一、大肠肿瘤石蜡标本P53 mRNA RT-PCRIS比较研究（论文文献综述）
郝书弘[1]（2020）在《结直肠癌患者KRAS、NRAS、BRAF基因突变与关键基因表达的相关性及circGLG1/miR-622/KRAS轴的分子作用机制》文中研究说明背景:结直肠癌（colorectal cancer,CRC）是严重危害人类健康的常见恶性肿瘤之一。在我国CRC的发病率呈逐渐上升趋势。结直肠癌的病因和发病机制十分复杂,涉及基因组、转录组、蛋白质组学及表观遗传学等多种因素的异常改变。利用现代分子生物学技术,对结直肠癌分子发病机制的更深入研究,对本病的早期诊断及个体化治疗至关重要。作为表皮生长因子受体（epidermal growth fatctor receptor,EGFR）信号通路的关键分子,KRAS、NRAS和BRAF基因突变已被证实在结直肠癌的发生、发展过程中起到重要作用,且对结直肠癌患者的靶向治疗具有重要的指导价值。然而,目前研究大多集中在KRAS、NRAS和BRAF的突变频率及其预后价值上,但对于这些基因突变与患者临床病理学特征及其他基因表达的关系仍缺乏了解。因此,分析上述基因突变和结直肠癌患者临床病理学参数及其他基因表达的内在联系对于更加精准的指导个体化治疗具有重要意义。环状RNA（circular RNA,circRNA）是新发现的一类共价闭合环状非编码RNA。CircRNA以其闭合成环,高度稳定,特异性强,易于检测等特点,逐渐成为恶性肿瘤领域的研究热点,且有望成为肿瘤诊断和评估预后最有潜力的分子标记物。KRAS基因作为结直肠癌中最关键的驱动基因,除了基因突变外KRAS基因是否通过其它方式参与结直肠癌的发生发展,在结直肠癌中,KRAS基因的表达水平如何,其表达还受到哪些非编码RNA,尤其是circRNA的分子调控,目前尚无相关报道。目的:本研究拟通过扩增阻碍突变系统PCR（amplification-refractory mutation system polymerase chain reaction,ARMS-PCR）的方法检测结直肠癌组织中KRAS、NRAS和BRAF的常见突变位点,同时,采用免疫组化的方法检测8个结直肠癌关键基因在蛋白水平的表达情况。通过多种统计学方法,探讨KRAS、NRAS和BRAF基因突变与结直肠癌患者临床病理学特征及关键基因表达的内在联系,旨在为更精准的指导结直肠癌的靶向治疗提供依据。此外,本研究在KRAS、NRAS、BRAF突变的基础之上,选取重要靶点,以KRAS表达调控为切入点,利用生物信息分析的方法筛选出结直肠癌发病过程中的关键circRNA/miRNA/KRAS调控轴,并在分子水平、蛋白水平、细胞功能水平对其进行验证。旨在转录后调控层面进一步完善KRAS基因在结直肠癌中的作用及机制,为结直肠癌患者的诊断、治疗提供新的生物标志物和分子靶点。方法:1.收集我院手术切除CRC组织216例。通过ARMS-PCR方法检测216例CRC组织中KRAS、NRAS和BRAF的常见突变位点。通过χ2检验、Mann-Whitney秩和检验、独立样本t检验等统计学方法分析上述基因突变与患者性别、年龄、肿瘤部位、TNM分期、浸润深度、有无淋巴结转移、病理类型、分化程度等临床指标的相关性。2.采用免疫组化的方法检测了P53、EGFR、CDX2、PMS2、MLH1、MSH6、MSH2和Ki67等8个CRC关键基因在蛋白水平的表达情况。通过χ2检验、Mann-Whitney秩和检验、多重对应分析探讨了上述基因表达与KRAS、NRAS和BRAF突变的相关性。3.收集我院手术切除的CRC组织及癌旁组织40对。通过实时定量聚合酶链反应（quantitative real-time-polymerase chain reaction,qRT-PCR）方法检测40对肿瘤组织及癌旁组织KRAS表达水平。利用生物信息分析的方法筛选出结直肠癌增殖及侵袭相关的circRNA分子及KRAS基因潜在的上游调控miRNA分子,建立可能的circRNA/miRNA/KRAS调控轴。在40对CRC临床样本中检测上述调控轴中circRNA（circGLG1）及miRNA（miR-622）的表达水平,利用Pearson线性相关法分析其表达与KRAS表达的相关性。4.检测3株结肠癌细胞系（HCT8、HCT116、DLD1）和正常人肠上皮细胞系（NCM460）中circGLG1的表达水平。根据circGLG1序列设计siRNA及其对照,利用Lipofectamine 2000进行细胞转染。在DLD1细胞系中敲低circGLG1后:1)采用CCK-8、克隆形成实验检测细胞增殖活性;2)采用Transwell、划痕愈合实验检测细胞侵袭及迁移能力;3)检测miR-622表达变化,在mRNA水平和蛋白水平检测KRAS表达变化。在成功敲低circGLG1的基础上共转染miR-622 inhibitor,观察细胞增殖、侵袭、迁移能力及KRAS表达变化是否可以回复。5.根据circGLG1及KRAS序列与miR-622互补配对的区域,设计合成野生型及突变型双荧光素酶报告载体质粒,通过双荧光素酶报告实验进一步验证circGLG1与miR-622,miR-622与KRAS的靶向结合作用。结果:1.CRC患者中KRAS基因突变率为39.8%,其突变位点按概率高低依次为G12D（16.2%）、G12V（8.8%）、G13D（8.3%）、G12S（1.9%）、G12C（1.9%）、G12A（1.4%）、G12R（0.9%）、双位点突变（G12D+G12S）（0.5%）。NRAS的突变率为2.7%,其突变位点为G12D、G13D、Q61R各0.9%。BRAF V600E的突变率为1.4%。KRAS突变与性别有关,女性突变率高于男性（53.3%vs 32.6%,P=0.003）。NRAS、BRAF突变与性别无关。KRAS、NRAS、BRAF突变与患者年龄、TNM分期、浸润深度、有无淋巴结转移、组织病理类型、腺癌分化程度等均无显着相关性。2.免疫组化与KRAS、NRAS、BRAF基因突变结果分析显示,EGFR表达与NRAS突变有关,EGFR阳性表达者突变率高于弱阳性表达者及阴性表达者（5.3%vs 1.4%vs 0%,P=0.047）。PMS2、MLH1、MSH2表达与BRAF突变有关,PMS2阴性表达者BRAF突变率高于弱阳性表达者及阳性表达者（16.7%vs 0%vs 1%,P=0.010）。MLH1阴性表达者BRAF突变率高于弱阳性表达者及阳性表达者（16.7%vs 7.7%vs 0.5%,P=0.001）。MSH2阴性表达者BRAF突变率高于弱阳性表达者及阳性表达者（33.3%vs 0%vs 1.0%,P=0.005）。3.在40对CRC组织及癌旁组织中检测KRAS表达,结果显示,与癌旁组织相比,KRAS在CRC组织中的表达水平显着升高（P<0.001）。通过生物信息学分析的方法建立假设:circGLG1可能通过circGLG1/miR-622/KRAS轴调节结直肠癌增殖及侵袭。为了进一步验证上述假设,我们通过临床样本PCR发现,与癌旁组织相比,circGLG1在CRC组织中的表达明显上调（P<0.01）且与KRAS表达水平呈正相关（R2=0.586,P<0.001）。同时miR-622在CRC组织中的表达明显下调（P<0.01）且与KRAS表达水平呈负相关（R2=-0.339,P<0.05）。4.CircGLG1在肠癌细胞中的表达高于正常肠上皮细胞,其中DLD1细胞中circGLG1表达量最高（P<0.001）。成功设计了2条circGLG1 siRNA。在DLD1细胞系中敲低circGLG1后:1)CCK-8、克隆形成实验证实DLD1细胞增殖受到抑制;2)Transwell、划痕愈合实验证实DLD1细胞侵袭及迁移受到抑制;3)miR-622表达升高,KRAS在mRNA水平和蛋白水平表达均降低。在成功敲低circGLG1的基础上通过共转染miR-622 inhibitor下调DLD1细胞中miR-622表达后,circGLG1不能发挥其对细胞增殖、侵袭的调节作用。且miR-622 inhibitor可回复circGLG1对KRAS表达的调控作用。5.双荧光素酶报告实验结果显示,同时加入野生型重组质粒pEZX-MT06-Wt-circGLG1或pEZX-MT06-Wt-KRAS和miR-622 mimic后,DLD1细胞的荧光素酶活性显着减低,而突变型重组质粒与miR-622 mimic共转染时,荧光素酶活性无明显差异,这充分证明了miR-622与circGLG1和KRAS之间的可结合性。综上,本研究全面检测了216例结直肠癌患者中KRAS、NRAS、BRAF的突变分布并分析了其与患者临床病理参数及关键基因表达的相关性,首次发现EGFR表达与NRAS突变有关,证实了PMS2、MLH1、MSH2等错配修复基因表达缺失与BRAF突变有关。此外,我们证实了KRAS基因在结直肠癌及癌旁组织种存在差异表达,其非编码RNA调节机制之一为circGLG1可以通过circGLG1/miR-622/KRAS轴促进结直肠癌细胞的增殖及侵袭。我们的研究为进一步阐明结直肠癌分子机制提供了理论和实验依据,同时为结直肠癌的诊断及治疗提供了新的生物标志物及关键分子靶点。
金浩[2]（2019）在《Syt7在调控肝癌细胞增殖中的作用及机制研究》文中指出背景原发性肝癌是一种高度恶性肿瘤,肝细胞肝癌是其主要的类型,是全世界最常见恶性肿瘤之一。根据最新统计,全球每年新发肝癌病例达到60万,居所有恶性肿瘤的第五位,死亡率位居恶性肿瘤第三位。其临床特点是发现迟、进展迅速、预后差。目前中国肝癌的病例超过全世界半数以上,严重危害中国人的生命健康,成为中国医师棘手的病种。原发性肝癌的起病、进展是多种因素导致的长期、复杂的连续过程。其病因主要包括酒精、肝炎病毒感染等,这些病因最终通过复杂的多种基因突变导致肿瘤的发生。因此,力争发现在肝癌中有意义的基因是明确复杂致病的前提。突触结合蛋白（synaptptagmin,Syt）一类分泌囊泡的蛋白,山N端跨膜结构域和C端结合Ca2+的C2结构域（包括C2A和C2B）构成。Ca2+结合的突触结合蛋白亚型调节了神经元、神经内分泌细胞以及各种其他分泌细胞融合孔的扩大。突触结合蛋白7（Syt7）是Syt家族中的一员,其在肿瘤中的作用报道较少。已有研究发现,Syt家族在几种类型的肿瘤中表达异常,如Syt（未提是哪类Syt）在小细胞肺癌中表达升高,Sytl3在左侧结肠癌标本中的表达低于右侧结肠癌,Sytl在神经母细胞瘤细胞中高表达,而钙调素对甲状旁腺激素的抑制效应有助于甲状旁腺瘤中Sytl的表达缺失。延伸的Sytl（E-Sytl）的磷酸化参与了原癌基因肺癌融合激酶激活的侵袭通路。但关于Syt尤其是Syt7在肝癌中未见文献报道。目的（1）检测原发性肝癌患者肿瘤及癌旁组织中Syt7蛋白的表达情况,分析肿瘤组织中Syt7表达水平与患者临床病理资料的关系（2）检测不同的肝癌细胞系中Syt7 mRNA的表达情况方法（1）收集蚌埠医学院第一附属医院2013年9月至2018年2月期间行手术切除的原发性肝癌患者的石蜡标本,免疫组化检测肿瘤及癌旁组织中Syt7蛋白的表达情况（2）qRT-PCR检测不同的肝癌细胞系中Syt7 mRNA表达情况（3）分析肝癌组织Syt7蛋白的表达与患者临床、病理资料的关系（4）肿瘤及癌旁组织中Syt7蛋白阳性率的比较及Syt7蛋白阳性率与临床病理学参数的相关性分析均采用x 2检验的方法,通过Kaplan-Meier模型的log-rank检验及Cox回归模型分析影响总体生存率（overall survival,OS）及无瘤生存率（disease-free survival,DFS）的因素,认定P<0.05时具有显着性差异。结果（1）Syt7蛋白在肝癌患者肿瘤组织中的阳性表达率为64.00%（48/75）,在癌旁组织中阳性表达率为2.67%（2/75）,在肿瘤组织中的阳性表达率明显高于癌旁组织,差异具有统计学意义（P<0.05）;（2）与Syt7阴性组相比,Syt7阳性组患者血清中AFP水平较高、肿瘤直径较大、肿瘤数目较多、血管侵犯的风险增加、TNM分期较晚、肿瘤分化程度较低,结果均具有显着性差异（P均<0.05）;（3）Cox单因素分析表明,术前肿瘤大小、血管侵犯、TNM分期、肿瘤分化程度、Child-Pugh分级及Syt7表达水平是影响肝癌患者术后OS的主要预后因素。多因素分析表明,术前肿瘤直径>5cm（HR=4.22,95%CI:1.44-12.39,P=0.009）、血管侵犯（HR=2.71,95%CI:1.15-6.40,P=0.023）、Child-Pugh B 级（HR=4.16,95%CI:1.54-11.25,P=0.005）及 Syt7 阳性（HR=2.84,95%CI:1.08-7.49,P=0.035）是术后OS的独立危险因素;（4）Cox单因素分析表明,术前AFP水平、肿瘤大小、血管侵犯、TNM分期、肿瘤分化程度、Child-Pugh分级及Syt7表达水平是影响肝癌患者术后DFS的主要预后因素。多因素分析表明,术前AFP≥200ng/ml（HR=2.37,95%CI:1.13-4.97,P=0.022）、肿瘤直径>5cm（HR=4.30,95%CI:1.43-12.95,P=0.010）、肿瘤具有血管侵犯（HR=2.57,95%CI:1.10-6.01,P=0.030）、Child-Pugh B 级（HR=4.65,95%CI:1.72-12.56,P=0.002）及 Syt7 阳性（HR=3.43,95%CI:1.26-9.29,P=0.016）是术后DFS的独立危险因素;（5）qRT-PCR结果显示,在肝癌细胞系Huh-7、Hep-3B中Syt7 mRNA表达水平较高,而在肝癌细胞系SMMC-7721、Hep G2、BEL-7402中表达水平较低。结论（1）原发性肝癌患者肿瘤标本中Syt7蛋白阳性率明显高于癌旁标本,Syt7表达水平与患者血清AFP水平、瘤体直径、肿瘤病灶数目、血管侵犯、TNM分期及肿瘤分化程度密切相关。（2）Syt7表达水平是影响肝癌患者术后OS及DFS的独立预后因素。（3）在肝癌细胞系Huh-7、Hep-3B中Syt7 mRNA表达水平较高,而在肝癌细胞系SMMC-7721、Hep G2、BEL-7402中表达水平较低背景原发性肝癌是肝胆系统最常见的恶性肿瘤之一,其病因多样,在西方国家以饮酒和丙肝病毒感染为主,而在中国以乙肝病毒感染多见。由于其起病隐匿,早期症状不明显,早期发现较为困难,进而导致根治性手术切除率低。因而,其综合治疗显得尤为重要,包括化疗,基因靶向治疗等。肝癌的生物学行为较差,预后欠佳,目前的治疗手段仍有限。研究表明,肝癌的起病、进展一定是多种基因参与的多步骤的复杂过程。近年来随着不断进步的分子生物学技术,使针对肝癌的基因治疗成为可能的研究方向。因而,研究在肝癌的增殖、克隆形成、侵袭及转移中起至关重要作用的基因,通过有目的裁剪、替换致病基因甚至修复表达异常的基因,可以进一步丰富肝癌的综合治疗手段。一些基因可能在肝癌细胞中表达异常,但是否对肝癌细胞增殖、克隆、周期变化、凋亡等细胞学及侵袭、转移等行为学方面有影响,以及如何影响,是研究的关键。神经系统释放神经递质和胰岛β细胞释放胰岛素所涉及的胞吐作用是生物体参与生命活动以及产生生化反应的重要组成部分。在这些生理生化过程中多种蛋白发挥了重要的作用。胞内各隔室间的蛋白转运受来自一个细胞器转运蛋白的介导并选择性地与另一个细胞器融合。囊泡的细胞器特异性转运需要调节囊泡转运、着位和融合的蛋白。根据 SNARE（soluble N-ethylmaleimide-sensitive fusion protein attachment protein receptor）假说:每一类囊泡包含一个 v-SNARE（vesicle SNARE）,并只能与一个t-SNARE（target SNARE）关联到合适的受体细胞膜。其中,Syt、突触小泡蛋白（synaptophysin）和 VAMP（vesicle-associated membrane protein）属于v-SNARE;而突触融合蛋白（syntaxin）和SNAP-25家族属于t-SNARE。SNARE蛋白参与了分泌通路中的每一步,但每个SNARE蛋白具有隔室特异性,并有助于着位和融合的特异性。在Syt家族中,Syt7作为Ca2+高亲和的感应器而发挥作用,参与了非神经细胞包括胰腺β细胞的胰岛素分泌颗粒、PC12细胞中大而致密中心的囊泡、溶酶体和大囊泡的胞吐作用中对融合孔动力学的调节。除了上述生理功能外,Syt7也参与了一些病理生理过程,如克氏锥虫侵袭细胞、帕金森病、肺纤维化等。此外有研究报道Syt7是Ca2+调节溶酶体囊泡分泌所必须的,可以通过调节囊泡分泌促进中性粒细胞的迁移。由此,我们提出疑问,Syt7是否可以影响肿瘤细胞的功能其内在机制又是如何呢?查阅文献尚未见Syt7影响肿瘤细胞功能尤其是肝癌细胞的报道。目的体外实验研究干扰Syt7对肝癌细胞系SMMC-7721,BEL-7404增殖的影响,体内实验验证干扰Syt7对肝癌裸鼠移植瘤生长的抑制作用方法（1）以Syt7基因为模板,设计其RNA干扰序列,以构建Syt7基因的RNA干扰慢病毒载体;将含有Syt7基因RNA干扰序列的慢病毒进行肝癌细胞系SMMC-7721、BEL-7404感染实验,分为实验组（shSyt7组）和对照组（shCtrl组）;（2）qRT-PCR检测靶点干扰后肝癌细胞系SMMC-7721及BEL-7404中Syt7 mRNA水平,评价干扰效率;Western Blot检测靶点干扰Syt7后外源蛋白水平表达;（3）Celigo细胞计数检测细胞生长;（4）克隆实验检测慢病毒干扰后细胞成瘤能力;（5）PI-FACS检测细胞周期的变化;（6）MTT实验检测肝癌细胞增殖能力;（7）裸鼠成瘤实验检测干扰Syt7对移植瘤生长的影响;（8）采用SPSS 21.0统计学软件进行统计学分析,均值±标准差的形式表示所有计量资料,成组资料间的比较采用t检验。P<0.05表示差异具有显着性意义。结果（1）成功构建了 Syt7干扰慢病毒载体,建立了稳定干扰Syt7的细胞系;荧光观察显示感染细胞效率达到70%以上;（2）慢病毒感染后,SMMC-7721及BEL-7404中Syt7 mRNA的表达量受到明显抑制（P<0.05）,敲减效率分别为62.3%及52.3%。Western Blot显示慢病毒感染对Syt7基因的外源蛋白表达水平有显着的敲减作用;（3）通过Celigo分析仪连续检测5天,结果发现,实验组SMMC-7721及BEL-7404细胞的生长受到明显抑制,表明Syt7可明显促进肝癌细胞的生长;（4）克隆实验结果发现,实验组SMMC-7721及BEL-7404细胞的集落数目显着减少,提示Syt7明显地提高了肝癌细胞的克隆形成能力;（5）PI-FACS检测细胞周期的结果提示,实验组SMMC-7721细胞G1期的细胞数量明显减少,而处于G2/M期的细胞则无明显变化,此外,处于S期的细胞数量明显增多。实验组BEL-7404细胞处于G1期的细胞明显增多,处于S期的细胞无显着变化,处于G2/M期的细胞明显减少,结果提示干扰Syt7后可使细胞周期停滞。提示Syt7可明显影响肝癌细胞的周期分布;（6）通过MTT实验连续检测5天,结果发现,实验组SMMC-7721和BEL-7404细胞的增殖受到明显的抑制,提示Syt7明显提高了肝癌细胞的增殖能力;（7）干扰Syt7后裸鼠体内移植瘤的荧光强度显着降低,瘤体体积及重量均显着降低。结论（1）干扰目的基因Syt7可抑制肝癌细胞系SMMC-7721和BEL-7404的增殖。（2）干扰Syt7可以诱导肝癌细胞系SMMC-7721和BEL-7404的周期停滞。（3）干扰Syt7可以抑制肝癌细胞系SMMC-7721和BEL-7404的克隆形成。（4）干扰Syt7可以抑制裸鼠体内移植瘤的生长。背景肝癌的综合治疗手段多样,而根治性手术切除仍是其中的首选治疗手段。由于肝癌的不良生物学行为如多中心性、进展快、容易复发和转移的特点,导致总体治疗效果仍较差,生存率不高。外源性的环境污染、内源性的染色体改变、细胞内基因的变化等综合因素最终导致细胞的恶性转化及肿瘤的发生。因此,发现肝癌细胞和组织标本中异常表达,且进一步实验证明在肝癌中有功能的基因仍然是不够的。进一步探讨基因相关的信号转导通路,明确其在通路中角色,有助于明确肝癌的发病、进展机制,使在此基础上寻找到肝癌靶向治疗的靶点成为可能。关于肝癌中信号通路的研究较多,如Wnt/β-catenin信号通路、p38-MAPK通路、Hedgehog 信号通路、P13K-hkt、MAPK、SAPK/JNK、NF-κ B、上皮间质转化、细胞自噬相关通路、细胞凋亡相关死亡信号通路及线粒体通路等在肝癌中可能都起一定的研究。Syt7在肿瘤中的作用未见报道,前两部分研究表明Syt7在肝癌组织标本及肝癌细胞中高表达,且可以促进肝癌细胞增殖及肝癌进展,其在肝癌中所涉及的通路尚不清楚。此部分研究力争明确Syt7在肝癌中所参与的信号通路及其在通路中的角色,为探寻新的肝癌治疗靶点提供理论及实验基础。目的检测干扰目的基因Syt7后对肝癌细胞SMMC-7721信号通路中关键信号分子的影响方法（1）以Syt7基因为模板,设计其RNA干扰靶点,以构建Syt7基因的RNA干扰慢病毒载体;含有Syt7基因RNA干扰序列的慢病毒进行肝癌细胞SMMC-7721感染实验,分为实验组（shSyt7组）和对照组（shCtrl组）。（2）qRT-PCR检测干扰后SMMC-7721中Syt7 mRNA水平,评价干扰效率。（3）使用 Cell Signaling Technology（CST）公司的 PathScan（？）Stress and Apoptosis Signaling Antibody Array Kit,检测和比较实验组和对照组信号通路中关键分子的变化。（4）Western blot进一步验证Syt7干扰后肝癌细胞系SMMC-7721中相关基因外源性蛋白表达水平。（5）采用SPSS 21.0统计学软件进行数据分析,均值±标准差的形式表示所有计量资料,P<0.05表示差异具有显着性意义。结果（1）成功构建了 Syt7干扰慢病毒载体,建立了稳定干扰Syt7的细胞系;荧光观察,显示细胞感染效率达到70%以上;（2）实验组SMMC-7721细胞中Syt7 mRNA的表达量受到明显抑制（P<0.05）,敲减效率达到53.4%;（3）PathScan（?）Antibody Array Kit结果提示,与对照组相比,实验组信号通路中p53、Chk1蛋白的磷酸化水平显着上调;（4）Western blot进一步提示,实验组p53、Chk1基因的外源性蛋白表达明显上调。结论干扰Syt7基因可以通过激活Chk1-p53信号通路抑制肝癌细胞SMMC-7721的增殖和使细胞周期停滞于S期。
祝敏[3]（2019）在《XRCC2表达水平与直肠癌术前放疗敏感性的相关性》文中研究表明目的:探讨XRCC2表达与直肠癌术前放疗后病理反应程度的关系,评价其表达水平是否可作为术前放疗敏感性的预测指标。方法:收集青岛大学附属医院肿瘤科2014年1月至2017年12月接受术前放化疗并行手术的直肠腺癌患者88例,分别采用免疫组织化学法及RT-PCR法检测XRCC2在放化疗前活检标本和手术切除标本中的表达水平,根据第七版AJCC手册肿瘤消退级别评价患者对术前放疗的敏感性,分析放化疗前后XRCC2表达水平及其变化,以及其放化疗前的表达水平与临床病理特征及术后病理反应程度的关系。结果:纳入的88例患者中,平均年龄58.6±9.0岁,放化疗前TNM分期为II、III、IV期的患者分别有17例、58例、13例。免疫组织化学结果显示,放疗敏感的患者52例,放疗抵抗的患者36例,放疗敏感率为59.1%（52/88）,其中,病理完全缓解率为4.5%;放化疗前XRCC2蛋白表达与放化疗前TNM分期（P=0.020）、术后肿瘤T分期（P=0.046）相关;放化疗后XRCC2蛋白表达升高者16例,表达降低者12例,表达无变化者56例,放化疗前后XRCC2蛋白在直肠癌组织中的表达差异无统计学意义（P>0.05）;放化疗前XRCC2蛋白高表达者的放疗敏感率为46.7%,低表达者的放疗敏感率为85.7%,肿瘤病理消退单因素分析示放化疗前XRCC2蛋白表达与放疗敏感性相关（P=0.001）:XRCC2蛋白高表达的患者术后病理缓解率低,对放疗不敏感;XRCC2蛋白低表达者的患者术后病理缓解率高,对放疗敏感。而患者性别、年龄、分化程度、神经侵犯、脉管癌栓等与放疗敏感性无关（P>0.05）。对不同病理缓解程度的患者进行分层分析发现,病理完全消退的患者其放化疗前XRCC2蛋白表达水平显着低于放疗抵抗的患者,差异有统计学意义（P=0.001）;放化疗后病理完全消退与部分消退的患者其放化疗前XRCC2蛋白表达差异无显着统计学意义（P>0.05）。肿瘤病理消退多因素Logistic回归分析显示放化疗前XRCC2蛋白表达是放疗抵抗的独立风险因素（OR:6.857,95%CI:2.12022.176）。RT-PCR结果显示,XRCC2 mRNA在放化疗前的表达水平与放疗抵抗相关（P=0.01）:放化疗前XRCC2 mRNA高表达者,对放疗不敏感;放化疗前XRCC2 mRNA低表达者,对放疗敏感。结论:XRCC2蛋白及mRNA表达水平均与直肠癌术前放疗敏感性相关,检测活检标本中XRCC2的表达有可能对于筛选直肠癌术前放疗敏感性的患者具有重要意义。
曹营卿[4]（2019）在《EGFL6通过AKT/ERK信号通路促进大肠癌发生发展的相关研究》文中进行了进一步梳理背景大肠癌是目前临床上最为常见的消化系统恶性肿瘤。据统计,美国大肠癌患者的发病率及病死率已经位居全部恶性肿瘤的第三位。大肠癌的发病十分隐匿,并且早期很多患者症状不明显,往往发现时已经处于癌症的中晚期,伴随有很大程度的转移及浸润,目前在全球范围内大肠癌是肿瘤致死的第4位,而肿瘤转移是导致大肠癌患者死亡的关键和重要原因。在肿瘤发生的早期通过有效的方法降低肿瘤的侵袭和转移能力是目前广大医学工作者研究的热门。近些年来,在我国大肠癌的发生率呈现明显的上升趋势,这可能同中国人的饮食结构的变化、开展大肠癌筛选普查以及人口老龄化等有关。研究大肠癌患者分子发生和调控机制对于大肠癌的治疗和诊断具有重要意义。大肠癌发生的原因还不明确,其可能与患者的遗传、大肠息肉、致癌物质损伤、肠道炎症损伤、放射损伤等多种不良因素有关,但是这些因素通过何种方式引起大肠癌的发生和发展尚不清楚。很多研究报道表明,癌基因或抑癌基因的异常表达是大肠癌发生及发展的重要调控因子,这些基因参与癌细胞的生长、侵袭等的调控过程,其异常表达还常常与肿瘤患者的预后、进展、转移等密切有关。目前,医学工作者一直致力于寻找同大肠癌的发生和恶性进展关系密切的分子标记物,并且通过分析其在大肠癌细胞功能中的作用寻找有效的治疗大肠癌的分子靶点,这对于大肠癌的分子发生机制和大肠癌患者早期诊断及治疗具有巨大意义。恶性肿瘤的发生及进展过程是一个多步骤的复杂过程,其受到组织细胞内多种基因共同构成的网络调控作用,这些基因共同影响着肿瘤细胞的生长、克隆、周期进展、侵袭、凋亡等生物学特性。目前对于肿瘤的治疗主要以手术切除为主,放疗及化疗辅助治疗,而近年来随着分子生物学的不断进展,分子靶向治疗也逐渐成为肿瘤治疗的热点,其具有准确性高、毒副作用小等优点,积极寻找有效的靶基因是当下医学工作者研究的热点。类表皮生长因子域 6（epidermal growth factor like domain 6,EGFL6）是肿瘤学的热门研究分子,其是EGF重复超家族的成员,EGF重复基序一般为30至40个氨基酸残基的结构域,内含有半胱氨酸和甘氨酸的保守结构,被认为参与蛋白与蛋白间的相互作用。目前已发现大约70种不同的EGF超家族蛋白,这些蛋白参与血液凝固,纤维蛋白溶解,细胞粘附等。EGFL6含有2个N连接的糖基化位点、在MAM结构域中还有3个羟基化位点及ATP/GDP结合位点、还有1个酪氨酸磷酸化位点,可作为激酶底物使其磷酸化以调节EGFL6表达。EGFL6与肿瘤的进展有关,在黑色素瘤中已经证实EGFL6沉默可以有效抑制黑素素瘤细胞的增殖和侵袭。EGFL6促进乳腺癌细胞的迁移和侵袭,并且还可以增加乳腺癌在体内的生长速度,而阻断EGFL6可以显着降低癌细胞的发生和迁移。在与肿瘤相关的内皮细胞中发现EGFL6表达水平高于正常的卵巢组织,EGFL6参与肿瘤相关血管形成过程,并且EGFL6的激活与AKT信号通路的激活水平有关。EGFL6不仅在肿瘤组织中异常高表达,在口腔鳞癌患者的血浆中同样发现EGFL6表达水平高于正常健康组,并且EGFL6的表达水平与口腔鳞癌患者远端转移、TNM分期等呈正相关。目前尚未见EGFL6在大肠癌中的研究,对于EGFL6在大肠癌细胞生物学特性中的作用也不明确。癌基因或抑癌基因参与肿瘤进展是一个十分复杂的过程,其是多种基因及信号共同传导的结果,癌基因常常可以通过激活下游促肿瘤进展的信号转导从而诱导肿瘤的发生,而抑癌基因常常通过下调下游促肿瘤进展的信号转导而发挥抗肿瘤功效,研究癌基因或抑癌基因在肿瘤发生中的分子机制对于肿瘤的治疗具有重要意义。目前对于EGFL6的作用机制的研究发现,EGFL6是一个多功能调节因子,其可以通过调节细胞内多种信号的转导发挥多种生物学作用。EGFL6可以通过激活细胞内ERK信号通路影响内皮细胞的血管形成及迁移能力,EGFL6过表达后可以提高细胞中ERK和AKT蛋白的磷酸化水平,EGFL6可以正调控ERK和AKT信号的激活。在恶性肿瘤进展中,EGFL6是通过何种机制影响肿瘤细胞恶性表型的机制尚不明确。MAPK是广泛存在真核细胞中的蛋白激酶家族,其包含有多种信号转导途径,其中ERK通路参与细胞的增殖、分化、侵袭等过程。ERK含有ERK1和ERK2两个亚家族,其是一种双重特异性蛋白激酶。活化以后的ERK可以通过作用于存在于细胞浆或细胞核内的底物而激活下游靶蛋白,从而调控细胞的增殖、凋亡、分化等过程。ERK信号通路激活后可以激活生长因子、生长因子、细胞因子等,其通过调控这些因子影响蛋白酶的激活、磷酸化等,从而参与机体正常生理或病理过程。细胞在正常生理状态下,ERK多存在于细胞质内,其在受到外界刺激以后被激活进入到细胞核内发挥生物学作用。AKT信号通路是一个在人类组织中具有多种作用的调控因子,其下游有多个效应分子,AKT磷酸化后可以激活下游分子,从而影响细胞的凋亡、生长、转移等。目前对于AKT的研究发现,AKT在肿瘤组织中过度激活,并且靶向抑制AKT信号通路也是目前为止肿瘤治疗的有效途径。AKT激活以后可以促进肿瘤血管形成、促进肿瘤转移、调控细胞周期。目的本次实验探讨EGFL6在大肠癌组织及细胞中的表达差异,并且通过基因转染的方法下调或上调EGFL6表达,确定EGFL6在大肠癌细胞生长、侵袭、凋亡、血管生成中的作用,同时探讨其在裸鼠移植瘤生长中的作用,并初步研究其作用机制,为靶向治疗大肠癌提供新的靶基因。方法（1）收集54例大肠癌患者的癌组织及对应的癌旁组织,其中癌旁组织取至距离癌组织约10cm处,患者在手术切除前没有接收放疗及化疗。大肠癌患者中有36例为男性,18例为女性,其中≥50岁的患者有29例,<50岁的患者有25例,TNM分期中有23例Ⅰ-Ⅱ期,31例Ⅲ-Ⅳ期。qRT-PCR测定癌组织和癌旁组织中EGFL6-mRNA表达差异。免疫组化测定癌组织和癌旁组织中EGFL6蛋白表达水平。分析EGFL6-mRNA表达水平同大肠癌患者年龄、性别、TNM分期及组织学分级相关性。（2）选取人大肠癌细胞系SW480、SW620、HT29、SW1116及正常人肠上皮细胞系FHC,qRT-PCR测定细胞中EGFL6-mRNA表达差异。（3）在大肠癌细胞中转染pcDNA3.1-EGFL6 和EGFL6-siRNA,Western blot检测细胞中EGFL6蛋白表达变化,MTT测定细胞增殖变化,PI单染流式细胞术测定细胞周期分布变化,平板克隆实验测定克隆形成能力,Transwell小室测定细胞侵袭和迁移能力变化,血管生成实验测定血管生成能力变化,Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术测定凋亡变化。（4）Western blot检测人大肠癌细胞系SW620、HT29和正常人肠上皮细胞系FHC中p-AKT、p-ERK、AKT、ERK蛋白表达变化。（5）用AKT信号抑制剂MK-2206和ERK信号抑制剂U0126处理大肠癌细胞,Western blot检测p-AKT、p-ERK、AKT、ERK蛋白表达变化,MTT测定细胞增殖,PI单染流式细胞术测定细胞周期分布变化,平板克隆实验测定克隆形成能力,Transwell小室测定细胞侵袭和迁移能力变化,血管生成实验测定血管生成能力变化,Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术测定凋亡变化。（6）Western blot检测过表达和下调EGFL6后的大肠癌细胞中p-AKT、p-ERK、AKT、ERK蛋白表达变化。（7）用EGFL6-shRNA慢病毒转染大肠癌细胞,接种到裸鼠皮下,测定裸鼠移植瘤生长体积和重量变化。（8）取裸鼠移植瘤,Western-blot检测EGFL6、p-AKT、p-ERK、AKT、ERK蛋白表达变化。结果（1）免疫组化显示大肠癌组织中EGFL6表达量高于正常的癌旁组织（P<0.05）。EGFL6-mRNA在癌组织中的表达水平明显高于癌旁正常组织（P<0.05）,并且EGFL6-mRNA表达水平与大肠癌患者TNM分期、组织学分级有关,与患者的年龄及性别无关。（2）人大肠癌细胞系SW480、SW620、HT29、SW1116中的EGFL6-mRNA水平明显高于正常人肠上皮细胞系FHC（P<0.05）。（3）pcDNA3.1-EGFL6转染的大肠癌细胞中的EGFL6蛋白水平明显升高（P<0.05）,转染EGFL6-siRNA可以明显抑制细胞中EGFL6的蛋白表达（P<0.05）。过表达EGFL6的大肠癌细胞增殖能力、克隆能力、侵袭能力、迁移能力、血管生成能力明显升高,S期比例明显升高,细胞凋亡明显减少（P<0.05）。下调EGFL6的大肠癌细胞增殖能力、克隆能力、侵袭能力、迁移能力、血管生成能力明显降低,G0/G1期细胞比例明显升高,细胞凋亡明显增多（P<0.05）。（4）人大肠癌细胞系SW620、HT29中p-AKT和p-ERK水平均明显高于正常人肠上皮细胞系FHC（P<0.05）。（5）AKT信号抑制剂MK-2206和ERK信号抑制剂U0126处理后的大肠癌细胞中p-AKT和p-ERK水平降低,细胞增殖、克隆、侵袭、迁移和血管生成能力降低,G0/G1期细胞比例升高,细胞凋亡增多（P<0.05）。（6）过表达EGFL6的大肠癌细胞中p-AKT和p-ERK水平升高（P<0.05）。下调EGFL6的大肠癌细胞中p-AKT和p-ERK水平降低（P<0.05）。（7）EGFL6 shRNA慢病毒转染后的大肠癌细胞皮下移植瘤生长体积和重量明显降低（P<0.05）。（8）EGFL6 shRNA慢病毒转染后的大肠癌细胞皮下移植瘤组织中EGFL6、p-AKT和p-ERK水平降低（P<0.05）。结论（1）EGFL6在大肠癌中高表达,并且其表达水平的高低与肿瘤患者的TNM分期以及组织学分级有关。（2）EGFL6可以正调控大肠癌细胞中AKT/ERK信号通路的激活。（3）抑制AKT和ERK信号通路降低大肠癌细胞的增殖、克隆、侵袭、迁移和血管形成能力,促进细胞凋亡。（4）下调EGFL6可能通过抑制AKT/ERK信号通路降低大肠癌细胞裸鼠移植瘤生长。
陈丹妮[5]（2019）在《MicroRNA-27b在乳腺癌生长与耐药中的作用机制及临床意义》文中提出化疗是乳腺癌全身治疗的基石,但化疗耐药的产生严重制约了治疗效果。化疗耐药的分子机制复杂,尚未完全阐明,其逆转剂的开发更是进展缓慢。已有研究表明,microRNAs（miRNA）可在转录后水平调节下游靶基因的表达,在乳腺癌化疗耐药中发挥着重要调控作用。肿瘤基因图谱（TCGA）是目前最大的癌症基因信息数据库,我们利用TCGA数据库,比对了大量乳腺癌组织与正常乳腺组织的miRNA表达谱。另外针对接受紫杉醇类药物治疗的患者,根据其化疗效果分出耐药组和敏感组,比对两组患者的乳癌组织中miRNA表达谱。从上述两部分比对结果中筛选出差异显着的miRNA,建立文库。髓样乳腺癌是三阴性乳腺癌中的一种特殊组织类型,以化疗为主要治疗手段。目前对髓样乳腺癌化疗耐药的研究甚少。我们以髓样乳腺癌多药耐药细胞Bads-200对紫杉醇的耐药性变化为主要研究目标,通过高通量实验从miRNA文库中筛选出可有效调控细胞耐药性的miRNA分子:miR-27b-3p。临床样本检测结果显示miR-27b在乳癌组织中显着下调,尤其是在紫杉醇耐药的乳癌组织中。统计分析发现,miR-27b在乳癌组织中低表达与疾病进展、不良预后密切相关。另外,miR-27b表达量与细胞对紫杉醇的耐药性呈显着负相关。体外实验表明,miR-27b可显着抑制髓样乳腺癌细胞的增殖及对紫杉醇等多种化疗药物的耐药性,这种抑制作用在其他乳腺癌细胞中同样有效。体内实验表明,miR-27b可显着增强紫杉醇对耐药细胞生长的抑制作用,降低肿瘤对紫杉醇的抵抗性。我们利用生物信息学技术预测了 miR-27b下游靶基因,并通过KEGG和GO分析筛选出与肿瘤发生、药物反应等重要信号通路相关的靶基因。经过双荧光素酶报告基因实验验证CBLB、GRB2是miR-27b的直接靶标。进一步的实验证实miR-27b可通过抑制CBLB、GRB2的表达,一方面下调Akt、Erk通路中重要蛋白的表达,抑制细胞增殖;另一方面抑制抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xl的表达,促进细胞凋亡;这两方面的共同作用降低髓样乳腺癌细胞对紫杉醇的耐药性。综上所述,本课题筛得的乳腺癌耐药相关miR-27b可作为判断乳腺癌患者预后及疾病进展的风险预测因子;可通过下调CBLB、GRB2的表达,显着抑制乳腺癌的生长及耐药。这些研究结果将有助于加深我们对乳腺癌化疗耐药机制的理解,可为乳腺癌治疗提供潜在靶点,为化疗耐药逆转剂的开发提供新思路。
朱旗[6]（2018）在《孕早期胚胎停育绒毛组织病理学变化及miRNA在胎盘异常发育中的作用》文中认为早期胚胎停育,又称稽留流产（missed abortion,MA）,是指妊娠早期胚胎停止发育、胚胎未见孕囊或心血管搏动等,是一种特殊类型的自然流产。我国MS的临床发病率为13%,且近年来呈现上升趋势,已经成为育龄妇女面临的一个重大健康问题。然而,但MA发生的确切机制至今尚未完全清楚。胎盘是妊娠期保证胎儿正常生长发育的临时性器官,是胎儿与母体进行营养和气体交换的唯一渠道。在胚胎发育过程中胎盘血管的形成和发育程度与妊娠的成功与否关系密切。胎盘发育异常是引起稽留流产的一个重要原因。在稽留流产中胎盘的病理生理变化尚不十分清楚,并且胎盘异常发生的分子机制也有待深入研究。MicroRNA（miRNA）是一种仅有18-25个核苷酸的内源性单链小分子RNA,广泛存在真核生物中,具有高度的保守性、组织特异性和时序性,在细胞增殖、分化和凋亡等多种生理过程中发挥着重要的作用。我们实验室的前期研究显示胎盘miRNAs异常表达参与了妊娠糖尿病的发生,而同样作为妊娠期相关疾病的稽留流产,miRNAs在其胎盘组织异常发育过程中的作用尚不明确。为了观察MA胎盘绒毛组织的病理学变化,采用免疫组化法检测了标记胎盘血管生成和滋养层细胞入侵情况的血管内皮生长因子（VEGF）、反应滋养层细胞分布情况的细胞角蛋白（CK19）和反应蜕膜间充质细胞分布情况的波形蛋白（Vimentin）在MA患者和正常早孕对照绒毛组织中的表达差异;通过Tunel检测法测定了 MS患者和正常对照胎盘绒毛组织的凋亡情况。结果显示,VEGF、CK19及Vimentin在胚胎停育的胎盘绒毛组织及正常对照绒毛组织中均有表达,VEGF的阳性信号主要定位于绒毛滋养细胞（包括细胞滋养细胞和合体滋养细胞）及间质细胞,CK19主要表达于滋养层细胞,Vimentin在间充质细胞及血管内皮细胞中表达丰富。利用H-score评分分析病例组及对照组的VEGF、CK19及Vimentin表达差异发现,病例组VEGF的表达水平显着低于对照组（P<0.001）,其与已经报道的自然流产中VEGF表达水平较低的研究结果相一致。对照组及病例组的CK19和Vimentin表达没有明显差异。在MA患者及正常早孕对照胎盘绒毛中均存在细胞凋亡,病例组的凋亡指数显着高于对照组（P<0.001）。这些结果提示MA发生时胎盘血管形成和绒毛滋养层细胞入侵受阻,滋养层细胞发生凋亡,其可能引起绒毛生长受限、侵袭不足,阻碍孕卵发育,从而发生胚胎停育。为了研究MA患者胎盘异常发育的分子机制,我们首先筛选了在MA患者胎盘组织中差异表达的miRNAs。miRNA探针原位杂交和RT-PCR方法被用来检测miR-98、miR-16、miR-503和miR-125a在MA患者胎盘中的表达。原位杂交结果显示miR-98、miR-16、miR-503和miR-125a在MA患者及正常早孕绒毛组织中的均有广泛表达,主要分布于细胞滋养层细胞、合体滋养层及间质细胞。对miRNAs的阳性信号进行平均光密度统计分析发现,与对照组相比,miR-98、miR-16、miR-503和miR-125a的表达在MA患者绒毛组织中均有显着升高（均P<0.05）。Real-time PCR结果显示miR-98、miR-16和miR-125a在对照组和病例组间的表达差异与其原位杂交结果一致（P<0.05,P<0.01,P<0.001）。这些结果提示miR-98、miR-16和miR-125a表达上调可能是引起胚胎停育的相关因素。我们实验室前期的研究结果显示miR-98和miR-125a在胚胎植入和复发性流产中发挥重要作用,故本研究选择miR-98和miR-125a进行深入研究。为了进一步分析这些miRNAs与MA的关系,我们研究了 miRNAs在滋养层细胞中的作用及机制。Edu、MTT、transwell小室法被用来分析miRNA对人绒毛滋养细胞功能的影响;miRWalk、targetscan数据库被用来预测miRNA的靶基因;双荧光素酶报告基因检测系统和Real-time PCR被用来鉴定及验证miRNA的靶基因;基因补偿实验被用来进一步证实miRNAs与靶基因的作用关系。研究结果显示,过表达miR-98,滋养层细胞HTR8的迁移能力及活性显着降低（P<0.01,P<0.05）,敲低miR-98,HTR8细胞的增殖能力及活性明显提高（P<0.05,P<0.05）,提示miR-98对细胞、增殖及迁移起抑制作用。生物信息学预测显示GDF6和PLEKHA8是miR-98的靶基因。利用双荧光素酶系统验证显示,含GDF6 3’UTR种子序列的重组质粒与miR-98模拟物共转染可以显着降低荧光素酶活性（P<0.01）,与miR-98抑制物共转染可以显着增加荧光素酶活性（P<0.05）,提示miR-98能够与GDF6 3’UTR发生结合。突变预测的miR-98与GDF6 3’UTR识别序列,荧光素酶的活性显着增加（P<0.05）,提示该位点突变可以抑制miR-98与GDF6 3’UTR结合。miR-98过表达,可以降低细胞中GDF6 mRNA表达水平（P<0.001）,敲低miR-98,GDF6表达量显着升高（P<0.05）。这些结果提示GDF6为miR-98靶基因。同样,双荧光素酶实验显示miR-98过表达可以显着抑制PLEKHA8的活性（P<0.05）,敲低可以明显促进PLEKHA8的活性（P<0.05）,突变miR-98识别的PLEKHA8 3’UTR位点,可以显着抑制miR-98与PLEKHA8 3’UTR结合（P<0.001）。qRT-PCR结果显示miR-98过表达可以降低细胞中PLEKHA8 mRNA表达水平（P<0.001）,miR-98低表达可以显着升高PLEKHA8 mRNA表达水平（P<0.05）。这些结果提示PLEKHA8为miR-98靶基因。靶基因RESCUE实验显示,敲低miR-98的同时抑制其靶基因PLEKHA8表达,可以使细胞增殖和迁移能力恢复到正常水平。过表达miR-125a,HTR8细胞的迁移能力及增殖显着降低（P<0.05,P<0.05）,敲低miR-125a,HTR8细胞的增殖能力及活性明显提高（P<0.05,P<0.05）,说明miR-125a对细胞增殖及迁移起抑制作用。过表达miR-125a可以抑制CBX7的表达,提示CBX7可能是miR-125a的靶基因。结论:胚胎停育的患者中,滋养层细胞与间质细胞的分布没有明显变化,而绒毛滋养细胞侵袭能力下降,细胞过度凋亡,说明VEGF低表达和细胞凋亡异常与MA发生相关;miR-98、miR-16和miR-125a的过表达参与了MA的发生;miR-98和miR-125a对细胞增殖及迁移起抑制作用,miR-98通过下调GDF6及PLEKHA8发挥作用,miR-125a通过调节CBX7发挥作用。
常顺[7]（2018）在《Gab2基因在胶质瘤中的作用机制研究》文中研究表明目的:近年来研究发现支架蛋白Gab2（Gab2-associated binding protein 2）在多种恶性肿瘤中高表达,其表达增高与肿瘤的发生发展密切相关。同时有研究显示Gab2蛋白在胶质瘤组织中也存在高表达的趋势,但其转录水平和表达水平对胶质瘤发生发展的影响尚无定论。对胶质瘤组织中Gab2mRNA进行检测,定量分析Gab2转录水平,并将其与临床病理特征和胶质瘤影像学资料进行关联分析,将有利于进一步解释Gab2表达水平对胶质瘤发生发展的调控机制。所以本研究将对胶质瘤和瘤旁组织中的Gab2mRNA进行检测,并分析其与临床病理和影像学资料各因素间的关系;进一步建立科学、规范的Sprague-Dawley大鼠脑胶质瘤原位移植模型;通过敲减Gab2的表达,研究其对C6胶质瘤细胞在体外和SD-大鼠脑内增殖和凋亡的影响,及对细胞因子IL-6、TNF-a、VEGF和肿瘤相关因子 MMP-2、MMP-9,Bax、Bcl-2、p53、Cleaved-caspase-3 表达的影响;初步阐明Gab2表达水平与胶质瘤发生发展的关系,探讨Gab2的表达对胶质瘤细胞增殖、凋亡的影响及其可能的分子机制,为寻求胶质瘤的有效治疗方法打下基础。方法:1.搜集临床胶质瘤患者样本40例,对其临床病理及影像学资料进行归纳总结,并应用qRT-PCR分别检测40例胶质瘤和瘤旁组织中Gab2mRNA的相对表达量,分析其表达差异,并研究其表达与临床病理特征及瘤周水肿的关系;2.利用胶质瘤细胞系C6研究Gab2对胶质瘤细胞的功能调控机制,将其分为对照组、空载体组及Gab2-siRNA组进行细胞Gab2-siRNA转染,以靶向沉默、敲减细胞中Gab2基因的表达,转染后48h用western-blot分别检测三组细胞Gab2蛋白的表达,验证转染效率,并于转染后72h用流式细胞仪检测三组细胞的凋亡情况;3.利用胶质瘤细胞系C6和SD-大鼠建立胶质瘤动物模型进一步研究Gab2对胶质瘤细胞体内增殖和凋亡的调控机制。将SD-大鼠分为三组:对照组、Gab2-siRNA组,每组47只,空白组5只;分别将数目相同的C6胶质瘤细胞和经Gab2-siRNA转染的C6胶质瘤细胞立体定向接种于对照组和Gab2-siRNA组SD-大鼠的右脑尾状核,构建动物模型,空白组5只则用等体积的生理盐水代替;在建模2周后,随机选取对照组和Gab2-siRNA组大鼠各15只行灌注后处死,剖颅探查取瘤,检测肿瘤的瘤重和体积,计算成瘤率;建模3周后,将对照组、Gab2-siRNA组大鼠各30只取眼眶血后和空白组大鼠5只灌注后处死,剖颅探查取瘤,检测肿瘤的瘤重和体积,计算成瘤率,与建模2周后的肿瘤瘤重、体积和成瘤率相比较;利用HE染色法明确肿瘤病理学特征,并采用GFAP染色法判断肿瘤来源,免疫组化染色检测肿瘤Bax、Bcl-2蛋白的表达水平;采用qRT-PCR和western-blot检测肿瘤MMP-2、MMP-9转录水平及蛋白表达水平;应用Western-blot检测肿瘤中Bax、Cleaved-caspase-3和p53蛋白的表达水平;采用ELISA检测经剖颅证实荷瘤成功的对照组及Gab2-siRNA组大鼠血清中细胞因子IL-6、TNF-α、VEGF的表达水平,并用电镜观察比较两组肿瘤细胞的超微结构。结果:1.Gab2在胶质瘤组织中的转录水平显着高于瘤旁组织（P<0.01）;且随着胶质瘤病理级别的升高及瘤周水肿的加重,Gab2-mRNA相对表达量的升高有显着统计学差异（P<0.01）,但其在不同性别和年龄间的表达差异无统计学意义（P>0.05）。2.Gab2-siRNA转染C6胶质瘤细胞后,与对照组和空载体组相比,Gab2-siRNA组Gab2蛋白的表达显着降低（P<0.01）,对照组及空载体组中Gab2蛋白的表达则无明显差异（P>0.05）;且对照组细胞的凋亡率与空载体组相比无明显差异（P>0.05）,而Gab2-siRNA组细胞凋亡率与对照组和空载体组相比明显增高,具有显着性差异（P<0.01）。3.剖颅探查取瘤、检测肿瘤体积和重量和计算成瘤率结果示:建模3周后肿瘤的体积和瘤重显着高于2周后（P<0.01）;同期,Gab2-siRNA组的肿瘤体积和瘤重显着低于对照组（P<0.01）,成瘤率稍低于对照组,但无统计学差异（P>0.05）,空白组无肿瘤形成。4.HE染色示:与对照组相比,Gab2-siRNA组细胞异型性较小,核浆比例下降,病理性核分裂象和新生血管较少。两组肿瘤GFAP染色都呈阳性,说明肿瘤来源于神经胶质细胞,而非其它性质肿瘤,可用作后续研究。5.两组肿瘤组织中均有Bax和Bcl-2蛋白的表达;与对照组相比,Gab2-siRNA组Bcl-2蛋白的表达强度减弱（P<0.05）,Bax蛋白的表达强度则明显升高（P<0.01）。6.与对照组相比,Gab2-siRNA组中MMP-2、MMP-9的mRNA的相对表达量和MMP-2、MMP-9蛋白的表达水平显着低于对照组（P<0.01）。7.与对照组相比,Gab2-siRNA组p53、Cleaved-caspase-3、Bax蛋白的表达水平明显升高（P<0.01）。8.与对照组相比,Gab2-siRNA组细胞因子IL-6、TNF-α、VEGF的表达明显降低（P<0.05）。9.电镜检查示:与对照组相比,Gab2-siRNA组细胞凋亡征象明显多见。结论:1.Gab2基因在胶质瘤组织中的表达显着高于瘤旁组织（P<0.01）,且其表达明显受到胶质瘤的病理分级及瘤周水肿程度的影响;提示Gab2可能在肿瘤组织中特异性高表达,与胶质瘤的发生发展关系密切,有望成为一个新的分子靶点。2.Gab2-siRNA转染C6胶质瘤细胞效率较高,能显着降低Gab2蛋白的表达水平（P<0.01）,敲减Gab2能明显促进体外C6胶质瘤细胞的凋亡（P<0.01）;SD-大鼠脑尾状核C6胶质瘤模型成瘤周期较短,成瘤率高,模型稳定性好,是一种较为理想的胶质瘤动物模型。3.敲减Gab2能明显抑制C6胶质瘤细胞在SD-大鼠脑内的增殖和生长并促进其凋亡,减轻瘤重、缩小肿瘤体积。其机制可能与敲减Gab2下调了MMP-2、MMP-9和IL-6、TNF-α、VEGF的表达、升高Bax和下调Bcl-2的表达进而升高了Bax/Bcl-2的比值、活化了凋亡信号途径p53/Bax/Cleaved-caspase-3有关。
马艳会[8]（2012）在《PTTG、VEGF、p53和TSP-1在大肠癌中的表达及其与生物学行为和血管生成的相关性研究》文中研究指明目的：大肠癌属高发癌症,其生物学行为影响临床治疗效果,提高大肠癌患者的生存期的关键是早期诊断并选择正确恰当的治疗方案。本课题通过观察大肠良恶性肿瘤中垂体瘤转化基因（Pituitary tumor transforming gene,PTTG）、血管生成内皮因子（Vascular Endothelial Growth factor VEGF）、凝血酶敏感蛋白（Thrombospondin,TSP-1）、p53的表达规律,探讨PTTG、VEGF、p53、TSP-1在大肠癌发生发展中的作用,并进一步研PTTG、VEGF、p53、TSP-1在大肠癌生物学行为和血管生成的作用及相互之间的相关性。方法：选取2008年1月至2009年1月临床资料完整且保存完好的18例正正常大肠组织,20例大肠腺瘤,44例大肠腺癌石蜡标本,患者术前均未进行放化疗及生物免疫治疗。利用免疫组化检测Envision二步法检测各组中PTTG、VEGF、p531和TSP-1表达,并用CD34标记肿瘤微血管数量。运用统计学方法分析PTTG的表达与VEGF、p531和TSP-1的相关性以及与各临床病理参数间的关系和血管生成的关系。结果：（1）PTTG在大肠腺癌中的阳性表达率为88.6%,明显高于正常大肠组织（11.1%）,大肠腺瘤（75%）。正常组织组与大肠腺癌组,正常组织组与大肠腺瘤组相比较有统计学差异（P<0.05）,大肠腺瘤组与大肠腺癌组未见明显的统计学差异（p>0.05）。PTTG与性别、年龄无关（p>0.05）,PTTG与大肠癌的分化程度、浸润深度、淋巴结转移、脉管瘤栓形成有密切的关系（p<0.05）与MVD呈正相关。（2）VEGF在大肠腺癌中的表达阳性率为70.4%,在大肠腺瘤及正常大肠组织的阳性率分别为40%,11.1%,各组两两比较差异有统计学意义（P<0.05）。VEGF与大肠腺癌的性别、年龄及分化程度无关（p>0.05）,VEGF与大肠腺癌的浸润深度、淋巴结转移、脉管瘤栓形成有密切的关系（p<0.05）,能促进肿瘤新生血管形成。（3）p53在正正常大肠组织中无表达,在大肠腺瘤及大肠腺癌中的阳性表达率为50%,68.2%,正常粘膜和大肠腺瘤,正正常粘膜组和大肠腺癌组相比较有统计学意义（P<0.05）；大肠腺瘤组与大肠腺癌组比较无统计学意义（P>0.05）。大肠腺癌中p53的阳性表达率仅与癌的浸润深度的差异有统计学意义（p<0.05）。（4）TSP-1在大肠腺癌中的表达阳性率为38.6%,而在大肠腺瘤及正正常大肠组织的阳性率分别为80%,44.4%,TSP-1蛋白在正正常大肠组织及大肠腺瘤组和大肠腺癌组两组相比较表达有逐渐减弱的趋势,差异有统计学意义（p<0.05）。TSP-1与大肠腺癌的浸润深度有关（p<0.05）。（5）MVD在大肠腺癌中的平均密度值为（67±26）；在大肠腺瘤级正正常大肠组织中的MVD值为（33±7vs11±4）,差异有统计学意义（P<0.05）。（6）大肠肿瘤组织中PTTG蛋白表达与VEGF、p53蛋白、MVD计数呈正正相关,与TSP-1蛋白呈负相关（P<0.05）；p53蛋白与VEGF蛋白、MVD计数呈正相关,与TSP-1蛋白负相关（p<0.05）；TSP-1与MVD计数负相关（p<0.05）,同时TSP-1与VEGF有负相关的趋势,但无统计学意义（P>0.05）。结论：（1）PTTG、VEGF、p53表达升高及TSP-1表达下降是参与大肠癌发生发展过程中的重要因素。（2） PTTG、VEGF与大肠癌的分化程度、浸润深度、淋巴结转移、脉管瘤栓形成有密切的关系,并且可能都有促进血管生成的作用,是大肠腺癌发生发展过程中的重要分子学改变。p53在大肠癌中能够促进浸润,TSP-1则抑制大肠癌的浸润。（3）大肠癌中PTTG与VEGF、p53表达呈正正相关,三者在大肠癌的发生、发展中有协同作用,PTTG、p53与TSP-1的表达呈负相关,推测PTTG在大肠癌中抑制TSP-1的表达从而抑制其抑血管生成的生物学作用,同时也间接的促进了促血管生成因子的表达进而促进了血管生成。
马建军[9]（2008）在《NDRG2基因在肾癌中的表达及其抑制肾癌A-498细胞增殖的实验研究》文中进行了进一步梳理目的意义:NDRG2基因是1999年从正常人全脑cDNA文库中克隆到的新基因[GenBank登录号AF159092.],染色体定位于14q12.1,基因组中由15个内含子,16个外显子构成。NDRG2基因的cDNA全长为2024 bp,编码357个氨基酸的蛋白质,分子量约41kD。目前研究表明,NDRG2基因在多种肿瘤组织或细胞系如结肠癌、胶质瘤、白血病、淋巴瘤和腮腺癌中无表达或低表达,相反在上述肿瘤相应的正常组织细胞中有较高水平的表达。另外在中枢神经系统的大脑皮质、白质、神经核,唾液腺上皮细胞和骨骼肌细胞中高表达。同时基因转染实验表明,NDRG2可抑制胶质瘤BT325细胞由G1期向S期的过渡,因此,推测NDRG2可能是一种新的抑癌基因。本研究的目的意义是探讨NDRG2基因在肾癌发病机制中的作用,确定NDRG2基因的功能,为肾癌的防治提供理论依据。实验方法:采用RT-PCR、Western blot和免疫组织化学方法确定NDRG2在肾癌细胞系、肾脏细胞系及正常组织和肾癌组织的表达;构建NDRG2的腺病毒表达载体并进行腺病毒的包装及滴度测定,获得高滴度的重组NDRG2腺病毒用于后续的细胞功能实验研究;用NDRG2重组腺病毒转染经证实低表达NDRG2的肾透明细胞癌细胞系A-498中,提高该细胞中NDRG2表达水平,通过流式细胞术分析细胞周期并检测凋亡,并运用蛋白免疫印迹检测细胞周期相关蛋白的变化;通过p53重组腺病毒转染肾癌A-498细胞,观察p53基因对NDRG2基因表达的影响。实验结果:1、通过免疫组织化学、RT-PCR、蛋白印迹等检测了人肾癌组织和人肾小管上皮细胞系、肾癌细胞系中NDRG2蛋白和mRNA的表达,结果显示:人近端肾小管上皮细胞HK-2细胞系、人胚肾上皮细胞HKC细胞系中NDRG2的mRNA表达水平较高;而在肾癌细胞系786-O、A-498中NDRG2的mRNA表达水平较低;NDRG2 mRNA在18例肾癌患者肿瘤组织中的表达水平较其相应癌旁组织低,且该表达与其病理分级呈正相关趋势;仅有6例患者的肾肿瘤组织中NDRG2的mRNA表达水平高于相对应的自身肿瘤瘤旁组织;另外有14例患者两者NDRG2 mRNA的表达无差异。2、采用美国Novagen公司成熟的pAdTrack-CMV腺病毒表达系统首先构建了含有NDRG2基因的重组穿梭载体,通过脂质体转染法将线性化的重组穿梭载体与骨架蛋白载体转染293细胞获得了原始病毒种,通过挑选单蚀斑进一步感染293细胞获得了单蚀斑病毒裂解液,在此基础上我们建立了原始种子批、主种子批及工作种子批,最后用工作种子批完成了pAd-GFP-NDRG2重组腺病毒的生产、病毒的纯化及病毒滴度的测定,最终获得的重组腺病毒滴度为1.1×1011pfu /ml。3、通过蛋白印迹实验证实重组腺病毒pAd-GFP-NDRG2转染可增加A-498细胞内源性NDRG2的表达水平;随后的MTT检测结果表明:A-498细胞病毒转染组,各检测时间点MTT OD值均低于未转染和空质粒转染组,48h差异具有显着性,说明NDRG2表达对A-498细胞生长具有抑制作用;进一步的细胞周期分析显示:A-498细胞质粒转染组出现G1期阻滞（G1期捕获）,提示NDRG2通过细胞周期阻滞来抑制A-498细胞增殖;凋亡检测实验结果显示:与未转染的A-498细胞（1.0%）和不含插段的重组腺病毒感染的A-498细胞（2.0%）相比,含NDRG2插段的重组腺病毒组感染的A-498细胞中凋亡细胞明显增多,感染48h后达12.0%;最后通过蛋白印迹实验检测发现:人NDRG2基因转染A-498细胞后,周期素蛋白cyclinD1、cyclinE表达减少,cyclinD2、cyclinD3和cdk2表达无明显变化,由此推测NDRG2基因抑制细胞增殖可能是通过影响周期素蛋白D1和E起作用的。4、通过蛋白印迹和RT-PCR发现A-498细胞表达没有活性的p53,但是基本检测不到NDRG2的表达;通过转染活化型p53基因到A-498细胞后观察到了NDRG2表达水平的升高,且呈剂量依赖关系,该结果说明NDRG2可受到p53基因的调控,提示NDRG2也是p53的一个下游基因。实验结论:NDRG2在正常肾组织中高表达,而在肾癌组织中出现低表达或无表达;NDRG2能够抑制肾癌A-498细胞的增殖,并能产生G1期阻滞,抑制细胞周期素D1、E的表达;p53的表达能够上调NDRG2的表达,本研究的结果进一步证实NDRG2基因是一种新的抑癌基因,以其为靶点的基因治疗策略可为肾癌的基因治疗提供新思路。
李赵江波[10]（2008）在《Kail和p53在大肠癌组织中的表达及其相关性研究》文中进行了进一步梳理目的:通过检测Kail和p53基因在大肠癌组织中的蛋白表达,进一步探讨它们与大肠癌病理特征之间的关系,并分析两者之间的相关性。材料和方法:组织标本取自南昌大学第二附属医院普外科2006年11月至2007年10月手术根治性切除的大肠癌组织,共56例,详细记录临床病理情况,以28例大肠腺瘤组织和22例正常大肠组织做为对照。用免疫组织化学EliVision法对56例大肠癌、28例大肠腺瘤和22例正常大肠组织的石蜡标本进行Kai1和p53蛋白表达的检测。结果:（1）大肠癌、大肠腺瘤和正常大肠组织中Kai1的蛋白表达Kai1主要定位于细胞膜上,也可见于细胞浆中。Kai1在大肠癌组织中蛋白的表达较大肠腺瘤和正常大肠组织明显下调（P<0.01）,大肠腺瘤和正常大肠组织中Kai1的蛋白表达差异无显着性（P>0.05）。Kai1在大肠癌中的蛋白表达与患者的年龄、性别、肿瘤的发生部位、大小以及浸润深度均无相关性（P>0.05）;Kai1在高/中分化组的蛋白表达明显高于低/未分化组,无淋巴结转移组明显高于有淋巴结转移组,无远处转移组高于有远处转移组,TNMⅠ期/Ⅱ期明显高于TNMⅢ期/Ⅳ期（P<0.05）。（2）大肠癌、大肠腺瘤和正常大肠组织中p53的蛋白表达p53定位于细胞核上。p53在正常大肠组织、大肠腺瘤和大肠癌中蛋白表达的差异有统计学意义（P<0.05）。p53在大肠癌中的蛋白表达与患者的年龄、性别、肿瘤的发生部位、大小、浸润深度以及有无远处转移均无相关性（P>0.05）;p53在高/中分化组的蛋白表达低于低/未分化组,有淋巴结转移组高于无淋巴结转移组,TNMⅠ期/Ⅱ期明显低于TNMⅢ期/Ⅳ期（P<0.05）。（3）大肠癌中Kai1和p53蛋白表达的相关性在Kai1呈阴性表达的大肠癌组织中,p53有1例呈阴性表达,21例呈阳性表达（3例弱阳性,18例阳性）,Kai1呈阳性表达的大肠癌组织中,p53有12例呈阴性表达,22例呈阳性表达（8例弱阳性,14例阳性）,Kai1与p53在大肠癌中的蛋白表达呈负相关（rs’=-0.5763,P=0.0000）。结论:（1）Kai1表达的下调和p53表达的增高可能促进了大肠癌的发生、发展。（2）联合检测Kai1和p53在大肠癌中的蛋白表达对大肠癌的病情评估及预测预后有一定的辅助意义。（3）在大肠癌中Kai1的表达可能受p53的直接调控。
二、大肠肿瘤石蜡标本P53 mRNA RT-PCRIS比较研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、大肠肿瘤石蜡标本P53 mRNA RT-PCRIS比较研究（论文提纲范文）
（1）结直肠癌患者KRAS、NRAS、BRAF基因突变与关键基因表达的相关性及circGLG1/miR-622/KRAS轴的分子作用机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略表 |
| 第1章 结直肠癌患者KRAS、NRAS、BRAF基因突变与关键基因表达的相关性 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 材料 |
| 1.2.1 实验试剂 |
| 1.2.2 实验仪器 |
| 1.3 方法 |
| 1.3.1 研究对象 |
| 1.3.2 组织DNA提取 |
| 1.3.3 DNA浓度测定 |
| 1.3.4 KRAS、NRAS、BRAF检测位点及突变类型 |
| 1.3.5 ARMS-PCR反应 |
| 1.3.6 KRAS、NRAS、BRAF基因突变结果判定 |
| 1.3.7 免疫组织化学染色 |
| 1.3.8 免疫组化结果判定 |
| 1.3.9 统计学分析 |
| 1.4 结果 |
| 1.4.1 患者一般资料 |
| 1.4.2 KRAS突变分布及其与结直肠癌患者临床病理学特征分析 |
| 1.4.3 NRAS突变分布及其与结直肠癌患者临床病理学特征分析 |
| 1.4.4 BRAF突变情况及其与结直肠癌患者临床病理学特征分析 |
| 1.4.5 免疫组织化学染色结果 |
| 1.4.6 KRAS、NRAS、BRAF基因突变与免疫组化结果分析 |
| 1.4.7 KRAS、NRAS、BRAF基因突变与免疫组化结果的多重对应分析 |
| 1.5 讨论 |
| 1.6 结论 |
| 第2章 Circ GLG1/miR-622/KRAS轴在结直肠癌中的分子作用机制 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料 |
| 2.2.1 细胞系 |
| 2.2.2 实验试剂 |
| 2.2.3 实验仪器 |
| 2.3 方法 |
| 2.3.1 研究对象 |
| 2.3.2 细胞培养 |
| 2.3.3 RNA提取及浓度测定 |
| 2.3.4 m RNA及 circRNA qRT-PCR反应 |
| 2.3.5 MiRNA qRT-PCR反应 |
| 2.3.6 生物信息学分析方法 |
| 2.3.7 细胞功能学实验 |
| 2.3.8 Western blot实验 |
| 2.3.9 双荧光素酶报告实验 |
| 2.3.10 统计学分析 |
| 2.4 结果 |
| 2.4.1 KRAS在结直肠癌组织中表达上调 |
| 2.4.2 生物信息学方法预测KRAS潜在的上游调控miRNA和circRNA分子 |
| 2.4.3 CircGLG1及miR-622 在临床样本中的表达水平 |
| 2.4.4 Circ GLG1 在结直肠癌细胞系中表达上调并促进结直肠癌细胞增殖及侵袭 |
| 2.4.5 CircGLG1 通过调控miR-622/KRAS轴促进结直肠癌细胞增殖及侵袭 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 结论 |
| 第3章 全文总结 |
| 3.1 结论 |
| 3.2 创新点 |
| 3.3 本论文的不足 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 综述1 RAS突变在肿瘤中的靶向治疗进展 |
| 1 RAS基因及蛋白的结构及功能 |
| 2 RAS基因及蛋白的直接靶向治疗 |
| 3 RAS蛋白下游信号通路靶向治疗进展 |
| 4 RAS突变的其他靶向治疗策略 |
| 5 总结 |
| 参考文献 |
| 综述2 环状RNA在结直肠癌中的研究进展 |
| 1 环状RNA的起源与特点 |
| 2 环状RNA的形成机制 |
| 3 环状RNA的功能 |
| 4 环状RNA在结直肠癌中的研究 |
| 5 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 博士研究生指导组成员和课题基金资助项目 |
| 致谢 |
（2）Syt7在调控肝癌细胞增殖中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略词表 |
| 第一部分 Syt7原发性肝细胞肝癌组织标本和肝癌细胞中的表达及意义 |
| 前言 |
| 材料方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附表 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 第二部分 Syt7在体内外实验中对肝癌增殖的影响 |
| 前言 |
| 材料方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附表 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 第三部分 Syt7调控肝癌细胞增殖的机理研究 |
| 前言 |
| 材料方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附表 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表论文 |
| 英文论文1 |
| 英文论文2 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（3）XRCC2表达水平与直肠癌术前放疗敏感性的相关性（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 资料与方法 |
| 1 临床资料 |
| 2 治疗方案 |
| 3 主要仪器与试剂 |
| 4 实验方法 |
| 4.1 免疫组织化学法检测XRCC2 蛋白表达 |
| 4.2 Real-timePCR检测XRCC2mRNA表达 |
| 5 免疫组织化学结果判断 |
| 6 放疗敏感性评价标准 |
| 7 统计学分析 |
| 结果 |
| 1 XRCC2 蛋白表达与直肠癌术前放疗敏感性的关系 |
| 1.1 XRCC2蛋白在直肠癌组织中的表达 |
| 1.2 放化疗前XRCC2 蛋白表达与临床病理特征的关系 |
| 1.3 放化疗前后XRCC2 蛋白表达 |
| 1.4 放疗敏感性结果及影响因素分析 |
| 1.5 放疗敏感性多因素Logistic回归分析 |
| 2 XRCC2mRNA表达与直肠癌术前放疗敏感性的关系 |
| 2.1 XRCC2 蛋白表达与mRNA表达比较 |
| 2.2 放化疗前XRCC2mRNA表达与放疗敏感性的关系 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 综述参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 致谢 |
（4）EGFL6通过AKT/ERK信号通路促进大肠癌发生发展的相关研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 第一章 EFGL6调控大肠癌细胞生物学特性的体外实验 |
| 一 材料与方法 |
| 二 结果 |
| 三 讨论 |
| 四 小结 |
| 第二章 EGFL6调控AKT和ERK信号影响大肠癌细胞的进程 |
| 一 材料与方法 |
| 二 结果 |
| 三 讨论 |
| 四 小结 |
| 第三章 sh-EGFL6抑制大肠癌移植瘤生长的体内实验 |
| 一 材料与方法 |
| 二 结果 |
| 三 讨论 |
| 四 小结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 英文论文Ⅰ |
| 英文论文Ⅱ |
（5）MicroRNA-27b在乳腺癌生长与耐药中的作用机制及临床意义（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 中英文对照表 |
| 1 绪论 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.2 问题的提出 |
| 1.3 研究路线 |
| 1.4 本文创新点 |
| 1.5 研究意义 |
| 2 乳腺癌化疗耐药相关miRNAs的筛选与鉴定 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验思路 |
| 2.3 实验材料 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.5 实验结果 |
| 2.5.1 TCGA数据库筛选与乳腺癌生长及耐药相关的miRNAs |
| 2.5.2 高通量鉴定可显着下调乳腺癌细胞耐药性的miRNAs |
| 2.5.3 MiR-27b、miR-204表达量在乳腺癌组织中显着下调 |
| 2.5.4 MiR-27b表达失调与紫杉醇耐药相关 |
| 2.5.5 MiR-27b的表达失调与乳腺癌患者的预后相关 |
| 2.5.6 MiR-27b的表达量与乳腺癌的恶性程度相关 |
| 2.6 讨论 |
| 2.7 本章小结 |
| 3 MiR-27b可抑制乳腺癌生长与耐药 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验思路 |
| 3.3 实验材料 |
| 3.4 实验方法 |
| 3.5 实验结果 |
| 3.5.1 MiR-27b可抑制乳腺癌细胞增殖、逆转紫杉醇耐药 |
| 3.5.2 MiR-27b可影响乳腺癌细胞对多种化疗药物的耐药性 |
| 3.5.3 MiR-27b可抑制乳腺癌细胞的克隆形成 |
| 3.5.4 MiR-27b可促进乳腺癌细胞的凋亡 |
| 3.5.5 MiR-27b可在体内抑制乳腺癌的生长和耐药性 |
| 3.5.6 低表达miR-27b可在体内促进乳腺癌的生长 |
| 3.6 讨论 |
| 3.7 本章小结 |
| 4 MiRNA-27b下游靶基因的确定 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验思路 |
| 4.3 实验材料 |
| 4.4 实验方法 |
| 4.5 实验结果 |
| 4.5.1 生物信息学预测miR-27b的下游靶标 |
| 4.5.2 筛选与乳腺癌生长及耐药相关的靶基因 |
| 4.5.3 确定miR-27b的直接靶标 |
| 4.5.4 MiR-27b可在体外抑制CBLB、GRB2的表达 |
| 4.5.5 MiR-27b可在体内抑制CBLB、GRB2的表达 |
| 4.5.6 CBLB、GRB2表达失调与紫杉醇耐药相关 |
| 4.6 讨论 |
| 4.7 本章小结 |
| 5 MiR-27b抑制乳腺癌细胞增殖与耐药的机制研究 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 实验思路 |
| 5.3 实验材料 |
| 5.4 实验方法 |
| 5.5 实验结果 |
| 5.5.1 CBLB、GRB2可在体外促进乳腺癌细胞的增殖、耐药 |
| 5.5.2 MiR-27b通过抑制CBLB、GRB2从而抑制细胞的增殖与耐药 |
| 5.5.3 MiR-27b可逆转CBLB、GRB2对凋亡的调控作用 |
| 5.5.4 CBLB、GRB2可抑制AKT、ERK信号通路 |
| 5.5.5 MiR-27b可抑制AKT、ERK信号通路 |
| 5.6 讨论 |
| 5.7 本章小结 |
| 6 预测乳腺癌中以耐药相关miRNAs为中心的调控网络 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 实验思路 |
| 6.3 生信平台 |
| 6.4 实验方法 |
| 6.5 实验结果 |
| 6.5.1 筛选关键miRNAs下游表达失调的靶基因 |
| 6.5.2 蛋白互作网络的构建及生物信息学分析 |
| 6.5.3 蛋白互作网络中筛选枢纽基因 |
| 6.5.4 筛选miRNAs上游表达失调的IncRNAs |
| 6.5.5 构建以关键miRNAs为中心的调控网络 |
| 6.6 本章小结 |
| 附图1 |
| 附图2 |
| 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 作者简历及在学期间所取得的科研成果 |
（6）孕早期胚胎停育绒毛组织病理学变化及miRNA在胎盘异常发育中的作用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 1 研究样本基本信息 |
| 2 早期停育胎盘绒毛组织病理变化研究 |
| 2.1 停育胎盘绒毛滋养层细胞入侵情况 |
| 2.2 滋养层细胞和蜕膜间质细胞分布的情况 |
| 2.3 胎盘细胞凋亡情况 |
| 3 胚胎停育组织差异表达miRNA的筛选 |
| 3.1 组织芯片的排列方式 |
| 3.2 miR-98在胚胎停育组织中的表达 |
| 3.3 miR-16在胚胎停育组织中的表达 |
| 3.4 miR-503在胚胎停育组织中的表达 |
| 3.5 miR-125a在胚胎停育组织中的表达 |
| 4 候选miRNA在胎盘绒毛组织中的作用机制研究 |
| 4.1 miR-98在胎盘绒毛组织中的作用机制研究 |
| 4.2 miR-125a在胎盘绒毛组织中的作用研究 |
| 讨论 |
| 1. 早期停育胎盘绒毛组织中的病理学变化 |
| 2. miRNA与胚胎停育发生的相关性 |
| 3. miR-98和miR-125a在胚胎停育发生中的作用机制 |
| 结论 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 综述一 |
| 参考文献 |
| 综述二 |
| 参考文献 |
| 英汉缩略语名词对照表 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（7）Gab2基因在胶质瘤中的作用机制研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 Gab2在胶质瘤及瘤旁组织中的表达及意义 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 RNA干扰技术敲减Gab2的表达及SD-大鼠C6胶质瘤模型的建立 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 敲减Gab2对胶质瘤细胞增殖和凋亡的影响及其分子机制研究 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（8）PTTG、VEGF、p53和TSP-1在大肠癌中的表达及其与生物学行为和血管生成的相关性研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 前言 |
| 参考文献 |
| 第二章 材料与方法 |
| 1 .研究对象 |
| 2.主要仪器设备和试剂 |
| 3.实验原理及检测方法 |
| 4.PTTG. VEGF及TSP-1 、 p53免疫组织化学染色结果判断 |
| 5.统计学方法 |
| 第三章 结果 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 英汉缩略词对照表 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间撰写的论文 |
| 致谢 |
（9）NDRG2基因在肾癌中的表达及其抑制肾癌A-498细胞增殖的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言和文献回顾 |
| 正文 NDRG2 基因在肾癌中的表达及其抑制肾癌A-498 细胞增殖的实验研究 |
| 实验一 NDRG2 基因在肾癌细胞系及肾癌组织中的表达 |
| 引言 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 实验讨论 |
| 实验二 NDRG2 重组腺病毒表达体系的建立 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 实验讨论 |
| 实验三 过表达NDRG2 对A-498 细胞的影响及机理研究 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 实验讨论 |
| 实验四 P53 对肾癌细胞A-498 NDRG2 表达的影响 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 实验讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 个人简介和研究成果 |
| 致谢 |
（10）Kail和p53在大肠癌组织中的表达及其相关性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 引言 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 标本 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 实验原理及方法 |
| 2.2.1 实验原理 |
| 2.2.2 染色步骤 |
| 2.3 实验结果的观察和判定 |
| 2.4 统计学处理 |
| 第3章 结 果 |
| 3.1 Kai1 蛋白表达的检测 |
| 3.1.1 Kai1 在正常大肠组织、大肠腺瘤和大肠癌中的蛋白表达 |
| 3.1.2 大肠癌中 Kai1 的蛋白表达与临床病理特征的关系 |
| 3.2 p53 蛋白表达的检测 |
| 3.2.1 p53 在正常大肠组织、大肠腺瘤和大肠癌中的蛋白表达 |
| 3.2.2 大肠癌中 p53 的蛋白表达与临床病理特征的关系 |
| 3.3 大肠癌中Kai1 和p53 的蛋白表达的相关性 |
| 第4章 讨 论 |
| 4.1 Kai1 在大肠癌中的蛋白表达及其意义 |
| 4.2 p53 在大肠癌中的蛋白表达及其意义 |
| 4.3 Kai1 和p53 在大肠癌中蛋白表达的相关性 |
| 第5章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 进一步工作的方向 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录A 图片 |
| 附录B 综述 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
四、大肠肿瘤石蜡标本P53 mRNA RT-PCRIS比较研究（论文参考文献）
- [1]结直肠癌患者KRAS、NRAS、BRAF基因突变与关键基因表达的相关性及circGLG1/miR-622/KRAS轴的分子作用机制[D]. 郝书弘. 吉林大学, 2020(08)
- [2]Syt7在调控肝癌细胞增殖中的作用及机制研究[D]. 金浩. 山东大学, 2019(02)
- [3]XRCC2表达水平与直肠癌术前放疗敏感性的相关性[D]. 祝敏. 青岛大学, 2019(02)
- [4]EGFL6通过AKT/ERK信号通路促进大肠癌发生发展的相关研究[D]. 曹营卿. 山东大学, 2019(09)
- [5]MicroRNA-27b在乳腺癌生长与耐药中的作用机制及临床意义[D]. 陈丹妮. 浙江大学, 2019(03)
- [6]孕早期胚胎停育绒毛组织病理学变化及miRNA在胎盘异常发育中的作用[D]. 朱旗. 北京协和医学院, 2018(02)
- [7]Gab2基因在胶质瘤中的作用机制研究[D]. 常顺. 昆明医科大学, 2018(06)
- [8]PTTG、VEGF、p53和TSP-1在大肠癌中的表达及其与生物学行为和血管生成的相关性研究[D]. 马艳会. 兰州大学, 2012(09)
- [9]NDRG2基因在肾癌中的表达及其抑制肾癌A-498细胞增殖的实验研究[D]. 马建军. 第四军医大学, 2008(04)
- [10]Kail和p53在大肠癌组织中的表达及其相关性研究[D]. 李赵江波. 南昌大学, 2008(01)