2020）在《不同光质对东北红豆杉愈伤组织中紫杉烷类成分合成代谢影响与初步机制解析》文中研究指明东北红豆杉主要生长于我国东北吉林老爷岭、张广才岭及长白山等地区。红豆杉中主要次生代谢产物是紫杉烷类化合物,紫杉醇是其中最具代表性的活性化合物,是世界公认的广谱抗癌药物。红豆杉生长极为缓慢且紫杉烷成分含量低,从自然资源中获取的传统方式满足不了国内外市场对其日益增长的需求,应用生物技术手段获得紫杉烷类成分已经成为目前研究的热点,该方法具有培养周期短、条件可人为控制,不受季节、地区的影响等优点。利用诱导技术处理红豆杉组织细胞培养体系获得紫杉烷类成分是目前可行的技术手段,目前LED光照已成为提高植物组织培养体系中次生代谢活性产物产量的一种极具前途技术手段。基于上述,本研究优化并建立了东北红豆杉愈伤组织培养体系,并使用5种不同光质（红光,蓝光,绿光,红蓝绿混合光和白光）的LED灯对愈伤组织进行照射处理,以暗培养作为对照,分析了不同光质照射下愈伤组织中7个紫杉烷类化合物（紫杉醇、巴卡亭Ⅲ、10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ、10-去乙酰基紫杉醇、三尖杉宁碱、7-木糖基-10-去乙酰基紫杉醇和7-表紫杉醇）的积累变化规律,并利用qRT-PCR技术分析愈伤组织中6个与紫杉烷生物合成密切相关基因（TXS、T7βOH、DBAT、ACL、BAPT和DBTNBT）的表达水平变化规律。本论文的主要研究结果如下:1、优化并建立了东北红豆杉愈伤组织培养体系以东北红豆杉嫩茎作为外植体,自来水冲洗4小时后使用75%酒精消毒30 s,再使用0.1%的HgCl2溶液消毒15 min,无菌滤纸吸干茎段表面水分,使用剪刀将叶片剪掉,茎段剪至0.5 cm长度,接种在MS+2 mg/LNAA+0.1 mg/LKT的培养基上诱导愈伤组织,诱导30天后,从外植体剥离愈伤组织至MS+2 mg/LNAA+0.1%活性炭的培养基上进行愈伤组织增殖。2、考察了不同光质对紫杉烷类化合物积累的影响使用不同光质（红光、绿光、蓝光、红蓝绿混合光和白光）的LED灯对东北红豆杉愈伤组织进行照射处理,以暗培养作为对照,利用UPLC-MS/MS对7个目标紫杉烷类化合物进行分析检测,结果发现不同光质对于紫杉烷类化合物的积累呈现出不同的影响效果,但5种光质均可促使紫杉烷类化合物积累增强,同时确定红光为最佳光质,其可使总紫杉烷含量增加2.17倍,紫杉醇含量增加2.84倍。此外,以红光照射处理东北红豆杉愈伤组织30天为周期,发现紫杉烷类化合物含量随着时间的增加均呈现逐渐升高后降低的趋势,25天时所有目标化合物含量均达到最高,此时总紫杉烷含量为61837.78±4893.59 ng/g DW,紫杉醇含量为 21385.07±2484.95 ng/g DW。3、研究了不同光质对紫杉烷类化合物生物合成相关基因表达的影响利用qRT-PCR技术对不同光质照射处理下东北红豆杉愈伤组织中6个紫杉烷类生物合成相关基因表达水平变化进行了研究。以暗培养为对照,发现几乎所有的光照对于6个基因的表达均有促进作用,这表明不同光质触发了这些紫杉烷生物合成酶基因的转录表达,进而促进了紫杉烷次生代谢成分的合成和积累。特别是在红光下,除T7βOH基因外,其他基因均达到了最高的表达量,特别是ACL基因在红光下表现出最大的转录丰度,可达12.51,这可能也是红光下紫杉烷类化合物积累比在其他光质下更多的内在原因。以红光照射处理东北红豆杉愈伤组织30天为周期,发现大部分基因呈现出逐渐升高后降低的趋势,这种变化趋势与紫杉烷类成分变化趋势相一致,这同样证明了红光诱导合成酶基因的表达上调是紫杉烷类化合物生物合成和积累增强的内在原因。其中,TXS、DBAT、ACL基因在第21天的时候表达量最高,T7βOH、BAPT和DBTNBT基因在第13天的时候达到最高水平,这些基因的最高表达水平均早于紫杉烷最大积累所需的时间点（25天）,这一现象符合基因转录表达早于产物合成的代谢组学规律。同时,本研究初步证实了 TXS、T7βOH、DBAT和ACL可能是紫杉烷类化合物生物合成的潜在关键基因。此外,本研究发现ACL基因在21天的转录丰度（可达36.08）明显高于其他目标基因,表明该基因对红光LED诱导紫杉烷类化合物合成更为敏感和关键。综上述所,本研究确定了红光照射可以有效增强东北红豆杉愈伤组织中紫杉烷类化合物的积累量,该方法操作简单,无污染,成本低,具有潜在的工业化应用价值。此外,本研究初步明确了光质调控紫杉烷类化合物生物合成的内在分子机制,发现ACL基因对红光调控紫杉烷类化合物生物合成较为敏感和关键,为未来利用代谢工程技术手段高产紫杉烷类化合物提供了一定的理论依据。
吴铭芳[7]（2020）在《紫杉醇提取纯化与pH响应的抗肝癌靶向纳米粒制备及功能评价》文中研究说明红豆杉中含有能够抑制肿瘤细胞增殖和生长的活性成分紫杉醇,在其树皮、叶、果实中均可分离得到紫杉醇化合物,然而红豆杉生长周期漫长,且含量极低无法满足市场需求,由于东北红豆杉为我国一级保护植物,在保护红豆杉资源的前提下,开发高效和简单的提取工艺技术是当下红豆杉资源利用的重点之一,国内外有关高效获取紫杉醇有效成分技术的研究报道较少。目前针对紫杉醇的临床应用存在着诸多限制性因素,如水溶性差、副作用大、生物利用度不高等缺点,因此开发一种多功能性的载体用于精准递送紫杉醇有望成为临床治疗肝癌的手段。本论文对东北红豆杉的枝叶进行高效、绿色的提取,通过分离与纯化获得高纯度紫杉醇,开发了新型靶向载有紫杉醇的纳米颗粒药物递送系统用于肝癌治疗。本论文研究结果如下:1、建立了一种紫杉醇HPLC测定方法,该方法的精密度、重复性、稳定性、加样回收率的RSD值均小于2%,是一种稳定可靠的HPLC测定方法。以N-（3-氢化松香酸酰-2-羟基）丙基-N,N,N-三乙醇基氯化铵（HREOA）的胶束溶液为提取溶剂,采用超高压辅助表面活性剂HREOA法提取东北红豆杉枝叶中紫杉醇,通过单因素与响应面法以紫杉醇提取率为指标,得到最佳提取工艺条件为:表面活性剂质量分数1.40%、液固比35:1 mL/g、提取压力94 MPa、提取时间6 min。在此条件下,紫杉醇的提取率为87.164%。通过与传统的提取方法进行对比,超高压提取方法所需要的提取时间最短,所获的目标产物的提取率最高,耗电量相对较低,CO2的排放量相对较少,超高压提取方法是一种高效、省时、环保、节能的提取紫杉醇的方法。2、高压辅助胶束溶液提取红豆杉枝叶中紫杉醇成分的提取机制做以初步探索。植物细胞和所有细胞器的结构不同,在一定压力下,具有单层膜的细胞器比双层膜的细胞器对比更容易破裂,控制压力范围有利于提高目标产物的提取效率,通过扫描电子显微镜观察物料纤维结构得知,提取压力为100 MPa时物料叶片表面出现更多更大的中空孔洞,继续增大压力结构变化不显着。物料前期的浸泡处理使细胞变膨胀饱满,可为有效成分的扩散提供有利的空间结构,然而采用不同的提取溶剂对于高压提取紫杉醇的提取效果也不相同,选择1.4%HREOA水溶液相比于有机溶剂乙醇而言,具有更好的提取紫杉醇的效果,且天然环保利于环境可持续发展。高压提取前后物料中纤维素、半纤维素、木质素含量与提取前物料相比均有减少的趋势。3、采用乙酸乙酯、石油醚和氯仿对紫杉醇粗提物进行分步萃取,得到粗品中紫杉醇的纯度和回收率分别为2.85%和93.6%。接下来采用氧化铝层析柱对紫杉醇粗品进行纯化条件研究,得到最佳工艺条件为:吸附时间30 min,径高比1:8,洗脱速度1.5 mL/min,在此条件下,所获得的紫杉醇的纯度和回收率分别为38.4%和132.5%。最后,采用重结晶法对紫杉醇粗品进行纯化工艺研究,得到最佳工艺条件为:紫杉醇粗品的浓度40 mg/mL,反溶剂与溶剂的体积比15:1,沉积温度25℃,沉积时间3 min,在此条件下,紫杉醇的纯度和回收率分别为84.5%和83.1%。采用二次重结晶,最终获得了纯度≥98%的紫杉醇产品。4、采用乳液溶剂挥发法制备了 PHBV-PTX-NPs,制备工艺优化条件依据单因素法与响应面法实验得出:水相与油相的体积比7:1、PHBV浓度30 mg/mL、PVA浓度1.6 mg/mL、匀浆时间7.5 min、均质压力80 MPa、均质次数7次,最优条件下制备得到的PHBV-PTX-NPs粒径为62.3 nm,通过多巴胺氧化自聚在纳米粒表面形成涂层,并利用迈克尔加成反应接枝靶向配体RGD肽,得到具有靶向性和pH响应性的纳米粒子RDG-PDA-PHBV-PTX-NPs,其为粒径大小124.6±7.7 nm的圆球状颗粒,通过傅里叶红外光谱鉴定了 PDA成功的包裹在PHBV-PTX-NPs上,X-射线衍射、差示扫描量热和热重分析的结果表明PTX是以无定型态存在于纳米粒子中。RDG-PDA-PHBV-PTX-NPs可在体外生理盐溶液和红细胞悬浮液中稳定存在,并且具有pH敏感性释放PTX的能力,由此证明RDG-PDA-PHBV-PTX-NPs可实现静脉注射的方式。5、通过高内涵细胞成像分析系统与红外成像系统验证了 RGD-PDA-PHBV-PTX-NPs 对 HepG2 肿瘤具有显着的靶向性,并通过 MTT 实验验证了空 白载体对正常肝细胞L02 无毒性,RGD-PDA-PHBV-PTX-NPs 对 HepG2 和 SMMC-7721 两种肝癌细胞的 IC50值分别是 0.78±0.04 μg/mL 和 16.1±0.97μg/mL。通过尾静脉注射 RGD-PDA-PHBV PTX-NPs为荷瘤HepG2小鼠治疗14天的肿瘤抑制率为86.56%,从而验证了其具有靶向功能和优良的化疗功效,RGD-PDA-PHBV-PTX-NPs治疗过程中小鼠的体重无明显变化,未出现严重的器官损伤。基于靶向功能和pH敏感释放的RGD-PDA-PHBV-PTX-NPs的靶向化疗是安全、低毒的,有望成为一种治疗HepG2细胞癌的潜在纳米递送系统。
朱先峰[8]（2019）在《无机氮源及短链羧酸对红发夫酵母合成虾青素的代谢影响研究》文中指出虾青素是一种高附加值的类胡萝卜素,不仅可以作为饲料添加剂应用到特种水产养殖,而且还可以作为天然抗氧化剂和自由基清除剂用于保健食品、高档化妆品。此外,动物试验证明虾青素在增强免疫和抗癌变等方面起到重要作用。红发夫酵母具有生长周期短、占地面积小、易实现高密度培养等优势,因而成为近年来生产天然色素和高附加值产品虾青素的研究对象。目前,利用红发夫酵母生产虾青素还面临着菌体密度较低和虾青素含量偏低等诸多问题,有必要进一步优化培养条件和探索红发夫酵母胞内虾青素的合成机制,期望提高红法夫酵母发酵生产虾青素的含量和产量。本文以实验室保藏的红法夫酵母（X.dendrorhous UV3-721）作为研究菌株,从较少有人开展的无机氮源对红法夫酵母合成虾青素的影响出发,选取不同铵盐和硝酸盐研究其对红法夫酵母的细胞生长和虾青素积累的影响,通过研究铵态氮对红法夫酵母虾青素合成途径中编码关键酶的基因转录水平以及胞内小分子代谢物相对丰度的变化情况,阐明铵态氮对虾青素合成的调控机制。同时,本文还研究了与TCA循环相关的四种短链羧酸对红发夫酵母菌体生长及虾青素合成的影响。在此基础上研究通过添加铵态氮和短链羧酸提高虾青素产量的发酵放大技术,找到利用红法夫酵母发酵生产虾青素的廉价氮源,具体结果如下:一、考察了添加不同无机氮源对红发夫酵母细胞生长和虾青素合成的影响。结果表明铵态氮的添加能够提高菌体合成虾青素能力。随后考察了硫酸铵的添加时间和添加浓度对红法夫酵母产虾青素的影响,确定了硫酸铵的最优添加时间为培养初期,添加浓度为1 g/L,在此培养条件下菌体的虾青素含量达到9.06 mg/g,比对照提高了64.4%。二、考察添加硫酸铵对虾青素生物合成途径中六个关键基因转录水平表达的影响,结果表明虾青素合成途径中上游基因ipi、crtE在菌体停滞期和对数生长期（0～72 h）显示较高的相对表达量,可能与菌体在准备上游路径的相关前体物质及其它类胡萝卜素合成有关;下游基因crtYB、crtS和crtR在菌体生长稳定期后（72～144 h）的相对表达量较高,表明前期积累的上游前体物质和其它类胡萝卜素在后期有效的流向了终端产物虾青素的合成。三、研究了红发夫酵母胞内小分子代谢物相对丰度的变化,其中发生明显变化的是硫酸铵实验组的脂肪酸代谢显着削弱,这会导致乙酰辅酶A更多的流入类胡萝卜素合成途径上游的甲羟戊酸合成,从而促进虾青素等类胡萝卜素的积累;并且菌体胞内酸性物质积累致使内环境呈现酸性,这也同样有利于菌体积累虾青素。四、研究了四种与TCA循环相关的短链羧酸（乙酸、丙酮酸、琥珀酸和苹果酸）对红发夫酵母菌体生长及虾青素合成的影响。结果表明在24h添加30 mM的乙酸钠可以明显提高菌体生物量,菌体生物量达到了4.66g/L,比对照组提高了38.2%;24 h添加40 mM的丙酮酸一定程度促进菌体生长和虾青素积累。复合添加丙酮酸和硫酸铵的策略在一定程度上缓解了硫酸铵对菌体的生长抑制作用,虾青素产量和含量分别达到33.24 mg/L和8.20 mg/g,比对照组分别提高了33.3%和36.4%。五、考察了在5L发酵罐中通过复合添加丙酮酸和硫酸铵提高虾青素产量的发酵放大技术,结果表明与对照组相比生物量和虾青素含量显着提高。经6d发酵,最大生物量可达13.40 g/L,总类胡萝卜素和虾青素产量分别为270.96 mg/L和99.66 mg/L,虾青素含量为7.65 mg/g,分别比对照组提高了 40%、83.7%和54.5%。
陈莉[9]（2018）在《红发夫酵母培养及虾青素产品的研究开发》文中研究指明虾青素具有长的共轭双键和分子末端羟基酮,其高度不饱和结构导致了其不稳定性,高温、酸碱以及光照都能导致其丧失天然的生理功能。多烯链易受氧化和异构化,自由电子对离体导致颜色损失。虾青素的结构同样显示了它极强的抗氧化性能,能降低癌症、心血管疾病、黄斑变性和白内障等退化性疾病的风险。本论文利用混合碳源培养红发夫酵母,前期快速积累生物量,后期则采用补加蛋白胨方式促进酵母产虾青素;探究不同破碎酵母细胞的方法,采用玻璃珠破壁乳化虾青素,避免了有机溶剂萃取色素过程;同时制备酵母抽提物提高红发夫酵母的生物利用度,采用复合壁材微囊化制备虾青素微囊粉,为酵母虾青素的工业化生产和应用奠定了基础。首先研究了混合碳源比例、不同碳氮比、氮源补加时间以及氮源补加量等对红发夫酵母细胞生长和类胡萝卜素合成的影响。当葡萄糖:菊糖=2:1（总糖浓度为30 g/L）时,红发夫酵母在36 h时生物量即可达到13.54±0.21 g/L,但是由于此时酵母生长速度较快,色素产量仅为37.76±1.91 mg/L。当碳氮比为4,生物量达到最高。摇瓶中不同时间补加蛋白胨实验中,当36 h时添加一定浓度蛋白胨对色素积累影响最大,酵母培养到72 h时色素产量为83.34±3.08 mg/L,较未补加蛋白胨组色素产量提高了10.62%。当36 h补加0.75 g/L蛋白胨时,其色素产量60 h时达到最大82.35 mg/L,较未补加蛋白胨组最大色素产量提高了15.25%。分别采用了酶法破壁和玻璃珠破碎两种方法对酵母细胞进行破壁研究。两种纤维素酶破壁,色素提取率都可达到100%,然而酶用量都很高;安琪酵母复配酶破壁色素提取率最高为64.96±1.21%。纤维素酶-安琪酵母复配酶复配后,其效果与单独添加等量的纤维素酶的效果相近。玻璃珠处理红发夫酵母6 h（150 rpm）,色素提取率达到98%,且色素在剪切力的作用下乳化于水中,浓度达到93.72 mg/L。采用玻璃珠破壁提取色素,并使用两种不同的酵母抽提工艺制备酵母抽提物:（1）玻璃珠破壁后加入安琪酵母复配酶水解;（2）玻璃珠和安琪酵母复配酶同时加入进行破壁抽提。工艺（1）使用不同剂量的复配酶,氨基氮得率（3.51-3.65%）没有显着性差异,均高于工艺（2）的氨基氮得率。因此,采用玻璃珠机械破壁后加入安琪酵母复配酶制备酵母抽提物,固形物得率为52.73±1.17%,氨基氮得率为3.65±0.07%。使用多孔淀粉和明胶进行酵母抽提液中色素的包埋,通过正交试验筛选出适合的酵母抽提液和壁材添加量,酵母抽提液（V,m L）:多孔淀粉（M,g）:明胶（M,g）=400:15:6,得到虾青素微囊化粉末,其包埋率,载药量和溶解度分别为88.5±0.01%,1.55 mg/g和81.3±0.7%。通过提高破壁强度,提升了虾青素在水中的浓度,包埋率和载药量分别为75.62%和10.42 mg/g。稳定性研究表明微囊化粉末颗粒越大其稳定性越强,然而微囊化粉末颗粒越小其颜色越鲜艳。
徐志荣[10]（2018）在《南方红豆杉细胞悬浮培养体系建立及培养条件优化》文中研究指明本试验以南方红豆杉一年生枝条诱导愈伤组织,建立细胞悬浮培养体系;分析悬浮细胞生长、紫杉醇积累动力学关系及主要营养成分的变化;同时探讨了理化因子对悬浮细胞生长及紫杉醇含量的影响。主要研究结果如下:1.从消毒组合、植物生长调节剂浓度与配比等因素,设计了外植体消毒方案及愈伤组织诱导方法;通过单因素和正交试验,筛选和优化南方红豆杉细胞悬浮培养的培养基种类、细胞接种量、培养基初始pH、植物生长调节剂种类及配比等,建立南方红豆杉细胞悬浮培养体系。结果表明,最适的消毒方式为75%酒精浸泡0.5 min后,再用0.1%氯化汞浸泡8 min;愈伤组织诱导固体培养基以MS+1.3 mg/L 2,4-D+1.0 mg/L NAA+1.3 mg/L 6-BA+30 g/L蔗糖为最佳。适合南方红豆杉细胞悬浮培养的最佳培养基配方为:B5+0.4 mg/L 2,4-D+0.3 mg/L NAA+1.2 mg/L 6-KT+30 g/L蔗糖,细胞最佳接种量为0.09 g/mL,初始pH为5.8;在27 d的培养周期内,悬浮培养的南方红豆杉细胞的生长曲线呈“S”型,第15 d时细胞鲜重达到最大值,为7.66 g/（30 mL）。2.采用超声波提取法从南方红豆杉愈伤组织中提取紫杉醇,通过单因素和正交实验考察了溶剂、级数、温度、时间、料液比对南方红豆杉细胞愈伤组织中紫杉醇提取的影响。结果表明,南方红豆杉愈伤组织中紫杉醇的最佳提取条件是:溶剂为甲醇,提取3次,温度55℃、每次提取30 min、料液比1:40。3.研究了南方红豆杉悬浮培养过程中细胞生长和紫杉醇积累的动力学关系及主要营养成分的变化,建立动力学模型。结果表明,在27 d的培养周期内,培养液中的总糖、磷元素、铵态氮、硝态氮在细胞培养的第18 d基本被消耗完;动力学拟合表明,南方红豆杉悬浮培养细胞生长符合Logistic生长模型,最大比生长速率为0.14365 d-1,底物消耗和紫杉醇合成可用Luedeking-Piret模型描述,悬浮细胞生长与紫杉醇积累属于部分生长偶联型。4.研究了碳源、氮源、磷源、Ca2+和Mg2+浓度对南方红豆杉悬浮培养细胞生长及紫杉醇合成的影响。结果表明,蔗糖浓度为30 g/L时,细胞生长较好,其浓度为40 g/L时,有利于紫杉醇的合成;铵态氮与硝态氮比例为3:24时,有利于细胞生长和紫杉醇合成;总氮浓度较高时有利于细胞生长,而低溶度氮有利于紫杉醇合成;磷源浓度为1 mmol/L时有利于细胞生长,磷源浓度为0.25 mmol/L时有利于紫杉醇的合成;CaCl2浓度为2 mmol/L有利于细胞生长和紫杉醇合成;MgSO4浓度为3 mmol/L时最有利于细胞生长,MgSO4浓度为2 mmol/L时有利于紫杉醇合成。
二、添加化学试剂对红豆杉培养细胞生长的影响（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、添加化学试剂对红豆杉培养细胞生长的影响（论文提纲范文）
（1）东北红豆杉产紫杉醇内生真菌Alternaria alternata F3的分离鉴定及体外抗癌活性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 东北红豆杉 |
| 1.1.1 东北红豆杉研究概况 |
| 1.1.2 东北红豆杉化学成分 |
| 1.2 紫杉醇研究概述 |
| 1.2.1 紫杉醇的性质及药理作用 |
| 1.2.2 紫杉醇的来源 |
| 1.3 植物内生真菌 |
| 1.3.1 植物内生真菌的概念 |
| 1.3.2 植物内生真菌的代谢产物及药理作用 |
| 1.4 内生真菌产紫杉醇发酵条件优化 |
| 1.4.1 前体 |
| 1.4.2 诱导子 |
| 1.4.3 单因素实验 |
| 1.4.4 统计学方法 |
| 1.5 研究目的和意义 |
| 2 东北红豆杉内生真菌的分离和纯化 |
| 2.1 实验材料、仪器及试剂 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验仪器 |
| 2.1.3 实验试剂 |
| 2.1.4 试剂配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 东北红豆杉内生真菌的分离、纯化及保存 |
| 2.2.2 东北红豆杉内生真菌的鉴定 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 东北红豆杉内生真菌的分离、纯化结果 |
| 2.3.2 东北红豆杉内生真菌的鉴定 |
| 2.4 本章小结 |
| 3 东北红豆杉产紫杉醇内生真菌的筛选 |
| 3.1 实验材料、仪器和试剂 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验仪器 |
| 3.1.3 实验试剂 |
| 3.1.4 试剂配制 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 菌种的活化 |
| 3.2.2 东北红豆杉中产紫杉醇的内生真菌的筛选 |
| 3.2.3 东北红豆杉产紫杉醇内生真菌的鉴定 |
| 3.2.4 统计学处理 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 东北红豆杉中产紫杉醇的内生真菌的筛选 |
| 3.3.2 东北红豆杉产紫杉醇内生真菌F3的鉴定 |
| 3.4 本章小结 |
| 4 产紫杉醇内生真菌Alternaria alternata F3发酵条件优化 |
| 4.1 实验材料、仪器和试剂 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 实验仪器 |
| 4.1.3 实验试剂 |
| 4.1.4 试剂配制 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 A.alternata F3产紫杉醇的单因素优化 |
| 4.2.2 Plackett-Burman试验设计筛选显着性因素 |
| 4.2.3 响应面与中心组合设计优化A.alternata紫杉醇的产量 |
| 4.2.4 统计学处理 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 A.alternata F3产紫杉醇的单因素优化 |
| 4.3.2 Plackett-Burman实验设计筛选前体和诱导子显着性因素 |
| 4.3.3 响应面优化设计及结果 |
| 4.3.4 验证实验 |
| 4.4 本章小结 |
| 5 Alternaria alternata F3 DCM提取物体外抗癌活性研究 |
| 5.1 实验材料、仪器和试剂 |
| 5.1.1 实验材料 |
| 5.1.2 实验仪器 |
| 5.1.3 实验试剂 |
| 5.1.4 主要溶液配制 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 实验前准备 |
| 5.2.2 细胞的复苏 |
| 5.2.3 细胞的培养和传代 |
| 5.2.4 细胞的冻存 |
| 5.2.5 MTT法检测A.alternata F3 DCM提取物对两种癌细胞存活率的影响 |
| 5.2.6 细胞形态学分析 |
| 5.2.7 统计学处理 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 A.alternata F3真菌DCM提取物对A549存活率的影响 |
| 5.3.2 A.Alternata F3真菌DCM提取物对HeLa存活率的影响 |
| 5.3.3 A.Alternata F3真菌DCM提取物对HeLa形态的影响 |
| 5.4 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
| 附件 |
（2）东北红豆杉内生真菌多样性与紫杉烷积累的相关性规律解析及其高产菌株的应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 红豆杉研究概况 |
| 1.1.1 红豆杉简介 |
| 1.1.2 红豆杉化学成分研究进展 |
| 1.1.3 代谢组学在红豆杉的研究进展 |
| 1.2 植物内生真菌研究概况 |
| 1.2.1 植物内生真菌简介 |
| 1.2.2 内生真菌与植物互作关系研究 |
| 1.2.3 内生真菌在药用植物研究中的应用 |
| 1.2.4 内生真菌种属分布与宿主生物活性物质的相关性研究 |
| 1.3 红豆杉内生真菌产紫杉烷的分子机制 |
| 1.4 研究的目的意义 |
| 1.5 本课题的研究内容及技术路线 |
| 1.5.1 研究内容 |
| 1.5.2 技术路线 |
| 2 东北红豆杉内生真菌的分离与多样性分析 |
| 2.1 实验材料及试剂 |
| 2.1.1 东北红豆杉来源 |
| 2.1.2 主要实验仪器 |
| 2.1.3 实验材料及试剂 |
| 2.1.4 培养基以及试剂的配制 |
| 2.2 实验方法与步骤 |
| 2.2.1 东北红豆杉内生真菌的分离 |
| 2.2.2 东北红豆杉内生真菌的鉴定 |
| 2.2.3 东北红豆杉内生真菌多样性 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 东北红豆杉内生真菌的分离结果 |
| 2.3.2 东北红豆杉植物不同器官内生真菌多样性分析 |
| 2.4 本章小结 |
| 3 东北红豆杉不同器官代谢组学研究 |
| 3.1 实验仪器与材料 |
| 3.1.1 植物样品 |
| 3.1.2 主要仪器与试剂 |
| 3.2 实验方法与步骤 |
| 3.2.1 东北红豆杉植物样品处理及制备 |
| 3.2.2 UPLC-MS/MS对标志性紫杉类化合物定量分析 |
| 3.2.3 非靶向代谢组学对不同部位东北红豆杉代谢组学研究 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 标志性紫杉类化合物定量分析 |
| 3.3.2 UPLC-Q-Exactive Focus-MS/MS对东北红豆杉整体代谢物的鉴定 |
| 3.3.3 紫杉醇途径前体物质、中间产物和紫杉烷类代谢物差异分析 |
| 3.4 本章小结 |
| 4 东北红豆杉内生真菌与宿主的相关性 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 东北红豆杉内生真菌分类和鉴定 |
| 4.1.2 东北红豆杉紫杉类化合物的含量分析 |
| 4.1.3 内生真菌菌群结构与宿主紫杉类化合物的相关性 |
| 4.1.4 内生真菌产与宿主相同紫杉烷类成分的筛选与鉴定 |
| 4.2 结果与讨论 |
| 4.2.1 内生真菌菌群结构与紫杉类化合物的相关性 |
| 4.2.2 内生真菌与紫杉醇通路及其他紫杉类化合物的相关性 |
| 4.2.3 内生真菌与紫杉烷类化合物含量的相关性 |
| 4.2.4 内生真菌产与宿主紫杉烷化合物的筛选 |
| 4.3 本章小结 |
| 5 东北红豆杉内生真菌R8-3-4的发酵工艺优化及应用 |
| 5.1 |
| 5.1.1 主要仪器 |
| 5.1.2 实验材料及试剂 |
| 5.2 实验方法与步骤 |
| 5.2.1 内生真菌R8-3-4的发酵条件单因素优化 |
| 5.2.2 诱导子对内生真菌R8-3-4发酵优化 |
| 5.2.3 磁性固定化内生真菌R8-3-4发酵产10-DAB |
| 5.2.4 统计学处理 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 内生真菌R8-3-4发酵条件单因素优化 |
| 5.3.2 添加诱导子对内生真菌R8-3-4发酵优化 |
| 5.3.3 磁性固定化10-DAB半连续发酵 |
| 5.4 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
| 博士学位论文修改情况确认表 |
（3）东北红豆杉细胞悬浮培养与紫杉醇提取分离技术研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 研究背景与意义 |
| 1.1.1 研究背景 |
| 1.1.2 目的与意义 |
| 1.2 国内外研究现状 |
| 1.2.1 细胞培养法生产紫杉醇的研究进展 |
| 1.2.2 紫杉醇的提取和分离 |
| 1.2.3 离子液体的发展与研究现状 |
| 1.2.4 分子印迹技术的研究现状 |
| 1.3 本文研究内容 |
| 1.3.1 主要内容 |
| 1.3.2 创新点 |
| 1.3.3 技术路线 |
| 1.3.4 预期目标 |
| 1.4 本章小结 |
| 第2章 细胞分泌促进剂对红豆杉悬浮细胞生产紫杉醇的影响 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 材料与仪器 |
| 2.2.2 试验方法 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 紫杉醇标准曲线 |
| 2.3.2 细胞分泌促进剂的浓度对细胞生长和紫杉醇产量的影响 |
| 2.3.3 细胞分泌促进剂对细胞膜相对透性随时间变化趋势的影响 |
| 2.3.4 细胞分泌促进剂对MDA含量随时间变化趋势的影响 |
| 2.3.5 细胞分泌促进剂对细胞生长速度随时间变化趋势的影响 |
| 2.3.6 细胞分泌促进剂对紫杉醇合成与释放随时间变化的影响 |
| 2.4 本章小结 |
| 第3章 东北红豆杉悬浮细胞代谢与释放紫杉醇优化试验 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 材料与仪器 |
| 3.2.2 试验方法 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 DMSO的加入时间对悬浮培养红豆杉细胞生长和生产紫杉醇的影响 |
| 3.3.2 小剂量连续添加DMSO的持续时间对悬浮细胞生长和生产紫杉醇的影响 |
| 3.3.3 DMSO、茉莉酮酸甲酯及乙烯利的浓度对细胞生长和生产紫杉醇的影响 |
| 3.3.4 DMSO与茉莉酮酸甲酯、乙烯利的协同作用的优化实验 |
| 3.4 本章小结 |
| 第4章 磁性离子液体辅助超声波提取紫杉醇工艺优化试验 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 材料与设备 |
| 4.2.2 试验方法 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 单、双咪唑磁性离子液体对超声波提取紫杉醇的影响 |
| 4.3.2 提取剂种类对超声波提取紫杉醇的影响 |
| 4.3.3 {C_4(Mim)_2}FeCl_3/Br_2 浓度对超声波提取紫杉醇的影响 |
| 4.3.4 超声时间对超声波提取紫杉醇的影响 |
| 4.3.5 固液比对超声波提取紫杉醇的影响 |
| 4.3.6 磁性离子作添加剂辅助超声波提取紫杉醇响应面优化实验 |
| 4.4 本章小结 |
| 第5章 利用分子印迹技术分离提纯紫杉醇结构类似物的研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 材料与仪器 |
| 5.2.2 试验方法 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 三尖杉宁碱标准曲线 |
| 5.3.2 三尖杉宁碱分子印迹聚合物合成条件的选择 |
| 5.3.3 三尖杉宁碱分子印迹聚合物合成条件的优化 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 本章小结 |
| 第6章 结论与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 展望 |
| 参考文献 |
| 导师及作者简介 |
| 攻读硕士学位期间发表成果 |
| 致谢 |
（4）刺梨果实愈伤组织诱导及影响其主要活性物质含量的因素（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 1 前言 |
| 1.1 果实愈伤组织的诱导条件及影响因素 |
| 1.1.1 基因型差异 |
| 1.1.2 培养基类型与植物生长调节剂种类 |
| 1.1.3 外植体类型 |
| 1.1.4 果实成熟度 |
| 1.1.5 环境条件 |
| 1.1.6 其他添加物 |
| 1.2 影响愈伤组织培养物中生物活性物质含量的主要因素 |
| 1.2.1 基因型差异 |
| 1.2.2 培养基与植物生长调节剂 |
| 1.2.3 愈伤组织外植体来源 |
| 1.2.4 选择高产细胞系 |
| 1.2.5 诱导子 |
| 1.2.6 环境条件 |
| 1.3 果实愈伤组织在活性物质研究方面取得的进展及应用 |
| 1.4 研究目的及主要内容 |
| 1.4.1 研究目的及意义 |
| 1.4.2 研究主要内容 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 主要试验化学试剂 |
| 2.1.3 主要试验仪器设备 |
| 2.2 试验设计及样品处理 |
| 2.2.1 植物材料获取 |
| 2.2.2 基本培养基的配制 |
| 2.2.3 外植体和试验器材的灭菌消毒 |
| 2.2.4 接种 |
| 2.2.5 刺梨果实脱分化 |
| 2.2.6 刺梨果实愈伤组织增殖培养及主要活性物质含量的影响因素 |
| 2.2.7 Vc含量测定 |
| 2.2.8 总酚含量的测定 |
| 2.2.9 总黄酮含量的测定 |
| 2.2.10 总三萜类化合物含量的测定 |
| 2.2.11 数据统计分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 刺梨果实愈伤组织诱导 |
| 3.1.1 果实成熟度对刺梨果实愈伤组织诱导的影响 |
| 3.1.2 植物生长调节剂对刺梨果实愈伤组织诱导的影响 |
| 3.1.3 培养基类型对刺梨果实愈伤组织诱导的影响 |
| 3.2 刺梨果实愈伤组织增殖条件及优化 |
| 3.2.2 培养基类型对刺梨果实愈伤继代与生长的影响 |
| 3.2.3 碳源类型及浓度对刺梨果实愈伤继代与生长的影响 |
| 3.2.4 光照时间对刺梨果实愈伤继代与生长的影响 |
| 3.2.5 温度对刺梨果实愈伤继代与生长的影响 |
| 3.3 刺梨果实愈伤组织主要生物活性物质的含量及影响因素 |
| 3.3.1 TDZ浓度对刺梨果实愈伤组织中活性物质含量的影响 |
| 3.3.2 培养基类型对刺梨果实愈伤组织中活性物质含量的影响 |
| 3.3.3 碳源类型及浓度对刺梨果实愈伤组织中活性物质含量的影响 |
| 3.3.4 温度对刺梨果实愈伤组织中活性物质含量的影响 |
| 3.3.5 光照时间对刺梨果实愈伤组织中活性物质含量的影响 |
| 4 讨论与总结 |
| 4.1 刺梨果实愈伤组织诱导影响因素 |
| 4.1.1 刺梨果实外植体的污染与褐化 |
| 4.1.2 外植体类型对刺梨果实愈伤组织诱导的影响 |
| 4.1.3 植物生长调节剂对刺梨果实愈伤组织诱导的影响 |
| 4.1.4 培养基类型对刺梨果实愈伤组织诱导的影响 |
| 4.2 影响刺梨果实愈伤组织的继代培养的因素 |
| 4.2.1 植物生长调节剂对刺梨果实愈伤组织继代与生长的影响 |
| 4.2.2 培养基类型对刺梨果实愈伤组织继代与生长的影响 |
| 4.2.3 碳源类型及浓度对刺梨果实愈伤组织继代与生长的影响 |
| 4.2.4 温度对刺梨果实愈伤组织继代与生长的影响 |
| 4.2.5 光照对刺梨果实愈伤组织继代与生长的影响 |
| 4.3 影响愈伤组织中活性物质含量的因素 |
| 4.3.1 外植体类型对刺梨果实愈伤组织中活性物质含量的影响 |
| 4.3.2 植物生长调节剂对刺梨果实愈伤组织中活性物质含量的影响 |
| 4.3.3 培养基类型对刺梨果实愈伤组织中活性物质含量的影响 |
| 4.3.4 碳源类型及浓度对刺梨果实愈伤组织中活性物质含量的影响 |
| 4.3.5 温度对刺梨果实愈伤组织中活性物质含量的影响 |
| 4.3.6 光照对刺梨果实愈伤组织中活性物质含量的影响 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 在读硕士期间发表的文章 |
| 缩略词表 |
（5）红豆杉多糖纳米制剂的制备及评价（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 红豆杉多糖 |
| 1.2.1 红豆杉 |
| 1.2.2 多糖 |
| 1.2.3 红豆杉果实多糖 |
| 1.3 黑色素的合成及调控 |
| 1.3.1 黑色素的生物合成 |
| 1.3.2 PI3K/Akt信号通路对黑色素合成的调控 |
| 1.3.3 常用黑色素合成抑制剂 |
| 1.4 脂质体经皮给药 |
| 1.4.1 经皮给药系统 |
| 1.4.2 脂质体经皮给药特点 |
| 1.4.3 脂质体促进经皮给药的作用机制 |
| 1.4.4 脂质体经皮给药应用及研究现状 |
| 1.5 论文选题和研究内容 |
| 参考文献 |
| 第二章 红豆杉多糖的抗黑色素生成活性研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验设备与材料 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验设备及仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 红豆杉多糖的初步筛选 |
| 2.3.1.1 细胞的培养 |
| 2.3.1.2 红豆杉多糖对人表皮永生化细胞(HACAT)活力的影响 |
| 2.3.1.3 红豆杉多糖对小鼠黑色素瘤细胞(B16F10)活力的影响 |
| 2.3.2 红豆杉果实多糖TMFP体外抗黑色素生成活性研究 |
| 2.3.2.1 细胞的培养 |
| 2.3.2.2 红豆杉果实多糖TMFP对 B16F10 细胞活力的影响 |
| 2.3.2.3 红豆杉果实多糖TMFP对 B16F10 细胞黑色素含量的影响 |
| 2.3.2.4 红豆杉果实多糖TMFP对 B16F10 细胞酪氨酸酶活力的影响 |
| 2.3.3 红豆杉果实多糖TMFP体外抗黑色素生成活性的作用机制研究 |
| 2.3.4 红豆杉果实多糖TMFP体内抗黑色素生成活性及作用机制研究 |
| 2.3.4.1 斑马鱼的饲养 |
| 2.3.4.2 药物浓度的确定 |
| 2.3.4.3 斑马鱼胚胎暴露实验 |
| 2.3.4.4 斑马鱼Tyr m RNA的表达检测 |
| 2.3.5 红豆杉果实多糖TMFP清除氧自由基抗氧化活性研究 |
| 2.3.5.1 羟自由基清除率测定 |
| 2.3.5.2 ABTS自由基清除率测定 |
| 2.3.6 统计学方法 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 红豆杉多糖的初步筛选 |
| 2.4.1.1 红豆杉多糖对人表皮永生化细胞(HACAT)活力的影响 |
| 2.4.1.2 红豆杉多糖对小鼠黑色素瘤细胞(B16F10)活力的影响 |
| 2.4.2 红豆杉果实多糖TMFP体外抗黑色素生成活性研究 |
| 2.4.2.1 红豆杉果实多糖TMFP对 B16F10 细胞活力的影响 |
| 2.4.2.2 红豆杉果实多糖TMFP对 B16F10 细胞黑色素含量的影响 |
| 2.4.2.3 红豆杉果实多糖TMFP对 B16F10 细胞酪氨酸酶活力的影响 |
| 2.4.3 红豆杉果实多糖TMFP体外抗黑色素生成活性的作用机制研究 |
| 2.4.4 红豆杉果实多糖TMFP体内抗黑色素生成活性及作用机制研究 |
| 2.4.4.1 药物浓度的确定 |
| 2.4.4.2 斑马鱼胚胎暴露实验 |
| 2.4.4.3 斑马鱼Tyr m RNA表达的检测 |
| 2.4.5 清除氧自由基抗氧化活性研究 |
| 2.4.5.1 羟自由基清除率测定 |
| 2.4.5.2 ABTS自由基清除率测定 |
| 2.5 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第三章 红豆杉果实多糖TMFP脂质体的制备与表征 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验设备与材料 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验设备及仪器 |
| 3.2.3 实验动物 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 脂质体的制备 |
| 3.3.2 脂质体的表征 |
| 3.3.2.1 粒径和电位的测定 |
| 3.3.2.2 脂质体微观形态观察 |
| 3.3.2.3 多糖含量的测定 |
| 3.3.2.4 包封率的测定 |
| 3.3.2.5 脂质体的稳定性测定 |
| 3.3.3 脂质体的体外经皮渗透实验 |
| 3.3.3.1 实验装置 |
| 3.3.3.2 鼠皮的准备 |
| 3.3.3.3 体外经皮渗透实验 |
| 3.3.4 统计学方法 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 葡萄糖标准曲线 |
| 3.4.2 脂质体的表征 |
| 3.4.3 脂质体微观形态的观察 |
| 3.4.4 脂质体的稳定性 |
| 3.4.5 脂质体的体外经皮渗透实验 |
| 3.5 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第四章 红豆杉果实多糖TMFP脂质体的功效评价 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验设备与材料 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验设备及仪器 |
| 4.2.3 实验动物 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 对B16F10 细胞的体外抗黑色素生成活性研究 |
| 4.3.1.1 细胞的培养 |
| 4.3.1.2 TMFP脂质体对B16F10 细胞活力的影响 |
| 4.3.1.3 TMFP脂质体对B16F10 细胞黑色素含量的影响 |
| 4.3.1.4 TMFP脂质体对B16F10 细胞酪氨酸酶活力的影响 |
| 4.3.2 对皮肤黑化模型的研究 |
| 4.3.2.1 模型的建立及分组 |
| 4.3.2.2 评价指标 |
| 4.3.3 对小鼠正常皮肤的研究 |
| 4.3.3.1 给药及分组 |
| 4.3.3.2 评价指标 |
| 4.3.4 统计学方法 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 对B16F10 细胞的体外抗黑色素生成活性研究 |
| 4.4.1.1 TMFP脂质体对B16F10 细胞活力的影响 |
| 4.4.1.2 TMFP脂质体对B16F10 细胞黑色素含量的影响 |
| 4.4.1.3 TMFP脂质体对B16F10 细胞酪氨酸酶活力的影响 |
| 4.4.2 对皮肤黑化模型的研究 |
| 4.4.2.1 体重称量 |
| 4.4.2.2 皮肤的水分、油分、柔软度 |
| 4.4.2.3 小鼠皮肤组织切片及分析 |
| 4.4.3 对小鼠正常皮肤的研究 |
| 4.4.3.1 体重称量 |
| 4.4.3.2 皮肤的水分、油分、柔软度 |
| 4.4.3.3 小鼠皮肤组织切片及分析 |
| 4.5 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第五章 红豆杉果实多糖TMFP脂质体的安全性评价 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验设备与材料 |
| 5.2.1 实验材料 |
| 5.2.2 实验设备及仪器 |
| 5.2.3 实验动物 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 TMFP脂质体对人表皮永生化细胞(HACAT)的体外安全性评价 |
| 5.3.1.1 人表皮永生化细胞(HACAT)的培养 |
| 5.3.1.2 TMFP脂质体对HACAT细胞活力的影响 |
| 5.3.2 TMFP脂质体经皮给药对小鼠的体内安全性评价 |
| 5.3.2.1 动物的饲养及分组 |
| 5.3.2.2 生存状态观察 |
| 5.3.2.3 肝脏、肾脏组织切片的获取 |
| 5.3.3 统计学方法 |
| 5.4 结果与讨论 |
| 5.4.1 红豆杉果实多糖TMFP脂质体对HACAT细胞的体外安全性评价 |
| 5.4.2 TMFP-脂质体经皮给药对小鼠的体内安全性评价 |
| 5.4.2.1 生存状态观察 |
| 5.4.2.2 肝脏、肾脏组织切片 |
| 5.5 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第六章 总结与展望 |
| 6.1 总结 |
| 6.2 论文创新点 |
| 6.3 展望 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（6）不同光质对东北红豆杉愈伤组织中紫杉烷类成分合成代谢影响与初步机制解析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 东北红豆杉的研究进展 |
| 1.1.1 东北红豆杉简介 |
| 1.1.2 东北红豆杉中主要化学成分简介 |
| 1.1.3 东北红豆杉的主要药理活性研究进展 |
| 1.2 紫杉烷类化合物药源途径研究 |
| 1.2.1 植物提取法 |
| 1.2.2 化学合成法 |
| 1.2.3 生物发酵法 |
| 1.2.4 组织培养法 |
| 1.3 植物组织培养技术在药用活性成分生产中的研究进展 |
| 1.3.1 植物细胞培养技术 |
| 1.3.2 植物器官培养技术 |
| 1.4 光质在植物组培体系应用中的研究进展 |
| 1.4.1 光质在植物组培快繁中的应用研究进展 |
| 1.4.2 光质在增强植物组培体系生产次生代谢活性产物中的应用研究进展 |
| 1.5 红豆杉组织培养生产紫杉烷类活性成分的研究进展 |
| 1.6 紫杉烷化合物生物合成途径关键酶及基因 |
| 1.7 研究的目的和意义 |
| 1.8 技术路线 |
| 2 东北红豆杉愈伤组织培养体系的建立 |
| 2.1 实验仪器、材料与试剂 |
| 2.2 实验方法与步骤 |
| 2.2.1 外植体的制备 |
| 2.2.2 外植体消毒处理过程的优化 |
| 2.2.3 愈伤组织诱导及增殖培养条件的优化 |
| 2.2.4 抗褐化剂的优化 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 外植体消毒处理的优化 |
| 2.3.2 愈伤组织诱导及增殖条件的优化 |
| 2.3.3 抗褐化剂的优化 |
| 2.4 本章小结 |
| 3 不同光质对东北红豆杉愈伤组织中紫杉烷类化合物积累量的影响 |
| 3.1 实验仪器、材料与试剂 |
| 3.2 实验方法与步骤 |
| 3.2.1 光源的选择 |
| 3.2.2 不同光质处理过程 |
| 3.2.3 样品溶液的制备 |
| 3.2.4 UPLC-MS/MS分析检测 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 不同光质对东北红豆杉愈伤组织中紫杉烷类化合物积累量的影响 |
| 3.3.2 红光照射时长对东北红豆杉愈伤组织中紫杉烷类化合物积累量的影响 |
| 3.4 本章小结 |
| 4 LED光对东北红豆杉愈伤组织中紫杉烷类化合物生物合成相关基因表达的影响 |
| 4.1 实验仪器、材料与试剂 |
| 4.2 实验方法与步骤 |
| 4.2.1 总RNA的提取 |
| 4.2.2 cDNA的制备 |
| 4.2.3 qRT-PCR分析 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 不同光质对东北红豆杉愈伤组织中紫杉烷类化合物生物合成酶基因表达水平的影响 |
| 4.3.2 红光照射时长对东北红豆杉愈伤组织中紫杉烷类化合物酶基因表达水平的影响 |
| 4.4 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（7）紫杉醇提取纯化与pH响应的抗肝癌靶向纳米粒制备及功能评价（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 课题背景 |
| 1.2 东北红豆杉概况 |
| 1.2.1 植物学研究 |
| 1.2.2 资源分布 |
| 1.2.3 化学成分研究 |
| 1.2.4 药理作用 |
| 1.3 紫杉醇的研究概况 |
| 1.3.1 紫杉醇理化性质 |
| 1.3.2 紫杉醇合成途径 |
| 1.3.3 紫杉醇抗肿瘤作用机制 |
| 1.3.4 紫杉醇临床应用 |
| 1.3.5 紫杉醇的提取分离技术 |
| 1.4 纳米靶向递送系统 |
| 1.4.1 纳米载体 |
| 1.4.2 纳米靶向递药系统的分类 |
| 1.5 纳米载体对药物释放方法 |
| 1.5.1 pH敏感药物释放 |
| 1.5.2 还原敏感药物释放 |
| 1.5.3 酶敏感的药物释放 |
| 1.6 课题研究意义、内容和路线 |
| 1.6.1 研究意义 |
| 1.6.2 研究内容 |
| 1.6.3 技术路线 |
| 2 东北红豆杉枝叶中紫杉醇成分的提取工艺研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料与仪器 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 紫杉醇HPLC测定方法的建立 |
| 2.3.2 超高压辅助表面活性剂提取紫杉醇工艺 |
| 2.3.3 不同方法提取东北红豆杉枝叶中紫杉醇 |
| 2.3.4 提取率、得率的计算 |
| 2.4 实验结果与分析 |
| 2.4.1 天然表面活性剂筛选结果 |
| 2.4.2 单因素优化结果 |
| 2.4.3 响应面优化 |
| 2.4.4 不同提取方法比较 |
| 2.5 本章小结 |
| 3 超高压辅助胶束溶液提取紫杉醇的机理初探 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料与仪器 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 高压对红豆杉叶片的作用 |
| 3.3.2 高压对红豆杉叶片中纤维素、半纤维素、木质素含量的影响 |
| 3.4 实验结果与分析 |
| 3.4.1 超高压提取过程对细胞显微结构的变化 |
| 3.4.2 水浸处理前后物料表征 |
| 3.4.3 不同溶剂高压提取后物料表征 |
| 3.4.4 不同高压提取后物料表征 |
| 3.4.5 高压提取前后三大素含量测定结果 |
| 3.5 本章小结 |
| 4 紫杉醇的分离与纯化工艺研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料与仪器 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 纯度、回收率的计算 |
| 4.3.2 紫杉醇提取液的制备 |
| 4.3.3 紫杉醇的富集 |
| 4.3.4 柱层析 |
| 4.3.5 重结晶法纯化紫杉醇 |
| 4.3.6 紫杉醇的鉴定 |
| 4.4 实验结果与分析 |
| 4.4.1 萃取溶剂的选择 |
| 4.4.2 萃取分离的结果 |
| 4.4.3 氧化铝柱层析试验结果 |
| 4.4.4 紫杉醇重结晶法 |
| 4.4.5 紫杉醇的鉴定结果 |
| 4.5 本章小结 |
| 5 RGD-PDA-PHBV-PTX-NPs的制备、表征、安全性和释放特性评价 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料与仪器 |
| 5.2.1 实验材料 |
| 5.2.2 实验仪器 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 紫杉醇纳米粒子的制备 |
| 5.3.2 纳米粒大小、zeta电位和形态 |
| 5.3.3 功能化纳米粒子的固态研究 |
| 5.3.4 稳定性评估 |
| 5.3.5 溶血实验 |
| 5.3.6 体外释放动力学实验 |
| 5.4 实验结果与分析 |
| 5.4.1 PHBV-PTX纳米粒制备工艺优化 |
| 5.4.2 纳米粒的形貌和载药量分析 |
| 5.4.3 固体表征分析 |
| 5.4.4 纳米粒稳定性及溶血性考察 |
| 5.4.5 pH敏感NPs的体外释放 |
| 5.5 本章小结 |
| 6 RGD-PDA-PHBV-PTX-NPs的靶向抗肿瘤评价 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 实验材料与仪器 |
| 6.2.1 实验材料 |
| 6.2.2 实验仪器 |
| 6.3 实验方法 |
| 6.3.1 基于TCGA数据库的肝癌/癌旁组织整合素编码基因表达谱分析 |
| 6.3.2 细胞培养 |
| 6.3.3 体外细胞毒性试验 |
| 6.3.4 细胞摄取实验 |
| 6.3.5 异位移植瘤模型 |
| 6.3.6 体内生物分布研究 |
| 6.3.7 体内抗肿瘤作用 |
| 6.3.8 体内安全性评价 |
| 6.4 实验结果与分析 |
| 6.4.1 TCGA数据库中整合素编码基因差异表达分析 |
| 6.4.2 载药对LO2细胞的毒性作用 |
| 6.4.3 体外细胞毒性考察 |
| 6.4.4 体外细胞摄取行为考察 |
| 6.4.5 小鼠体内NIRF成像 |
| 6.4.6 体内抗肿瘤作用 |
| 6.4.7 体内安全性分析 |
| 6.5 本章小结 |
| 结论 |
| 总结与展望 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（8）无机氮源及短链羧酸对红发夫酵母合成虾青素的代谢影响研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 虾青素简介 |
| 1.1.1 虾青素理化性质 |
| 1.1.2 虾青素的生理学功能 |
| 1.1.3 虾青素的应用现状 |
| 1.2 虾青素生产方法 |
| 1.2.1 化学合成法 |
| 1.2.2 水产品加工废弃物提取 |
| 1.2.3 雨生红球藻培养 |
| 1.2.4 红发夫酵母发酵 |
| 1.3 红发夫酵母与虾青素 |
| 1.3.1 红发夫酵母简介 |
| 1.3.2 红发夫酵母胞内虾青素的生物合成 |
| 1.4 红发夫酵母虾青素研究现状 |
| 1.4.1 红发夫酵母育种研究 |
| 1.4.2 红发夫酵母培养工艺现状 |
| 1.5 本论文的研究目的和内容 |
| 1.5.1 研究意义和目的 |
| 1.5.2 研究内容 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌种 |
| 2.1.2 主要实验试剂及仪器 |
| 2.1.3 培养红发夫酵母相关培养基 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 菌种培养 |
| 2.2.2 菌种保藏 |
| 2.2.3 菌体生物量测定 |
| 2.2.4 残余葡萄糖浓度测定 |
| 2.2.5 残余铵离子浓度测定 |
| 2.2.6 总类胡萝卜素和虾青素的提取测定 |
| 2.2.7 菌体代谢物的提取与测定 |
| 2.2.8 RNA提取方法 |
| 2.2.9 cDNA逆转录 |
| 2.2.10 实时荧光定量PCR |
| 第三章 无机氮源对红发夫酵母的影响 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 结果与讨论 |
| 3.2.1 不同无机氮源对红发夫酵母生长和产虾青素的影响 |
| 3.2.2 硫酸铵对红发夫酵母生长和产虾青素的影响 |
| 3.2.3 硫酸铵添加时间对红发夫酵母产虾青素的影响 |
| 3.2.4 硫酸铵添加浓度对红发夫酵母产虾青素的影响 |
| 3.2.5 硫酸铵对红发夫酵母虾青素的合成途径关键基因转录水平的影响 |
| 3.2.6 硫酸铵添加条件下的菌体代谢组学分析 |
| 3.3 本章小结 |
| 第四章 短链羧酸对红发夫酵母的影响 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 结果与讨论 |
| 4.2.1 不同短链羧酸对红发夫酵母生长和产虾青素的影响 |
| 4.2.2 乙酸对红发夫酵母生长和产虾青素的影响 |
| 4.2.3 乙酸添加时间对红发夫酵母生长和产虾青素的影响 |
| 4.2.4 乙酸添加浓度对红发夫酵母生长和产虾青素的影响 |
| 4.2.5 复合添加策略A对红发夫酵母生长和产虾青素的影响 |
| 4.2.6 丙酮酸添加时间对红发夫酵母生长和产虾青素的影响 |
| 4.2.7 丙酮酸添加浓度对红发夫酵母生长和产虾青素的影响 |
| 4.2.8 复合添加策略B对红发夫酵母生长和产虾青素的影响 |
| 4.3 本章小结 |
| 第五章 发酵罐放大培养 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 5L发酵罐培养 |
| 5.3 本章小结 |
| 第六章 总结与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 存在的问题与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在读期间发表论文 |
| 致谢 |
（9）红发夫酵母培养及虾青素产品的研究开发（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 虾青素简介 |
| 1.1.1 来源 |
| 1.1.2 提取和稳定性 |
| 1.1.3 虾青素的商业应用 |
| 1.2 酵母抽提物简介 |
| 1.2.1 酵母抽提物来源与应用 |
| 1.2.2 酵母抽提物的发展方向 |
| 1.3 虾青素微囊粉的研究 |
| 1.3.1 虾青素微囊粉的制备方法 |
| 1.3.2 制备虾青素微囊粉影响因素 |
| 1.3.3 虾青素微囊粉的研究概况 |
| 1.4 酵母残渣的利用 |
| 1.5 本论文的研究意义及内容 |
| 1.5.1 研究意义 |
| 1.5.2 主要研究内容 |
| 第二章 补加氮源对红发夫酵母生物量以及色素的影响 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 菌种来源 |
| 2.2.2 培养基 |
| 2.2.3 仪器与试剂 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 菊芋提取液制备 |
| 2.3.2 酵母菌种保藏与活化 |
| 2.3.3 混合碳源培养红发夫酵母产虾青素特性研究 |
| 2.3.4 优化碳氮比 |
| 2.3.5 氮源的补加时间对生物量及色素的影响 |
| 2.3.6 氮源补加的量对生物量及色素的影响 |
| 2.3.7 分析方法 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 混合碳源培养红发夫酵母生长和虾青素积累的影响 |
| 2.4.2 不同碳氮比对生物量的影响 |
| 2.4.3 不同时间补加蛋白胨对生物量及色素的影响 |
| 2.4.4 不同的量的蛋白胨补加对色素及生物量的影响 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 红发夫酵母破碎及酵母抽提物的制备 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 实验菌株 |
| 3.2.2 培养基 |
| 3.2.3 仪器与试剂 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.0 菌种的保藏、活化与培养 |
| 3.3.1 收集红发夫酵母细胞 |
| 3.3.2 红发夫酵母复合酶法破壁的研究 |
| 3.3.3 添加玻璃珠机械破壁对细胞破碎以及色素提取的影响 |
| 3.3.4 酵母抽提物的制备 |
| 3.3.5 分析方法 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 外加安琪酵母复配酶的量对色素提取率的影响 |
| 3.4.2 外加纤维素酶Ctec2和Celluclast1.5L对色素提取率的影响 |
| 3.4.3 温度对酶破壁色素提取率的影响 |
| 3.4.4 pH对酶破壁色素提取率的影响 |
| 3.4.5 纤维素酶与安琪酵母复配酶复合对红发夫酵母破壁色素提取率的影响 |
| 3.4.6 玻璃珠涡旋振荡对红发夫酵母细胞破碎及色素提取的影响 |
| 3.4.7 玻璃珠摇床中振荡对红发夫酵母细胞破碎及色素提取的影响 |
| 3.4.8 两种条件下制备酵母抽提物参数比较 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 虾青素微囊化粉末制备 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 实验菌株 |
| 4.2.2 培养基 |
| 4.2.3 仪器与试剂 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 菌种的保藏、活化和培养 |
| 4.3.2 收集红发夫酵母细胞 |
| 4.3.3 制备含色素的酵母抽提物 |
| 4.3.4 制备多孔淀粉 |
| 4.3.5 虾青素微囊粉的制备 |
| 4.3.6 提高酵母抽提液中色素浓度以制备高载药量的微囊粉 |
| 4.3.7 微囊粉中色素的稳定性研究 |
| 4.3.8 分析方法 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 虾青素微囊粉制备条件优化 |
| 4.4.2 提高载药量的扩展实验 |
| 4.4.3 红外光谱定性分析 |
| 4.4.4 不同颗粒微囊粉颜色测定 |
| 4.4.5 不同颗粒微囊粉溶解度测定 |
| 4.4.6 不同颗粒微囊粉稳定性实验 |
| 4.5 本章小结 |
| 结论和展望 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 附件 |
（10）南方红豆杉细胞悬浮培养体系建立及培养条件优化（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 红豆杉简介 |
| 1.2 紫杉醇研究进展 |
| 1.3 植物细胞组织培养研究进展 |
| 1.3.1 植物细胞培养 |
| 1.3.2 植物细胞组织培养获取天然产物 |
| 1.3.3 植物细胞获取及培养方式 |
| 1.3.4 红豆杉细胞悬浮培养的研究进展 |
| 1.4 课题来源、研究目的及意义 |
| 1.4.1 课题来源 |
| 1.4.2 研究目的及意义 |
| 1.5 本文主要研究内容 |
| 第2章 南方红豆杉细胞悬浮培养体系的建立 |
| 2.1 材料与试剂 |
| 2.1.1 试验材料 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器与设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 外植体的消毒 |
| 2.2.2 丙酸钠在愈伤组织诱导中的抑菌作用 |
| 2.2.3 植物生长调节剂组合对愈伤组织诱导率的影响 |
| 2.2.4 培养基种类对细胞生长的影响 |
| 2.2.5 细胞接种量对细胞悬浮培养的影响 |
| 2.2.6 培养基初始pH值对细胞悬浮培养的影响 |
| 2.2.7 植物生长调节剂配比对细胞生长的影响 |
| 2.2.8 悬浮细胞生长曲线绘制 |
| 2.2.9 测定指标及方法 |
| 2.2.10 数据处理与统计分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 外植体消毒 |
| 2.3.2 丙酸钠对外植体的作用 |
| 2.3.3 植物生长调节剂配比对外植体的诱导作用 |
| 2.3.4 培养基种类对南方红豆杉悬浮培养细胞的影响 |
| 2.3.5 细胞接种量对南方红豆杉悬浮培养细胞的影响 |
| 2.3.6 培养基初始pH对南方红豆杉悬浮培养细胞的影响 |
| 2.3.7 植物生长调节剂浓度及配比对南方红豆杉悬浮培养细胞生长的影响 |
| 2.3.8 南方红豆杉细胞生长曲线 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 愈伤组织紫杉醇提取与含量测定方法的建立 |
| 3.1 材料与试剂 |
| 3.1.1 试验材料 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器与设备 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 愈伤组织预处理 |
| 3.2.2 紫杉醇标准品溶液配制 |
| 3.2.3 最大波长的选择 |
| 3.2.4 标准曲线的绘制 |
| 3.2.5 方法学考察 |
| 3.2.6 南方红豆杉愈伤组织紫杉醇的提取检测及含量测定 |
| 3.2.7 紫杉醇提取条件的优化 |
| 3.2.8 数据处理与统计分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.0 方法学考察结果 |
| 3.3.1 薄层色谱及HPLC分析结果 |
| 3.3.2 提取溶剂对紫杉醇含量的影响 |
| 3.3.3 提取级数对紫杉醇含量的影响 |
| 3.3.4 单因素试验 |
| 3.3.5 正交试验结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第4章 南方红豆杉细胞悬浮培养动力学研究 |
| 4.1 材料与试剂 |
| 4.1.1 试验材料 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器与设备 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 悬浮细胞动态 |
| 4.2.2 测定指标及方法 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 南方红豆杉细胞干重、细胞活力、细胞紫杉醇含量和产量动态变化 |
| 4.3.2 南方红豆杉细胞培养过程中基质消耗动态变化 |
| 4.3.3 南方红豆杉细胞悬浮培养动力学模型及其参数估计 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第5章 南方红豆杉细胞悬浮培养条件的优化 |
| 5.1 材料与试剂 |
| 5.1.1 试验材料 |
| 5.1.2 主要试剂 |
| 5.1.3 主要仪器与设备 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 蔗糖浓度对南方红豆杉细胞生长和紫杉醇含量的影响 |
| 5.2.2 氮源对悬浮培养南方红豆杉细胞生长的影响 |
| 5.2.3 磷源浓度对细胞生长及紫杉醇含量的影响 |
| 5.2.4 Ca~(2+)浓度对细胞生长及紫杉醇含量的影响 |
| 5.2.5 Mg~(2+)浓度对细胞生长及紫杉醇含量的影响 |
| 5.2.6 测定指标及方法 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 蔗糖浓度对南方红豆杉细胞生长及紫杉醇合成的影响 |
| 5.3.2 铵态氮和硝态氮比值对南方红豆杉细胞生长及紫杉醇合成的影响 |
| 5.3.3 总氮浓度对南方红豆杉细胞生长及紫杉醇合成的影响 |
| 5.3.4 磷源浓度对南方红豆杉细胞生长及紫杉醇合成的影响 |
| 5.3.5 Ca~(2+)浓度对南方红豆杉细胞生长及紫杉醇合成的影响 |
| 5.3.6 Mg~(2+)浓度对南方红豆杉细胞生长及紫杉醇合成的影响 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 第6章 结论与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 创新点 |
| 6.3 展望 |
| 参考文献 |
| 附表Ⅰ 几种常用培养基组成成分表 |
| 附表Ⅱ 缩略词表 |
| 附图 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
四、添加化学试剂对红豆杉培养细胞生长的影响（论文参考文献）
- [1]东北红豆杉产紫杉醇内生真菌Alternaria alternata F3的分离鉴定及体外抗癌活性研究[D]. 张智慧. 东北林业大学, 2021
- [2]东北红豆杉内生真菌多样性与紫杉烷积累的相关性规律解析及其高产菌株的应用[D]. 李弘琨. 东北林业大学, 2021
- [3]东北红豆杉细胞悬浮培养与紫杉醇提取分离技术研究[D]. 白贺. 吉林大学, 2020(01)
- [4]刺梨果实愈伤组织诱导及影响其主要活性物质含量的因素[D]. 房洪舟. 贵州大学, 2020
- [5]红豆杉多糖纳米制剂的制备及评价[D]. 王歆悦. 东南大学, 2020(01)
- [6]不同光质对东北红豆杉愈伤组织中紫杉烷类成分合成代谢影响与初步机制解析[D]. 王馨. 东北林业大学, 2020(02)
- [7]紫杉醇提取纯化与pH响应的抗肝癌靶向纳米粒制备及功能评价[D]. 吴铭芳. 东北林业大学, 2020(01)
- [8]无机氮源及短链羧酸对红发夫酵母合成虾青素的代谢影响研究[D]. 朱先峰. 厦门大学, 2019(07)
- [9]红发夫酵母培养及虾青素产品的研究开发[D]. 陈莉. 华南理工大学, 2018(02)
- [10]南方红豆杉细胞悬浮培养体系建立及培养条件优化[D]. 徐志荣. 江西农业大学, 2018(02)