一、低分子量肝素的性质与应用（论文文献综述）
盛安然[1]（2021）在《基于质谱的糖胺聚糖结构表征及其与蛋白互作分子机制研究》文中研究指明糖胺聚糖（Glycosaminoglycans,GAGs）是一类异质性极高、结构十分复杂的生物大分子,广泛存在于哺乳动物的细胞表面和细胞外基质中。GAGs的糖链骨架主要由己糖醛酸或半乳糖与己糖胺连接的重复二糖单元组成。根据糖苷键连接形式、硫酸化程度以及硫酸化位置的不同,可以将GAGs分为肝素/硫酸乙酰肝素（Heparan sulfate,HS）、硫酸软骨素/硫酸皮肤素（Dermatan sulfate,DS）、硫酸角质素和透明质酸四类。与其他GAGs相比,肝素和HS具有更多变的硫酸化位点和高的负电荷密度,并在生物体内参与多种生物学过程的调控,使其成为GAGs家族中结构最复杂且重要的一类多糖。由于GAGs糖链的分子量大、结构组成复杂,对于糖链结构的表征十分困难。目前,大多数分析方法都集中在对多糖整体的组成单元或寡糖片段的分析上,对于较高分子量的糖链由于色谱分离的分辨率较低难以被具体表征,而GAGs与其靶蛋白的相互作用通常需要一定的糖链长度。因此,本研究的第一个目标是开发适用于较大GAGs糖链的结构表征方法,为直接阐明这些具有更重要生物意义的相对较大的糖链结构提供强有力的工具。GAGs在许多生物过程中起至关重要的作用,包括细胞信号转导、识别、迁移和粘附等。在人体内,GAGs还参与多种疾病的发生和发展,例如肿瘤、炎症和传染性疾病。并且,GAGs还具有广泛的生物学活性,包括抗炎、抗凝、抗肿瘤转移和控制血管生成等。除了作为生物体内重要的活性物质外,GAGs也作为一类重要的生物药物在临床广泛使用了数十年。此外,用于治疗各种急性或慢性疾病的新型的GAGs药物也在持续不断的开发中。GAGs具有上述重要功能主要依赖于其与蛋白的相互作用,两者间的相互作用是通过各自结构中的特征序列特异性识别实现的。例如肝素的抗凝血作用是通过糖链中的一个特定的含有3-O-S的核心五糖序列与抗凝血酶III特异性结合实现的。因此,阐明GAGs与蛋白相互作用中的关键序列和分子机制对于寻找特定靶向GAGs-蛋白相互作用的新型疗法至关重要。本研究的第二个目标是以质谱（Mass spectrometry,MS）为主要技术手段,开发一套GAGs与蛋白相互作用分子机制的研究策略。我们选择以肝素及其相互作用蛋白干扰素-γ（Interferon-γ,IFN-y）作为模式研究对象,从糖链长度和序列等方面阐明肝素与IFN-γ相互作用的分子机制,为更多GAGs与蛋白相互作用的研究提供快速准确的分析策略。本论文的主要研究成果如下:1.建立了一套聚丙烯酰胺凝胶电泳（Polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE）与MS联用的糖链分析方法PAGE是表征GAGs结构和性质的强大工具之一,相比于液相色谱方法具有更广泛的糖链分子量分布适用范围,但由于未能提供糖链结构信息,PAGE的应用十分受限。为此,我们将蛋白胶内酶解的策略应用到GAGs的分析中,利用聚丙烯酰胺凝胶可以脱水收缩及吸水溶胀的特点,建立了一套新的GAGs提取方法,将PAGE与具有超高灵敏度的LC-MS/MS结合进行GAGs糖链的表征。通过该方法我们对肝素糖链进行了全面的结构分析。从电泳银染结果看,肝素在PAGE中的分布是连续的,且条带之间没有明显的界限。我们将肝素条带等分成20段,分别进行胶内酶解和LC-MS/MS分析。在其中的12段凝胶中检测到了 8种来源于骨架结构的二糖和3种来源于非还原端（Non-reducingend,NRE）的饱和二糖。根据饱和二糖与骨架二糖的分子量和比例,计算得到糖链的分子量。在PAGE中,肝素糖链的分子量范围为3.9 kDa至46.8 kDa,平均分子量为14.4 kDa,且糖链的迁移距离与分子量的对数成反比关系。在不同的凝胶区间中,肝素糖链的二糖组成基本一致,这表明肝素糖链在PAGE中的分离,不受糖链负电荷密度的影响,按照分子量大小均匀且连续分布。我们还对比了直接酶解和胶内提取方法得到的肝素二糖,两者的二糖组成和含量基本一致,表明PAGE-MS方法能够保证GAGs糖链的结构信息完整。另外,经过方法验证,PAGE-MS方法还具有良好的可靠性和可重复性。PAGE-MS方法结合了 PAGE的高分离能力与MS的高灵敏度和高信息含量,为不同来源的肝素/HS糖链表征以及肝素药物的结构一致性评价提供了强大的工具支持。2.建立了一套琼脂糖凝胶电泳（Agarose-gel electrophoresis,AGE）与MS联用的糖链结构表征方法AGE是另外一种常被用于多组分GAGs糖链的直接分离分析的电泳方法。但由于凝胶性质不同,肝素酶难以进入琼脂糖凝胶,胶内酶解方法对AGE并不适用。因此,我们开发了一套针对AGE的样品提取方法。该方法是基于琼脂糖凝胶在相对较低的温度下加热即可熔化的特点实现的。含有糖链的AGE条带加热熔化为液体,经过强阴离子交换（Strong anion exchange,SAX）瞬时离心柱回收以及GAGs酶处理,得到的组成单元使用LC-MS/MS进行定性和相对定量分析,实现各组分糖链结构的表征。应用这一方法,我们选择了一种具有代表性的多分组GAGs药物舒洛地特进行结构分析。舒洛地特在琼脂糖凝胶中具有三个明显的条带,包括快速移动肝素（Fast-movingheparin,FMH）和DS两个主要的组分,以及含量极少的慢速移动肝素（Slow-movingheparin,SMH）。三个条带分别使用SAX提取和肝素酶或硫酸软骨素酶降解,最后经过优化后的LC-MS/MS方法分析。在FMH中,共定性和定量到17种基本组成单元,分别来自糖链的NRE、中间骨架、核心五糖及还原端（Reducingend,RE）结构。根据末端和骨架结构的比例计算,FMH的平均分子量为10.7 kDa。而在SMH中,共有13种结构被定量,平均分子量为15.4 kDa。根据两者的硫酸化程度判断,SMH具有更典型的肝素结构,FMH则可以看作是分子量较低的低硫酸化肝素。DS的糖链结构相对简单,共鉴定到13种基本组成单元,平均分子量为19.9 kDa。根据LC-MS/MS定量的舒洛地特的三个组成比例与AGE凝胶直接染色得到的结果基本一致。此外,我们还首次应用了核磁技术的一种扩散排序谱（Diffusion-ordered spectroscopy,DOSY）分析了舒洛地特,在谱图的不同扩散系数范围内分别归属到了肝素/HS和DS的特征信号峰,估算两者比例约为3:1,这一结果与AGE-MS方法得到的组成一致。AGE与MS与DOSY方法为直接表征多组分GAGs样品提供了新思路。3.采用氢氘交换-MS 法（Hydrogen/Deuteriumexchange-MS,HDX-MS）研究不同聚合度肝素糖链与IFN-γ的相互作用糖链长度是GAGs与蛋白相互作用的关键因素之一。我们将HDX-MS方法应用到不同聚合度肝素糖链与IFN-γ的相互作用的研究中,通过对不同肽段氘代率的变化和IFN-γ三维构象的分析,阐明两者的结合模式。首先从IFN-γ酶解产物中筛选出10条长度合适且能覆盖氨基酸全序列的肽段用于后续分析,其中包含文献报道的两个已知的肝素结合域D1（KTGKRKR）和D2（RGRR）。然后对氘代时间、肝素与IFN-γ结合比等条件进行优化,再将不同糖链长度的肝素与IFN-γ分别进行HDX-MS分析,计算得到各条肽段的氘代率变化曲线,并将它们分为稳定型、持续下降型、平台稳定型及多平台下降型四类。根据各类肽段氘代率的变化趋势与其在IFN-γ蛋白空间位置、碱性氨基酸分布及分子长度相结合,推测出当糖链长度较短时,糖链与IFN-γ表面的碱性氨基酸簇相互吸引;随着糖链长度增长,糖链在与D1相互作用的同时还向IFN-γ二聚体的另一侧延伸;当糖链长度达到dp20左右时,可以同时覆盖IFN-y二聚体的两个D1区域;并在dp28时糖链与二聚体的构象达到稳定,部分肽段的氘代率不再发生变化,同时糖链开始进一步固定D2区域。在此过程中,IFN-γ的局部构象也因相互作用发生了改变。GAGs与蛋白的HDX-MS分析,不仅可以得到蛋白的特征结合域和构象变化等信息,还可以阐明不同聚合度糖链与蛋白的结合方式,为GAGs与蛋白相互作用的研究提供了强有力的技术支持。4.表征了肝素与IFN-γ相互作用的糖链序列结构GAGs糖链中包含的特殊序列对多糖与蛋白的结合至关重要。我们基于亲和色谱、质谱以及计算机技术,对肝素糖链中IFN-γ的特征结合序列进行了表征。不同聚合度的肝素糖链首先使用IFN-γ亲和柱富集得到具有亲和性的糖链,经LC-MS分析,与未经富集糖链相比,亲和糖链的糖链长度和硫酸化程度较高。分离得到亲和糖链中的dp8进行测序分析。为了解决MS/MS测定复杂混合寡糖序列的难题,我们开发了一款计算机辅助测序软件,该软件是将相同聚合度的混合糖链的二糖组成经过排列组合和概率计算,得到所有可能的糖链序列及其相对含量。亲和dp8经过计算机软件计算和二级质谱测序,最终得到5个确定的糖链序列。这些结构都包含一个五糖序列“-GlcNS6S-IdoA2S-GlcNS6S-IdoA2S-G1cNS6S-”,这一结构无论从单糖个数、硫酸化程度还是序列对称性都满足与二聚体IFN-γ的任意一个D1区域相互作用。并且,在亲和dp24中,含有两个能分别与二聚体IFN-y的两个D1相互作用五糖序列的糖链含量比未经富集的糖链增加了 1.7倍,这一结果也从侧面说明糖链与IFN-γ两个C末端相互作用需要至少两个全硫酸的五糖结构。另外,IFN-γ与五糖序列的分子对接结果表明,糖链主要与D1区域结合,且更易受到IFN-γ两个C端中心区域的碱性氨基酸吸引。两者的结合是由静电力主导,并且D1区域中的四个碱性氨基酸残基和五糖中几乎所有的酸性基团都参与了两者的相互作用。计算机对接结果进一步说明肝素糖链中的五糖结构在两者结合中的重要性。这一序列的发现为设计人工干预IFN-γ的靶向药物提供了重要的理论依据。同时,亲和色谱、计算机辅助测序和质谱测序以及分子对接相结合的分析策略也可以用于更多GAGs特征序列的研究。
刘彩芸[2]（2020）在《三种肝素酶Ⅰ的克隆表达及性质研究》文中研究指明肝素酶Ⅰ（Hep Ⅰ）是一种可以特异性将肝素降解为低聚糖或不饱和二糖的多糖裂解酶,可用于低分子量肝素的制备,体外循环中肝素的消除以及肝素精确结构的确定。本文选择了三种不同来源的肝素酶I,构建可溶性表达肝素酶I的大肠杆菌表达系统,制备了三种重组肝素酶I,对其表达过程和酶学性质进行研究,并对肝素酶I与底物肝素的作用方式进行了初步探索,主要研究内容包括:1)选择来源于Bacteroides eggerthii VPI T5-42B-1、Bacteroides xylanisolvens SDCC 2a和Bacteroides cellulosilyticus DSM 14838的三种肝素酶I,分别命名为BeHep Ⅰ、BxHep Ⅰ和BcHep Ⅰ,各自编码394、381和389个氨基酸残基。成功构建了三种pET-28a-Hep Ⅰ表达载体,通过E.coli BL21（DE3）表达可溶性肝素酶I。2)对三种重组肝素酶Ⅰ进行表达研究。诱导BeHep Ⅰ的最适IPTG浓度为0.1mM,温度为30℃,诱导时长为6 h,得到的粗酶活力为5038 U·L-1。经镍柱亲和纯化后,得到了一条分子量为42.23 kDa的明显目的蛋白条带。其比活力为480 U·mg-1。BxHep Ⅰ的最佳表达条件为:0.2 mM的IPTG在25℃诱导7 h,得到的粗酶活力为7144 U·L-1。镍柱亲和纯化得到一条分子量为43.06kDa的目的蛋白条带,比活力为57.6 U·mg-1。BcHep Ⅰ的最适表达条件为:0.05 mM IPTG在30℃诱导表达12 h,得到的肝素酶I粗酶总活为7005.4U·L-1。通过Ni-NTA纯化后,SDS-PAGE结果显示得到了单一的目的蛋白条带,比活力为639.5 U·mg-1。3)对三种重组肝素酶Ⅰ的酶学性质进行研究。BeHep Ⅰ在40 mM,pH 7.5的Tris-HCl缓冲液中相对酶活力最高。BeHep Ⅰ的最适反应温度为30℃,在此温度下半衰期为350 min。1 mM Ca2+对BeHep Ⅰ活力具有69%的提升作用,而Zn2+可以完全抑制BeHep Ⅰ的活性。BeHep Ⅰ的Km值为3.6 mg·mL-1,Vmax为647.93 U·mg-1。BeHep Ⅰ在4℃储存一周后活力可以保持89.1%。BxHep Ⅰ最适反应温度和pH为:35℃,pH 7.5。Ca2+和Mg2+可以促进BxHep Ⅰ的酶促反应速率,而Zn2+和Co2+抑制BxHep Ⅰ的活力。BxHep Ⅰ的Km值为0.79mg·mL-1,Vmax为124.58 U·mg-1。BxHep Ⅰ在30℃保温时半衰期为597 min,37℃下半衰期约为158 min。在4℃储存7天后,肝素酶I活力为初始活力的73%。BcHep Ⅰ在35℃,pH 7.5的条件下能够达到最高的比活力。Ca2+、Mg2+和Mn2+对酶活力有不同程度的促进作用,而Co2+和Zn2+使酶活力降低。BcHep Ⅰ的Km值为0.17 mg·mL-1,Vmax值为740.58 U·mg-1。BcHep Ⅰ在30℃半衰期为300 min,37℃半衰期为59 min。BcHep Ⅰ在4 o C和-20℃储存3天后,活力均能够保持81%,在4℃储存时半衰期约为10天。4)通过同源建模和分子对接分析肝素酶Ⅰ与底物肝素的作用方式。对BeHep Ⅰ而言,肝素通过Lys99、Arg101、Gln241、Lys270、Asn275和Lys292六个高度保守的氨基酸残基与BeHep Ⅰ进行结合,形成的8个氢键较BsHep Ⅰ和BtHep Ⅰ中形成的氢键短,说明了BeHep Ⅰ活力较高;建模之后BeHep Ⅰ的构象熵较小,验证了该酶的稳定性良好。BxHep Ⅰ与肝素通过Asn25、Gln27、Arg88、Lys116、His156、Arg161、Gln228、Tyr356、Lys358和Tyr362十个氨基酸残基进行结合,BxHep Ⅰ与肝素之间形成的13个氢键增强了蛋白-配体的稳定性,最小的构象熵也证明了BxHep Ⅰ优良的稳定性。而Arg88、His156、Tyr356和Tyr362这四个残基形成较大的空间位阻,阻碍了蛋白与配体的结合,因而降低了酶与蛋白的亲和力以及酶的催化活力,这解释了BxHep Ⅰ的Km值较大,比活力较低的原因。BcHep Ⅰ与肝素的结合涉及Gln15、Lys74、Arg76、Lys104、Arg149、Gln208、Tyr336、Tyr342和Lys338九个氨基酸残基,与底物肝素形成了11个氢键,且结构中不含侧链较大的His,避免了额外的空间位阻的形成,因而相比于BeHep Ⅰ和BxHep Ⅰ,Km值更小,比活力更高。
王浩[3]（2020）在《糖胺聚糖硫酸软骨素和肝素裂解酶的重组表达与分子改造》文中指出硫酸软骨素和肝素是存在于动物组织细胞外基质和细胞表面的一类糖胺聚糖,具有重要的生物学功能。其中,硫酸软骨素与氨基葡萄糖及胶原蛋白配合使用能够有效缓解关节疼痛,而肝素主要作为抗坏血栓及术后的抗凝血药物。近年来研究发现,低分子量硫酸软骨素和低分子量肝素更容易被机体吸收利用,具有更高的生物活性。目前,商业化的低分子量硫酸软骨素和低分子量肝素主要由化学降解法生产。尽管化学工艺已经十分成熟,但也存在脱磺酸化破坏结构、产品单一性差、环境污染等问题。相比于化学降解法,生物酶解法具有反应条件温和、无污染、工艺简单、产品分子量易于控制、不会破坏硫酸活性基团等优势。因此,采用生物酶解法生产低分子量硫酸软骨素和低分子量肝素是一种新型的绿色生产方式。本论文主要从酶的表达及性能两个层次对硫酸软骨素裂解酶ABC I及肝素裂解酶Ⅲ进行研究。主要研究结果如下:（1）硫酸软骨素裂解酶ABC I及肝素裂解酶Ⅲ在大肠杆菌中的重组表达。将Proteus vulgaris硫酸软骨素裂解酶ABC I（cs ABC I）的核苷酸序列按照大肠杆菌密码子偏好性进行密码子优化,构建了表达cs ABC I的重组菌。结果表明,在RSF 1030高拷贝复制子、T7启动子条件下,重组cs ABC I能够高效表达,但主要以包涵体的形式存在。通过在N端融合麦芽糖结合蛋白促溶标签后,蛋白的可溶表达水平有明显的提高。进一步通过定点突变（I309V）提高了cs ABC I的催化活力。在此基础上,通过信号肽筛选实现了重组蛋白的胞外分泌,其中omp A信号肽的分泌效率最高,胞外酶活为3.2×102 U·L-1。进一步敲除外膜脂蛋白基因lpp,胞外酶活达到5.0×102 U·L-1。通过优化诱导剂和接种量,胞外酶活达到1.4×103 U·L-1。另外,在优化的培养条件下也实现了Flavobacterium heparinum肝素裂解酶Ⅲ（Fhep Ⅲ）和Bacteroides thetaiotaomicron肝素裂解酶Ⅲ（Bhep Ⅲ）的可溶表达。通过对两者的酶学性质比较分析,发现Bhep Ⅲ表现出更高的催化性能和热稳定性,具有更大的优势用于未来低分子量肝素的酶法生产。（2）硫酸软骨素裂解酶ABC I的热稳定性改造。基于B-factor的柔性loop截短,发现删除N端结构域中的R166-L170柔性片段提高了cs ABC I的热稳定性。截短突变体NΔ5的t1/237℃为18 min,相比于对照（4.6 min）提高了2.9倍。在此基础上,基于Consensus的定点突变和定点饱和突变,发现E694P突变显着提高cs ABC I的热稳定性。突变体NΔ5/E694P的最适反应温度为35℃,相比于NΔ5和对照（30℃）提高了5℃;t1/237℃为19 h,相比于突变体NΔ5（18 min）提高了62倍,相比于对照提高了247倍,远高于目前文献报道的最高水平。突变体NΔ5/E694P的比酶活为57.6 U·mg-1,相比于对照(24.7 U·mg-1)提高了133%;kcat/Km为544.1 m L·mg-1 s-1,相比于对照(121.9 m L·mg-1s-1)提高了346%。3-L发酵罐分批发酵,表达突变体NΔ5/E694P的重组菌酶活达到1.0×105 U·L-1。（3）肝素裂解酶Ⅲ的催化性能改造。通过对活性口袋的半理性设计,鉴定出Ser264与Asp321是影响Bhep Ⅲ热稳定性与催化性能的两个关键氨基酸残基。单点突变体S264F的t1/250℃为3.8 h,相比于野生型（2.7 h）提高了40%,kcat/Km为124.7 m L·mg-1 min-1,相比于野生型(164.2 m L·mg-1 min-1)降低了24%;单点突变体D321Q的t1/250℃为2.2 h,相比于野生型降低了19%,kcat/Km为276.6 m L·mg-1 min-1,相比于野生型提高了69%;组合突变体S264F/D321Q的kcat/Km为566.8 m L·mg-1 min-1,相比于野生型提高了245%,t1/250℃为2.0 h,相比于野生型降低了26%。进一步通过对底物通道电势改造,获得了E105R单点突变体,其kcat/Km为735.7 m L·mg-1 min-1,相比于野生型提高了348%,t1/250℃为2.2 h,相比于野生型降低了19%;组合突变体E105R/S264F的kcat/Km为851.6 m L·mg-1min-1,相比于野生型提高了418%,t1/250℃为2.7 h,与野生型一致。3-L发酵罐分批发酵,表达突变体E105R/S264F的重组菌酶活达到2.9×104 U·L-1。（4）硫酸软骨素裂解酶ABC I在枯草芽孢杆菌中的高效表达及在低分子量硫酸软骨素制备中的应用。通过比较游离质粒与基因组整合表达两种形式,发现游离质粒更适合突变体NΔ5/E694P的高效表达。通过将诱导型启动子Pxyl A替换成组成型启动子Pspov G,重组菌酶活达到9.8×103 U·L-1。通过在基因N端插入一段45 bp的gln A编码序列,重组菌酶活提高到1.2×104 U·L-1,提高了22%。通过优化5’UTR序列,重组菌胞内酶活进一步提高到3.8×104 U·L-1,提高了217%。3-L发酵罐分批发酵,重组菌酶活达到5.0×104 U·L-1,比摇瓶水平提高了32%。通过控制加酶量及解聚时间可以制备低分散系数的低分子量硫酸软骨素。
朱梦[4]（2020）在《具有不同ATⅢ亲和力依诺肝素组分的分离制备与结构解析》文中认为肝素是临床中使用历史悠久的抗凝药物,它主要是通过与抗凝血酶Ⅲ（ATⅢ）结合后与凝血因子十因子（FXa）生成三元络合物,发挥抗凝血作用的。然而,肝素与ATⅢ的结合物还可以与凝血酶Ⅱa因子结合生成三元络合物,导致出血等副作用。依诺肝素,作为重要的低分子量肝素之一,由肝素降解所得,分子量较小,其在一定程度上保持了与ATⅢ和FXa因子结合成三元络合物达到抗凝血作用的能力,同时极大减少了其与ATⅢ结合后和凝血酶Ⅱa形成复合物的能力,进而降低了其临床出血副作用的风险。目前,依诺肝素在实际临床使用中被广泛应用。肝素是由重复二糖单元组成的直链多糖物质,主要的二糖单元是2-硫酸化艾杜糖醛酸1,4连接6,N-硫酸化氨基葡萄糖（约占60-70%）,同时还含有多种少量其它二糖单元。较大的分子量和不均一的分子量分布、复杂的糖基组成和不完全硫酸化使得肝素结构异常复杂。依诺肝素相对于肝素虽然分子量减小了,但由于工艺原因糖链末端增加了不饱和糖醛酸和2-5位脱水结构,这使得依诺肝素的结构较肝素更加复杂和多样。在此前提下,依诺肝素中复杂的糖链体系与ATⅢ结合情况研究对阐述依诺肝素的有效性和安全性就显得格外重要。但是,由于依诺肝素结构的复杂性和微不均一性以及其分析方法的限制等原因,目前针对依诺肝素中与ATⅢ不同亲和力组分的结构研究仍然十分有限。为了对比依诺肝素中与ATⅢ具有不同亲和力的依诺肝素组成的结构差异,找出其抗凝活性的发挥与其结构之间的关系,本课题建立了亲和层析系统来分离制备与ATⅢ具有不同亲和力的依诺肝素钠组分,并对不同组分进行初步的活性验证以及结构解析,进一步探索了依诺肝素抗凝活性及结构之间的关系,为依诺肝素结构解析、质量监控、一致性评价工作奠定理论基础。1.本课题通过对亲和层析系统中的ATⅢ蛋白制品、亲和层析色谱规格等进行了筛选,最终建立了亲和层析制备系统,并成功分离收集了一定量与ATⅢ具有低、中、高亲和力的依诺肝素组分。2.对制备所得的依诺肝素组分进行初步的活性验证和结构解析,其活性测试结果显示随着依诺肝素组分与ATⅢ亲和力的提高,其抗FXa活性也随之增强。3.本课题利用肝素酶降解后的强阴离子分离高效液相分析法、多反应检测扫描-三重四极杆质谱分析法（MRM-QQQ）等对不同依诺肝素组分进行了细致的结构解析,其结果显示,不同组分的二糖寡糖组成呈现一定的差异及规律,虽然各组分降解产物中主要组成仍是8个常见肝素二糖,但随着依诺肝素组分与ATⅢ亲和力的提高,其二糖组成含量有所降低,其含有三位硫酸化的不能被肝素酶彻底降解的四糖含量随之增加,这为依诺肝素抗凝血活性的发挥与其结构之间的关系的验证提供了一定依据。
栗慧超[5]（2020）在《肝素酶Ⅰ在原核工程菌中异源可溶性表达及性质表征的研究》文中认为肝素酶来源于肝素黄杆菌,是一类能够特异性降解肝素和乙酰肝素的多糖裂解酶。目前研究发现,肝素酶在制备低分子量肝素、抑制肿瘤细胞增殖,清除血液中残留肝素等方面具有重要的生物学作用,受到越来越多人的关注。目前研究最多的是肝素酶Ⅰ,肝素酶Ⅰ在重组大肠杆菌中可溶性表达低,导致其产量较低,纯化较难,成本较高等问题,限制了其在医药方面的应用。因此寻找合适的方法来提高肝素酶Ⅰ的产量和纯度具有重要的意义。分子伴侣素CpkA是从嗜热菌Thermococcus kodakarensis中发现的耐热伴侣蛋白,具有辅助蛋白折叠功能和ATPase活性。本文构建重组质粒pACYC-CpkA和切去前导肽并加上带正电signal-tag的HepI’-28a质粒,并以单转或共转化形式转入大肠杆菌E.coli DE3（BL21）中诱导表达,通过镍柱纯化,除盐柱除盐,阳离子交换柱层析等优化纯化方式获得可溶性的HepI’蛋白;同时在E.coli DE3-RIPL中原核表达分子伴侣素CpkA,经85℃热处理1h、饱和度为80%的硫酸铵沉淀、透析除盐和阴离子交换柱层析,获得高纯度CpkA蛋白;利用本文制备的分子伴侣素CpkA蛋白在体外与HepI包涵体蛋白进行尿素梯度复性研究;实验结果表明:去除前导肽后,肝素酶Ⅰ的可溶性表达量明显增加,与CpkA共表达后,包涵体蛋白进一步较少,最终纯化得到大小为43 kDa,纯度90%以上,最大浓度为0.404 mg/ml的HepI’蛋白,酶活为27.16 IU/mg;原核表达获得大小为59.17kDa,纯度为93%以上,浓度为2.706 mg/ml的CpkA蛋白,其ATPase活性为539IU/mg;利用纯化的CpkA蛋白帮助HepI包涵体蛋白进行体外尿素梯度梯度复性,包涵体蛋白回收率约为50%,复性蛋白无明显肝素酶Ⅰ活性。本研究工作为肝素酶Ⅰ的大量制备提供了一种新的方法,为肝素酶Ⅰ在医药方面的广泛应用奠定了物质基础。也为分子伴侣素CpkA能够在体内环境下帮助异源蛋白折叠提供了实验依据。
崔雪莹[6]（2020）在《低分子肝素活性寡糖链的质谱表征与模拟测序》文中认为尽管早在100年前肝素已被一名医学研究生发现,但作为临床抗凝血剂,它的结构至今没有完全被阐明。肝素及硫酸化程度更低的硫酸乙酰肝素是复合单位构成的不同聚合度的非分支多糖混合物。复合单位为C2位可发生磺基化取代的艾杜糖醛酸或葡萄糖醛酸通过1→4糖苷键连接C3位、C6位、N位可以发生磺基化取代或N位可以发生乙酰化取代的葡糖糖胺。肝素在临床不仅用作抗凝剂治疗动脉血栓,静脉血栓,毛细管血栓,在手术过程中防止血液凝固,还对于癌症,老年痴呆症和一些传染病的治疗起着关键作用。肝素经酶β-消除裂解法或化学裂解法获得聚合度更低的低分子量肝素,其给药更可控,副反应更少,半衰期更长。其中市场销售份额最高的低分子量肝素是通过化学β-消除裂解法获得的依诺肝素钠。依诺肝素钠通过含稀有三磺基化葡萄糖胺的残基的五糖序列与抗凝血酶Ⅲ结合,加强其对凝血酶和凝血因子X的抑制完成抗凝血,因此只有能与抗凝血酶Ⅲ结合的组分才具有抗凝血活性。天然肝素中该五糖序列仅占很少一部分,再加上低分子肝素制备工艺中的降解和切割,依诺肝素钠中能与ATⅢ结合的糖链仅占总糖链的30%左右。目前对依诺肝素钠的结构研究主要是通过液相色谱法或液质联用法分析其完整糖链分布、基本组成单元和寡糖片段组成,或使用核磁共振波谱法分析其单糖组成和取代的情况。这些分析都局限于对依诺肝素钠整体的表征,未能对发挥抗凝作用的依诺肝素钠活性糖链进行直接的分析,不利于更好的理解依诺肝素钠抗凝血作用的构效关系。随着软电离技术的发展,多级质谱在低分子肝素的测序中发挥着越来越重要的作用,但由于质谱对非挥发性盐离子不耐受,限制了强阴离子交换色谱（SAX-HPLC）与其在线联用。而我们之前开发的离线SAX-HPLC与电喷雾质谱（ESI-MS-MS）相结合的方法需要多次对样品单一组分进行收集和逐一脱盐,自动化程度低,因此建立辅助测序的数据库十分有必要。为了对依诺肝素钠中抗凝血活性有效成分进行表征,解决离线液质联用测序费时费力的缺点,本研究中我们利用抗凝血酶Ⅲ键合琼脂糖珠亲和色谱在不同盐离子浓度下分离依诺肝素钠中的亲和组分与非亲和组分,通过亲水相互作用色谱与质谱联用（HILIC-ESI-MS）对依诺肝素钠中的亲和组分与非亲和组分进行完整糖链指纹图谱分析和基本组成单元分析。采用分子筛色谱分离低聚合度的亲和组分,对低聚和度的亲和组分进行酶解与亚硝酸降解,获得二糖、四糖及糖醛酸的含量信息,在这些实验数据基础上采用数据库模拟的方式推导出亲和糖链可能的序列及其比例。本研究为深入理解低分子肝素的构效关系提供了新的方法,对于提升药物评价水准、保障药物安全具有应用价值。
蒋莹子[7]（2019）在《新型肝素酶高产菌的筛选鉴定及其基因的克隆与表达》文中研究指明肝素是一类高度硫酸化的线性糖胺聚糖,具有抗凝血、抗血栓、抗病毒、抗炎症及抗肿瘤等作用,但研究表明,在肝素应用的过程中常伴随着很多不同的副作用,例如肝素诱导性血小板减少、过敏反应等。相对来说,由普通肝素通过裂解得到的相对分子量较低的低分子量肝素和超低分子量肝素不仅具有更高的抗凝血活性,并且副作用更小,因此其研究与制备受到越来越多的关注。目前来说,低分子量肝素类产品主要是通过化学方法制备,该法处理效果过于激烈容易导致肝素结构发生改变,失去生物活性。相比之下,肝素酶裂解法反应条件温和,不影响肝素本身的结构特征,产物得率较高;反应一步完成,且几乎不产生杂质,比较利于下游的分离纯化。因此,肝素类药物的酶法生产研究具有重要的工业化应用前景。肝素酶是一类能够专一性地裂解肝素和硫酸类肝素糖苷键的蛋白质。肝素酶裂解法生产肝素类药物需要解决的关键问题是肝素酶来源狭隘以及酶制备成本高。因此,筛选高产肝素酶的新型微生物以及构建高效表达可溶性肝素酶体系就显得尤为重要。本课题正是基于以上问题,从自然界土壤中分离出产肝素酶的新型微生物——拉乌尔菌Raoultella sp.NX-TZ-3-15并对其发酵条件进行优化研究,对该菌的全基因组测序结果进行分析,得到新型肝素酶的基因序列H1（684 bp）和H2（699 bp）,利用无缝克隆和组装技术直接克隆该新型肝素酶,构建重组质粒导入大肠杆菌,高效表达可溶性肝素酶。本论文主要结果如下:（1）本课题通过对屠宰场附件的土壤进行筛选,得到了一株肝素酶高产菌,并且通过形态观察、对菌株的16S rDNA扩增产物进行测序和BLAST同源性比较,确定该菌株属于拉乌尔菌属（Raoultella sp.）,并将该菌命名为Raoultella sp.NX-TZ-3-15。（2）以Raoultella sp.NX-TZ-3-15为出发菌株,对影响该菌株生长和代谢的发酵培养基成分和培养条件进行了研究,得到了最优的发酵培养基——1%麦芽糖,1%大豆蛋白胨,0.25%KH2PO4,0.025%MgSO4·7H2O,0.2%肝素钠;以及最优培养条件——初始pH 9.5,10%接种量,37℃,200 rpm,24 h。（3）将Raoultella sp.NX-TZ-3-15进行全基因组测序,利用生物信息学技术对测序结果进行分析,得到新型肝素酶的基因序列H1和H2。以Raoultella sp.NX-TZ-3-15 DNA为PCR模板获得目的基因H1和H2,再通过无缝克隆与组装技术成功与质粒pBENT构建出重组质粒pBENT-H1和pBENT-H2,并转入大肠杆菌感受态细胞E.coli BLR（DE3）。通过菌落PCR,重组质粒单酶切以及测序等方法对重组工程菌进行验证,结果表明克隆成功。（4）重组工程菌诱导表达结果表明:E.coli BLR（DE3）pBENT-H1和E.coli BLR（DE3）pBENT-H2两株重组工程菌表达的目的蛋白主要在上清液中,均可溶,蛋白分子量大小为25 kDa。E.coli BLR（DE3）pBENT-H1的酶活为1650 U/L,是原菌酶活的4.34倍,但E.coli BLR（DE3）pBENT-H2几乎没有肝素酶活性,在后续研究中,选择E.coli BLR（DE3）pBENT-H1作为进一步的研究对象。（5）E.coli BLR（DE3）pBENT-H1的诱导条件优化研究结果表明,其诱导和表达肝素酶的最优条件为:在37℃,200 rpm条件下培养3.5 h至菌液OD600为0.7左右时,加入IPTG（100 mM）至终浓度为0.25 mM,30℃,200 rpm诱导8 h,肝素酶酶活最高可达2140 U/L。
欧阳艺兰[8]（2019）在《肝素分子量和组成分析方法开发及两种肝素物质的结构解析》文中指出肝素类药物是目前临床应用最为广泛的抗凝剂,主要应用在深度抗凝、透析、外科手术等领域。据不完全统计,2018年全球肝素类药物的销售额突破了 150亿美元。目前肝素主要以猪小肠内壁粘膜为主要原料,通过提取、纯化等一系列制备工艺获得,是目前依然在临床应用的最古老生化药物之一。肝素是一类硫酸多糖药物,与其它多糖一样,肝素有着较大的分子量、一定的分子量分布、不同的糖基组成和硫酸化位置等,它是目前结构最复杂的临床药物之一。然而,其广泛的临床应用和复杂结构体系导致的大量分析问题之间有着巨大的矛盾,这些矛盾一直困扰着药物分析学家们。简言之,目前对其结构的“一知半解”限制了肝素类药物的质量控制、临床用药安全性、新适应症的拓展及基于肝素结构的新药研究与开发的研究。特别是,2007-2008年肝素污染事件的发生,最大程度地激发了该矛盾,暴露了当时肝素类药物有效质量控制方法的缺失问题。此后,肝素类药物分析方法的建立和结构特点研究成为了药物分析领域的热点之一。其中,由肝素制备的低分子量肝素（LMWHs）和具有广泛生物学活性的非抗凝肝素（NACHs）是最具典型特点的两种肝素类物质,它们的结构研究就成为了该领域的焦点。本课题围绕分子量、含量和组成分析方法的建立及肝素、LMWHs和NACHs的结构解析展开了系统的研究工作,简述如下:1、建立和优化肝素分析方法,首先建立针对肝素类药物分子量和含量的分析方法。该方法利用分子排阻色谱与多角度激光散射/示差（SEC-MALS/RI）可以在无需标准品的状态下准确、直接地分析肝素类多糖的分子量、分子量分布和含量。相对常规GPC方法,不再受同系列物质分子量标准品的限制。同时,利用分子排阻色谱与电感耦合质谱联用（SEC-ICP-MS）对肝素的阳离子进行定性定量分析,实现肝素类药物等酸性多糖的准确分子量和含量有效校准,是现有GPC方法的重要补充和提高。接着我们利用亲水间相互作用色谱质谱联用（HILIC-MS）建立了一种肝素二糖组成分析方法。该方法有极高的分辨率,可以将常规和罕见的肝素类药物结构单元进行有效的分离和鉴定,包括常规二糖、抗凝活性相关的3-O-硫酸化四糖、肝素和蛋白连接域四糖及其衍生物等16种结构组成单元。该方法可有效用于肝素类药物结构解析、质量控制、工艺研究等领域。此外,我们还利用等电点聚焦毛细管质谱联用（CIEF-MS）建立了另一种二糖分析方法。该方法是首次基于被测物等电点（pI）差异分离肝素二糖乃至寡糖的反极性CIEF-MS应用,该方法是电荷异质性复杂酸性寡糖的潜在的高灵敏度分析方法。2、对不同动物来源、厂家、生产时期的肝素和依诺肝素钠（临床应用最广泛的低分子量肝素）结构进行深入研究和对比。主要内容包括对不同动物来源、厂家、生产时期的肝素和低分子量肝素的寡糖分布、组成和结构进行系统对比分析。深入地阐述了肝素和低分子量肝素的结构特点,有效地阐述了不同原料来源、生产厂家和生产时期的肝素和低分子量肝素结构差异与原料来源、厂家、生产时期以及抗凝活性之间的关系。3、对非抗凝肝素结构进行了深入的研究。主要内容包括综合利用二糖分析方法、top-down和bottom-up序列分析手段详细阐明了由抗凝肝素制备产生的非抗凝肝素的结构特点和差异。同时,SPR研究显示可与几种不同的重要蛋白因子有不同的结合能力,该结果显示了广泛的非抗凝肝素的潜在临床应用。本课题中肝素类药物分析方法的建立和应用,完善或拓展了肝素产品的质量控制方法。对肝素、低分子量肝素和非抗凝肝素的结构特点进行深入阐释,为肝素类药物的生产、工艺优化、质量控制、新适应症拓展和新药开发提供了坚实的理论基础。
马丽娜[9]（2019）在《肝素调节激肽释放酶抑制剂活性的结构生物学机制研究》文中研究指明激肽释放酶-激肽系统（Kallikrein-Kinin System）参与人体血压调控以及凝血等多种生理过程,它的紊乱与炎症和心血管高血压等疾病的发生发展密切相关[1,2]。该系统中激肽释放酶（Kallikrein）能切割激肽原（Kininogen）并释放激肽（Kinin）,可以结合血管内皮细胞表面的激肽受体从而刺激血管舒张。激肽释放酶抑制剂（Kallistatin,KAL）可以特异性地抑制Kallikrein的蛋白酶活性,而且它们之间的相互作用受到肝素的调控,但是这些KAL相关的结构生物学机制尚不明确。在本论文研究中由此我们制备了重组人源KAL蛋白并解析了它不同构象的及其与肝素复合物的晶体结构,阐述了肝素调节其抑制蛋白酶活性的分子机制。我们分别用大肠杆菌和HEK293细胞表达体系制备了重组人源KAL蛋白,并解析了的3种KAL晶体结构——天然构象的KAL（Native-KAL,糖基化,分辨率2.5 A）、剪切构象的KAL（Cleaved-KAL,无糖基化修饰,分辨率1.9A）以及分辨率为1.8A的剪切构象KAL与肝素复合物的晶体结构。我们发现天然KAL具有典型的丝氨酸蛋白酶抑制剂（SERPIN）家族的亚稳态构象,含有一个中心片层结构以及一个暴露在分子表面的反应活性中心环（RCL）,同时这个RCL部分插入到该蛋白的中心片层结构中,使其呈部分开放状态。而且一旦这个暴露于分子表面的RCL被蛋白酶切割,该中心环会全部插入到KAL的中心片层结构中,形成一个超稳态的Cleaved-KAL构象。这种典型的丝氨酸蛋白酶抑制剂构象的转换是该家族成员抑制其靶蛋白酶活性所共有的。与其它SERPIN家族蛋白相比,KAL的Hα螺旋（hH）和β片层结构C的第二层（s2C）之间具有4个额外的氨基酸（R306KRN309）,且这些氨基酸形成了一个独特的310螺旋结构。由于这个310螺旋与相邻氨基酸W254、R256、F277和Y311形成的阳离子-π键紧密堆积,使得该螺旋相对比较稳定。同时,肝素和KAL复合物晶体结构显示肝素特异性地结合于KAL的这个独特的310螺旋附近。其中KAL的R259与肝素寡糖的磺酸基团形成3个离子键,R300与肝素寡糖磺酸基团形成2个离子键。定点突变及相关肝素结合能力的分析显示,KAL的K307、R308、K313、K313、R259、R300、R394和H395都参与了肝素的相互作用,其中对肝素结合影响最大的氨基酸为 R256 和 R394。前人的研究结果显示KAL可以特异性地抑制激肽释放酶1（KLK1）且肝素可以完全抑制这两个蛋白之间的相互作用,但这种肝素介导的抑制机制并不清楚。这里我们首先验证了这一现象,同时我们发现KAL也可以抑制激肽释放酶7（KLK7）的活性,且非常有意思的是,肝素促进了 KAL和KLK7的反应速率约23倍,这使得KAL成为目前报道的最有效的KLK7抑制剂。针对肝素的这种对蛋白酶依赖的调节方式,我们系统分析了 KLK1和KLK7的分子表面特性,并进行了相关定点突变和酶动力学研究。首先我们发现肝素分子对KAL和KLK7相互作用的促进取决于KLK7分子表面70-80 loop区域的带正电荷的氨基酸,突变这些氨基酸会导致肝素促进功能的丧失;同时我们发现肝素分子的长度也影响这种促进作用,含有8个或更多寡糖的肝素分子才具有促进活性。这表明肝素分子是通过同时结合KAL和KLK7这种传统的“模板机制”来促进这两个蛋白之间的反应的。其次我们发现KLK1是一个酸性蛋白酶,其分子表面富含负电荷。如果将KLK1的70-80 loop突变为相应的KLK7区域,肝素就可以有效促进KAL对这一 KLK1突变体活性的抑制,这揭示由于肝素分子富含负电荷,当它结合在KAL分子表面,它可以通过“静电排斥”的方式阻止KLK1与KAL的结合。综上所述,KAL通过典型的SERPIN家族蛋白质构象的转换来抑制它的靶蛋白酶;同时肝素分子可以特异地结合与KAL分子表面独特的310螺旋附近,通过“模板机制”或者“静电排斥”的方式调节KAL的蛋白酶特异性;另外这项研究也说明在生理情况下,结合在内皮细胞表面肝素分子上的KAL是一个专一的KLK7的抑制剂。这些研究后续通过肝素来调节激肽释放酶-激肽系统提供了可能,也为应用肝素和KAL来治疗KLK7过多导致的相关鱼鳞癣病变（Netherton Syndrome）奠定了基础。
王建全[10]（2017）在《叶酸功能化的肝素和聚苯炔纳米粒子在肿瘤治疗中的应用》文中进行了进一步梳理近年来,随着纳米技术在医学中的广泛应用,高分子纳米载体越来越多地应用在医学诊断以及靶向性治疗方面,并取得了较大的发展。但是在临床治疗方面仍然存在很多问题需要解决,其中之一就是对于纳米载体在体内生理条件下的复杂行为、详细的动力学以及作用机制研究较少,尤其是一些天然生物高分子载体因其在体内循环时间比较短而被忽略研究,如肝素、壳聚糖等,进而影响到纳米载体的合理设计与开发。另一方面就是针对癌症患者个体差异缺乏有效的早期诊断技术手段,因此,迫切的需要开发新型的纳米探针以及治疗手段来解决。本论文首先探究了叶酸修饰的纳米化肝素在抗肿瘤治疗上与天然肝素、低分子量肝素及化学修饰肝素的差异,以及其在抗肿瘤生长与转移中的机理探究,证实了高分子纳米肝素的优越性,并且设计合成了两个基于肝素叶酸载体的纳米铂药,即被动靶向性肝素顺铂纳米粒子（HDDP）与主动靶向性肝素叶酸-顺铂纳米粒子（HFDDP）。分别考察了HFDDP与HDDP纳米粒子在体内的抗肿瘤效果与药物代谢动力学性能,最后我们利用癌症靶向分子叶酸以及共轭聚合物聚苯炔,采用纳米共沉淀方法制备了水溶液的纳米荧光探针,研究了其在生物体内成像的应用,具体内容如下:（1）我们利用靶向性分子叶酸对天然高分子肝素进行改性,发现修饰后的肝素能够在水溶液中进行自组装反应,形成尺寸为20nm左右,比较均一的球形纳米粒子。我们研究了该叶酸修饰的纳米化肝素与标准肝素、低分子量肝素在抗凝血以及抑制肿瘤生长以及转移的区别,并对其机制进行了初步的研究,结果表明叶酸修饰后的肝素不仅具有很好的抗肿瘤生长效果,而且对肿瘤的转移也具有良好的抑制作用,此外还具有良好的生物安全性,该体系的研究为是否能够应用于其他具有生物活性的天然高分子开发提供了依据。（2）在改性后的肝素叶酸纳米粒子的基础上,制备了具有相同纳米尺寸、表面电荷的靶向性和非靶向性的生物纳米铂药,利用ICP-MS定量的方法详细地研究了其在体内的药代动力学与生物分布性差异。研究发现在肝素纳米载体表面添加癌细胞的靶向分子叶酸时,递送至肿瘤的药物量增加一倍,显着地抑制了肿瘤的生长。同时,系统的毒副作用也得到了降低。我们还证明了在治疗效果提升方面,主动靶向性生物载体要优于被动靶向性载体,与合成的在体内循环周期较长的类似物相比,叶酸修饰的靶向性肝素纳米粒子具有相似的治疗效果,而且更容易在体内代谢掉,因此可以作为一种输送药物的纳米载体应用到生物体内。（3）利用化学全合成的方法,我们制备了聚苯炔类（PPEs）导电共轭聚合物,通过叶酸修饰的聚乙二醇-聚己内酯,利用共沉淀方法合成了水溶性的纳米荧光探针。研究发现,改变聚苯炔侧链聚酯的长度,可以减少π-π的堆积作用,进而阻断苯环骨架之间的能量转移,使纳米探针的荧光量子产率从0.14%提高到36%。而且我们证明了这些纳米探针易于用肿瘤靶向性配体修饰,此外,该探针与传统荧光染料（FITC）相比,不仅具有良好的光学稳定性,同时还能够对肿瘤细胞进行靶向性成像,非常有希望能够在未来的其它肿瘤诊断及治疗中发挥巨大作用。以上的研究结果为后期研究以肝素与聚苯炔类聚合物为纳米载体的新型纳米药物和纳米探针提供了全新的思路与方向,对进一步开发具有临床应用价值的相关纳米药物与纳米探针具有重要的意义。
二、低分子量肝素的性质与应用（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、低分子量肝素的性质与应用（论文提纲范文）
（1）基于质谱的糖胺聚糖结构表征及其与蛋白互作分子机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略符号说明 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 糖胺聚糖概述 |
| 1.1.1 糖胺聚糖的结构与功能 |
| 1.1.1.1 肝素及硫酸乙酰肝素 |
| 1.1.1.2 硫酸软骨素及硫酸皮肤素 |
| 1.1.1.3 透明质酸 |
| 1.1.1.4 硫酸角质素 |
| 1.1.2 糖胺聚糖类药物及应用 |
| 1.1.2.1 肝素 |
| 1.1.2.2 低分子量肝素 |
| 1.1.2.3 超低分子量肝素 |
| 1.1.2.4 多组分糖胺聚糖药物 |
| 1.2 糖胺聚糖的分析方法 |
| 1.2.1 电泳 |
| 1.2.2 高效液相色谱法 |
| 1.2.3 质谱法 |
| 1.2.4 核磁共振波谱法 |
| 1.3 糖胺聚糖与蛋白相互作用 |
| 1.3.1 糖胺聚糖与蛋白相互作用中蛋白的结构特点 |
| 1.3.2 糖胺聚糖与蛋白相互作用中糖链的结构特点 |
| 1.4 糖胺聚糖与蛋白相互作用分析方法 |
| 1.4.1 基于亲和力的方法 |
| 1.4.2 核磁法、X-射线晶体衍射和分子对接 |
| 1.4.3 质谱法 |
| 1.5 论文大纲 |
| 第二章 糖胺聚糖的聚丙烯酰胺凝胶电泳-质谱联用方法研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 试剂与耗材 |
| 2.2.2 主要仪器 |
| 2.2.3 色谱柱 |
| 2.2.4 缓冲液及流动相的配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 肝素寡糖制备 |
| 2.3.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染 |
| 2.3.3 胶内酶解 |
| 2.3.4 AMAC标记 |
| 2.3.5 肝素寡糖LC-MS分析 |
| 2.3.6 C18-MS/MS MRM分析 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 聚丙烯酰胺凝胶电泳分析GAGs |
| 2.4.2 通过胶内酶解将PAGE与LC-MS/MS结合 |
| 2.4.3 LC-MS/MS-MRM方法建立 |
| 2.4.4 LC-MS/MS MRM分析PAGE分离的肝素 |
| 2.4.5 方法验证 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 糖胺聚糖的琼脂糖凝胶电泳-质谱联用方法研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 药品与试剂 |
| 3.2.1 试剂与耗材 |
| 3.2.2 主要仪器 |
| 3.2.3 色谱柱 |
| 3.2.4 缓冲液及流动相的配制 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 DS寡糖制备及质谱鉴定 |
| 3.3.2 琼脂糖凝胶电泳 |
| 3.3.3 糖链的提取及酶解 |
| 3.3.4 HILIC-MS/MS MRM分析 |
| 3.3.5 2D NMR分析 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 琼脂糖凝胶电泳分析多组分GAGs |
| 3.4.2 SAX离心提取及LC-MS/MS方法建立 |
| 3.4.3 LC-MS/MS MRM分析AGE分离的舒洛地特 |
| 3.4.4 方法验证 |
| 3.4.5 舒洛地特的核磁分析 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 不同聚合度肝素糖链与IFN-γ的氢氘交换质谱研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 试剂与耗材 |
| 4.2.2 主要仪器 |
| 4.2.3 色谱柱 |
| 4.2.4 缓冲液的配制 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 肝素寡糖制备 |
| 4.3.2 IFN-γ覆盖度考察 |
| 4.3.3 氘代时间 |
| 4.3.4 IFN-γ与肝素糖链互作比 |
| 4.3.5 不同聚合度糖链与IFN-γ的氢氘交换实验 |
| 4.3.6 数据处理 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 IFN-γ覆盖度考察 |
| 4.4.2 HDX实验条件优化 |
| 4.4.3 不同聚合度糖链与IFN-γ的HDX研究 |
| 4.4.4 糖链聚合度与IFN-γ相互作用的关系 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 肝素与IFN-γ相互作用的糖链序列结构表征 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料 |
| 5.2.1 试剂与耗材 |
| 5.2.2 主要仪器 |
| 5.2.3 色谱柱 |
| 5.2.4 缓冲液及流动相的配制 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 肝素寡糖制备 |
| 5.3.2 装填IFN-γ亲和柱 |
| 5.3.3 IFN-γ亲和柱纯化肝素寡糖 |
| 5.3.4 完整糖链LC-MS分析 |
| 5.3.5 酶解基本组成单元及LC-MS分析 |
| 5.3.6 亚硝酸降解及LC-MS分析 |
| 5.3.7 SAX分离IFN-γ亲和dp8 |
| 5.3.8 IFN-γ亲和dp8 LC-MS/MS测序 |
| 5.4 结果与讨论 |
| 5.4.1 IFN-γ亲和糖链分析 |
| 5.4.2 计算机辅助亲和dp8糖链测序 |
| 5.4.3 LC-MS/MS亲和dp8糖链序列鉴定 |
| 5.4.4 肝素与IFN-γ特异性结合的糖链序列 |
| 5.4.5 亲和dp24糖链序列验证 |
| 5.4.6 分子对接 |
| 5.5 本章小结 |
| 全文总结 |
| 回顾本论文的内容 |
| 本文取得的创新成果 |
| 展望 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文及申请的专利 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（2）三种肝素酶Ⅰ的克隆表达及性质研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.2 研究进展 |
| 1.2.1 肝素酶的来源 |
| 1.2.2 肝素酶的种类 |
| 1.2.3 肝素酶的催化机理 |
| 1.2.4 肝素酶I的克隆表达研究 |
| 1.2.5 肝素酶I的稳定性 |
| 1.2.6 肝素酶的应用 |
| 1.3 本课题研究的目的及意义 |
| 1.4 本课题研究的主要内容 |
| 第二章 来源于B.eggerthii VPI T5-42B-1 肝素酶Ⅰ的克隆表达及性质研究 |
| 2.1 实验材料与方法 |
| 2.1.1 实验材料与仪器 |
| 2.1.2 菌种的活化与培养 |
| 2.1.3 基因组DNA的获取 |
| 2.1.4 重组表达载体的构建 |
| 2.1.5 琼脂糖凝胶电泳分析 |
| 2.1.6 重组Hep Ⅰ表达条件的优化 |
| 2.1.7 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析 |
| 2.1.8 蛋白含量的测定 |
| 2.1.9 重组Hep Ⅰ活力的测定 |
| 2.1.10 重组Hep Ⅰ的亲和纯化 |
| 2.1.11 重组Hep Ⅰ的性质表征 |
| 2.1.12 同源建模与分子对接 |
| 2.2 结果与讨论 |
| 2.2.1 B.eggerthii VPI T5-42B-1 肝素酶Ⅰ序列分析 |
| 2.2.2 重组Hep Ⅰ表达载体的构建 |
| 2.2.3 重组Hep Ⅰ表达条件的优化 |
| 2.2.4 重组Hep Ⅰ的亲和纯化 |
| 2.2.5 重组Hep Ⅰ的性质表征 |
| 2.2.6 同源建模及分子对接 |
| 2.3 本章小结 |
| 第三章 来源于B.xylanisolvens SD CC2a肝素酶Ⅰ的克隆表达及性质表征 |
| 3.1 实验材料与方法 |
| 3.1.1 实验材料与仪器 |
| 3.1.2 菌种的活化与培养 |
| 3.1.3 基因组DNA的获取 |
| 3.1.4 重组表达载体的构建 |
| 3.1.5 琼脂糖凝胶电泳分析 |
| 3.1.6 重组Hep Ⅰ表达条件的优化 |
| 3.1.7 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析 |
| 3.1.8 蛋白含量测定方法 |
| 3.1.9 重组Hep Ⅰ酶活力测定方法 |
| 3.1.10 重组Hep Ⅰ的纯化 |
| 3.1.11 重组Hep Ⅰ的性质表征 |
| 3.1.12 同源建模与分子对接 |
| 3.2 结果与讨论 |
| 3.2.1 B.xylanisolvens SD CC2a肝素酶Ⅰ序列分析 |
| 3.2.2 重组Hep Ⅰ表达载体的构建 |
| 3.2.3 重组Hep Ⅰ表达条件的优化 |
| 3.2.4 重组Hep Ⅰ的纯化 |
| 3.2.5 重组Hep Ⅰ的性质表征 |
| 3.2.6 同源建模及分子对接 |
| 3.3 本章小结 |
| 第四章 来源于B.cellulosilyticus DSM14838 肝素酶Ⅰ的克隆表达及性质表征 |
| 4.1 实验材料与方法 |
| 4.1.1 实验材料与仪器 |
| 4.1.2 菌种的活化与培养 |
| 4.1.3 基因组DNA的获取 |
| 4.1.4 重组表达载体的构建 |
| 4.1.5 琼脂糖凝胶电泳分析 |
| 4.1.6 重组Hep Ⅰ表达条件的优化 |
| 4.1.7 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析 |
| 4.1.8 蛋白含量测定方法 |
| 4.1.9 重组Hep Ⅰ酶活力测定方法 |
| 4.1.10 重组Hep Ⅰ的纯化 |
| 4.1.11 重组Hep Ⅰ的性质表征 |
| 4.1.12 同源建模与分子对接 |
| 4.2 结果与讨论 |
| 4.2.1 B.cellulosilyticus DSM14838 肝素酶Ⅰ序列分析 |
| 4.2.2 重组Hep Ⅰ表达载体的构建 |
| 4.2.3 重组HepⅠ表达条件的优化 |
| 4.2.4 重组Hep Ⅰ的纯化 |
| 4.2.5 重组Hep Ⅰ的性质表征 |
| 4.2.6 同源建模及分子对接 |
| 4.3 本章小结 |
| 第五章 结论与展望 |
| 结论 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表论文 |
（3）糖胺聚糖硫酸软骨素和肝素裂解酶的重组表达与分子改造（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 糖胺聚糖的概述 |
| 1.1.1 硫酸软骨素 |
| 1.1.2 低分子量硫酸软骨素 |
| 1.1.3 肝素 |
| 1.1.4 低分子量肝素 |
| 1.2 糖胺聚糖的酶法降解 |
| 1.2.1 硫酸软骨素裂解酶 |
| 1.2.2 肝素裂解酶 |
| 1.3 硫酸软骨素裂解酶ABC Ⅰ的研究进展 |
| 1.3.1 硫酸软骨素裂解酶ABC Ⅰ的晶体结构 |
| 1.3.2 硫酸软骨素裂解酶ABC Ⅰ的催化机理 |
| 1.3.3 硫酸软骨素裂解酶ABC Ⅰ的生产 |
| 1.3.4 硫酸软骨素裂解酶ABC Ⅰ的分子改造 |
| 1.4 肝素裂解酶Ⅲ的研究进展 |
| 1.4.1 肝素裂解酶Ⅲ的晶体结构 |
| 1.4.2 肝素裂解酶Ⅲ的催化机理 |
| 1.4.3 肝素裂解酶Ⅲ的分子改造 |
| 1.5 本论文的立题依据及主要研究内容 |
| 1.5.1 本论文的立题依据 |
| 1.5.2 本论文的主要研究内容 |
| 第二章 硫酸软骨素裂解酶 ABC Ⅰ与肝素裂解酶 Ⅲ在 E.coli中的重组表达 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 菌株和质粒 |
| 2.2.2 试剂及培养基 |
| 2.2.3 主要仪器 |
| 2.2.4 分子生物学操作 |
| 2.2.5 重组质粒构建 |
| 2.2.6 基因敲除菌的构建 |
| 2.2.7 培养条件 |
| 2.2.8 蛋白分离纯化 |
| 2.2.9 分析方法 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 硫酸软骨素裂解酶ABC Ⅰ的可溶表达 |
| 2.3.2 定点突变提高硫酸软骨素裂解酶ABC Ⅰ的催化活力 |
| 2.3.3 硫酸软骨素裂解酶ABC Ⅰ的分泌表达 |
| 2.3.4 硫酸软骨素裂解酶ABC Ⅰ的发酵优化 |
| 2.3.5 肝素裂解酶Ⅲ的重组表达与酶学性质分析 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 硫酸软骨素裂解酶ABC Ⅰ的热稳定性改造 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 菌株和质粒 |
| 3.2.2 试剂及培养基 |
| 3.2.3 主要仪器 |
| 3.2.4 分子生物学操作 |
| 3.2.5 重组质粒构建 |
| 3.2.6 培养条件 |
| 3.2.7 蛋白分离纯化 |
| 3.2.8 分析方法 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 基于结构导向的loop截短设计 |
| 3.3.2 截短突变体的酶学性质分析 |
| 3.3.3 基于序列导向的一致性突变设计及筛选 |
| 3.3.4 NΔ5/E694P突变体的酶学性质分析 |
| 3.3.5 热稳定性提高的分子解析 |
| 3.3.6 3-L罐分批发酵 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 肝素裂解酶Ⅲ的催化性能改造 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 菌株与质粒 |
| 4.2.2 试剂及培养基 |
| 4.2.3 主要仪器 |
| 4.2.4 分子生物学操作 |
| 4.2.5 重组质粒构建 |
| 4.2.6 培养条件 |
| 4.2.7 蛋白分离纯化 |
| 4.2.8 分析方法 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 底物口袋的半理性设计 |
| 4.3.2 鉴定影响催化性能与热稳定性的关键氨基酸残基 |
| 4.3.3 突变体S264F、D321Q和 S264F/D321Q的结构分析 |
| 4.3.4 底物口袋的理性设计 |
| 4.3.5 突变体E105R/S264F的结构分析 |
| 4.3.6 3-L罐分批发酵 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 硫酸软骨素裂解酶ABC Ⅰ在 Bacillus subtilis中的高效表达 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 菌株与质粒 |
| 5.2.2 试剂及培养基 |
| 5.2.3 主要仪器 |
| 5.2.4 分子生物学操作 |
| 5.2.5 重组质粒构建 |
| 5.2.6 培养条件 |
| 5.2.7 蛋白分离 |
| 5.2.8 分析方法 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 NΔ5/E694P在 B.subtilis WB600 的组成型表达 |
| 5.3.2 优化N端序列提高NΔ5/E694P的表达水平 |
| 5.3.3 优化5'UTR提高NΔ5/E694P的表达水平 |
| 5.3.4 插入终止子序列对NΔ5/E694P表达的影响 |
| 5.3.5 3-L罐分批发酵 |
| 5.3.6 低分子量硫酸软骨素的制备 |
| 5.4 本章小结 |
| 主要结论与展望 |
| 主要结论 |
| 展望 |
| 论文创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录:作者在攻读博士期间发表的论文 |
（4）具有不同ATⅢ亲和力依诺肝素组分的分离制备与结构解析（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 引言 |
| 1.1 肝素类药物的简介 |
| 1.1.1 肝素的理化性质 |
| 1.1.2 肝素类药物的结构与功能 |
| 1.1.3 肝素类药物的临床应用范围 |
| 1.1.4 肝素的副作用 |
| 1.1.5 肝素类药物市场份额 |
| 1.2 LWMH的分类与制备方法 |
| 1.2.1 LWMH的分类 |
| 1.2.2 LWMH的制备方法 |
| 1.3 依诺肝素等低分子量肝素的药理活性 |
| 1.4 依诺肝素等LWMH的结构解析的研究进展 |
| 1.5 本课题的研究思路和主要内容 |
| 第二章 亲和层析系统的建立及应用 |
| 2.1 两种ATⅢ蛋白的对比筛选 |
| 2.1.1 前言 |
| 2.1.2 实验设备及材料 |
| 2.1.4 结果与讨论 |
| 2.2 不同型号亲和层析柱的对比筛选 |
| 2.2.1 前言 |
| 2.2.2 实验设备及材料 |
| 2.2.3 实验方法 |
| 2.2.4 结果与讨论 |
| 2.3 不同制备时间下ATⅢ活性测试 |
| 2.3.1 前言 |
| 2.3.2 实验设备及材料 |
| 2.3.4 结果与讨论 |
| 第三章 依诺肝素不同组分的活性测试与结构解析 |
| 3.1 生物活性检测 |
| 3.1.1 前言 |
| 3.1.2 实验设备及材料 |
| 3.1.4 结果与讨论 |
| 3.2 酶解后运用SAX对比不同依诺肝素组分寡糖组成 |
| 3.2.1 不同来源肝素酶作用效果对比筛选 |
| 3.2.2 不同降解温度作用效果对比筛选 |
| 3.2.3 依诺肝素不同组分酶解后二糖寡糖组成对比 |
| 3.3 PMP衍生化后对比不同组分寡糖组成 |
| 3.3.1 前言 |
| 3.3.2 实验设备及材料 |
| 3.3.4 结果与讨论 |
| 3.4 三重四级杆质谱对比分析不同组分寡糖组成 |
| 3.4.1 前言 |
| 3.4.2 实验设备及材料 |
| 3.4.3 实验方法 |
| 3.4.4 结果与讨论 |
| 论文总结与展望 |
| 参考文献 |
| 缩写词表 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 致谢 |
（5）肝素酶Ⅰ在原核工程菌中异源可溶性表达及性质表征的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 中英文缩略词对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 肝素 |
| 1.2 低分子量肝素 |
| 1.3 肝素酶 |
| 1.4 肝素酶Ⅰ的国内外研究现状 |
| 1.5 分子伴侣 |
| 1.5.1 Gro EL/ES |
| 1.5.2 Cpk A/Cpk B |
| 1.6 研究目的及意义 |
| 1.7 研究策略及方法 |
| 第二章 肝素酶Ⅰ的原核表达 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验菌种及质粒 |
| 2.1.2 实验仪器 |
| 2.1.3 实验药品 |
| 2.1.4 试剂及配方 |
| 2.2 实验内容 |
| 2.2.1 HepI的检测验证 |
| 2.2.2 感受态的制备及转化 |
| 2.2.3 HepI的表达 |
| 2.2.4 HepI表达条件的优化 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 质粒提取及PCR鉴定 |
| 2.3.2 测序验证 |
| 2.3.3 不同诱导温度下HepI的表达结果 |
| 2.3.4 不同诱导转速下HepI的表达结果 |
| 2.4 结果讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 CpkA参与的肝素酶Ⅰ原核表达、纯化及表征 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 质粒及菌株 |
| 3.1.2 实验仪器与药品 |
| 3.1.3 试剂及溶液 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 去除前导肽的肝素酶Ⅰ(Hep Ⅰ’-28a)的构建 |
| 3.2.2 p ACYC-Cpk A质粒的构建 |
| 3.2.3 共转化体系的建立 |
| 3.2.4 单转和共转菌株的初步表达与纯化 |
| 3.2.5 纯化方法学的建立与优化 |
| 3.2.6 肝素酶Ⅰ的性质表征 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 HepI’-28a重组质粒的验证 |
| 3.3.2 重组质粒p ACYC-Cpk A的验证 |
| 3.3.3 共转化体系的验证 |
| 3.3.4 Hep I和 Hep I’蛋白在单转和共转情况下的初步表达 |
| 3.3.5 镍柱纯化 |
| 3.3.6 初步建立的HepI’蛋白纯化方法 |
| 3.3.7 纯化方法学的优化 |
| 3.3.8 肝素酶Ⅰ的性质研究 |
| 3.4 结果讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 Cpk A的原核表达及对Hep I体外复性的研究 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 质粒及菌株 |
| 4.1.2 仪器及药品 |
| 4.1.3 实验试剂 |
| 4.2 实验内容 |
| 4.2.1 CpkA-21a质粒的转化 |
| 4.2.2 CpkA蛋白的表达 |
| 4.2.3 CpkA蛋白的纯化 |
| 4.2.4 CpkA的性质表征 |
| 4.2.5 肝素酶Ⅰ的体外复性 |
| 4.2.6 肝素酶Ⅰ的酶活测定 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 CpkA的热处理及硫酸铵沉淀最适浓度的筛选 |
| 4.3.2 阴离子交换柱层析结果 |
| 4.3.3 CpkA的纯度和浓度测定 |
| 4.3.4 Cpk A的 ATPase酶活测定 |
| 4.3.5 尿素梯度复性结果 |
| 4.3.6 包涵体蛋白的回收率 |
| 4.3.7 复性肝素酶Ⅰ蛋白的酶活测定 |
| 4.4 结果讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（6）低分子肝素活性寡糖链的质谱表征与模拟测序（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略符号说明 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 糖胺聚糖的分类与结构 |
| 1.2 糖胺聚糖的生理病理功能 |
| 1.3 蛋白聚糖 |
| 1.4 硫酸化糖胺聚糖:肝素及硫酸乙酰肝素 |
| 1.5 低分子量肝素 |
| 1.6 低分子量肝素的结构分析 |
| 1.6.1 分离技术 |
| 1.6.2 检测技术 |
| 1.7 本课题研究内容 |
| 1.8 本课题创新点和研究意义 |
| 第二章 低分子肝素活性寡糖链的质谱表征与模拟测序 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验试剂与仪器 |
| 2.2.1 实验试剂 |
| 2.2.2 实验仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 亲和分离溶液配制 |
| 2.3.2 亲和色谱柱制备 |
| 2.3.3 分离亲和组分与非亲和组分 |
| 2.3.4 完整糖链分析 |
| 2.3.5 基本组成单元分析 |
| 2.3.6 亲和dp8组分的分离 |
| 2.3.7 亲和dp8的酶解 |
| 2.3.8 亲和dp8的亚硝酸降解 |
| 2.4 实验结果与讨论 |
| 2.4.1 亲和色谱柱制备与亲和组分分离结果 |
| 2.4.2 完整糖链分析结果 |
| 2.4.3 基本组成单元分析结果 |
| 2.4.4 亲和dp8组分分离结果 |
| 2.4.5 亲和dp8酶解结果 |
| 2.4.6 亲和dp8亚硝酸降解结果 |
| 2.4.7 亲和dp8序列模拟结果 |
| 第三章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文及申请的专利 |
| 附件 |
（7）新型肝素酶高产菌的筛选鉴定及其基因的克隆与表达（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 肝素 |
| 1.1.1 肝素的定义和结构 |
| 1.1.2 肝素的作用 |
| 1.1.3 肝素的副作用 |
| 1.2 低分子量肝素和超低分子量肝素 |
| 1.2.1 低分子量肝素和超低分子量肝素的定义 |
| 1.2.2 低分子量肝素的制备方法 |
| 1.2.3 低分子量肝素和超低分子量肝素的质量评价方法 |
| 1.2.4 国内外研究现状和发展趋势 |
| 1.3 肝素酶 |
| 1.3.1 肝素酶的来源及分类 |
| 1.3.2 肝素酶的作用机理 |
| 1.3.3 肝素酶活性的检测方法 |
| 1.3.4 肝素酶的应用 |
| 1.3.5 微生物产肝素酶的国内外研究进展 |
| 1.4 当前肝素酶法制备肝素类药物的瓶颈 |
| 1.5 本论文的研究意义和主要内容 |
| 1.5.1 研究意义 |
| 1.5.2 研究内容 |
| 第2章 新型肝素酶高产菌的筛选与鉴定 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 样品来源 |
| 2.2.2 实验试剂与仪器 |
| 2.2.3 培养基 |
| 2.2.4 肝素酶活的测定 |
| 2.2.5 肝素酶高产菌的筛选 |
| 2.2.6 肝素酶高产菌的菌种鉴定 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 肝素酶高产菌的筛选 |
| 2.3.2 肝素酶高产菌的菌种鉴定 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 发酵条件对Raoultella sp.NX-TZ-3-15 产肝素酶的影响 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 菌种 |
| 3.2.2 实验试剂与仪器 |
| 3.2.3 培养基 |
| 3.2.4 培养方法 |
| 3.2.5 肝素酶活的测定 |
| 3.2.6 培养基成分的优化 |
| 3.2.7 培养环境条件的优化 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 培养基成分对Raoultella sp.NX-TZ-3-15 产肝素酶酶活的影响 |
| 3.3.2 培养条件对Raoultella sp.NX-TZ-3-15 产肝素酶酶活的影响 |
| 3.3.3 正交实验 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 Raoultella sp.NX-TZ-3-15 中肝素酶基因的克隆与表达 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 实验菌株和质粒 |
| 4.2.2 实验试剂和实验仪器 |
| 4.2.3 培养基 |
| 4.2.4 Raoultella sp.NX-TZ-3-15 产肝素酶基因的确定 |
| 4.2.5 无缝克隆与组装 |
| 4.2.6 重组工程菌的验证 |
| 4.2.7 重组工程菌的诱导表达 |
| 4.2.8 重组工程菌表达产物SDS-PAGE分析 |
| 4.2.9 肝素酶活的测定 |
| 4.2.10 E.coli BLR(DE3)pBENT-H1 重组工程菌的诱导表达条件优化 |
| 4.3 实验结果与分析 |
| 4.3.1 重组质粒的构建 |
| 4.3.2 重组工程菌的验证 |
| 4.3.3 重组质粒测序结果 |
| 4.3.4 重组工程菌诱导表达结果 |
| 4.3.5 E.coli BLR(DE3)pBENT-H1 重组工程菌诱导条件的优化结果 |
| 4.4 本章小结 |
| 第5章 结论与展望 |
| 5.1 主要结论 |
| 5.2 课题展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间的研究成果 |
（8）肝素分子量和组成分析方法开发及两种肝素物质的结构解析（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 抗凝肝素 |
| 1.1.1 肝素 |
| 1.1.2 抗凝低分子量肝素(LMWHs) |
| 1.2 非抗凝肝素(NACHs) |
| 1.2.1 NACHs的制备 |
| 1.2.2 NACHs的结构 |
| 1.2.3 NACHs生物活性 |
| 1.3 肝素类药物的结构分析 |
| 1.3.1 结构分析 |
| 1.3.2 活性分析 |
| 1.4 本论文研究的主要内容 |
| 第二章 肝素类药物分析方法的建立 |
| 2.1 基于SEC-MALS/RI的分子量和含量分析方法的建立 |
| 2.1.1 前言 |
| 2.1.2 材料与样品配制 |
| 2.1.3 实验优化 |
| 2.1.4 结果与讨论 |
| 2.1.5 结论 |
| 2.2 基于HILIC-MS的二糖组成分析方法的建立 |
| 2.2.0 前言 |
| 2.2.1 材料与方法 |
| 2.2.2 方法建立 |
| 2.2.3 方法应用 |
| 2.2.4 结论 |
| 2.3 基于CIEF-MS的二糖组成分析方法的建立 |
| 2.3.1 前言 |
| 2.3.2 材料与样品配制 |
| 2.3.3 方法建立 |
| 2.3.4 方法验证和应用 |
| 2.3.5 结论 |
| 第三章 不同原料来源、厂家和生产时期的肝素和LMWHS的结构解析 |
| 3.1 不同动物来源肝素的结构解析 |
| 3.1.1 前言 |
| 3.1.2 材料与方法 |
| 3.1.3 结果与讨论 |
| 3.1.4 结论 |
| 3.2 不同动物来源、厂家和生产时期LMWHs的结构解析 |
| 3.2.1 前言 |
| 3.2.2 材料与方法 |
| 3.2.3 结果与讨论 |
| 3.2.4 结论 |
| 第四章 非抗凝肝素的结构解析和潜在应用研究 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 样品制备 |
| 4.2.3 实验方法 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 NACH结构分析 |
| 4.3.2 NACH活性分析 |
| 4.4 结论 |
| 论文总结与展望 |
| 本文不足之处 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间本人出版或公开发表的论着、论文 |
| 缩写词表 |
| 致谢 |
（9）肝素调节激肽释放酶抑制剂活性的结构生物学机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 激肽释放酶-激肽系统 |
| 1.1.1 激肽释放前体 |
| 1.1.2 激肽释放酶 |
| 1.1.3 激肽和激肽受体 |
| 1.1.4 血浆接触系统 |
| 1.1.5 激肽释放酶-激肽系统与肾素-血管紧张素系统 |
| 1.1.6 激肽释放酶-激肽系统与疾病 |
| 1.2 丝氨酸蛋白酶抑制剂的结构与功能 |
| 1.2.1 丝氨酸蛋白酶抑制剂的结构 |
| 1.2.2 肝素调节丝氨酸蛋白酶功能的机制 |
| 1.3 课题的研究内容和意义 |
| 第二章 实验方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 主要试剂耗材 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 研究方法 |
| 2.2.1 质粒构建 |
| 2.2.2 定点突变 |
| 2.2.3 蛋白质表达纯化 |
| 2.2.4 Kallistatin与KLK1、KLK7酶反应动力学二级反应速率常数的测定 |
| 2.2.5 肝素对Kallistatin与KLK1、KLK7反应速率的影响 |
| 2.2.6 蛋白质的结晶与晶体优化 |
| 2.2.7 蛋白质晶体的衍射与结构解析 |
| 第三章 KALLISTATIN蛋白的制备与晶体结构解析 |
| 3.1 人源Kallistatin及变体蛋白的制备和活性检测 |
| 3.1.1 Kallistatin及变体在大肠杆菌中的表达纯化 |
| 3.1.2 Kallistatin在HEK293悬浮细胞中的表达和纯化 |
| 3.2 Kallistatin的结构解析 |
| 3.2.1 Cleaved-Kallistatin与肝素复合物晶体结构 |
| 3.2.2 验证Kallistatin与肝素结合位点 |
| 3.2.3 Native-Kallistatin的晶体结构 |
| 3.3 本章总结 |
| 第四章 肝素特异性调节KALLISTATIN与KLK1和KLK7反应速率机制的研究 |
| 4.1 KLK1及变体蛋白的制备和活性检测 |
| 4.2 KLK7及变体蛋白的制备和活性检测 |
| 4.3 肝素对Kallistatin活性和特异性的影响 |
| 4.3.1 Kallistatin抑制KLK1和KLK7的蛋白酶活性 |
| 4.3.2 肝素调节Kallistatin与KLK1/KLK7相互作用的反应速率 |
| 4.3.3 肝素通过结合KAL的307/308D和312/313D位点影响KAL与KLK1的反应速率 |
| 4.3.4 测定Kallistatin与KLK1、KLK7酶反应动力学二级反应速率常数 |
| 4.4 肝素促进Kallistatin与KLK7相互作用,但抑制Kallistatin与KLK1相互作用的分子机制 |
| 4.4.1 验证肝素通过盐桥效应促进Kallistatin与KLK7相互作用 |
| 4.4.2 肝素通过负电荷之间的静电排斥作用抑制Kallistatin与KLK1相互作用 |
| 4.5 本章总结 |
| 第五章 全文总结与展望 |
| 5.1 全文总结 |
| 参考文献 |
| 专有名词中英文对照 |
| 附录 溶液配方 |
| 致谢 |
（10）叶酸功能化的肝素和聚苯炔纳米粒子在肿瘤治疗中的应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 高分子纳米载体的研究背景 |
| 1.2 高分子纳米载体的性质 |
| 1.2.1 高分子载体的被动靶向性 |
| 1.2.2 高分子载体的主动靶向性 |
| 1.2.3 高分子载体的刺激响应性 |
| 1.3 高分子纳米载体的分类 |
| 1.3.1 树支状高分子 |
| 1.3.2 二元或者多元聚合物 |
| 1.3.3 天然多糖高分子聚合物 |
| 1.4 课题的提出及创新性 |
| 1.4.1 论文的研究内容 |
| 1.4.2 论文的创新点 |
| 参考文献 |
| 第二章 非抗凝肝素叶酸纳米粒子在抗肿瘤活性中的研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 肝素叶酸纳米粒子的合成 |
| 2.2.2 肝素叶酸纳米粒子的表征 |
| 2.2.3 纳米粒子细胞毒性研究 |
| 2.2.4 纳米粒子对肿瘤的抑制作用 |
| 2.2.5 纳米粒子体内抗凝活性的研究 |
| 2.2.6 纳米粒子体外抗凝活性的研究 |
| 2.2.7 纳米粒子对肿瘤肺部转移抑制的研究 |
| 2.2.8 肺转移的组织切片实验 |
| 2.2.9 Fibrin bead assay |
| 2.2.10 蛋白印迹实验(Western Blot) |
| 2.2.11 明胶酶谱分析 |
| 2.2.12 纳米粒子对血管生成的抑制作用 |
| 2.2.13 创伤愈合实验 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 肝素叶酸纳米粒子的合成与表征 |
| 2.3.2 肝素叶酸纳米粒子体内抗凝血的研究 |
| 2.3.3 肝素叶酸纳米粒子体外抗凝血的研究 |
| 2.3.4 肝素叶酸纳米粒子对肿瘤生长的抑制作用 |
| 2.3.5 肝素叶酸纳米粒子对肺肿瘤转移的抑制作用 |
| 2.3.6 肝素叶酸纳米粒子对血管生长的抑制作用 |
| 2.3.7 肝素叶酸纳米粒子对血管生长抑制作用的机制研究 |
| 2.4 小结 |
| 参考文献 |
| 第三章 非抗凝型肝素叶酸-顺铂纳米粒子在生物中的研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 HDDP与HFDDP纳米粒子的制备 |
| 3.2.3 HDDP与HFDDP纳米粒子的表征 |
| 3.2.4 体外实验 |
| 3.2.5 血液循环时间检测 |
| 3.2.6 血样中Pt-DNA复合物的检测 |
| 3.2.7 DDP、HDDP和HFDDP纳米粒子的生物分布 |
| 3.2.8 HDDP和HFDDP纳米粒子的体内抗肿瘤效率检测 |
| 3.2.9 外周血液分析 |
| 3.2.10 组织病理学评价 |
| 3.2.11 体外细胞内铂的浓度分析 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 HDDP、HFDDP纳米粒子的制备 |
| 3.3.2 DDP体外释放研究 |
| 3.3.3 细胞摄取分析 |
| 3.3.4 纳米粒子的体外细胞毒性测试 |
| 3.3.5 纳米粒子的药代动力学研究 |
| 3.3.6 纳米粒子在肿瘤和组织的药物摄取分析 |
| 3.3.7 纳米粒子的体内抗肿瘤效果研究 |
| 3.3.8 老鼠体重与器官重量 |
| 3.3.9 组织病理学评估与血样分析 |
| 3.4 小结 |
| 参考文献 |
| 第四章 聚苯炔纳米粒子示踪剂在肿瘤成像中的应用 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 聚苯炔类单体的合成(PPEs) |
| 4.2.2 聚合物P_0,P_(20),P_(60)的合成 |
| 4.2.3 FA-PEG-PCL和PEG-PCL共聚物的合成 |
| 4.2.4 纳米粒子的制备 |
| 4.2.5 纳米粒子的形貌表征 |
| 4.2.6 不同pH下的纳米尺寸与荧光变化 |
| 4.2.7 聚合物光学性质的测定 |
| 4.2.8 纳米粒子的细胞毒性研究 |
| 4.2.9 纳米粒子在细胞成像中的研究 |
| 4.2.10 纳米粒子的光稳定性测试 |
| 4.2.11 单分子荧光的制备 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 聚合物PPEs合成与纳米粒子的制备 |
| 4.3.2 聚合物性质 |
| 4.3.3 聚合物纳米粒子的性质 |
| 4.3.4 聚合物以及纳米粒子荧光寿命测定 |
| 4.3.5 pH对纳米粒子荧光以及尺寸变化的影响 |
| 4.3.6 纳米粒子的细胞毒性研究 |
| 4.3.7 细胞成像研究 |
| 4.3.8 光稳定性研究 |
| 4.3.9 单分子荧光的研究 |
| 4.4 小结 |
| 参考文献 |
| 第五章 总结与展望 |
| 攻读博士期间取得科研成果 |
| 致谢 |
四、低分子量肝素的性质与应用（论文参考文献）
- [1]基于质谱的糖胺聚糖结构表征及其与蛋白互作分子机制研究[D]. 盛安然. 山东大学, 2021(11)
- [2]三种肝素酶Ⅰ的克隆表达及性质研究[D]. 刘彩芸. 江苏大学, 2020(02)
- [3]糖胺聚糖硫酸软骨素和肝素裂解酶的重组表达与分子改造[D]. 王浩. 江南大学, 2020(01)
- [4]具有不同ATⅢ亲和力依诺肝素组分的分离制备与结构解析[D]. 朱梦. 苏州大学, 2020(02)
- [5]肝素酶Ⅰ在原核工程菌中异源可溶性表达及性质表征的研究[D]. 栗慧超. 长春理工大学, 2020(01)
- [6]低分子肝素活性寡糖链的质谱表征与模拟测序[D]. 崔雪莹. 山东大学, 2020(02)
- [7]新型肝素酶高产菌的筛选鉴定及其基因的克隆与表达[D]. 蒋莹子. 深圳大学, 2019(09)
- [8]肝素分子量和组成分析方法开发及两种肝素物质的结构解析[D]. 欧阳艺兰. 苏州大学, 2019(04)
- [9]肝素调节激肽释放酶抑制剂活性的结构生物学机制研究[D]. 马丽娜. 上海交通大学, 2019
- [10]叶酸功能化的肝素和聚苯炔纳米粒子在肿瘤治疗中的应用[D]. 王建全. 南京大学, 2017(01)