人子宫内膜癌单克隆抗体的制备与鉴定

人子宫内膜癌单克隆抗体的制备与鉴定

一、人子宫内膜癌单克隆抗体的制备及鉴定(论文文献综述)

孙一卿[1](2021)在《NLRC3及GDF15在子宫内膜癌中的表达及对细胞生物学行为的影响》文中进行了进一步梳理第一部分NLRC3在子宫内膜癌中的表达及对细胞生物学行为的影响研究背景:子宫内膜癌(endometrial carcinoma,EnC)是最常见的三大女性生殖系统恶性肿瘤之一,发病率位于世界女性恶性肿瘤的第六位,常见于围绝经期及绝经后老年女性。近年来,因糖尿病、肥胖、高血压、不孕以及含雌激素食物过量摄入,使EnC发病率增高,居我国女性生殖系统恶性肿瘤第2位,且发病年龄年轻化,严重威胁女性健康。肿瘤微环境与肿瘤发生、发展及转移有密切关系,免疫炎性微环境在子宫内膜癌发生发展中起重要作用。因涉及胚胎植入这一过程,子宫内膜也是固有免疫相关的重要组织。子宫内膜的慢性炎症反应可导致微环境改变,促进肿瘤发生发展,包括促炎细胞因子、趋化因子、其他炎性分子等。模式识别受体(pattern recognitionreceptors,PRRs)是宿主固有免疫系统重要的组成部分,定位在包浆的 PRRs 主要包括 NOD 样受体(the NOD-like receptors,NLRs)。NLR 由三个部分组成,包括N端的效应域、中间的寡聚域、C端富含亮氨酸的重复序列,作用分别为结合下游的效应分子、介导自身的寡聚反应、识别配体。NOD蛋白与配体结合后,蛋白与下游的受体蛋白相互作用,激活转录因子NF-κB,介导炎性介质的表达。NLRC3(NOD3)是NLR家族中的一员,参与调控经典、非经典的NF-κB信号通路,影响肿瘤发生发展过程。多项研究表明,NLRC3与炎症反应有关,是炎症信号通路的负性调控因子,其功能失调可导致炎症反应和多种自身免疫性疾病。在肿瘤中,NLRC3也有着重要作用。已有研究报道,NLRC3在肝癌组织中表达低于非酒精性脂肪肝炎组织,并可调控肝癌细胞增殖、迁移和侵袭;在膀胱癌中可调控肿瘤的生长和转移;在结肠癌中表达低于正常组织,并可作为磷脂酰肌醇3-激酶/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(phosphoinositide 3-kinase/the mammalian target of rapamycin,PI3K/mTOR)信号通路的抑制性感受器,可通过抑制结肠癌细胞PI3K/mTOR通路预防结肠癌的发生。PI3K/AKT/mTOR信号通路是调控子宫内膜癌发生发展的关键通路之一,参与子宫内膜癌细胞的多项生命活动,影响其生物学行为,包括细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡、自噬等,并促进肿瘤新生血管形成,对子宫内膜癌上皮-间质转化(epithelial to mesenchymal transition,EMT)起核心调控作用。目前,NLRC3调控子宫内膜癌发生发展的机制尚不明确,且缺乏关于该分子与EMT指标的相互影响的研究。本文通过检测NLRC3在子宫内膜癌组织中的表达情况,探索NLRC3过表达后对细胞生物学行为的影响及对EMT指标的作用,进一步探讨NLRC3对子宫内膜癌细胞增殖、迁移、侵袭和EMT的影响及潜在作用机制,为NLRC3在子宫内膜癌演进中的作用提供理论和实验基础,为子宫内膜癌的个体化治疗及靶向治疗提供新的方向。研究目的:1.探究NLRC3在子宫内膜癌组织、癌旁组织及正常子宫内膜组织中的表达情况及其临床意义。2.探究NLRC3过表达后对子宫内膜癌细胞上皮-间质转化标志物表达的影响。3.探究NLRC3对子宫内膜癌细胞系Ishikawa、KLE增殖、迁移、侵袭及体内成瘤能力的影响。4.探讨NLRC3在EnC发生、发展中的可能作用及临床意义。研究方法:1.免疫组织化学法检测各标本组织中NLRC3的表达情况(标本来源于山东大学附属省立医院病理科石蜡包埋组织,包括高、中、低级别子宫内膜样腺癌、子宫肌瘤内膜组织)。收集术中新鲜标本(标本来源于山东大学附属省立医院中心院区妇科手术患者,包括高、中、低级别子宫内膜样腺癌及对应的癌旁内膜组织,子宫肌瘤内膜组织)。采用Western blot、RT-qPCR检测EnC患者肿瘤组织中NLRC3及其mRNA的表达水平。2.子宫内膜癌细胞系Ishikawa、KLE转染NLRC3过表达慢病毒,利用Western blot法验证转染效率,检测NLRC3的过表达水平,建立NLRC3过表达细胞系。3.利用 Western blot 法检测 NLRC3 过表达对 EMT 标志物 Vimentin、N-cadherin、E-cadherin蛋白表达的影响。4.通过CCK-8实验、细胞平板克隆实验、划痕愈伤实验、Transwell迁移和侵袭实验检测NLRC3对Ishikawa、KLE细胞增殖、迁移、侵袭能力的影响。5.利用Western blot法检测NLRC3过表达对PI3K/AKT信号通路的影响。6.裸鼠体内成瘤实验检测NLRC3对KLE细胞裸鼠体内成瘤和增殖能力的影响。结果:1.免疫组化、Western blot结果表示NLRC3在EnC中的阳性表达率显着低于子宫肌瘤内膜组织(P<0.05),根据Western blot结果,NLRC3在EnC组织中的表达显着低于同一患者的癌旁组织(P<0.05)。NLRC3表达与病理分级有关,随着病理分级升高NLRC3表达下降(P<0.05)。根据PCR结果,NLRC3 mRNA水平在EnC组织中高于子宫肌瘤内膜组织(P<0.05)。2.子宫内膜癌细胞系Ishikawa、KLE转染过表达NLRC3慢病毒后,KLE细胞中N-cadherin、Vimentin表达明显降低(p<0.05),E-cadherin表达有上升趋势但无统计学显着性(p>0.05);Ishikawa转染过表达NLRC3慢病毒后,E-cadherin、Vimentin表达水平增高,N-cadherin表达下降,结果无统计学显着性(p>0.05)。3.CCK-8实验绘制生长曲线实验组与对照组相比无明显差异(p>0.05),平板克隆试验中,实验组克隆数及克隆直径均小于对照组,结果有统计学显着性(p<0.05)。通过划痕愈伤实验及Transwell实验,NLRC3过表达可降低子宫内膜癌细胞Ishikawa、KLE迁移和侵袭能力(p<0.05)。4.NLRC3过表达后,在KLE、Ishikawa细胞中,对PI3K/AKT通路无明显抑制作用,提示NLRC3在子宫内膜癌中的作用可能通过其它通路进行。5.裸鼠移植瘤模型表明KLE细胞中NLRC3过表达降低裸鼠体内移植瘤的增殖能力(p<0.05)。结论:1.NLRC3参与EnC的发生和发展,在EnC中的表达显着低于正常子宫内膜,且低于相应的癌旁正常组织,与EnC病理分级有关,随肿瘤分级升高NLRC3表达降低,NLRC3可作为EnC病理分级的诊断依据之一,可作为EnC恶性程度划分及选择辅助治疗的辅助指标。2.KLE细胞中NLRC3过表达抑制EMT,进而抑制EnC发展。3.NLRC3负性调控子宫内膜癌细胞的生物学行为,过表达NLRC3可降低子宫内膜癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力,在体内可抑制裸鼠移植瘤模型中肿瘤增殖。4.Ishikawa、KLE细胞中,均未发现NLRC3可通过PI3K/AKT信号通路发挥其作用。5.NLRC3有望成为EnC诊断和治疗的新靶点。第二部分GDF15对子宫内膜癌细胞转移机制的研究研究目的:1.探究GDF15变化对子宫内膜癌KLE、Ishikawa细胞系增殖、迁移、侵袭、EMT的影响。2.探究GDF15在子宫内膜癌细胞中影响其生物学行为可能的作用机制。3.探究米非司酮和雌激素对GDF15的作用。研究方法:1.Ishikawa、KLE细胞转染siGDF15,RT-qPCR法验证转染效率。2.应用CCK8检测实验组及对照组细胞增殖能力,划痕愈伤实验及Transwell迁移和侵袭检测细胞迁移、侵袭能力。3.Western blot 检测 EMT 及 Wnt/β-catenin 通路的变化。4.RT-qPCR检测米非司酮和雌激素作用细胞后GDF15 mRNA的变化。结果:1.子宫内膜癌KLE、Ishikawa细胞系敲低GDF15后,Ishikawa细胞增殖能力被抑制;KLE细胞增殖无明显变化。2.敲低GDF15后,KLE、Ishikawa细胞迁移、侵袭能力受到显着抑制(p<0.05)。3.敲低 GDF15 表达后,抑制 KLE 细胞 Vimentin、Snail 表达(p<0.05),E-cadherin表达水平升高,敲低GDF15抑制KLE细胞上皮-间质转化能力。4.敲低 GDF15,Ishikawa 细胞中 Wnt、β-catenin 表达显着下降(p<0.05),KLE细胞中β-catenin表达显着下降(p<0.05),Wnt无明显变化(p>0.05)。敲低GDF15可影响子宫内膜癌细胞中Wnt/β-catenin信号通路变化。5.米非司酮干预KLE、Ishikawa后,GDF15 mRNA表达水平均提高,雌激素干预对细胞GDF15 mRNA表达影响不显着。结论:1.敲低子宫内膜癌KLE、Ishikawa细胞中GDF15表达,对细胞增殖无明显影响,可抑制细胞迁移、侵袭、EMT能力,抑制Wnt/β-catenin信号通路的激活。2.米非司酮有可能通过GDF15在子宫内膜癌发生发展中起作用。

沈文平[2](2021)在《Mcm5在子宫内膜浆液性癌发生发展中的作用及机制》文中认为背景子宫内膜癌(endometrial carcinoma,EC)是女性生殖系统常见的恶性肿瘤,每年新发病例接近20万,且发病率呈逐年上升趋势。EC主要分为两型,Ⅰ型为雌激素依赖型,以子宫内膜样癌(endometrial endometrioid carcinoma,EEC)为原型,通常在子宫内膜增生的基础上发展而来,预后较好;子宫内膜浆液性癌(endometrial serous carcinoma,ESC)为 Ⅱ 型,虽然发病率仅占 EC 的 10-15%,但侵袭性高,预后差,导致的死亡约占内膜癌总死亡率的50%。ESC死亡率居高不下,根本原因在于缺乏有效的早期诊断手段和策略,大多数患者发现时已处于临床3、4期,因此早期发现和早期治疗对改善ESC患者的预后情况至关重要。课题组前期采用Cre-loxp-Ksp1.3系统,特异性敲除雌鼠子宫内膜腺上皮细胞中的Trp53基因,使具有重要抑癌作用的TP53基因失表达,从而建立起ESC小鼠模型,为深入研究ESC发病提供了一个很好的工具。在此基础上,收集并分离肿瘤组织和对照组以及空白组非肿瘤子宫内膜组织,进行蛋白质谱分析,发现微小染色体维持缺陷蛋白 5(minichromosome maintenance deficient 5,MCM5)在ESC组织中表达显着高于正常子宫内膜组织。Mcm5位于染色体22q 13.1上,其表达蛋白MCM5参与MCM复合物(MCMs)的组成。MCMs是一组高度保守的蛋白,参与DNA复制启动和延伸,并保证DNA复制在一个细胞周期中只进行一次。MCM5作为转录复合体的重要组成部分,在细胞周期从G0到G1/S的过渡中上调,通过与CDC45-MCM-GINS复合物中的CDC45和GINS中的PSF3相互作用,在DNA复制过程中发挥至关重要的作用。本课题以Trp53基因敲除的ESC小鼠模型为基础,筛选ESC发生发展相关蛋白,进一步检测MCM5在ESC组织中的表达,体外实验研究MCM5在ESC中的功能,并初步探讨其发挥功能的分子机制。方法1.蛋白质谱:收集转基因小鼠ESC肿瘤组织和对照组及空白组的子宫内膜组织,酶消化法分离肿瘤和上皮细胞,然后进行蛋白质谱检测,筛选差异表达蛋白。2.生物信息学分析:对差异表达蛋白进行生物信息学分析,确定ESC发生发展相关的差异表达基因。3.标本收集和细胞培养:收集ESC、EmGD、萎缩性子宫内膜和EEC标本,通过免疫组织化学技术在组织水平验证差异表达蛋白。4.功能学实验:CCK8实验和平板克隆形成实验检测Mcm5对ESC细胞增殖的影响;细胞划痕实验和Transwell实验检测Mcm5对ESC细胞迁移侵袭的影响;流式细胞术检测Mcm5对ESC细胞凋亡的影响。5.Western-blot实验:检测Mcm5在上皮细胞-间叶转化(EMT)过程中是否发挥作用以及细胞凋亡相关分子表达水平。6.细胞荧光实验:检测Mcm5对DNA复制的影响。7.细胞周期实验:流式细胞术检测Mcm5对细胞周期的影响。8.免疫共沉淀(CoIP):p53蛋白与MCM5蛋白的相互作用。9.mRNA芯片:干扰子宫内膜癌细胞的Mcm5表达后,进行mRNA芯片检测,筛选Mcm5下游靶基因,GO分析和KEGG通路富集初步探索Mcm5的作用通路。结果1.成功建立特异性敲除Trp53基因的小鼠ESC模型,并且先后检测到EmGD、SEIC、ESC 发生。2.蛋白质谱结果分析结合生物信息学,筛选得到四个差异表达蛋白MCM5、MYBL2、ATP8A1 和 ITGA9。3.MCM5蛋白表达在ESC表达显着升高。MCM5在萎缩性子宫内膜、EmGD、ESC表达率分别为16.7%(3/18)、50%(2/4)和93.2%(55/59),表达逐步升高,在EEC中的总阳性率为26.7%(12/39)。4.体外实验显示Mcm5促进ESC细胞的增殖、迁移侵袭,抑制凋亡。5.干扰Mcm5影响HEC-1B和ISHIKAWA细胞中EMT相关分子表达。上皮细胞标记物ZO-1表达升高,而间质细胞标记物N-cadherin、Vimentin、β-catenin的表达降低;HEC-1B细胞中促凋亡蛋白caspase3、caspase9和BAX表达明显上调。6.干扰Mcm5后,HEC-1B和ISHIKAWA细胞DNA合成减少,且细胞周期被阻滞于S期。7.p53蛋白与MCM5蛋白存在直接结合,且TP53抑制Mcm5的表达。8.mRNA芯片结果中Fold change>2,p<0.05的表达上调基因有464个,表达下调基因1129个;多个差异基因在NF-κB和TNF-α信号通路富集,p<0.001。结论1.特异性敲除小鼠子宫腺上皮的Trp53基因,能够诱发ESC,证实了“RE→EmGD→SEIC→ESC”的发生发展过程。2.MCM5在人ESC组织中表达显着上调。3.Mcm5促进ESC细胞的增殖、迁移侵袭,抑制凋亡,促进肿瘤细胞DNA的复制和细胞周期进程。4.p53通过直接结合调控MCM5表达。

赵雪莹[3](2021)在《RFRP-3对子宫内膜和人源子宫内膜癌细胞株HEC-1A的影响及分子机制》文中提出促性腺激素抑制激素(gonadotropin-inhibitory hormone,Gn IH)是2000年发现的一种新型下丘脑神经肽,其在摄食、能量平衡和生殖等方面发挥重要作用。该神经肽结构高度保守,RF酰胺相关肽-1(RFamide-related peptide-1,RFRP-1)和RF酰胺相关肽-3(RFamide-related peptide-1,RFRP-3)是Gn IH在哺乳动物中的同系物,其中RFRP-3起主要作用。Gn IH可通过其受体—G蛋白偶联受体147(the G protein-coupled receptor147,GPR147)作用于下丘脑,垂体等组织器官以抑制生殖。子宫是女性重要的生殖器官,研究发现侧脑室注射RFRP-3可引起大鼠子宫发育延迟,其机制及其它作用尚不清楚。因此,深入探索Gn IH对子宫作用的分子机制对哺乳动物乃至人类生殖有着重要意义。子宫内膜癌(endometrial carcinoma,EC)是女性常见的三大恶性肿瘤之一,严重威胁女性生命健康,其发病率在世界范围内逐年上升,并呈现年轻化趋势。目前其主要的治疗措施有传统手术治疗,放、化疗及激素治疗,但对于晚期癌,复发癌以及满足年轻患病女性生育需求治疗效果欠佳。因此,寻找更加有效的治疗方法,从而降低病死率,延缓复发,并提高患者生活质量,是国内外学者广泛关注的焦点。本课题组前期实验表明,侧脑室注射RFRP-3 6 h对卵巢摘除术后补充雌激素(ovariectomized estrogen primed,OEP)大鼠作用显着,RFRP-3可通过抑制POMC、kisspeptin神经元,刺激NPY神经元抑制Gn RH神经元,以抑制Gn RH的释放,进而抑制垂体促性腺激素的释放,从而发挥对下丘脑-垂体生殖轴的调节作用。子宫是下丘脑-垂体生殖轴的下游靶器官,RFRP-3是否可通过下丘脑-垂体生殖轴对其进行调节尚不清楚。因此,本研究利用液相色谱-串联质谱(Liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)技术对侧脑室微量注射RFRP-3及生理盐水的OEP大鼠子宫腔液中的蛋白质进行鉴定,对所筛选的差异蛋白(differentially expressed proteins,DEPs)进行GO(Genetic Ontology)功能富集分析、KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路分析和蛋白-蛋白间相互作用(Protein-Protein Interaction,PPI)网络等生物信息学分析,探索RFRP-3作用于子宫的影响及潜在分子机制。应用子宫内膜癌细胞株HEC-1A进行细胞增殖、凋亡检测,旨在阐明RFRP-3作用于子宫内膜癌细胞株HEC-1A的分子机制,探索RFRP-3对子宫内膜癌细胞的影响,此结果可能为深入探索RFRP-3对子宫的影响提供新思路。第一部分基于蛋白质组学对侧脑室注射RFRP-3的OEP大鼠子宫腔液分泌蛋白的研究目的:探讨侧脑室注射促性腺激素抑制激素对卵巢摘除术后补充雌激素模型大鼠子宫腔液的蛋白组改变的影响及其潜在分子机制。方法:1.子宫腔液的收集及分组:取成年雌性SD大鼠30只,建立卵巢摘除术后补充雌激素大鼠模型。将30只造模成功的OEP大鼠随机分为生理盐水对照组和RFRP-3实验组(n=15),按16μl/kg侧脑室注射生理盐水及RFRP-3。注射后6 h取子宫腔液,分别将实验组(n=15)和对照组(n=15)大鼠的子宫腔液混合后分成三份。2.利用LC-MS/MS法比较6 h后侧脑室注射RFRP-3实验组(n=15,16μl/kg)与生理盐水对照组(n=15,16μl/kg)的蛋白质组分,利用Maxquant软件进行定性分析,利用Uniport数据库筛选差异蛋白。3.利用GO功能富集分析分生物学过程、细胞成分和分子功能三部分分析差异蛋白的功能。4.利用KEGG通路分析对差异蛋白涉及到的信号途径进行分析。5.利用Omicsbean软件绘制PPI网络筛选中心节点蛋白。结果:1.侧脑室注射RFRP-3影响子宫腔液蛋白变化利用LC-MS/MS技术检测子宫腔液蛋白变化情况。结果显示,与生理盐水对照组相比,侧脑室注射RFRP-3 6 h对OEP大鼠的子宫腔液蛋白成分及表达水平产生显着影响(P<0.05)。根据P<0.05,FC=2的标准,筛选出了417个差异表达蛋白,其中包括279个上调的DEPs和138个下调的DEPs。2.侧脑室注射RFRP-3后所得DEPs的生物学功能分析GO分析显示,差异表达蛋白主要定位于胞外区(及膜结合囊泡;生物过程涉及对有机物质的反应、对含氧化合物的反应、内源性刺激反应、胁迫反应等,参与蛋白结合,蛋白质复合物结合,大分子复合物结合等分子功能。3.侧脑室注射RFRP-3后所得DEPs涉及到的信号途径分析KEGG通路分析显示,侧脑室注射RFRP-3后DEPs显着富集(P<0.05)的前十位通路为:碳代谢、缝隙连接、长期抑制、肌动蛋白骨架调控、氨基酸生物合成、补体和凝血级联、糖酵解/糖异生、癌症蛋白多糖、血小板活化和甲状腺激素合成。4.侧脑室注射RFRP-3后所得DEPs的蛋白互作分析利用STRING数据库获取蛋白质间相互作用数据,并利用Omicsbean软件对PPI网络进行可视化。通过分析比较蛋白间相互作用的密切程度,共筛选出5个蛋白为中心节点蛋白,分别为Gna13、Gnaq、Gnai3、Kras、Mmp9。其中Mmp9上调,Gna13、Gnaq、Gnai3、Kras下调。结论:RFRP-3可能通过上调Mmp9和下调Gna13、Gnaq、Gnai3、Kras等中心节点蛋白改变OEP大鼠子宫腔液的蛋白表达谱。第二部分RFRP-3对人源子宫内膜癌细胞株HEC-1A的作用及机制研究目的:探索RFRP-3对人子宫内膜癌细胞HEC-1A增殖和凋亡的影响及其作用的分子机制。方法:1.利用UALCAN数据库搜索中心节点蛋白在子宫内膜癌组织中的表达情况。2.利用CCK8实验检测子宫内膜癌细胞(HEC-1A、Ishikawa)在不同浓度RFRP-3作用24、48h后的增殖能力。3.AnnexinⅤ-FITC/PI双染流式检测子宫内膜癌细胞HEC-1A加入RFRP-3 24h后的细胞凋亡情况。4.蛋白印迹法检测子宫内膜癌细胞HEC-1A对照组与RFRP-3组凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax的表达水平。5.蛋白印迹法检测子宫内膜癌细胞HEC-1A对照组与RFRP-3组Kras(中心节点蛋白)蛋白的表达水平。6.RT-qPCR检测子宫内膜癌细胞HEC-1A对照组与RFRP-3组PI3K/AKT/mTOR通路基因的转录水平。7.蛋白印迹法检测子宫内膜癌细胞HEC-1A对照组与RFRP-3组PI3K/AKT/mTOR通路蛋白的表达水平。8.RT-qPCR检测子宫内膜癌细胞HEC-1A对照组与RFRP-3组ERK通路的基因的转录水平。9.蛋白印迹法检测子宫内膜癌细胞HEC-1A对照组与RFRP-3组ERK通路蛋白的表达水平。10.RT-qPCR和蛋白印迹法分别从基因、蛋白水平检测子宫内膜癌细胞HEC-1A对照组与RFRP-3组自噬发生情况。11.蛋白印迹法检测子宫内膜癌细胞HEC-1A对照组与RFRP-3组GPR147蛋白的表达水平。结果:1.子宫内膜癌组织中Gna13、Gnaq、Kras、Mmp9表达发生显着改变在UALCAN数据库对5个中心节点蛋白进行搜索后,结果显示,Gna13、Gnaq、Kras、Mmp9均在子宫内膜癌组织与正常组织的比较中存在差异。与正常组织相比,Kras、Mmp9在子宫内膜癌组织中的表达上调,Gna13、Gnaq在子宫内膜癌组织中的表达下调。2.RFRP-3抑制子宫内膜癌细胞HEC-1A的增殖在雌激素受体阴性子宫内膜癌细胞系HEC-1A和雌激素受体阳性子宫内膜癌细胞系Ishikawa中,选取0.1、1、10、100、1000、10000 ng/ml6个RFRP-3浓度,24 h和48 h两个时间点进行CCK8实验。结果显示,10000ng/ml RFRP-3抑制子宫内膜癌细胞HEC-1A的增殖,加药24 h效果最好。0.1、1、10、100、1000、10000 ng/ml 6个RFRP-3浓度,24 h和48 h两个时间点加入RFRP-3,未对雌激素受体阳性子宫内膜癌细胞系Ishikawa产生影响。3.RFRP-3诱导HEC-1A发生凋亡Annexin V-FITC/PI双染法对加入RFRP-3 24 h后子宫内膜癌细胞HEC-1A的凋亡率进行了检测,本实验统计的凋亡率为晚期凋亡与早期凋亡的总和(UR区+LR区)。结果显示,相对于对照组,10000 ng/ml RFRP-3组凋亡率上升(P<0.05)。4.RFRP-3改变HEC-1A中凋亡相关蛋白的表达RFRP-3作用于HEC-1A细胞24 h后,提取蛋白进行蛋白印记实验,结果显示,10000 ng/ml RFRP-3组抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白表达低于对照组(P<0.05),促凋亡蛋白Bax蛋白表达量高于对照组(P<0.05),差异有统计学意义。5.RFRP-3降低HEC-1A中Kras蛋白表达量对在子宫内膜癌组织中表达发生显着变化的中心节点蛋白进行检测。RFRP-3作用于HEC-1A细胞24 h后,提取蛋白进行蛋白印记实验,结果显示,与对照组相比,10000 ng/ml RFRP-3组中Kras蛋白表达下降,差异有统计学意义(P<0.05)。6.RFRP-3下调HEC-1A中PI3K/AKT/mTOR通路基因的转录水平为进一步验证中心节点蛋白Kras在RFRP-3影响子宫内膜癌细胞HEC-1A增殖与凋亡中的作用,我们对Kras下游通路进行了RT-qPCR检测。RFRP-3作用于HEC-1A细胞24 h后,提取RNA进行RT-qPCR实验。结果显示:相对于对照组,10000 ng/ml RFRP-3加药组PI3K的m RNA相对表达水平降低(P<0.001);AKT的m RNA相对表达水平降低(P<0.01);mTOR的m RNA相对表达水平降低(P<0.01)。7.RFRP-3下调HEC-1A中PI3K/AKT/mTOR通路蛋白表达水平为进一步验证中心节点蛋白Kras在RFRP-3影响子宫内膜癌细胞HEC-1A增殖与凋亡中的作用,我们对Kras下游通路进行了蛋白印迹检测。RFRP-3作用于HEC-1A细胞24 h后,提取蛋白进行蛋白印记实验,结果显示:与对照组相比,10000 ng/ml RFRP-3组PI3K蛋白相对表达水平降低(P<0.01);p-AKT蛋白相对表达水平降低(P<0.05);AKT总蛋白相对表达水平未发生变化;mTOR蛋白相对表达水平低于对照组(P<0.05)。8.RFRP-3下调HEC-1A中ERK通路基因的转录水平为进一步验证中心节点蛋白Kras在RFRP-3影响子宫内膜癌细胞HEC-1A增殖与凋亡中的作用,我们对Kras下游ERK通路进行了RT-qPCR检测。RFRP-3作用于HEC-1A细胞24 h后,提取RNA进行RT-qPCR实验,结果显示:与对照组相比,10000 ng/ml RFRP-3加药组ERK的m RNA相对表达水平降低,差异均具有统计学意义(P<0.001)。9.RFRP-3下调HEC-1A中ERK通路蛋白表达水平为进一步验证中心节点蛋白Kras在RFRP-3影响子宫内膜癌细胞HEC-1A增殖与凋亡中的作用,我们对Kras下游ERK通路进行了蛋白印迹检测。RFRP-3作用于HEC-1A细胞24 h后,提取蛋白进行蛋白印记实验,结果发现:相对于对照组,10000 ng/ml RFRP-3组p-ERK蛋白相对表达水平下降(P<0.05);ERK1/2蛋白相对表达水平未发生改变。10.RFRP-3引起HEC-1A发生自噬由于自噬调控因子mTOR活化,进而检测了检测自噬标志物LC3-I/Ⅱ及自噬底物p62的表达情况。RFRP-3作用于HEC-1A细胞24 h后,提取RNA进行RT-qPCR实验,结果显示:10000 ng/ml RFRP-3组LC3-Ⅱ的m RNA转录水平高于对照组(P<0.01)。RFRP-3作用于HEC-1A细胞24 h后,提取蛋白进行蛋白印记实验,结果显示:相对于对照组,10000 ng/ml RFRP-3组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值升高(P<0.05);自噬降解产物p62蛋白相对表达水平降低(P<0.05)。11.RFRP-3增加HEC-1A中受体GPR147的蛋白表达为了阐释RFRP-3作用于子宫内膜癌细胞HEC-1A的起效机制,我们利用蛋白印迹法对GPR147的蛋白表达进行了检测。RFRP-3作用于HEC-1A细胞24 h后,提取蛋白进行蛋白印记实验,结果显示:相较于对照组,10000 ng/ml RFRP-3加药组GPR147蛋白相对表达升高(P<0.05)。结论:RFRP-3对HEC-1A细胞的抑制作用可能通过激活受体GPR147并与之结合,影响中心节点蛋白Kras,激活其下游PI3K/AKT/mTOR通路和ERK通路,降低Bcl-2的表达、促进Bax的表达,引起自噬发生发挥作用。

窦晓青[4](2021)在《miRNA-335通过RBM10调节Numb可变剪切影响子宫内膜癌细胞增殖功能的研究》文中认为子宫内膜癌是女性生殖道三大恶性肿瘤之一,起源于子宫内膜上皮,常发生于围绝经期及绝经后妇女。近年来,子宫内膜癌的发病率呈逐年上升趋势,来源于子宫内膜上皮的子宫内膜样腺癌大约占85%-90%。迄今为止,子宫内膜癌的常见治疗方法主要包括手术治疗,放化疗、激素治疗,靶向治疗等。大多数子宫内膜癌早期即可出现症状,早期诊断,采用手术为主的综合治疗预后较好。晚期或低分化子宫内膜癌发生浸润性转移、综合治疗后复发率较高,预后差。因此寻找子宫内膜癌生物标志物,研究其发生发展的分子机制具有十分重要的意义。Numb正常生理条件下能够调节细胞分化,其在恶性肿瘤中的作用也已有报道,但在不同类型的癌症中其所发挥的作用有所不同。Numb被证明可以抑制前列腺肿瘤异种移植物的生长和去势抵抗性前列腺癌的发展,其涉及与信号传导相关的各种功能(如调节Notch激活和TP53激活途径),乳腺癌患者中Numb水平较低与预后不良相关。然而,在胶质瘤体外实验中,Numb过表达不能抑制肿瘤细胞增殖,这可能与Numb的可变剪切(alternative splicing,AS)有关。可变剪切(AS)是一个前mRNA产生多个可能处于不同转录后调控下的mmRNA异构体或编码不同功能的蛋白质。最近的大规模平行RNA测序(RNA-seq)转录组分析表明,人类基因经历可变剪切的可能在90%以上。在人类细胞中,可变剪切由剪切体完成,剪切体是由4个核糖核蛋白颗粒组成的动态酶复合物。可变剪切系统的组成和过程在不同的发育阶段被严格调控,其失调与包括癌症在内的各种人类疾病密切相关。通常情况下,可变剪切模式是组织和发育阶段所特有,受到新生转录本中反式RNA结合蛋白(RBPs)和顺式调控元件之间协同作用的精确调控。Numb基因可变剪切主要产生两种亚型的转录本,即Numb-L和Numb-S,对应翻译为两种Numb蛋白亚型,主要区别是富含脯氨酸区域(PRR)的长度。这两种蛋白亚型在调节细胞功能方面发挥相反的作用。Numb-L可促进小鼠胚胎癌细胞增殖,但是不促进分化,Numb-S可以促进分化,但不促进增殖。据报道,Numb-L在肺癌、膀胱癌、乳腺癌和结肠癌中表达增加。有研究报道,在子宫内膜癌组织中Numb呈现高表达,然而关于Numb可变剪切产物Numb-L和Numb-S在子宫内膜癌中的表达情况尚无相关研究。剪切调控因子的突变和RNA靶标的异常剪切与许多人类疾病有关。然而,到目前为止,在生理和病理条件下控制可变剪切过程的确切分子机制尚不清楚。RBM10编码一个930个氨基酸的蛋白质,包含两个RNA识别基序(RRM)、两个锌指和一个G补丁基序。这些基序通常存在于参与前mmRNA剪切的RNA结合蛋白中,如异质性核糖核蛋白(HnRNPs)和小核核糖核蛋白(SnRNPs)的蛋白质组分。通过质谱分析,已有报道RBM10与纯化的剪接复合物结合,并进一步被鉴定为U2 snRNPs、剪接体A(或前剪接体)和B复合物的一个成分。此外,基于酵母双杂交方法,一项对剪接体中已知的200多种蛋白质之间相互作用的研究,证明RBM10与多种剪切体成分之间的相互作用。尽管所有这些观察都提示RBM10在mRNA前剪切调控中的潜在作用,但目前还不清楚RBM10是否参与剪切以及如何调控剪切。此外,可变剪切的调控机制有组蛋白修饰和microRNA(miRNA),microRNA是一类参与基因转录后调控的非编码小分子RNA,它们通过转录后结合靶基因的3‘—非翻译区(UTR)来抑制其翻译,从而调节不同的生物学过程。本研究就可变剪切调节因子RBM更容易受到miRNA的调控为研究目的,致力于在子宫内膜癌中检测Numb可变剪切的表达情况,研究其对子宫内膜癌细胞增殖功能的影响,并进一步探索调节Numb可变剪切的可能机制。第一部分Numb可变剪切在子宫内膜癌中的表达及功能目的1.验证Numb-L和Numb-S两种可变剪切体在子宫内膜癌中的表达差异;2.探索Numb-L可变剪切体表达水平与子宫内膜癌临床特征的相关性;3.筛选在子宫内膜癌中可以靶向调控Numb可变剪切的相关蛋白,并验证可变剪切调控因子RBM在子宫内膜癌组织中的表达;4.探索可变剪切调控因子RBM10水平与临床特征及Numb-L的相关性,并在子宫内膜癌细胞中验证Numb可变剪切受RBM10调控;5.研究Nummb-L和Numb-S两种可变剪切体表达水平与子宫内膜癌预后的规律。材料与方法1.研究纳入就诊于浙江中医药大学附属第一医院妇产科的子宫内膜癌患者,时间范围2016年1月至2019年5月,患者术前均未接受放化疗,收集子宫内膜癌的肿瘤组织及配对的癌旁正常内膜组织。最终收集上述配对标本共29例。2.研究通过半定量聚合酶链反应(PCR)和免疫印迹法检测配对子宫内膜癌及邻近非肿瘤对照组织中Numb-L、Numb-S亚型的mmRNA和蛋白质水平。3.收集患者临床特征数据分析不同临床特征的子宫内膜癌患者的Numb-L水平差异。4.采用免疫印迹法测定可变剪切的三种相关蛋白RBM5、RBM6和RBM10和Numb下游基因Notchl的表达水平。5.收集患者临床特征数据分析不同临床特征子宫内膜癌患者的可变剪切相关蛋白RBM10表达水平的差异,并分析Numb-L和RBM10相关性。6.通过构建敲低或过表达RBM10的HEC-1A和RL95-2稳定细胞系,采用免疫印迹法测定RBM10对Numb-L和Numb-S表达的影响。7.通过构建过表达Numb-L和Numb-S的HEC-1A和RL95-2稳定细胞系,采用MTT分析和平板克隆实验测定细胞增殖活力差异,半定量聚合酶链反应(PCR)检测Notch通路的靶分子HES1和HEY2的mRNA水平。结果1.Numb-L mRNA和蛋白表达水平在子宫内膜癌组织中均显着高于癌旁正常内膜组织,然而Numb-SmmRNA和蛋白表达水平无明显差异。2.子宫内膜癌患者中,Numb-L水平越高,淋巴结转移越多和FIGO分期越高。3.子宫内膜癌组织中可变剪切的三种相关蛋白中仅RBM10蛋白表达水平存在差异,其表达水平发生降低,RBM5和RBM6蛋白表达水平无明显差异。4.子宫内膜癌患者中,RBM10水平越低,淋巴结转移越多和FIGO分期越高,且与Numb-L水平呈负相关关系。5.过表达RBM10的HEC-1A和RL95-2细胞Numb-L蛋白表达下降,Numb-S蛋白表达升高,RBM10敲低后则相反,Numb-L蛋白表达升高,Numb-S蛋白表达降低。6.过表达Numb-L的HEC-1A和RL95-2细胞增殖活力升高,过表达Nummb-S的HEC-1A和RL95-2细胞增殖活力发生下降。7.子宫内膜癌组织中Notch1蛋白表达显着高于癌旁正常内膜组织。8.过表达Numb-L的HEC-1A和RL95-2细胞中,Notch1靶基因HES1和HEY2 mRNA表达升高,而过表达Numb-S的HEC-1A和RL95-2细胞中,HES1和HEY2 mRNA表达降低。结论1.Numb-L在子宫内膜癌组织中表达异常,且与肿瘤的恶性程度相关,过表达Numb-L的子宫内膜癌细胞增殖活力升高,其可能机制是通过激活Notch信号通路。2.RBM10在子宫内膜癌组织中表达异常,且与肿瘤恶性程度相关,子宫内膜癌细胞中RBM10的表达与Numb-L的表达呈负相关。3.Numb-L的表达可能受可变剪切相关蛋白RBM10的调节,RBM10与Numb可变剪切之间的关系,可能为子宫内膜癌的诊断和治疗提供新的生物学标志。第二部分 miR-335通过RBM10调节Numb的可变剪切目的1.验证可变剪切相关蛋白RBM10与microRNA的转录后调控关系;2.筛选靶向作用于RBM10的miRNA;3.验证子宫内膜癌组织中筛选出miR-335及RBM10表达水平的相关性,及其与患者临床特征的相关性;4.研究裸鼠模型miR-335对子宫内膜癌细胞增殖功能的影响;5.探索miR-335通过RBM10调节Numb的可变剪切对子宫内膜癌细胞增殖功能影响的相关机制。材料与方法1.同第一部分,收集子宫内膜癌组织及配对的正常癌旁内膜组织患者标本共29例。2.通过半定量聚合酶链反应(PCR)和免疫印迹法检测配对子宫内膜癌及邻近非肿瘤对照组织中RBM10的mRNA和蛋白质水平。3.利用生物信息学工具预测靶向作用于RBM10的miRNAs,并通过双荧光素酶报告基因方法分析和免疫印迹证实它们与RBM10的相互作用关系,通过分析miRNAs水平与RBM10的相关性进一步筛选靶向miRNA。4.筛选靶向作用于可变剪切蛋白RBM10的miRNA---miRNA-335,分析子宫内膜癌不同临床特征与miR-335表达水平的相关性,并通过Kaplan-Meier Plotter在线工具分析RBM10和miR-335与子宫内膜癌患者预后的相关性。5.将miR-335过表达HEC-1A及其空白对照HEC-1A种植于裸鼠皮下,观察肿瘤生长并计算肿瘤体积,通过PCR法检测miR-335的表达水平,免疫印迹法检测裸鼠肿瘤组织中RBM10和Numb可变剪切的蛋白表达情况。结果1.与癌旁正常内膜组织相比,子宫内膜癌组织中RBM10蛋白水平明显降低,水平越低患者预后越差,但其mRNA水平无显着变化。2.生物信息学工具筛选出靶向作用于RBM10的miRNA包括miR-22、miR-29a、miR-29b、miR-122、miR-133a、miR-133b、miR-179、miR-335、miR-382。3.经荧光素酶报告基因分析显示,上述筛选出的miRNA构建报告基因质粒与RBM10共转染后荧光素酶活性受到显着抑制的是miR-133a、miR-133b和miR-335。4.过表达miR-133a/b或miR-335的HEC-1A细胞中RBM10表达降低。在子宫内膜癌组织中miR335水平明显上调,且与RBM10蛋白水平呈负相关,但miR-133a/b水平无显着性差异,与RBM10蛋白水平之间无显着相关性。5.接种过表达miRNA-335HEC-1A的裸鼠,肿瘤体积明显增加较快,与对照组差异显着,PCR证实裸鼠肿瘤组织内miR-335过表达,RBM10蛋白表达水平下降,Numb-L蛋白表达水平升高。结论1.Numb-L的表达水平与RBM10有关,RBM10进一步受miRNA-335表达的调控。2.miRNA-335可能通过在转录后水平调节RBM10,从而调控Numb的可变剪切,进而促进子宫内膜癌细胞的增殖,这也为子宫内膜癌发生发展机制研究提供了新的思路。

孔德水[5](2021)在《基于WGCNA筛选的lncRNA-ZXF1在子宫内膜样子宫内膜癌中的抑癌作用及机制研究》文中研究指明研究背景子宫内膜癌是一种比较常见的,主要发生部位为女性子宫内膜的恶性上皮性肿瘤。根据国际权威的癌症期刊CA CANCER J CLIN所发表的最新调查结果,子宫内膜癌是美国发病率最高的妇科肿瘤,在我国的发病率也逐年升高。临床上子宫内膜癌患者大多数为绝经后的中老年女性,最为常见的首发症状为异常的阴道流血或者阴道排液等。虽然一直以来对子宫内膜癌的研究从未停止,但遗憾的是目前病因尚不完全明确,还需要更多的临床和基础医学研究。目前针对性的手术治疗依然是子宫内膜癌的首选治疗手段,然而随着目前临床上更多的提倡精准医疗和个体化治疗,目前对于恶性肿瘤的免疫治疗和特异性的分子靶向治疗也开始成为国际研究热点,而精准治疗的难点在于寻找有效且敏感的靶点分子。生物信息学(Bioinformatics)起源于上个世纪的50年代,其发展至今已逐渐成长为一门涉及到生命科学、统计学、信息学、计算生物学和数学的多种学科汇总的交叉学科。生物信息学的应用主要是通过生物大数据的计算和分析,同时关联基础生物学方面的研究,从而获得更多的研究内容。研究人员使用编程工具来完成具体、精细的生信分析和可视化,常用的编程语言有R、Per1和Python等。其中R的编程语言逻辑性强,且更加接近于自然语言,这降低了学习和操作的难度。目前众多已开发成熟且不断更新的包(Packages)让研究人员可以有多种途径实现对数据的读取、分析和可视化。加权基因共表达网络分析(Weighted Gene Co-expression Network Analysis,WGCNA)是一种特殊的生物信息学分析方法,主要用于探索不同来源的样本之间(如癌组织和正常组织)基因关联模式的计算生物学方法,其作用主要是用来聚类各种生物进程中的一些高度协同变化的基因模块,并根据这些基因模块和临床特征信息之间的相关性筛选重要的核心模块和分子。P21是一种调控细胞周期的重要核心分子,在肿瘤形成和发展的过程中常常发挥非常重要的作用,能够参与多种分子和通路的调控。P21在细胞周期中的主要功能是通过抑制CDK2和CDK4结合成复合体发挥作用,若P21发生基因突变或被大量降解可能会解除对CDKs的抑制作用,从而使细胞周期进程加速,其中泛素化系统介导的P21降解是一个非常重要的降解途径。LncRNA可以通过与蛋白、DNA、RNA等结合发挥作用,与蛋白的结合有可能影响蛋白包括泛素化、乙酰化等在内的翻译后修饰,进而调控蛋白功能。竞争性内源RNA(competing endogenous RNAs,ceRNA)是一种lncRNA调控下游靶分子的重要途径。其原理是lncRNA等在细胞内通过竞争性结合miRNA,以减少miRNA所形成剪切复合体对mRNA的降解,从而实现对mRNA分子链的保护作用,这种调控机制通常被称为ceRNA机制。迄今为止,已有大量文献证明lncRNA可以通过ceRNA机制调控靶分子表达来实现功能,同时也参与到众多疾病的发生和发展中。本课题通过使用WGCNA的方法将肿瘤基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)中子宫体子宫内膜癌(Uterine Corpus Endometrial Carcinoma,UCEC)患者的lncRNA表达数据进行模块化分析,再通过分析各模块对应的临床特征,结合前期本课题组的测序数据筛选核心分子lncRNA-ZXF1,并进行后续的基础医学研究。目前有大量研究表明,lncRNA-ZXF1在多种恶性实体肿瘤中起作用,常常调控增殖等肿瘤生物学行为。然而lncRNA-ZXF1在子宫内膜癌中的功能尚不明确。为了探索lncRNA-ZXF1在子宫内膜癌中所发挥的作用,我们通过大量的基础医学实验和生物信息学方法,证实了 lncRNA-ZXF1在子宫内膜癌中发挥抑癌作用及其作用机制,这些研究结果为lncRNA-ZXF1在未来成为子宫内膜癌早期诊断的标志物和精准免疫治疗的靶点提供了可能。第一部分:基于WGCNA的子宫内膜癌患者临床信息的模块分析及分子筛选研究目的:1.通过WGCNA分析TCGA中子宫内膜癌lncRNA的表达数据与临床特征信息之间的相关性,并通过模块分析结果筛选子宫内膜癌中的核心lncRNA。2.分析筛选得到的lncRNA,通过对其靶分子进行多层次的功能富集分析,探索lncRNA-ZXF1在子宫内膜癌中的主要功能。研究方法:利用WGCNA对TCGA中子宫内膜癌的lncRNA数据进行分析,根据表达谱特点筛选合适的软阈值,并通过计算获得拓扑重叠矩阵。再通过使用动态树切割的方法进行层次聚类分析,同时与临床特征信息进行关联,得到与特定临床特征相关性高的基因模块。通过对模块结果进行深度分析,筛选得到子宫内膜癌的核心分子 lncRNA-ZXF1。通过‘Deseq2’包计算 TCGA 和 Genotype-Tissue Expression(GTEx)数据中癌和正常组织的差异表达基因(Different Expression Genes,DEGs),再利用多种在线数据库预测lncRNA-ZXF1可能调控的靶分子。对计算得到的差异表达基因集和在线预测得到的lncRNA-ZXF1的靶分子集取共同基因,并对这些分子进行基于京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)、基因集富集分析(Gene Set Enrichment Analysis,GSEA)、Reactome数据库和基因本论(Gene Ontology,GO)的功能富集分析。研究结果:1.筛选最佳软阈值β=5,通过动态树切割并关联TCGA临床特征,棕色和绿色模块与临床肿瘤分级相关度最高,且为负相关。对模块结果和前期测序结果分析,筛选lncRNA-ZXF1作为后续研究的分子。2.使用“Deseq2”包对TCGA和GTEx数据分析,计算筛选得到4677个DEGs。使用生物信息学的方法对lncRNA-ZXF1的靶分子进行全面预测,所得到的结果与差异表达基因集的共同基因有1130个。对共同基因进行功能富集分析,富集结果中有癌症通路、代谢、生物氧化、转录调控和细胞增殖等功能。研究结论:棕色和绿色模块与TCGA肿瘤分级负相关。LncRNA-ZXF1可能在子宫内膜癌中通过调控细胞增殖、有丝分裂、肿瘤中重要的癌症通路以及脂质代谢等发挥功能。第二部分:LncRNA-ZXF1通过调控CDC20介导的泛素化降解P21的蛋白表达研究目的:1.探索lncRNA-ZXF1在子宫内膜癌中的表达和预后。2.明确lncRNA-ZXF1在子宫内膜癌细胞中发挥的作用和具体作用机制。3.通过构建子宫内膜癌动物模型,检测lncRNA-ZXF1对动物模型中裸鼠皮下肿瘤生长的调控作用。研究方法:1.通过对TCGA、GSE17025和齐鲁医院收集的肿瘤样本进行生物信息学和聚合酶链式反应分析,明确lncRNA-ZXF1的表达情况。使用生物信息学方法分析lncRNA-ZXF1的预后和诊断价值。2.通过聚合酶链式反应实验检测lncRNA-ZXF1在子宫内膜癌各个细胞系中的表达水平,用荧光原位杂交实验检测lncRNA-ZXF1在子宫内膜癌细胞中特异的亚细胞定位。通过构建的lncRNA-ZXF1过表达病毒转染Ishikawa和HEC-1A两种细胞系,再使用稳转细胞系进行CellTiter-Glo实验、MTT实验、克隆形成实验、EdU染色实验和流式细胞周期实验,探索过表达lncRNA-ZXF1后对子宫内膜癌细胞增殖能力的影响。同时进行划痕愈合实验和Transwell小室实验明确过表达lncRNA-ZXF1后对子宫内膜癌细胞的迁移和侵袭能力的具体调控。3.使用慢病毒稳转后的细胞构建子宫内膜癌异种移植瘤动物模型,隔日测量瘤体大小绘制皮下肿瘤生长曲线。使用小动物成像系统测量皮下瘤体大小,并检测lncRNA-ZXF1、P21和Ki67在皮下瘤体中的表达。4.通过RIP试验验证lncRNA-ZXF1和P21的结合,使用western blot和co-IP等方法验证lncRNA-ZXF1对P21泛素化的影响。使用放线菌酮(Cycloheximide,CHX)和MG132处理子宫内膜癌细胞,进一步明确lncRNA-ZXF1在P21泛素化降解中的作用。研究结果:1.相较于正常的子宫内膜组织,lncRNA-ZXF1在子宫内膜癌组织中低表达。LncRNA-ZXF1表达水平较高的子宫内膜癌患者的无病生存期(DFS)明显优于低表达的患者,有较好的预后价值,且受试者工作曲线(receiver operating characteristic curve,ROC)结果表明lncRNA-ZXF1在子宫内膜癌中有较高的敏感性和特异性,有良好的诊断价值。荧光原位杂交实验的结果明确了 lncRNA-ZXF1不仅可以在细胞核中表达,同时还能在细胞质中表达。2.CellTiter-Glo实验、MTT实验、克隆形成实验、EdU染色实验和流式细胞周期实验的结果证明了过表达lncRNA-ZXF1后子宫内膜癌细胞的增殖能力明显受到抑制。GSEA分析结果也证实了 lncRNA-ZXF1抑制细胞周期和核内DNA复制。划痕愈合实验和Transwell小室实验的结果也证明了在过表达lncRNA-ZXF1后,子宫内膜癌细胞的迁移和侵袭能力受到明显抑制,且MMP2和N-Cadherin的蛋白表达水平降低,而E-Cadherin的蛋白表达水平升高了。3.体内实验中,过表达lncRNA-ZXF1后所形成的裸鼠皮下肿瘤的生长受到抑制且肿瘤中的P21表达增加,Ki67的表达降低。4.过表达lncRNA-ZXF1能够使P21的蛋白表达水平明显增加,但mRNA表达则没有改变。使用CHX和MG132处理后,lncRNA-ZXF1使P21蛋白降解速度减慢而聚集的更多。RIP实验证明了 lncRNA-ZXF1和P21能够直接结合。LncRNA-ZXF1能够挽救CDC20对P21的降解作用,且阻碍了 CDC20与P21的结合。研究结论:1.LncRNA-ZXF1在子宫内膜癌中表达水平较低,同时具有有良好的诊断和预后的价值。2.LncRNA-ZXF1能够明显抑制子宫内膜癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。3.LncRNA-ZXF1在体内实验中能够抑制动物模型中裸鼠皮下所形成的肿瘤的生长。4.LncRNA-ZXF1通过与P21结合,阻碍CDC20对P21的泛素化降解。第三部分:LncRNA-ZXF1通过miR-378a-3p/PCDHA3轴调控P21的表达研究目的:1.探索 lncRNA-ZXF1 通过 miR-378a-3p/PCDHA3 的 ceRNA 机制调控 P21 的表达。2.探索PCDHA3可能的预后价值和诊断价值,并明确PCDHA3在子宫内膜癌细胞中对增殖和侵袭过程所起到的作用。研究方法:1.在Ishikawa和HEC-1A细胞系中过表达lncRNA-ZXF1后,对稳定转染的细胞进行全转录组测序,同时使用多种在线工具预测lncRNA-ZXF1的下游靶分子。2.通过数据库和齐鲁医院收集的内膜癌样本对PCDHA3的表达进行检测。使用分子生物学方法明确lncRNA-ZXF1/miR-378a-3p/PCDHA3三者之间的调控关系。3.用双荧光素酶报告实验来证实在线工具所预测的ceRNA机制中的各个分子之间的直接结合。4.进行CellTiter-Glo实验、MTT实验、克隆形成实验、EdU染色实验和流式细胞周期实验来探索过表达PCDHA3后对子宫内膜癌细胞的增殖能力所起到的调控作用。同时通过划痕愈合实验和Transwell小室实验进一步明确过表达PCDHA3后对子宫内膜癌细胞迁移和侵袭能力的影响。用western blot实验探索PCDHA3对P21表达的调控。研究结果:1.在过表达lncRNA-ZXF1后进行了转录组测序,其结果结合生物信息学方法,预测得到了 lncRNA-ZXF1/miR-378a-3p/PCDHA3 的 ceRNA 调控轴。2.TCGA和GSE17025的数据,以及课题组所收集的齐鲁医院子宫内膜癌样本结果都明确了 PCDHA3在子宫内膜癌中的表达水平更低。ROC曲线也说明了 PCDHA3潜在的诊断价值。3.过表达lncRNA-ZXF1后miR-378a-3p的表达降低,而PCDHA3的表达升高。在转染miR-378a-3p的inhibitor后,PCDHA3的表达量升高,而miR-378a-3p的mimics抑制了 PCDHA3的表达。相应的挽救实验证实了 lncRNA-ZXF1可以使PCDHA3的表达量升高,而miR-378a-3p能够使这种变化被逆转。RIP实验证明了miR-378a-3p与AGO2的结合。双荧光素酶报告实验的结果显示了 miR-378a-3p能够显着的降低lncRNA-ZXF1和PCDHA3野生型质粒的荧光强度,但是并不能使相应的突变型质粒的荧光强度改变。4.CellTiter-Glo实验、MTT实验、克隆形成实验、EdU染色实验和流式细胞周期实验的结果证明了 PCDHA3能够抑制子宫内膜癌细胞的增殖能力。GSEA分析结果也证实了 PCDHA3抑制细胞周期和核内DNA复制。划痕愈合实验和Transwell小室实验的结果也同时说明了在过表达PCDHA3后,子宫内膜癌细胞的迁移和侵袭能力受到显着抑制。并且P21的表达可以随PCDHA3的升高而增加。研究结论:1.PCDHA3在子宫内膜癌组织中的表达低于相应的正常组织,且PCDHA3在子宫内膜癌中具有潜在的诊断价值。2.过表达PCDHA3能够明显抑制子宫内膜癌细胞的增殖能力和迁移侵袭能力。3.LncRNA-ZXF1 可以通过 lncRNA-ZXF1/miR-378a-3p/PCDHA3 轴所形成的ceRNA机制调控下游P21蛋白的表达。创新性及局限性创新性:1.研究了 lncRNA-ZXF1能够在子宫内膜癌细胞中调控增殖、迁移和侵袭。2.明确了 lncRNA-ZXF1通过介导泛素化降解和miR-378a-3p/PCDHA3轴两条机制,调控P21的蛋白表达。3.发现了 PCDHA3在子宫内膜癌细胞中可能参与到增殖和迁移侵袭的调控中。局限性:1.纳入本研究的子宫内膜癌和癌旁组织临床样本数量较少。2.体内实验中未进行鼠尾静脉注射,未获取肺转移模型的数据。3.机制部分未明确PCDHA3对P21的具体调控方式,机制研究不够深入。

李熠[6](2020)在《类泛素化Neddylation通路抑制剂MLN4924抑制子宫内膜癌细胞增殖的作用与机制研究》文中认为目的:子宫内膜癌严重危害人类健康,迫切需要寻找广谱高效、低毒副作用的新型抗肿瘤分子治疗靶点。类泛素化Neddylation通路是一种新型蛋白质翻译后修饰方式。研究表明Neddylation通路在多种人类原发肿瘤组织中过度活化,可通过激活CRLs(Cullin-Ring ligases)泛素连接酶引起CRL抑癌蛋白底物降解而促进肿瘤发生发展,该通路NEDD8活化酶抑制剂MLN4924具有显着的体内外抗肿瘤效果。但MLN4924对子宫内膜癌细胞增殖的作用与机制研究鲜见报道。本研究旨在揭示Neddylation通路抑制剂MLN4924杀伤子宫内膜癌细胞的作用机制。方法:利用免疫印记(IB)明确MLN4924对子宫内膜癌细胞中的类泛素化Neddylation修饰通路的影响;采用ATPlite/CCK8细胞增殖法以及经典克隆形成分析评价MLN4924灭活Neddylation修饰通路对内膜癌细胞增殖、克隆形成的影响;利用免疫印记(IB)和细胞流式分析MLN4924对细胞周期、细胞DNA损伤应答、细胞凋亡以及CRL经典底物的表达和降解的影响;最后利用小RNA干扰技术(siRNA)做细胞表型拯救实验。结果:1.TCGA数据库分析,Neddylation通路中的关键分子NEDD8以及催化酶UBE2M和UBE2F在子宫内膜癌组织中的转录水平均高于癌旁组织。不同浓度的MLN4924处理子宫内膜癌细胞系(Ishikawa以及HEC-1-A),免疫印记分析(IB)显示:子宫内膜癌细胞内总体蛋白Neddylation修饰水平以及底物Cullins(Cullin1、2、3、4a、4b、5、7、9)蛋白Neddylation修饰水平均受抑制。2.CCK8和ATPlite细胞增殖检测方法显示MLN4924处理组的细胞活力低于对照组,且随着MLN4924浓度的增高,细胞活力越低。平板克隆形成实验显示MLN4924处理组的细胞克隆数目明显低于对照组。3.流式细胞仪PI染色细胞周期分析,MLN4924处理组细胞的细胞周期均阻滞在G2/M期。WB结果显示,MLN4924处理组的细胞中,与细胞周期相关的周期蛋白P21、P27、WEE1的表达均高于对照组。此外,与DNA损伤应答相关的蛋白标记物ORC1、CDT1以及p-H2AX的表达也明显高于对照组。4.流式细胞仪Annexin V-FITC/PI染色细胞凋亡分析,MLN4924处理组细胞发生细胞凋亡的比例明显多于对照组,且MLN4924浓度越高,细胞凋亡的比例也越高。WB结果显示,MLN4924处理组的细胞中,细胞凋亡的蛋白标记物剪切PARP(C-PARP)蛋白和剪切casp-3(C-casp-3)蛋白表达均升高,且促凋亡蛋白Noxa表达显着上调,siRNA下调Noxa后,处理组中C-PARP、C-casp-3以及p-H2AX蛋白表达均有所回补。结论:1.Neddylation通路在子宫内膜癌临床样本中活化,MLN4924可以显着抑制子宫内膜癌细胞中的类泛素化Neddylation修饰通路。2.MLN4924显着抑制子宫内膜癌细胞的增殖。3.MLN4924诱导子宫内膜癌细胞发生细胞周期G2期阻滞、细胞DNA损伤应答以及细胞凋亡而最终杀伤肿瘤细胞。4.MLN4924激活细胞凋亡通路部分是通过促凋亡蛋白Noxa所介导的,敲低Noxa可以显着挽救子宫内膜癌细胞的凋亡表型。

姜慕惟[7](2020)在《HNL/NGAL抗体制备及分子形式特异性HNL/NGAL定量方法建立》文中研究指明人中性粒细胞载脂蛋白(Human neutrophil lipocalin,HNL),又称中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白(Neutrophil gelatinase-associated lipocalin,NGAL),是由198个氨基酸组成的分泌型糖蛋白。它以单体、同二聚体及异二聚体等多种分子形式存在。不同分子形式HNL/NGAL可能来源不同,它们的功能也可能存在差异。HNL/NGAL能抑制细菌生长,调节细胞的分化与凋亡,以及参与肿瘤、肾损伤、急性感染等病理过程。HNL/NGAL是一具有临床应用潜力的疾病生物标志物。大量研究表明HNL/NGAL可用于早期预判急性肾损伤,也可以区分急性细菌和病毒感染。但是来自不同课题组或不同研究队列的研究数据显示HNL/NGAL在诊断相关疾病时的临床表现存在显着差异。课题组前期研究发现定量方法对HNL/NGAL临床表现产生显着影响。究其原因可能是因为临床样本中HNL/NGAL以多种分子形式存在,而目前HNL/NGAL定量方法缺乏分子形式特异性,这导致所定量的HNL/NGAL存在不确定性。因此,本论文尝试建立分子形式特异性的HNL/NGAL定量方法。主要进行了以下研究工作。1、制备分子形式特异性的HNL/NGAL单克隆抗体。首先,本论文分别利用大肠杆菌和杆状病毒-昆虫细胞表达系统表达HNL/NGAL,并通过亲和层析和凝胶过滤层析对HNL/NGAL进行分离纯化,获得单体和同二聚体HNL/NGAL。这为后续动物免疫和抗体鉴定提供抗原,也为构建HNL/NGAL定量方法提供标准蛋白。接着,用单体、同二聚体HNL/NGAL或两者的混合物免疫BALB/c小鼠,制备HNL/NGAL单克隆抗体,最终筛选到8株抗体。随后,我们采用Western-blotting和非竞争ELISA对制备的抗体与不同分子形式HNL/NGAL的识别特异性及亲和力进行了表征。其中1C5E5G3、2H8G11E7及4E9B10G4主要识别单体HNL/NGAL,其对单体HNL/NGAL亲和常数分别为1.8×108、3.8×107和4.2×108,对同二聚体HNL/NGAL亲和常数分别为2.8×107、1.5×107和1.8×108;7D10G3C4、8E7F5E3和9C6C7G8主要识别同二聚体HNL/NGAL,其对单体HNL/NGAL亲和常数分别为1.3×108、8.6×107和5.5×108,对同二聚体HNL/NGAL亲和常数分别为6×108、2.3×108和1.1×109;5D10G5E4、8E8D8D6对单体和同二聚体HNL/NGAL均能识别,它们对单体HNL/NGAL亲和常数分别为7×108、2.8×108,对同二聚体HNL/NGAL亲和常数分别为5.6×108、2.4×108。今后,我们将对上述抗体所识别的表位进行详细的鉴定。这部分研究结果为建立各种基于抗原-抗体反应的分子形式特异性的HNL/NGAL免疫学定量方法提供了可能。2、建立基于表面增强拉曼光谱(Surface-Enhanced Raman Scattering,SERS)技术的分子形式特异性HNL/NGAL检测方法。融合拉曼技术和免疫反应的优点,以4-巯基苯甲酸(4-mercaptobenzoic acid、4-MBA)修饰的纳米银粒子为SERS活性基底,以拉曼频移为参数,首次构建了基于SERS的分子形式特异性HNL/NGAL检测方法。该方法对单体和同二聚体HNL/NGAL的最低检测限均为10 ng/mL。我们今后将对耦合抗体的选择、报告分子4-MBA的浓度、反应条件等参数进行优化,以期克服目前该方法线性范围窄(10 ng/mL40 ng/mL)、批间差异大(CV%=32%)等显着不足。这部分研究实现了单体和同二聚体HNL/NGAL的同步检测,丰富了HNL/NGAL快速检测技术。综上,本论文制备了单体和同二聚体HNL/NGAL,获得了分子形式特异性的抗HNL/NGAL单克隆抗体,初步建立了基于SERS的同步检测单体和同二聚体HNL/NGAL技术。这些研究有助于推动建立分子形式特异性HNL/NGAL检测方法,从而提高HNL/NGAL作为生物标志物诊断相关疾病的精确度,进而促进HNL/NGAL的临床应用。

丁巍[8](2020)在《CMKLR1通过Wnt/β-catenin通路介导子宫内膜癌发生发展的研究》文中研究表明背景:子宫内膜癌是严重威胁女性健康的生殖系统恶性肿瘤,发病率呈逐年上升趋势。流行病学显示,肥胖、糖尿病、高血压与Ⅰ型子宫内膜癌的发病有关。肥胖症者脂肪组织增加,细胞分泌功能紊乱,导致体内多种脂肪因子水平异常。Chemerin是近年来新发现的一种脂肪因子,在脂肪组织中高度表达,可参与糖脂代谢,调节细胞分化等过程,与受体CMKRL1结合后可促进胰岛素抵抗、炎症及癌症的发生。现已证实chemerin及其受体CMKLR1在多种胰岛素抵抗相关性疾病,如肥胖、高血压、糖尿病、多囊卵巢综合征中发挥重要作用,其中包括多项子宫内膜癌的高危因素。但目前国内外尚缺乏chemerin/CMKLR1与子宫内膜癌的相关性研究。目的:探讨chemerin及其受体CMKLR1与子宫内膜癌是否存在联系,以及在子宫内膜癌发生发展过程中的作用及相关机制,为子宫内膜癌的发病机制及靶向治疗提供新的理论依据。方法:1.采集天津市中心妇产科医院2018年1月至2018年12月因子宫内膜癌住院患者(20例)作为子宫内膜癌组,以BMI进行配对(1:2,40例)选择同一时期体检或因良性病变住院患者作为对照组。通过ELISA方法检测血清chemerin表达水平。免疫组化检测CMKLR1在子宫内膜癌组织中的表达。应用生物信息学分析技术基于癌症基因组图谱数据库(TCGA),探究CMKLR1与子宫内膜癌临床病理特征、患者预后的联系。2.在人子宫内膜癌细胞Ishikawa、HEC-1A及HEC-1B中加入不同浓度重组chemerin因子,通过CCK-8和划痕实验观察对子宫内膜癌细胞增殖及迁移能力的影响。3.慢病毒转染子宫内膜癌HEC-1B细胞实验,经过嘌呤霉素筛选获得敲低CMKLR1的稳定克隆细胞系;通过RT-PCR及Western Blot验证干扰效率。利用CCK-8检测稳转细胞系与空载细胞增殖能力变化并绘制细胞增殖曲线;划痕实验和Transwell小室实验检测敲减CMKLR1后子宫内膜癌细胞的迁移能力。4.采用Western Blot检测敲减CMKLR1蛋白对稳转细胞Wnt/β-catenin信号通路的影响。结果:1.子宫内膜癌患者血清chemerin水平为(871.4±302.2)ng/ml,高于正常对照组(727.8±303.9)ng/ml,比较差异无统计学意义(P=0.091)。免疫组化显示CMKLR1在子宫内膜癌组织中表达高于癌旁组织。在TCGA数据库中,CMKLR1高表达与子宫内膜癌的病理分期密切相关(P=0.002),在预后方面,与生存时间存在负相关性(P=0.005)。2.细胞学显示,外源性重组chemerin对子宫内膜癌细胞Ishikawa、HEC-1A及HEC-1B促增殖及迁移作用与对照组无差异。3.RT-PCR显示,HEC-1B细胞CMKLR1表达较其它子宫内膜癌细胞系高(P<0.01)。因此选择HEC-1B细胞进行细胞学实验。利用质粒敲减CMKLR1基因表达获得低表达CMKLR1蛋白的稳定克隆HEC-1B细胞系,RT-PCR和Western Blot结果显示,si CMKLR1组CMKLR1-m RNA及蛋白表达水平明显低于空载组(P<0.01);CCK-8细胞活性实验结果显示,与空载组相比,si CMKLR1组细胞的增殖能力下降;细胞划痕和Transwell实验结果显示,敲减目的基因组细胞迁移能力与空载组相比明显降低(P<0.01)。4.通过Western Blot实验检测si CMKLR1细胞中相关信号通路蛋白的表达,发现Wnt/β-catenin信号通路下游的关键靶标,包括c-Myc、cyclin D1、MMP-7蛋白表达量减少,降低CMKLR1蛋白表达显着降低了子宫内膜癌HEC-1B细胞中磷酸化β-catenin蛋白的水平(P<0.01)。结论:1.子宫内膜癌患者血清chemerin水平与正常对照无明显差异,并且外源性脂肪因子chemerin对于子宫内膜癌细胞的增殖及迁移能力无明显影响;2.子宫内膜癌组织CMKLR1表达水平高于癌旁组织,敲减CMKLR1基因可能通过Wnt/β-catenin信号通路抑制子宫内膜癌细胞增殖、迁移能力;

解丹[9](2020)在《miR-152靶向CDC25B在子宫内膜癌中的作用及机制研究》文中提出目的:研究miR-152在子宫内膜癌组织及细胞中的表达及作用情况,并通过筛选鉴定其下游靶基因进一步探讨可能的作用机制,为子宫内膜癌的发病机制及分子分型提供理论依据,探寻子宫内膜癌的早期诊断及靶向治疗的新方向。方法:第一部分:miR-152在子宫内膜癌组织中的表达及与临床病理特征的关系研究:以35例子宫内膜癌患者的子宫内膜癌组织和20例同期因子宫肌瘤行全子宫切除术患者的正常子宫内膜组织为研究对象,运用q RT-PCR(实时荧光定量反转录聚酶链式反应)法检测组织样本中miR-152的表达情况;对比miR-152在子宫内膜癌不同临床病理特征分组中的表达差异。第二部分:miR-152对子宫内膜癌细胞系生物功能的影响研究:运用q RTPCR法检测不同人子宫内膜癌细胞系中miR-152的表达情况,选取相对表达量下降明显的细胞,转染miR-152模拟物,使子宫内膜癌细胞过表达miR-152;分别运用MTT、Brd-U及流式细胞分析技术研究miR-152对子宫内膜癌细胞的增殖能力及细胞周期变化的影响。第三部分:miR-152对子宫内膜癌细胞增殖及细胞周期调控机制的研究:生物信息软件预测miR-152的可能靶基因,选取CDC25B(细胞分裂周期蛋白25B)作为miR-152的备选靶基因,荧光素酶基因报告实验进行验证,Western blot检测子宫内膜癌细胞中过表达miR-152后CDC25B的表达水平变化;转染si-CDC25B,干扰子宫内膜癌细胞中CDC25B的表达,分别用MTT、Brd-U及流式细胞分析技术研究CDC25B表达降低后对子宫内膜癌细胞的增殖活力及细胞周期变化的影响;在过表达miR-152的子宫内膜癌细胞中,通过转染pc DNA3.1-CDC25B,恢复CDC25B的表达水平,分别用MTT、Brd-U及流式细胞分析技术检测细胞的增殖能力及细胞周期变化,进一步验证miR-152是否通过CDC25B在子宫内膜癌中发挥作用。结果:第一部分:子宫内膜癌组织标本中miR-152的相对表达量较正常子宫内膜组下调,差异具有统计学意义(P<0.05);在子宫内膜癌组,miR-152在临床分期Ⅲ+Ⅳ期组的相对表达量低于Ⅰ+Ⅱ期组,在有脉管间隙受侵组的相对表达量低于无脉管间隙受侵组,在肌层浸润深度≥1/2组的相对表达量低于肌层浸润深度<1/2组,在孕激素受体(PR)为阴性组的相对表达量低于PR阳性组,差异均有统计学意义(P<0.05);miR-152的相对表达量在不同病理类型组、在雌激素受体(ER)阴性和阳性组、在子宫内膜样腺癌不同组织分级组之间的差异不具统计学意义(P>0.05)。第二部分:在人子宫内膜癌细胞系HEC-1B、Ishikawa、KLE及RL-952中,miR-152在HEC-1B和KLE细胞中的表达量下降显着,选取HEC-1B及KLE细胞进行细胞功能研究;HEC-1B和KLE细胞,转染miR-152模拟物后miR-152表达水平显着增加,细胞增殖能力下降,G2/M期的细胞百分比升高。第三部分:生物信息数据库分析CDC25B可能为miR-152的靶基因;荧光素酶基因报告实验显示:与共转染CDC25B-WT/CDC25B-MUT和miRNA-152模拟物对照比,共转染CDC25B-WT和miR-152模拟物的子宫内膜癌细胞的相对荧光素酶活性明显降低;与对照组相比,转染miR-152模拟物后子宫内膜癌细胞中CDC25B的表达降低;细胞功能实验显示:转染si-CDC25B后子宫内膜癌细胞中CDC25B的表达降低,细胞增殖能力下降,G2/M期的细胞百分比升高;与对照组比较,在过表达miR-152的子宫内膜癌细胞中,转染pc DNA3.1-CDC25B,恢复CDC25B的表达,细胞增殖能力增强,G2/M期的细胞百分比降低。结论:(1)miR-152在子宫内膜癌组织样本中的相对表达量低于正常子宫内膜组织样本中的相对表达量;miR-152在子宫内膜癌组织样本中的相对表达量可能与子宫内膜癌的临床分期、脉管间隙受侵、肌层浸润深度及孕激素受体的表达相关。(2)miR-152过表达后,抑制人子宫内膜癌细胞系KLE和HEC-1B的增殖,诱导细胞G2/M期阻滞,提示miR-152对子宫内膜癌的细胞增殖有抑制作用。(3)CDC25B是miR-152的候选靶基因;CDC25B下调导致的细胞增殖能力下降及诱导细胞G2/M期细胞比例增加与过表达miRNA-152相类似;在过表达miR-152的子宫内膜癌细胞中,转染pc DNA3.1-CDC25B后,KLE细胞的细胞增殖能力增强,而G2/M期细胞比例降低,提示miR-152通过抑制CDC25B的表达,抑制人子宫内膜癌细胞增殖。综上所述,miR-152通过靶向作用于CDC25B在子宫内膜癌的发生发展中发挥着重要作用。

向花花[10](2020)在《过表达孕激素受体B提高子宫内膜癌细胞对醋酸甲羟孕酮敏感性的研究》文中指出目的:研究过表达孕激素受体B,可增强子宫内膜癌细胞Ishikawa和KLE对孕激素类药物醋酸甲羟孕酮的敏感性,为临床子宫内膜癌孕激素保守治疗提供理论依据。方法:先提取子宫内膜癌细胞Ishikawa的RNA,逆转录为c DNA作为模板,设计PRB的CDS区全长的特异性引物并对目的片段进行扩增,然后将目的片段产物克隆到pcDNA3.1(+)质粒载体中,再将连接产物转化到DH5α感受态细胞,在预先制备好的LB选择性固体培养基(含氨苄)中进行培养,挑阳性克隆经300 rpm,培养12-16 h后,经双酶切及测序鉴定,构建pcDNA3.1(+)-PRB重组质粒载体。体外培养子宫内膜癌细胞Ishikawa和KLE,将构建好的pcDNA3.1(+)-PRB重组质粒载体转染至Ishikawa和KLE细胞中,运用Real-time PCR、Western blot技术检测转染后Ishikawa和KLE中PRB m RNA和蛋白的表达变化,来确定是否构成PRB过表达的细胞系。然后用醋酸甲羟孕酮来处理转染前后子宫内膜癌细胞Ishikawa和KLE,用CCK-8法、划痕实验和单克隆形成实验来检测细胞增殖活性和侵袭能力。最后通过统计,来分析PRB的表达对醋酸甲羟孕酮处理子宫内膜癌细胞的敏感性的影响。结果:1、利用PCR扩增PRB的CDS序列片段并克隆到p CD3.1(+)质粒载体中,成功构建了pcDNA3.1(+)-PRB重组质粒载体。2、经Real-time PCR结果显示,Isk-pcDNA3.1(+)-NC组(转染空载体)和Isk-pcDNA3.1(+)-PRB组(转染pcDNA3.1(+)-PRB重组质粒载体)PRB的m RNA水平分别为(1.56±0.74)、(40.38±6.72),Isk-pcDNA3.1(+)-PRB组PRB的m RNA表达升高,与Isk-pcDNA3.1(+)-NC组相比,差异有统计学意义(p<0.0001)。KLE-pcDNA3.1(+)-NC组(转染空载体)和KLE-pcDNA3.1(+)-PRB组(转染pcDNA3.1(+)-PRB重组质粒载体)PRB的m RNA水平分别为(1.89±0.52)、(51.27±11.38),KLE-pcDNA3.1(+)-PRB组PRB的m RNA表达升高,与KLE-pcDNA3.1(+)-NC组相比差异有统计学意义(p<0.0001)。3、经Western blot的结果显示,Isk-pcDNA3.1(+)-NC组和Isk-pcDNA3.1(+)-PRB组的PRB蛋白表达水平分别为(0.71±0.05)和(1.05±0.07),Isk-pcDNA3.1(+)-PRB组与Isk-pcDNA3.1(+)-NC组相比,差异有统计学意义(p<0.05)。KLE-pcDNA3.1(+)-NC组和KLE-pcDNA3.1(+)-PRB组的PRB蛋白表达水平分别为(0.18±0.01)和(0.70±0.03),KLE-pcDNA3.1(+)-PRB组与KLE-pcDNA3.1(+)-NC组相比,差异有统计学意义(p<0.01)。4、用醋酸甲酸孕酮处理Ishikawa和KLE细胞,CCK-8结果显示,Isk-pcDNA3.1(+)-PRB组(64.12±1.37)相比较于Isk-pcDNA3.1(+)-NC组(42.21±1.67)细胞抑制率增高(p<0.01),KLE-pcDNA3.1(+)-PRB组(39.88±2.22)相比较于KLE-pcDNA3.1(+)-NC组(15.04±1.34)细胞抑制率增高(p<0.001)。单克隆形成实验结果显示,醋酸甲羟孕酮处理细胞之后,Ishikawa-pcDNA3.1(+)-PRB组和KLE-pcDNA3.1(+)-PRB组较空载体组相比,单克隆细胞数量均减少。划痕实验显示,Ishikawa-pcDNA3.1(+)-PRB组与Ishikawa-pcDNA3.1(+)-NC组相比,细胞迁移率减少(13.81±0.60 vs 22.06±0.84,p<0.01),KLE-pcDNA3.1(+)-PRB与KLE-pcDNA3.1(+)-NC组相比,细胞迁移率减少(15.66±1.07 vs 24.60±2.31,p<0.01)。结论:1、成功构建了pcDNA3.1(+)-PRB的重组质粒载体,并提高了孕激素受体B在子宫内膜癌Ishikawa细胞和KLE细胞中的表达。2、过表达孕激素受体B,可以提高子宫内膜癌细胞Ishikawa和KLE对于醋酸甲羟孕酮的敏感性。

二、人子宫内膜癌单克隆抗体的制备及鉴定(论文开题报告)

(1)论文研究背景及目的

此处内容要求:

首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景,再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题,并提出你的论文准备的观点或解决方法。

写法范例:

本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。

(2)本文研究方法

调查法:该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。

观察法:用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。

实验法:通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。

文献研究法:通过调查文献来获得资料,从而全面的、正确的了解掌握研究方法。

实证研究法:依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。

定性分析法:对研究对象进行“质”的方面的研究,这个方法需要计算的数据较少。

定量分析法:通过具体的数字,使人们对研究对象的认识进一步精确化。

跨学科研究法:运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。

功能分析法:这是社会科学用来分析社会现象的一种方法,从某一功能出发研究多个方面的影响。

模拟法:通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。

三、人子宫内膜癌单克隆抗体的制备及鉴定(论文提纲范文)

(1)NLRC3及GDF15在子宫内膜癌中的表达及对细胞生物学行为的影响(论文提纲范文)

摘要
ABSTRACT
符号说明
前言
实验材料与方法
结果
讨论
结论
附图
参考文献
致谢
攻读学位期间发表的学术论文和参加科研情况
附件

(2)Mcm5在子宫内膜浆液性癌发生发展中的作用及机制(论文提纲范文)

中文摘要
Abstract
符号说明
前言
材料与方法
结果
讨论
结论
参考文献
致谢
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附件

(3)RFRP-3对子宫内膜和人源子宫内膜癌细胞株HEC-1A的影响及分子机制(论文提纲范文)

中文摘要
英文摘要
英文缩略词
第一部分 基于蛋白质组学对侧脑室注射RFRP-3的OEP大鼠子宫腔液分泌蛋白的研究
    前言
    材料与方法
    结果
    附图
    附表
    讨论
    结论
    参考文献
第二部分 RFRP-3 对人源子宫内膜癌细胞株HEC-1A的作用及机制研究
    前言
    材料与方法
    结果
    附图
    附表
    讨论
    结论
    参考文献
综述 GnIH 对女性生殖功能调控机制的研究进展
    参考文献
致谢
个人简历

(4)miRNA-335通过RBM10调节Numb可变剪切影响子宫内膜癌细胞增殖功能的研究(论文提纲范文)

中文摘要
ABSTRACT
符号说明
第一部分 Numb可变剪切在子宫内膜癌中的表达及功能
    前言
    材料与方法
    结果
    讨论
    结论
    附图表
    参考文献
第二部分 miR-335通过RBM10调节Numb的可变剪切
    前言
    材料与方法
    结果
    讨论
    结论
    附图表
    参考文献
致谢
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学位论文评阅及答辩情况表
英文论文
    论文Ⅰ
    论文Ⅱ

(5)基于WGCNA筛选的lncRNA-ZXF1在子宫内膜样子宫内膜癌中的抑癌作用及机制研究(论文提纲范文)

中文摘要
英文摘要
符号说明
前言
第一部分 基于WGCNA的子宫内膜癌患者临床信息的模块分析及分子筛选
    引言
    材料与方法
    实验结果
    讨论
    结论
    第一部分附图
第二部分 LncRNA-ZXF1通过管理CDC20介导的泛素化降解调控P21的蛋白表达
    引言
    材料与方法
    实验结果
    讨论
    结论
    第二部分附图
第三部分 LncRNA-ZXF1通过miR-378a-3p/PCDHA3轴调控P21的表达
    引言
    材料与方法
    实验结果
    讨论
    结论
    第三部分附图
参考文献
文献综述 生物信息学在子宫内膜癌分子分型研究中的进展
    参考文献
致谢
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学位论文评阅及答辩情况表
英文文章一
英文文章二

(6)类泛素化Neddylation通路抑制剂MLN4924抑制子宫内膜癌细胞增殖的作用与机制研究(论文提纲范文)

中文摘要
Abstract
第1章 引言
    1.1 子宫内膜癌概述
    1.2 Neddylation修饰概论
    1.3 新型抗肿瘤治疗靶点:类泛素化Neddylation修饰通路
第2章 实验材料与方法
    2.1 实验材料
    2.2 实验方法
第3章 实验结果
    3.1 Neddylation通路在子宫内膜癌临床样本中活化
    3.2 MLN4924抑制子宫内膜癌细胞的Neddylation通路
    3.3 MLN4924抑制子宫内膜癌细胞的增殖
    3.4 MLN4924诱导子宫内膜癌细胞发生G2期细胞周期阻滞
    3.5 MLN4924增强周期蛋白P21、P27以及WEE1的稳定性
    3.6 MLN4924诱导子宫内膜癌细胞发生DNA损伤
    3.7 MLN4924诱导子宫内膜癌细胞发生细胞凋亡
    3.8 MLN4924通过上调Noxa诱导子宫内膜癌细胞发生细胞凋亡
第4章 讨论
第5章 结论
参考文献
综述: 子宫内膜癌的分类和治疗
    参考文献
附录
个人基本情况
致谢

(7)HNL/NGAL抗体制备及分子形式特异性HNL/NGAL定量方法建立(论文提纲范文)

中文摘要
abstract
第1章 前言
    1.1 HNL/NGAL及其生物学功能
        1.1.1 HNL/NGAL的发现及其结构
        1.1.2 HNL/NGAL的组织分布与表达模式
        1.1.3 HNL/NGAL的生物学功能
    1.2 HNL/NGAL用作疾病标志物
        1.2.1 生物标志物
        1.2.2 HNL/NGAL作为肾损伤生物标志物
        1.2.3 HNL/NGAL作为细菌感染生物标志物
        1.2.4 HNL/NGAL作为肿瘤生物标志物
    1.3 HNL/NGAL定量方法
        1.3.1 现有HNL/NGAL定量方法
        1.3.2 现有HNL/NGAL定量方法的不足
    1.4 单克隆抗体技术
        1.4.1 单克隆抗体的制备技术
        1.4.2 单克隆抗体的鉴定技术
    1.5 表面增强拉曼光谱技术及其在生物标志物检测中的应用
        1.5.1 SERS的基本原理及其优点
        1.5.2 SERS在生物标志物检测中的应用
    1.6 立题依据、创新点及实验设计
        1.6.1 立题依据
        1.6.2 创新点
        1.6.3 实验设计
第2章 单体和同二聚体HNL/NGAL的制备
    2.1 实验材料与仪器
        2.1.1 主要仪器
        2.1.2 菌株、质粒、细胞、抗体
        2.1.3 主要试剂
        2.1.4 主要试剂的配制
    2.2 实验方法
        2.2.1 大肠杆菌表达系统表达HNL/NGAL
        2.2.2 昆虫细胞杆状病毒表达系统表达HNL/NGAL
        2.2.3 单体和同二聚体HNL/NGAL的纯化
    2.3 实验结果
        2.3.1 大肠杆菌表达系统表达HNL/NGAL
        2.3.2 昆虫细胞杆状病毒表达系统表达HNL/NGAL
        2.3.3 单体和同二聚体HNL/NGAL的纯化
    2.4 讨论
    2.5 小结
第3章 抗HNL/NGAL抗体的制备
    3.1 实验材料与仪器
        3.1.1 主要仪器
        3.1.2 动物、细胞、抗体
        3.1.3 主要试剂
        3.1.4 主要试剂的配制
    3.2 实验方法
        3.2.1 抗HNL/NGAL单克隆抗体的制备
        3.2.2 抗HNL/NGAL多克隆抗体的制备
        3.2.3 鉴定抗体对不同分子形式HNL/NGAL的结合能力
    3.3 实验结果
        3.3.1 抗HNL/NGAL单克隆抗体的制备
        3.3.2 抗HNL/NGAL多克隆抗体的制备
        3.3.3 鉴定抗体对不同分子形式HNL/NGAL的结合能力
    3.4 讨论
    3.5 小结
第4章 基于SERS的分子形式特异性HNL/NGAL快速定量方法研究
    4.1 实验材料与仪器
        4.1.1 主要仪器
        4.1.2 主要试剂
        4.1.3 主要试剂的配制
    4.2 实验方法
        4.2.1 纳米银基底的制备
        4.2.2 扫描电镜样品的观察
        4.2.3 表面增强拉曼光谱样品分析单体、同二聚体HNL/NGAL
    4.3 实验结果
        4.3.1 纳米银基底的SEM表征
        4.3.2 纳米银基底修饰及活化
        4.3.3 单体和同二聚体HNL/NGAL的 SERS分析
    4.4 讨论
    4.5 小结
第5章 总结与展望
参考文献
作者简介及在学期间科研成果
致谢

(8)CMKLR1通过Wnt/β-catenin通路介导子宫内膜癌发生发展的研究(论文提纲范文)

中文摘要
Abstract
缩略语
前言
    研究现状、成果
    研究目的、方法
一、Chemerin/CMKLR1 与子宫内膜癌的临床研究
    1.1 材料和方法
        1.1.1 临床标本收集
        1.1.2 病理切片收集
        1.1.3 TCGA数据库资料提取分析
        1.1.4 主要试剂及仪器设备
        1.1.5 实验方法
        1.1.6 统计学处理
    1.2 结果
        1.2.1 病例组与对照组临床资料特征
        1.2.2 子宫内膜癌组与对照组血清chemerin水平无差异
        1.2.3 Chemerin表达水平与子宫内膜癌分期、分级不相关
        1.2.4 免疫组化显示CMKLR1在子宫内膜癌中表达增高
        1.2.5 TCGA统计分析CMKLR1 与子宫内膜癌病理分期密切相关
    1.3 讨论
        1.3.1 子宫内膜癌流行病学及高危因素
        1.3.2 不良生活习惯与子宫内膜癌发病
        1.3.3 子宫内膜癌与周围慢性炎症微环境
        1.3.4 脂肪因子与子宫内膜癌
        1.3.5 脂肪因子chemerin的命名和结构
        1.3.6 Chemerin与恶性肿瘤的相关性研究
        1.3.7 Chemerin及其受体CMKLR1 与恶性肿瘤发生的病因学说
        1.3.8 血清chemerin与子宫内膜癌临床特征无差异性探讨
    1.4 小结
二、脂肪因子chemerin对子宫内膜癌细胞增殖迁移的影响
    2.1 材料和方法
        2.1.1 对象
        2.1.2 主要试剂及仪器设备
        2.1.3 细胞培养及分组
        2.1.4 实验方法
        2.1.5 统计学方法
    2.2 结果
        2.2.1 CCK-8法鉴定各组细胞增殖情况无差异
        2.2.2 划痕实验检测chemerin对细胞迁移能力无影响
    2.3 讨论
    2.4 小结
三、CMKLR1 通过Wnt信号通路介导子宫内膜癌细胞增殖迁移
    3.1 材料和方法
        3.1.1 细胞学材料
        3.1.2 主要试剂及仪器设备
        3.1.3 实验方法
        3.1.4 统计学方法
    3.2 结果
        3.2.1 HEC-1B相较于其他子宫内膜癌细胞系CMKLR1 表达更高
        3.2.2 划痕试验显示HEC-1B细胞体外迁移能力较强
        3.2.3 携带CMKLR1-si RNA慢病毒感染HEC-1B细胞
        3.2.4 鉴定敲低CMKLR1的HEC-1B细胞系构建成功
        3.2.5 下调CMKLR1 蛋白表达抑制HEC-1B细胞增殖
        3.2.6 下调CMKLR1 蛋白表达抑制HEC-1B细胞迁移
        3.2.7 下调CMKLR1 蛋白表达抑制Wnt信号通路靶基因激活
    3.3 讨论
        3.3.1 CMKLR1的命名、结构和功能
        3.3.2 Wnt/β-catenin信号通路与恶性肿瘤
        3.3.3 子宫内膜癌转移特征
        3.3.4 子宫内膜癌分子靶向治疗研究现状
        3.3.5 子宫内膜癌TCGA分子分型
        3.3.6 下调CMKLR1 蛋白通过Wnt信号途径抑制子宫内膜癌进展
    3.4 小结
全文结论
论文创新点
参考文献
综述 脂肪因子与癌症
    综述参考文献
致谢
个人简历

(9)miR-152靶向CDC25B在子宫内膜癌中的作用及机制研究(论文提纲范文)

中文摘要
Abstract
缩略语/符号说明
前言
    研究现状、成果
    研究目的、方法
一、miR-152在子宫内膜癌组织中表达研究
    1.1 对象和方法
        1.1.1 研究对象
        1.1.1.1 病例标本
        1.1.1.2 主要试剂
        1.1.1.3 主要仪器设备
        1.1.2 方法
        1.1.2.1 手术标本的收集
        1.1.2.2 组织总RNA的提取
        1.1.2.3 总RNA浓度及质量检验
        1.1.2.4 RNA逆转录
        1.1.2.5 qRT-PCR反应(Quantitative real-time polymerase chain reaction)
        1.1.3 统计学分析
    1.2 .结果
        1.2.1 子宫内膜癌组的临床病理特征
        1.2.2 miR-152在子宫内膜癌组织及正常子宫内膜组织中的表达
        1.2.3 miR-152的表达水平与子宫内膜癌的临床病理特征的相关性
        1.2.4 在子宫内膜样腺癌组与组织分级的相关性
    1.3 .讨论
        1.3.1 miRNA与子宫内膜癌
        1.3.2 miR-152与恶性肿瘤
        1.3.3 miR-152与子宫内膜癌
        1.3.4 miR-152 的表达与子宫内膜癌临床病理特征的关系
        1.3.5 miR-152作为子宫内膜癌分子标记物的探讨
    1.4 小结
二、miRNA-152 对子宫内膜癌细胞增殖及细胞周期的调控
    2.1 对象与方法
        2.1.1 对象
        2.1.1.1 子宫内膜癌细胞系
        2.1.1.2 试剂与耗材
        2.1.1.3 仪器设备
        2.1.2 方法
        2.1.2.1 细胞实验
        2.1.2.1.1 细胞复苏
        2.1.2.1.2 细胞传代
        2.1.2.1.3 细胞冻存
        2.1.2.1.4 细胞计数
        2.1.2.2 细胞中miR-152的定量检测
        2.1.2.2.1 细胞中总RNA的提取
        2.1.2.2.2 qRT-PCR
        2.1.2.3 质粒细胞转染
        2.1.2.4 MTT实验
        2.1.2.5 5-溴脱氧尿苷掺入实验
        2.1.2.6 流式细胞检测
        2.1.3 统计学分析
    2.2 .结果
        2.2.1 miR-152在不同人子宫内膜癌细胞系中的表达
        2.2.2 转染miR-152 模拟物后KLE和 HEC-1B细胞中miR-152 的表达
        2.2.3 miR-152与子宫内膜癌细胞增殖能力
        2.2.3.1 MTT实验检测细胞增殖能力
        2.2.3.2 5-溴脱氧尿苷(BrdU)掺入实验检测细胞相对生存率
        2.2.4 miR-152与子宫内膜癌细胞周期
    2.3 讨论
        2.3.1 miRNA在恶性肿瘤中的作用方式
        2.3.2 miR-152在恶性肿瘤中的作用方式
        2.3.3 miR-152对子宫内膜癌细胞生物功能的调控
    2.4 小结
三、miR-152对子宫内膜癌细胞增殖及细胞周期调控机制的研究
    3.1 对象与方法
        3.1.1 对象
        3.1.1.1 子宫内膜癌细胞系
        3.1.1.2 试剂与耗材
        3.1.1.3 仪器与设备
        3.1.2 方法
        3.1.2.1 生物信息技术检测靶基因
        3.1.2.2 细胞培养
        3.1.2.3 双荧光素酶报告实验
        3.1.2.4 Western blot实验
        3.1.2.5 建立CDC25B敲低的子宫内膜癌细胞模型
        3.1.2.6 MTT、5-溴脱氧尿苷掺入实验
        3.1.2.7 流式细胞仪检测
        3.1.2.8 CDC25B对 miR-152 生物功能的影响
        3.1.3 统计学分析
    3.2 结果
        3.2.1 miR-152 在子宫内膜癌细胞中靶向CDC25B
        3.2.1.1 生物信息技术检测结果
        3.2.1.2 双荧光素酶基因报告结果
        3.2.1.3 miR-152 在子宫内膜癌细胞中对CDC25B表达的影响
        3.2.2 转染si-CDC25B后 KLE和 HEC-1B细胞中CDC25B的表达
        3.2.3 CDC25B与子宫内膜癌细胞增殖能力
        3.2.3.1 MTT实验检测细胞增殖能力
        3.2.3.2 5-溴脱氧尿苷(BrdU)掺入实验检测细胞相对生存率
        3.2.4 CDC25B与子宫内膜癌细胞周期
        3.2.5 CDC25B对 miR-152 过表达产生的生物功能的影响
    3.3 讨论
        3.3.1 miRNA在恶性肿瘤中的研究模式
        3.3.2 CDC25B在恶性肿瘤中的作用
        3.3.3 CDC25B在子宫内膜癌中的作用
    3.4 小结
全文结论
论文创新点
参考文献
综述 miRNA在妇科恶性肿瘤中研究
    综述参考文献
致谢
个人简历

(10)过表达孕激素受体B提高子宫内膜癌细胞对醋酸甲羟孕酮敏感性的研究(论文提纲范文)

摘要
Abstract
第1章 绪论
第2章 实验材料
    2.1 主要仪器
    2.2 主要试剂
    2.3 相关试剂盒
    2.4 相关生物信息学分析网站与软件
第3章 实验方法
    3.1 主要溶液的配制
    3.2 引物设计
    3.3 细胞培养
    3.4 pcDNA3.1(+)-PRB重组载体构建
    3.5 细胞转染
    3.6 Real-time PCR检测转染后PRB mRNA的表达
    3.7 Western Blot检测转染后PRB蛋白的表达
    3.8 CCK-8 法检测MPA对转染前后Ishikawa和 KLE细胞系增殖的影响
    3.9 单克隆形成实验检测MPA对转染前后Ishikawa和 KLE细胞系增殖的影响
    3.10 划痕实验检测MPA对转染前后Ishikawa和 KLE细胞系迁移的影响
    3.11 统计分析
第4章 实验结果
    4.1 细胞RNA的提取
    4.2 pcDNA3.1(+)-PRB重组载体构建
    4.3 Real-time PCR检测转染后PRB mRNA的表达情况
    4.4 Western Blot检测转染后PRB蛋白的表达情况
    4.5 CCK-8法检测细胞增殖能力
    4.6 单克隆形成实验检测细胞增殖能力
    4.7 划痕实验检测细胞迁移能力
第5章 实验讨论
第6章 实验结论
参考文献
综述
    参考文献
研究生期间科研成果
致谢

四、人子宫内膜癌单克隆抗体的制备及鉴定(论文参考文献)

  • [1]NLRC3及GDF15在子宫内膜癌中的表达及对细胞生物学行为的影响[D]. 孙一卿. 山东大学, 2021(12)
  • [2]Mcm5在子宫内膜浆液性癌发生发展中的作用及机制[D]. 沈文平. 山东大学, 2021(09)
  • [3]RFRP-3对子宫内膜和人源子宫内膜癌细胞株HEC-1A的影响及分子机制[D]. 赵雪莹. 承德医学院, 2021(01)
  • [4]miRNA-335通过RBM10调节Numb可变剪切影响子宫内膜癌细胞增殖功能的研究[D]. 窦晓青. 山东大学, 2021(11)
  • [5]基于WGCNA筛选的lncRNA-ZXF1在子宫内膜样子宫内膜癌中的抑癌作用及机制研究[D]. 孔德水. 山东大学, 2021(11)
  • [6]类泛素化Neddylation通路抑制剂MLN4924抑制子宫内膜癌细胞增殖的作用与机制研究[D]. 李熠. 苏州大学, 2020(02)
  • [7]HNL/NGAL抗体制备及分子形式特异性HNL/NGAL定量方法建立[D]. 姜慕惟. 吉林大学, 2020(08)
  • [8]CMKLR1通过Wnt/β-catenin通路介导子宫内膜癌发生发展的研究[D]. 丁巍. 天津医科大学, 2020(06)
  • [9]miR-152靶向CDC25B在子宫内膜癌中的作用及机制研究[D]. 解丹. 天津医科大学, 2020(06)
  • [10]过表达孕激素受体B提高子宫内膜癌细胞对醋酸甲羟孕酮敏感性的研究[D]. 向花花. 南华大学, 2020

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人子宫内膜癌单克隆抗体的制备与鉴定
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